JP5681392B2 - 微生物によるｌ−グリセリン酸の製造方法 - Google Patents
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本発明は、微生物によるＬ−グリセリン酸の製造方法に関する。
近年、化石燃料に代わる燃料として、バイオディーゼル（ＢＤＦ）の生産が欧州などにおいて盛んに行われてきている。バイオ燃料であるＢＤＦは油脂から製造される燃料であるが、製造過程においてグリセリン等が付随して生産されてくる。また、グリセリンは天然油脂から高級アルコールや脂肪酸を合成する過程においても副産物として生産されてくる。環境問題等の観点から、副産物であるグリセリンを廃棄物として出すことなく有効利用することが望まれている。
このような観点から、グリセリンを種々の化学合成品の原材料として利用することが検討されており、現在のところ、グリセリンは主にエピクロロヒドリンやプロピレングリコールなどの合成原料として用いられている。また、微生物を用いてグリセリンを有用物質に変換する検討も種々行われており、例えば放線菌を用いた糖含有化合物への変換が報告されている（非特許文献１参照）。しかしながら、このような用途だけでは上記副産物であるグリセリン廃棄物を十分に有効利用することはできず、環境問題、エネルギー問題の解決には課題が残る。
グリセリン酸は、ポリマーの原料や、有機材料の原料として有用な化合物である。グリセリン酸は、グリセリンの酸化反応により化学合成することができ、例えば、グリセリンからＤＬ−グリセリン酸を合成する方法が知られている。しかしながら、この方法ではコストがかかることに加え、Ｌ−グリセリン酸を得るためには、ＤＬ−グリセリン酸からＬ−グリセリン酸を分離する必要があり、操作が煩雑になる。また、Ｌ−アスコルビン酸からＬ−グリセリン酸を化学合成により製造する方法も知られているが、マスキング、環の開裂、酸化反応による鎖長変換、保護基の脱離という多段階の操作を必要とする（非特許文献２参照）。
一方、微生物を用いたグリセリン酸の製造方法も検討されており、例えば、酢酸菌を用いてグリセリンからＤ−グリセリン酸を製造する方法（特許文献１参照）、グリセリン酸生産能の高い微生物を用いた、効率的なＤ−グリセリン酸の製造方法（非特許文献３参照）が提案されている。しかしながら、微生物を培養することにより得られるグリセリン酸はＤ体のみであり、微生物を培養することにより光学異性体であるＬ−グリセリン酸を得る方法は知られていない。一方、１，２−プロパンジオールを含むグリセリン培地で培養したグラム陰性の菌体を用いて、休止菌体反応によりＬ−グリセリン酸が作られることをグリコシルオキシダーゼを用いた酵素反応でアッセイした報告（非特許文献４参照）がある。しかしながら、ここでのＬ−グリセリン酸分析方法は、例えば１，２−プロパンジオールより乳酸を生成する場合において擬陽性になるという問題がある。
Folia Microbiol., 2007, 52, 451-456
Tetrahedron Asymmetry,1991, 2, 359-362
Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 81, 1003-1039
甲子園大学紀要,2008, 36, 109-112
本発明は、Ｌ−グリセリン酸の製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、前記方法に用いる微生物の提供を課題とする。
本発明者等は上記課題に鑑み、グリセリンを有効利用し、かつ、工業的に利用価値の高いＬ−グリセリン酸を生産しうる微生物について鋭意検討を行った。その結果、ディエジア（Dietzia）属細菌がＬ−グリセリン酸生産能を有することを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
本発明は、ディエジア（Dietzia）属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を、グリセリン酸への変換可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることを特徴とするＬ−グリセリン酸の製造方法を提供する。
また、本発明は、ディエジア（Dietzia）属に属し、グリセリン酸への変換可能な炭素源からのＬ−グリセリン酸生産能を有する微生物を提供する。
また、本発明は、ディエジア（Dietzia）属に属し、グリセリン酸への変換可能な炭素源からのＬ−グリセリン酸生産能を有する微生物を提供する。
本発明によれば、Ｌ−グリセリン酸を効率的に製造することができる。また、本発明の微生物は、前記方法に好適に用いることができる。本発明の製造方法により得られたＬ−グリセリン酸を用いれば、例えば、Ｄ−グリセリン酸と任意の割合で配合することで、グリセリン酸を原料とする多様な合成物、変換物を製造することができる。
