JP5158775B2 - グリセロールからのd−グリセリン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
D,L−グリセリン酸のうち、光学活性体のD−グリセリン酸は、L-セリン等のアミノ酸原料として(特許文献5)、または医薬品、農薬製造の中間体として(特許文献6)、さらには樹脂等への添加剤あるいはその原料(特許文献7)として用いられる産業上有用な化学物質である。
しかしながら、化学触媒による方法(特許文献1、2、3)ではD,L−グリセリン酸のラセミ体が生成し、D−グリセリン酸を得るためには、ラセミ体を化学的手段または微生物学的手段によってラセミ分割してD−グリセリン酸を得る(特許文献8)必要がある。従って、原料のグリセロール含有溶液から、D−グリセリン酸を直接的かつ選択的に製造する方法の開発は非常に重要である。
バイオディーゼル燃料(BDF)製造等におけるエステル交換反応は、ほとんどがアルカリ触媒法により行われるため、副生する廃グリセロール溶液(粗グリセロール)は、その製造プロセスにもよるが、一般的にpH8〜11程度のアルカリ性である。従って粗グリセロールを有効活用するという観点からみて、粗グリセロールから中和工程なしにD−グリセリン酸を直接生産できることが望まれる。すなわち、初発のグリセロール含有溶液のpHがアルカリ条件(pH8〜11)のままでD−グリセリン酸が生産可能なシステムの構築が必要となる。しかしながら、これまで、アルカリ条件下で、グリセロールをD−グリセリン酸に変換できる微生物の報告はない。
また、エステル交換反応により副生した粗グリセロールなどの場合、一般に含まれるグリセロールの濃度が高いので、アルカリ性であることに加えて、できるだけ高濃度(例えば15%(v/v)以上)のグリセロール濃度でも生育でき、かつD−グリセリン酸高生産性の微生物であることは、さらに望まれる特性である。しかし、特許文献9に記載される中性から微酸性下でのD−グリセリン酸製造例では、培地中のグリセロール濃度はたかだか10%(v/v)でしかなく、満足できるものではなかった。
〔1〕 グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌を、アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、D−グリセリン酸の製造方法。
〔2〕 前記酢酸菌が、グルコノバクター(Gluconobacter)属、アセトバクター(Acetobacter)属、又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の細菌から選ばれることを特徴とする、前記〔1〕に記載の製造方法。
〔3〕 前記グリセロール含有培地の初発pHがpH8〜9であることを特徴とする、前記〔1〕又は〔2〕に記載の製造方法。
〔4〕 前記グリセロール含有培地が、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液(粗グリセロール)であることを特徴とする、前記〔3〕に記載の製造方法。
典型的には、アセトバクター属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属に属し、グリセロールをD−グリセリン酸へと変換する能力を有している微生物を用いることができる。具体的な細菌の例としては、アセトバクターアセティ(Acetobacter aceti)NBRC14818株、アセトバクターシビノンジェンシス(Acetobacter cibinongensis)NBRC16605株、アセトバクターエスチュネンシス(Acetobacter estunensis)NBRC13751株、アセトバクターインドネシエンシス(Acetobacter indonesiensis)NBRC16471株、アセトバクターラバニエンシス(Acetobacter lovaniensis)NBRC13753株、アセトバクターオリエンタリス(Acetobacter orientalis)NBRC16606株、アセトバクターパスツリアヌス(Acetobacter pasteurianus)NBRC3188株、アセトバクターペルオキシダンス(Acetobacter peroxydans)NBRC13755株、アセトバクターシジギ(Acetobacter syzygii)NBRC16604株、アセトバクタートロピカリス(Acetobacter tropicalis)NBRC16470株、アセトバクター属細菌(Acetobacter sp.)NBRC3283株等が挙げられる。また、具体的なグルコンアセトバクター属細菌の例としては、グルコンアセトバクターユーロパス(Gluconacetobacter europaeus)NBRC3261株、グルコンアセトバクターハンセニ(Gluconacetobacter hansenii)NBRC14820株、グルコンアセトバクターリクファシエンス(Gluconacetobacter liquefaciens)NBRC12388株、グルコンアセトバクターオボディエンス(Gluconacetobacter oboediens)NBRC14822株、グルコンアセトバクターキシリナス(Gluconacetobacter xylinus)NBRC15273株、グルコンアセトバクター属細菌(Gluconacetobacter sp.)NBRC14815株等が挙げられる。一方、具体的なグルコノバクター属細菌の例としては、グルコノバクターセリナス(Gluconobacter cerinus)NBRC3262株、グルコノバクターサブオキシダンス(Gluconobacter suboxydans)NBRC3172株、グルコノバクターメラノジーナス(Gluconobacter melanogenus)NBRC3292株等が挙げられる。
さらに、本発明に用いる微生物には、グリセロールからD−グリセリン酸を生産することができる限り、上記微生物の同じ属に属する程度の変異株であれば包含される。これは、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって塩基の付加、欠失、置換等を人工的に誘発したものであってもよい。
本発明で、「アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する」というとき、初発pHがアルカリ性(pH7<)であることを指す。図1にも示されるように、酢酸菌は培地中のグリセロールを利用してD−グリセリン酸を産生するため、培養中にpHは徐々に下がる傾向にある。本発明においては、用いる培地のpHをアルカリ性に調整してから、本発明の酢酸菌を培養する。初発pHはpH7よりも高ければよく、好ましくはpH8〜pH11、より好ましくはpH8〜pH9である。
