JP5158776B2 - グリセロールからのd−グリセリン酸の製造方法 - Google Patents
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D,L-グリセリン酸のうち、光学活性体のD-グリセリン酸は、L-セリン等のアミノ酸原料として(特許文献5)、または医薬品、農薬製造の中間体として(特許文献6)、さらには樹脂等への添加剤あるいはその原料(特許文献7)として用いられる産業上有用な化学物質である。
しかしながら、化学触媒による方法(特許文献1、2、3)ではD,L-グリセリン酸のラセミ体が生成され、D-グリセリン酸を得るためには、ラセミ体を化学的手段または微生物学的手段によってラセミ分割してD-グリセリン酸を得る(特許文献8)必要がある。従って、原料のグリセロール含有溶液から、D-グリセリン酸を直接的かつ選択的に製造する方法の開発は非常に重要である。
また、エステル交換反応により副生した粗グリセロールなどの場合、一般に含有するグリセロール濃度が高いので、アルカリ性であることに加えて、できるだけ(例えば15%(v/v)以上)高濃度のグリセロール濃度でも生育でき、かつD−グリセリン酸高生産性の微生物であることは、さらに望まれる特性である。しかし、特許文献9に記載されるグルコノバクターを用いたD−グリセリン酸製造例では、培地中のグリセロール濃度はたかだか10重量%でしかなく、満足できるものではなかった。
その上、上記特許文献9によれば、D-グリセリン酸産生能を有するグルコノバクター属微生物によるD-グリセリン酸を産生するための培養条件は微酸性条件(pH4〜7)であるが、本発明で培養時のpH条件を確認した結果、むしろ初期状態の培養液pHをアルカリ条件下に設定する方がD−グリセリン酸の産生効率が高まることが判明した。アセトバクター属およびグルコンアセトバクター属は、グルコノバクター属細菌と同様、エタノールから酢酸への酸化能を有する酢酸菌であり、微生物自身の至適培養条件が中性から微酸性条件であることからみて、アルカリ条件下での高生産性は驚くべき結果であった。
なお、上記文献中のグルコノバクター属微生物の培養条件を再度検討してみると、グルコノバクター属微生物においても初発の培養液pHをアルカリ条件にするとD−グリセリン酸の産生が認められたため、本出願と同日付で、グリセロールを基質とするD−グリセリン酸産生能を有する酢酸菌を用いた、アルカリ条件下でのD−グリセリン酸製造方法については別出願を行っている。
また、従来知られていた培地中のグリセロール濃度はたかだか10%(v/v)でしかなかった(特許文献9)が、本発明の微生物(特にアセトバクター属微生物)を用いた場合では、初発培地のグリセロール濃度は、低濃度(10%(v/v)以下)よりもさらに高濃度の15%(v/v)での方がむしろ生産性が高まるという結果を得た。
さて、近年の分子生物学的手法を使った解析により、16S-23S rDNAスペーサー領域の塩基配列や、ピロロキノリンキノン(PQQ)依存性アルコール脱水素酵素サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列における、属特異的な配列の存在が知られるようになり、これらを利用した酢酸菌各属の同定方法が開発されている(例えば非特許文献1、2)。
例えば、国立遺伝学研究所DDBJのデータベースより取得したアセトバクタートロピカリス(Acetobacter tropicalis)とグルコノバクターセリナス(Gluconobacter cerinus)の16S rRNA遺伝子(それぞれのアクセッション番号は、AB032354およびAB178401)の配列1409 bpを比較してみるとその相同性は94.7%であり、一般に保存性の高いrRNA配列の相同性としては非常に低い。また、グルコンアセトバクターハンセニ(Gluconacetobacter hansenii)とグルコノバクターセリナス(Gluconobacter cerinus)の16S rRNA遺伝子(それぞれのアクセッション番号は、X75620およびAB178401)の配列1409 bpを比較した結果も94.2%の相同性であり同様に非常に低い。これらの事実は、アセトバクター属およびグルコンアセトバクター属の微生物は、グルコノバクター属とは同じ酢酸菌と呼ばれ、エタノールから酢酸の生成能という機能的には類似した微生物ではあるが、分子系統解析によれば、進化の分岐した時期はかなり早い時期にさかのぼれるものであり、分類上もかなりの距離がある微生物群である。
〔1〕 グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D-グリセリン酸生産能を有するアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属に属する微生物を、グリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、D-グリセリン酸の製造方法。
〔2〕 グリセロール含有培地の初発グリセロール濃度が15%(v/v)以上であることを特徴とする、前記〔1〕に記載のD-グリセリン酸の製造方法。
〔3〕 グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D-グリセリン酸生産能を有するアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属に属する微生物を培養し、得られた微生物菌体またはその処理物を、グリセロール含有溶液に対して反応させる工程を含むことを特徴とする、D-グリセリン酸の製造方法。
〔4〕 微生物の培養工程は微酸性から中性条件下で行い、グリセロール含有溶液との反応工程はアルカリ性条件下で行う、前記〔3〕に記載のD-グリセリン酸の製造方法。
さらに、本発明に用いる微生物には、グリセロールからD-グリセリン酸を生産することができる限り、上記微生物の同じ属に属する程度の変異株であれば包含される。これは、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって塩基の付加、欠失、置換等を人工的に誘発したものであってもよい。
培地のグリセロール以外の基本的組成は、当該技術分野に知られるものを任意に選択することができる。窒素源としては、酵母抽出液(酵母エキス、例えばDIFCO社製BactoTM Yeast Extractなど)、ポリペプトン、ペプトン、コーンスティープリカー等が利用でき、特に、酵母抽出液、ポリペプトンが好ましい。その際の酵母抽出液濃度は10〜25g/l、特に20±5 g/lが最適である。その他、必要に応じて、例えば Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、FeCl3・6H2O 等の無機塩類を添加する。また、使用菌株の増殖を促進し、グリセロールからD-グリセリン酸への変換を促進するような有機物および無機物を適宜添加することもできる。