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法は、ディエジア（Dietzia）属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を、グリセリン酸への変換可能な炭素源を含む培地に培養し、培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることを特徴とする。ディエジア（Dietzia）属に属する微生物がＬ−グリセリン酸生産能を有することは、本発明者らによって初めて見い出された知見である。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法に用いられるＬ−グリセリン酸生産菌は、Ｌ−グリセリン酸を生成することができ、ディエジア属に属するものであれば特に制限はない。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法において、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、下記の菌学的性質を示す、Ｌ−グリセリン酸の生産能を有するディエジア属に属する微生物を用いることが好ましい。
（菌学的性質）
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 桿形
（３）酸素に対する態度 好気性
（４）運動性 有せず
（５）グルコースの酸化 陰性
（６）カタラーゼ反応 陽性
（７）オキシダーゼ反応 陰性
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法は、ディエジア（Dietzia）属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を、グリセリン酸への変換可能な炭素源を含む培地に培養し、培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることを特徴とする。ディエジア（Dietzia）属に属する微生物がＬ−グリセリン酸生産能を有することは、本発明者らによって初めて見い出された知見である。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法に用いられるＬ−グリセリン酸生産菌は、Ｌ−グリセリン酸を生成することができ、ディエジア属に属するものであれば特に制限はない。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法において、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、下記の菌学的性質を示す、Ｌ−グリセリン酸の生産能を有するディエジア属に属する微生物を用いることが好ましい。
（菌学的性質）
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 桿形
（３）酸素に対する態度 好気性
（４）運動性 有せず
（５）グルコースの酸化 陰性
（６）カタラーゼ反応 陽性
（７）オキシダーゼ反応 陰性
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法に用いられるＬ−グリセリン酸生産菌は、Ｌ−グリセリン酸生産能を有するディエジア属に属する微生物の中でもＬ−グリセリン酸生成能が高いがディエジア・エスピー（Dietzia sp.）ＫＳＭ−ＴＢ４２７株であることが、更に好ましい。なお、ディエジア・エスピー（Dietzia sp.）ＫＳＭ−ＴＢ４２７株は、２００９年９月１７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８４８として寄託された。
本発明に用いることができるＬ−グリセリン酸生産菌の取得方法に特に制限はなく、例えば任意の場所の土壌中の細菌を、寒天を添加したグリセリンを含有するＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）で培養し、以下に記載の菌学的性質（培養的性質、形態的性質、生理学的性質、化学分類学的性質）を適宜組み合わせた指標によりコロニーをスクリーニングすることで、本発明に用いることができる微生物を見い出すことができる。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法に特に好ましく用いることができるディエジア・エスピー（Dietzia sp.）ＫＳＭ−ＴＢ４２７株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８４８）の菌学的性質は、以下の通りである。
（ａ）培養的性質
１．ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）：２５℃、３日間で良好に生育
２．グリセリンを１０％含有するＬＢ−人工海水寒天培地（１．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、１０％ グリセリン、３．６％ 人工海水、１．５％ 寒天、ｐＨ９）における生育：２５℃、６日間で良好に生育
３．１０％グリセリンを含むＭＡ寒天培地（１０％ グリセリン、３．５％ ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ２２１６培地 （ＢＤ社製）、１．５％ 寒天、ｐＨ９）における生育：２５℃、６日間で良好に生育