培地のグリセロール以外の基本的組成は、当該技術分野に知られるものを任意に選択することができる。窒素源としては、酵母抽出液(例えばDIFCO社製BactoTM Yeast Extractなど)、ポリペプトン、ペプトン、コーンスティープリカー等が利用でき、特に、酵母抽出液、ポリペプトンが好ましい。その際の酵母抽出液濃度は10〜25g/l、特に20±5 g/lが最適である。その他、必要に応じて、例えば Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、FeCl3・6H2O 等の無機塩類を添加する。また、使用菌株の増殖を促進し、グリセロールからD−グリセリン酸への変換を促進するような有機物および無機物を適宜添加することもできる。
培養条件は特に制限はないが、例えば25〜35℃、好ましくは30℃の温度で、好気条件のもと、振とう培養することができる。
このような培養条件の下、使用菌株を1〜7日間培養すると、培地中にD−グリセリン酸が生成される。
なお下記実施例におけるグリセロールおよびD−グリセリン酸の定量は糖と有機酸を同時に分析するカラム(Shodex社製 SH1011)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて行った。
各種微生物保存機関より入手した酢酸菌、アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株をグルコース0.5%、酵母抽出液0.5%、ポリペプトン0.5%、MgSO4・7H2O 0.5%の組成を有する前培養培地(5 ml/試験管)に植菌し、30℃で48時間往復振とう培養を行った。次いで、表1に示す組成で初発グリセロール濃度が10%(v/v)の培地30 mLが入った300 mL容三角フラスコに上記培養液を1.5 mLずつ植菌した。培養は、温度30℃、振とう200 rpmで行った。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで、表1に示す組成で初発グリセロール濃度が10、15、20%(v/v)の培地30 mLの入った300 mL容三角フラスコに上記培養液を1.5 mLずつ植菌し、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表3の通りであった。
上記検討した初発グリセロール濃度のうち、D−グリセリン酸生産量が最も高かった15%(v/v)を実施例3以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表4に示す組成のうち、窒素源(0.5 g/l)としてポリペプトン(日本製薬製)、ぺプトン(DIFCO社製BactoTM Pepton)、酵母エキス(DIFCO社製BactoTM Yeast Extract)、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムをそれぞれ0.5 g/l入れた培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表5の通りであった。
上記検討した窒素源のうち、D−グリセリン酸生産量が最も高かった酵母エキス(DIFCO社製BactoTM Yeast Extract)を実施例4以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表6に示す組成のうち、酵母エキス濃度を5〜40 g/lとした培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表7の通りであった。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株について実施例1と同じ前培養を行い、次いで表8に示す組成の培地をpH7〜9に調整した培地を用いて、実施例1と同様に本培養を行った。本培養開始4日後に生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表9の通りであった。このようにいずれの菌株も、培地の初発pHをpH8,9といったアルカリ側に調整しても、15%(v/v)という高濃度グリセロール含有培地であるにもかかわらず、D−グリセリン酸能を有しており、特にアセトバクタートロピカリス
NBRC16470株およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株では、中性よりもアルカリ性側でD−グリセリン酸の生産量は増加している。また反応液を遠心分離後、強陰イオン交換樹脂、ダウエックス1-X8 (Cl型)(ダウケミカル社製)を用いてD−グリセリン酸を溶出後、光学分割用カラム、キラルパックMA(+)(ダイセル化学工業製)を用いてHPLC分析した。その結果、D−グリセリン酸標品(シグマ社)とピークの保持時間が完全に一致した。
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例1と同じ前培養を行った。次いで、表6に示す組成の培地(ただし、酵母抽出液濃度は20 g/l、pH8.2)500 mlが入った1 L容ミニジャーに上記培養液を25mlずつ植菌した。培養は、温度30℃、通気量0.8 vvm、攪拌500 rpmで行った。生成したD−グリセリン酸量を定量したところ、下記の図1の通りであり、4日間の反応で25.1 g/lであった。このように、初発pHをアルカリ性に調整しても、24時間以上培養を続けると通常培地のpHは徐々に中性から微酸性に変化する傾向があることがわかった。
Claims (2)
- グリセロールを基質とするD−グリセリン酸の製造方法であって、D−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌であって、グルコノバクター(Gluconobacter)属、アセトバクター(Acetobacter)属、又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の細菌から選ばれた酢酸菌を、初発pHがpH8〜9であるグリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、D−グリセリン酸の製造方法。
- 前記グリセロール含有培地が、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液であることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
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