また、微生物菌体またはその処理物とグリセロールを作用させることによりD-グリセリン酸を生成させる場合にも、微生物の培養には前述の培地組成および培養条件を用いることができるが、その場合にはアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属微生物の至適培養pHであるpH5.4からpH6.3で培養することが好ましい。
本発明の微生物菌体としては、例えば菌体そのもの、または菌体を含有した培養液等が挙げられる。一方、菌体処理物としては、例えば超音波処理、凍結乾燥処理、乾燥処理、機械的破砕処理、界面活性剤処理、酵素処理した菌体等が挙げられる。これら反応により、水溶液中にD-グリセリン酸が生成する。
なお下記実施例におけるグリセロールおよびD-グリセリン酸の定量は糖と有機酸を同時に分析するカラム(Shodex社製 SH1011)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて行った。
各種微生物保存機関より入手したアセトバクター属に属する微生物菌株、およびグルコンアセトバクター属に属する微生物菌株を、グルコース0.5%、酵母エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、MgSO4・7H2O 0.5%の組成を有する前培養培地(5 ml/試験管)に植菌し、30℃で48時間往復振とう培養を行った。次いで、表1に示す組成で初発グリセロール濃度が10%(v/v)もしくは5%(v/v)の培地30 mL(pH 7)が入った300 mL容三角フラスコに上記培養液を1.5 mLずつ植菌した。培養は、温度30℃、振とう200rpmで行った。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株およびグルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表3に示す組成の、高濃度グリセロール含有培地を用いてpH7に調整し、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD-グリセリン酸量を定量したところ、下記の表4の通りであった。この結果より、アセトバクタートロピカリス NBRC16470株の場合は、より高濃度のグリセロール存在下で、D-グリセリン酸産生量が向上することが明らかとなった。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表5に示す組成のうち、窒素源(0.5 g/l)としてポリペプトン(日本製薬製)、ぺプトン(DIFCO社製BactoTM Pepton)、酵母エキス(DIFCO社製BactoTM Yeast Extract)、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムをそれぞれ0.5 g/l入れた培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表6の通りであり、窒素源としては、特に酵母抽出液、ポリペプトンが優れていることがわかった。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表7に示す組成のうち、酵母エキス濃度を5〜40 g/lとした培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表8の通りであり、酵母抽出液濃度は10〜25g/l、特に20±5 g/lが好ましいことがわかった。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、およびグルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表9に示す組成の培地をpH7〜9に調整した培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表10の通りであった。このようにいずれの菌株も、培地の初発pHをpH8,9といったアルカリ側に調整しても、15%(v/v)という高濃度グリセロール含有培地であるにもかかわらず、D−グリセリン酸能を有しており、特にアセトバクタートロピカリス NBRC16470株は、アルカリ側でD−グリセリン酸の生産量は増加した。また反応液を遠心分離後、強陰イオン交換樹脂、ダウエックス1-X8 (Cl型)(ダウケミカル社製)を用いてD−グリセリン酸を溶出後、光学分割用カラム、キラルパックMA(+)(ダイセル化学工業製)を用いてHPLC分析した。その結果、D−グリセリン酸標品(シグマ社)とピークの保持時間が完全に一致した。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行った。次いで、表8に示す組成の培地(ただし酵母抽出液濃度は20g/L,pH8.2)500 mlが入った1 L容ミニジャーに上記培養液を25mlずつ植菌した。培養は、温度30℃、通気量0.8 vvm、攪拌500 rpmで行った。生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の図1の通りであり、4日間の反応で25.1 g/lであった。このように、初発pHをアルカリ性に調整しても、24時間以上培養を続けると通常培地のpHは徐々に中性から微酸性に変化する傾向があることがわかった。
Claims (4)
- グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D-グリセリン酸生産能を有するアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属に属する微生物を、グリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、D-グリセリン酸の製造方法。
- グリセロール含有培地の初発グリセロール濃度が15%(v/v)以上であることを特徴とする、請求項1に記載のD-グリセリン酸の製造方法。
- グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D-グリセリン酸生産能を有するアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属に属する微生物を培養し、得られた微生物菌体またはその処理物を、グリセロール含有溶液に対して反応させる工程を含むことを特徴とする、D-グリセリン酸の製造方法。
- 微生物の培養工程は微酸性から中性条件下で行い、グリセロール含有溶液との反応工程はアルカリ性条件下で行うことを特徴とする、請求項3に記載のD-グリセリン酸の製造方法。
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