１．ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）：２５℃、３日間で良好に生育
２．グリセリンを１０％含有するＬＢ−人工海水寒天培地（１．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、１０％ グリセリン、３．６％ 人工海水、１．５％ 寒天、ｐＨ９）における生育：２５℃、６日間で良好に生育
３．１０％グリセリンを含むＭＡ寒天培地（１０％ グリセリン、３．５％ ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ２２１６培地 （ＢＤ社製）、１．５％ 寒天、ｐＨ９）における生育：２５℃、６日間で良好に生育
（ｂ）形態的性質
ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）における、２５℃、７２時間培養後のコロニー形態を示す。
１．直径：１．０ｍｍ
２．色調：オレンジ色
３．形状：円形
４．隆起状態：レンズ状
５．周縁：全縁
６．表面形状：スムーズ
７．透明度：不透明
８．粘稠度：バター様
ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）における、２５℃、７２時間培養後のコロニー形態を示す。
１．直径：１．０ｍｍ
２．色調：オレンジ色
３．形状：円形
４．隆起状態：レンズ状
５．周縁：全縁
６．表面形状：スムーズ
７．透明度：不透明
８．粘稠度：バター様
（ｃ）生理学的性質
１．生育温度試験
３７℃ 生育する
４５℃ 生育せず
２．カタラーゼ反応：陽性
３．オキシダーゼ反応：陰性
４．嫌気状態での生育：陰性
５．グルコースからの酸／ガス産生
酸産生：陰性
ガス産生：陰性
６．Ｏ／Ｆテスト
酸化：陰性
醗酵：陰性
７．生化学試験
硝酸塩還元 ：陰性
ピラジンアミダーゼ ：陰性
ピロリドニルアリルアミダーゼ ：陰性
アルカリフォスフォターゼ ：陽性
β−グルクロニダーゼ ：陰性
β−ガラクトシダーゼ ：陰性
α−グルコシダーゼ ：陽性
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：陰性
エスクリン（β−グルコシダーゼ） ：陰性
ウレアーゼ ：陰性
ゼラチン加水分解 ：陰性
カタラーゼ ：陽性
８．醗酵性試験
グルコース ：陰性
リボース ：陰性
キシロース ：陰性
マンニトール ：陰性
マルトース ：陰性
乳糖 ：陰性
白糖 ：陰性
グリコーゲン ：陰性
９．資化試験
グリセロール ：陰性
エリスリトール ：陰性
Ｄ−アラビノース ：陰性
Ｌ−アラビノース ：陰性
リボース ：陰性
Ｄ−キシロース ：陰性
Ｌ−キシロース ：陰性
アドニトール ：陰性
β−メチルＤ−キシロシド ：陰性
ガラクトース ：陽性
グルコース ：陽性
フラクトース ：陽性
マンノース ：陽性
ソルボース ：陰性
ラムノース ：陽性
ズルシトール ：陰性
イノシトール ：陰性
マンニトール ：陽性
ソルビトール ：陰性
α−メチル−Ｄ−マンノシド ：陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド ：陰性
Ｎ−アセチルグルコサミン ：陰性
アミグダリン ：陰性
アルブチン ：陰性
エスクリン ：陰性
サリシン ：陰性
セロビオース ：陰性
マルトース ：陰性
ラクトース ：陰性
メリビオース ：陰性
サッカロース ：陰性
トレハロース ：陰性
イヌリン ：陽性
メレチトース ：陰性
ラフィノース ：陰性
でんぷん ：陰性
グリコーゲン ：陽性
キシリトール ：陰性
ゲンチオビオース ：陰性
Ｄ−ツラノース ：陰性
Ｄ−リキソース ：陰性
Ｄ−タガトース ：陰性
Ｄ−フコース ：陰性
Ｌ−フコース ：陰性
Ｄ−アラビトール ：陰性
Ｌ−アラビトール ：陰性
グルコネート ：陰性
２−ケトグルコネート ：陰性
５−ケトグルコネート ：陰性
１０．最適生育温度範囲：２５〜３０℃
１１．最適生育ｐＨ範囲：７〜９
１２．生育可能上限温度：３７℃
１３．生育可能ｐＨ範囲：５〜９
１．生育温度試験
３７℃ 生育する
４５℃ 生育せず
２．カタラーゼ反応：陽性
３．オキシダーゼ反応：陰性
４．嫌気状態での生育：陰性
５．グルコースからの酸／ガス産生
酸産生：陰性
ガス産生：陰性
６．Ｏ／Ｆテスト
酸化：陰性
醗酵：陰性
７．生化学試験
硝酸塩還元 ：陰性
ピラジンアミダーゼ ：陰性
ピロリドニルアリルアミダーゼ ：陰性
アルカリフォスフォターゼ ：陽性
β−グルクロニダーゼ ：陰性
β−ガラクトシダーゼ ：陰性
α−グルコシダーゼ ：陽性
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：陰性
エスクリン（β−グルコシダーゼ） ：陰性
ウレアーゼ ：陰性
ゼラチン加水分解 ：陰性
カタラーゼ ：陽性
８．醗酵性試験
グルコース ：陰性
リボース ：陰性
キシロース ：陰性
マンニトール ：陰性
マルトース ：陰性
乳糖 ：陰性
白糖 ：陰性
グリコーゲン ：陰性
９．資化試験
グリセロール ：陰性
エリスリトール ：陰性
Ｄ−アラビノース ：陰性
Ｌ−アラビノース ：陰性
リボース ：陰性
Ｄ−キシロース ：陰性
Ｌ−キシロース ：陰性
アドニトール ：陰性
β−メチルＤ−キシロシド ：陰性
ガラクトース ：陽性
グルコース ：陽性
フラクトース ：陽性
マンノース ：陽性
ソルボース ：陰性
ラムノース ：陽性
ズルシトール ：陰性
イノシトール ：陰性
マンニトール ：陽性
ソルビトール ：陰性
α−メチル−Ｄ−マンノシド ：陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド ：陰性
Ｎ−アセチルグルコサミン ：陰性
アミグダリン ：陰性
アルブチン ：陰性
エスクリン ：陰性
サリシン ：陰性
セロビオース ：陰性
マルトース ：陰性
ラクトース ：陰性
メリビオース ：陰性
サッカロース ：陰性
トレハロース ：陰性
イヌリン ：陽性
メレチトース ：陰性
ラフィノース ：陰性
でんぷん ：陰性
グリコーゲン ：陽性
キシリトール ：陰性
ゲンチオビオース ：陰性
Ｄ−ツラノース ：陰性
Ｄ−リキソース ：陰性
Ｄ−タガトース ：陰性
Ｄ−フコース ：陰性
Ｌ−フコース ：陰性
Ｄ−アラビトール ：陰性
Ｌ−アラビトール ：陰性
グルコネート ：陰性
２−ケトグルコネート ：陰性
５−ケトグルコネート ：陰性
１０．最適生育温度範囲：２５〜３０℃
１１．最適生育ｐＨ範囲：７〜９
１２．生育可能上限温度：３７℃
１３．生育可能ｐＨ範囲：５〜９
（ｄ）化学分類学的性質
ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ディエジア・マリス（Ｄｉｅｔｚｉａ ｍａｒｉｓ）ＤＳＭ４３６７２株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列との間で９９．８％、ディエジア・シマエ（Ｄｉｅｔｚｉａ ｓｃｈｉｍａｅ）ＹＩＭ６５００１株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列との間で９９．７％の同一性を有する。
ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ディエジア・マリス（Ｄｉｅｔｚｉａ ｍａｒｉｓ）ＤＳＭ４３６７２株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列との間で９９．８％、ディエジア・シマエ（Ｄｉｅｔｚｉａ ｓｃｈｉｍａｅ）ＹＩＭ６５００１株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列との間で９９．７％の同一性を有する。
（ｅ）その他の特徴
上記に示した性質は、ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株が、ディエジア・マリス及びディエジア・シマエの性状に類似するディエジア属細菌であることを支持するが、これらの性質と完全に一致する菌種はディエジア属の中に見当たらないことから、ディエジア・エスピーであると同定される。
上記に示した性質は、ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株が、ディエジア・マリス及びディエジア・シマエの性状に類似するディエジア属細菌であることを支持するが、これらの性質と完全に一致する菌種はディエジア属の中に見当たらないことから、ディエジア・エスピーであると同定される。
本発明のＬ−グリセリン酸の製造方法において、ディエジア属に属し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号１）と１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含むと共に前記の菌学的性質を示し、グリセリン酸への変換可能な炭素源からのＬ−グリセリン酸生産能を有する微生物を用いることができる。
分子系統樹に基づいて生物や遺伝子の進化を研究する手法は、分子系統学として確立されている（例えば、木村資生編分子進化学入門（培風館）第１６４〜１８４頁、「７分子系統樹の作り方とその評価」参照）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹は、対象の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、菌学的性質から同微生物と同種又は類縁と推定される公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とともに、多重アラインメント及び進化距離の計算を行い、得られた値に基づいて系統樹を作成することにより、得ることができる。分子系統樹の作成に用いる公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、既存のデータベースの同一性検索によっても、取得することができる。ここで、進化距離とは、ある遺伝子間の座位（配列の長さ）あたりの変異の総数をいう。
本発明において「分子系統学上同等」とは、前記分子系統樹において同属と認められる微生物を指すが、その中でも、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が９７％以上であればより類縁であり、９９％以上であれば同一種である可能性が高いと認められる。ここで、塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））並びにＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ゼネティックス）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
上記のようなディエジア属に属する微生物を、グリセリン酸への変換可能な炭素源を含む培地に好気的条件下で培養することにより、同培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることができる。ディエジア属に属する微生物は単独で使用することができるが、任意の１種又は２種以上の微生物を同時に使用してもよい。
本発明において、培地は、通常液体培地が用いられる。このような培地の具体例として、ＬＢ培地（２．５％グリセリン、１．８％ダイゴ人工海水（日本製薬）、１．２５％ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、ｐＨ９）等が挙げられる。培地に含まれるグリセリン酸への変換可能な炭素源としては、ディエジア属に属する微生物を好気的に培養したときにＬ−グリセリン酸に変換されるものであれば特に制限されず、グリセリン、グルコース、フルクトース、マンニトール等が挙げられ、グリセリンが好ましい。これらのグリセリン酸への変換可能な炭素源は、市販品を購入することや、当業者に周知の方法で合成することで入手することができる。また、グリセリン酸への変換可能な炭素源としては、前記化合物を所定量含んでいるものであればよい。
また、グリセリン酸への変換可能な炭素源としてグリセリンを用いる場合においては、バイオ燃料の製造時に生じる副産物であるグリセリンを用いることもできる。副産物であるグリセリンをグリセリン酸への変換可能な炭素源とするときは、余剰物質処理にかかるエネルギー低減、廃棄による環境汚染の低減といった副次的な効果もあり、本発明の製造方法の実施が環境負荷の低減につながる。更に、これらの副産物は安価に購入できるので、コストの面でも大きなメリットがある。副産物は、グリセリン酸への変換可能な炭素源としてそのまま用いてもよく、当業者に周知の方法によりグリセリン酸への変換可能な炭素源を分離、精製して用いてもよい。
培地中に含まれるグリセリン酸への変換可能な炭素源の濃度は、Ｌ−グリセリン酸を産生することができれば特に制限はないが、２．５〜１０ｇ／ｄｌの濃度であることが望ましい。グリセリン酸への変換可能な炭素源は段階的に培地中に追添してもよい。
さらに、必要に応じて微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類、各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを培地中に添加することができる。これらの培地成分は、必要に応じて培地中に追添してもよい。
ディエジア属に属するＬ−グリセリン酸生産菌の培地へ接種は、例えば、生理食塩水に懸濁したディエジア属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を生産培地に直接摂取する方法や、生産培地にディエジア属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を１白金耳直接接種することにより行うことができる。
本培養の培養温度は、ディエジア属に属するＬ−グリセリン酸生産菌が生育しうる範囲内、即ち通常１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２５〜３０℃の範囲である。また、培地のｐＨは通常５〜９、好ましくは７〜９の範囲で調節される。培養期間は使用する培地の種類及び炭素源の濃度により異なり、通常２４時間から１４日間程度である。本発明における培養は、グリセリン酸への変換可能な成分が最大限に利用され、かつ培地中に生成するＬ−グリセリン酸の蓄積量が最大に達した時点で培養を終了させることが好ましい。
なお、培養液中のＬ−グリセリン酸の生成量は高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳなどの通常の方法を用いて速やかに測定することができる。本発明により得られたＬ−グリセリン酸は、当該分野において通常使用されている周知の手段、例えばろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留、結晶化などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることにより、培養液中から採取できるが、これらの方法に特に制限されることはない。
本発明の製造方法により、Ｌ−グリセリン酸を微生物により製造することができる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１
（１）菌株の取得
０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水５ｍＬに土壌（東京湾の土壌）を適量加え、撹拌し、静置後、ｐＨ９に調整した１０％（ｗ／ｖ） グリセリン（和光純薬工業）、１．２５％（ｗ／ｖ） ＬＢ培地「ダイゴ」 （日本製薬）、１．５％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬工業）からなる寒天培地に適量塗抹し、２５℃にて６〜１０日間培養した。生育してきた菌株をモノコロニー化し、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株を取得した。
（１）菌株の取得
０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水５ｍＬに土壌（東京湾の土壌）を適量加え、撹拌し、静置後、ｐＨ９に調整した１０％（ｗ／ｖ） グリセリン（和光純薬工業）、１．２５％（ｗ／ｖ） ＬＢ培地「ダイゴ」 （日本製薬）、１．５％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬工業）からなる寒天培地に適量塗抹し、２５℃にて６〜１０日間培養した。生育してきた菌株をモノコロニー化し、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株を取得した。
（２）菌株の同定
形態観察並びにＢＡＲＲＯＷらの方法（G.I.BARROW and R.K.A.FELTHAM: Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria,3rd edition,1993,Cambridge University Press参照）に基づきカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応試験を行った。その結果、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株が運動性を有さないグラム陽性菌で、胞子を形成しない桿菌（０．７−０．８×１．５−２．０μｍ）で、嫌気条件下で生育せず、３７℃で生育するが４５℃では生育しないこと、ＭＢ２２１６寒天培地上でオレンジ色のコロニーを形成し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応に対し陽性を示し、オキシダーゼ反応に対し陰性を示すことがわかった。
形態観察並びにＢＡＲＲＯＷらの方法（G.I.BARROW and R.K.A.FELTHAM: Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria,3rd edition,1993,Cambridge University Press参照）に基づきカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応試験を行った。その結果、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株が運動性を有さないグラム陽性菌で、胞子を形成しない桿菌（０．７−０．８×１．５−２．０μｍ）で、嫌気条件下で生育せず、３７℃で生育するが４５℃では生育しないこと、ＭＢ２２１６寒天培地上でオレンジ色のコロニーを形成し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応に対し陽性を示し、オキシダーゼ反応に対し陰性を示すことがわかった。
ＡＰＩＣＯＲＹＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、生化学試験、醗酵性試験、資化性試験などの各試験を行ったところ、硝酸塩を還元せず、アルカリフォスファターゼ及びグルコシダーゼ活性を示し、ウレアーゼ活性を示さず、各糖を酸化せず、ガラクトース、グルコース及びフラクトースを資化し、Ｌ−アラビノース、アドニトール及びエスクリンなどを資化しない性質を示した。
生理・生化学試験の結果からは、ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株が、ディエジア・マリス及びディエジア・シマエの性状に類似性があるものの、硝酸塩を還元しない、グリコーゲン、イヌリン及びＬ−ラムノースを資化する点で異なっておりディエジア属細菌であることを支持するが、一致した属種は認められなかった。
ＫＳＭ−ＴＢ４２７株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、常法に従いＰＣＲを行い（中川恭好、川崎浩子：遺伝子解析法 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編 放線菌の分類と同定 ８８−１１７ｐｐ、日本化学会事務センター、２００１）、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域を増幅させた。得られた増幅断片の塩基配列を解読し、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分配列（配列番号１：１４７７塩基）を決定した。
解読した配列と同一性のある配列をＢＬＡＳＴ検索したところ、ディエジア・マリス（Ｄｉｅｔｚｉａ ｍａｒｉｓ）ＤＳＭ４３６７２株の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９９．８％、ディエジア・シマエ（Ｄｉｅｔｚｉａ ｓｃｈｉｍａｅ）ＹＩＭ６５００１株の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９９．７％、の高い同一性を有していた。そのため、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株は、ディエジア・マリス又はディエジア・シマエに帰属する可能性も考えられるが、それぞれ３塩基及び４塩基の相違点が認められる。
以上の結果から、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株がディエジア属に属するディエジア・エスピーであると同定した。
試験例２ グリセリン酸の製造
ＬＢ培地（２．５％グリセリン、１．８％ダイゴ人工海水（日本製薬）、１．２５％ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、ｐＨ９）にディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株を１白金耳植菌し、５日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
ＬＢ培地（２．５％グリセリン、１．８％ダイゴ人工海水（日本製薬）、１．２５％ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、ｐＨ９）にディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株を１白金耳植菌し、５日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
培養液上清中に含まれる化合物の分析は、有機酸分析用イオン排除型ポリマーカラムＩＣＳｅｐ ＩＯＮ−３００（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を用い、日立ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて行った。サンプルを溶離液（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸溶液）で適宜希釈し、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸、カラム温度５０℃、サンプル注入量１０μＬ、分析時間４０ｍｉｎの条件にてＨＰＬＣを行い、ＣｏｒｏｎａＴＭ ＣＡＤＴＭ荷電化粒子検出器（ＳＥＡ社）及びＵＶ検出器（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて分析した。分析サンプルはいずれもＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてフィルター濾過処理して用いた。
その結果、ＬＢ培地には存在しない物質の特徴的なピーク（溶離時間１８．７分）が認められた。比較用に、溶離時間が既知のＤ−グリセリン酸（０．０２％（ｗ／ｖ））を同様の条件にてＨＰＬＣ分析したところ、溶離時間が一致し、本ピークがグリセリン酸であることが確認された。
その結果、ＬＢ培地には存在しない物質の特徴的なピーク（溶離時間１８．７分）が認められた。比較用に、溶離時間が既知のＤ−グリセリン酸（０．０２％（ｗ／ｖ））を同様の条件にてＨＰＬＣ分析したところ、溶離時間が一致し、本ピークがグリセリン酸であることが確認された。
実施例 Ｌ−グリセリン酸の製造
ＬＢ培地（２．５％グリセリン、１．８％ダイゴ人工海水（日本製薬）、１．２５％ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、ｐＨ９）及び前記ＬＢ培地とグリセリンを含まないこと以外は同じ組成の培地にディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株を１白金耳植菌し、６日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
ＬＢ培地（２．５％グリセリン、１．８％ダイゴ人工海水（日本製薬）、１．２５％ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、ｐＨ９）及び前記ＬＢ培地とグリセリンを含まないこと以外は同じ組成の培地にディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株を１白金耳植菌し、６日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
培養液上清中に含まれる化合物の分析は、試験例２と同様に有機酸分析用イオン排除型ポリマーカラムＩＣＳｅｐ ＩＯＮ−３００（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を用い、日立ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて行った。
その結果、グリセリン酸のピーク（溶離時間１８．７分）はＬＢ培地にのみ認められ、グリセリンを抜いたＬＢ培地には認められなかった。ＬＢ培地上清中のグリセリン酸生産量は、対照に用いたＤ−グリセリン酸のピーク面積から換算して１．８ｇ／Ｌであった。
その結果、グリセリン酸のピーク（溶離時間１８．７分）はＬＢ培地にのみ認められ、グリセリンを抜いたＬＢ培地には認められなかった。ＬＢ培地上清中のグリセリン酸生産量は、対照に用いたＤ−グリセリン酸のピーク面積から換算して１．８ｇ／Ｌであった。
ＬＢ培地培養上清を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて分画した。ＬＨ−２０を１０％メタノールで膨潤させた後、２０ｍｍΦ×１０００ｍｍカラム（山善社）に充填（９５０ｍｍ）した。ＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）にてフィルター濾過した培養上清１．５ｍＬをカラムに供し、１０％メタノール溶液で室温にて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出した。溶出液を５ｍＬ／試験管（１６ｍｍΦ×１００ｍｍ）に分画した後、目的の化合物が含まれる画分を濃縮乾固し、ミリＱ水（日本ミロポア社）に溶解して、光学純度測定用サンプルとした。
溶解したサンプルを硫酸銅濃度が２ｍＭとなるように適宜希釈し、移動層である２ｍＭ硫酸銅溶液で安定化させたＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＭＡ（＋）カラム（ダイセル化学工業）を用い、流速０．５ｍＬ、カラム温度３０℃、サンプル注入量１０μＬ、分析時間２０ｍｉｎの条件にてＨＰＬＣを行い、ＲＩ検出器及びＵＶ（２１０ｎｍ）検出器にて分析した。対照として、３．２ｍＭのＤ−グリセリン酸と、２．８ｍＭのＬ−グリセリン酸についても同様に分析した。結果を図１（ａ）〜（ｃ）に示す。
図１に示すように、ＫＳＭ−ＴＢ４２７株の生産するグリセリン酸のピーク（ＵＶ検出器での溶離時間５．２１３分）は、試薬のＬ−グリセリン酸のピーク（ＵＶ検出器での溶離時間５．２９３分）と実質的に一致することが確認された。一方、Ｄ−グリセリン酸のピーク（ＵＶ検出器でのピークの溶離時間５．６５３分）とは一致しなかった。
以上の結果より、ディエジア・エスピーＫＳＭ−ＴＢ４２７株は、Ｌ−グリセリン酸生産能を有し、ティエジア属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を用いた本発明の製造方法により、グリセリンからＬ−グリセリン酸を効率的に製造できることがわかった。
Claims (4)
- ディエジア（Dietzia）属に属するＬ−グリセリン酸生産菌を、グリセリンを含む培地で培養し、培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることを特徴とするＬ−グリセリン酸の製造方法であって、該Ｌ−グリセリン酸生産菌がディエジア・エスピー（Dietzia sp.）ＫＳＭ−ＴＢ４２７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８４８）である、Ｌ−グリセリン酸の製造方法。
- 配列番号１に示す塩基配列又は配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、下記の菌学的性質を示し、グリセリンからのＬ−グリセリン酸生産能を有するディエジア（Dietzia）属に属する微生物を、グリセリンを含む培地で培養し、培地中にＬ−グリセリン酸を生成させることを特徴とするＬ−グリセリン酸の製造方法。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 桿形
（３）酸素に対する態度 好気性
（４）運動性 有せず
（５）グルコースの酸化 陰性
（６）カタラーゼ反応 陽性
（７）オキシダーゼ反応 陰性 - ディエジア（Dietzia）属に属し、グリセリンからのＬ−グリセリン酸生産能を有する微生物であって、ディエジア・エスピー（Dietzia sp.）ＫＳＭ−ＴＢ４２７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８４８）である微生物。
- 配列番号１に示す塩基配列又は配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、下記の菌学的性質を示し、グリセリンからのＬ−グリセリン酸生産能を有するディエジア（Dietzia）属に属する微生物。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 桿形
（３）酸素に対する態度 好気性
（４）運動性 有せず
（５）グルコースの酸化 陰性
（６）カタラーゼ反応 陽性
（７）オキシダーゼ反応 陰性
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