CN112094767A - 一株海洋沉积物来源的木质素降解菌及其在降解木质素中的应用 - Google Patents

一株海洋沉积物来源的木质素降解菌及其在降解木质素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株海洋沉积物来源的木质素降解菌及其在降解木质素中的应用，其特征在于：该株海洋沉积物来源的木质素降解菌为太平洋鼠尾菌DBX666，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19599，保藏日期为2020年04月22日；所述的太平洋鼠尾菌DBX666的序列如SEQ ID NO.1所示，与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供的菌株DBX666能够在成本较低的培养基中良好生长，且具有较强的木质素降解能力，具有较强的应用价值，实现了海洋微生物资源最大利用化。

Description

一株海洋沉积物来源的木质素降解菌及其在降解木质素中的 应用
技术领域
本发明属于应用微生物技术领域，尤其是涉及一种适合海洋沉积物来源的几丁质高效 降解菌及其应用。
背景技术
木质素是自然界中含量丰富的三大生物质之一，其作为有机物质的仅次于纤维素的可 持续储存库可用于替代石油基燃料和化学品。同时，木质素不但是木材水解工业和造纸工 业的副产物，也是秸秆以及城市生活垃圾中一种较难降解的物质，可造成严重的环境污染。 木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合 物，其分子量大、结构稳定，难以降解，是生物质能源利用的关键瓶颈之一。尽管针对木 质素的降解方法已经有了几十年的研究，但是仍然存在许多的问题，如化学法存在环境污 染问题，而物理法所面对的高能耗的挑战，生物法虽然绿色环保但是效率较低。
木质素在自然界中的完全降解是真菌、细菌及相关微生物群落共同作用的结果，其中 真菌降解木质素的研究最为广泛和深入，但是到目前为止仍未开发出具有商业价值的生物 利用木质素工业途径，以真菌为主要模式菌株开展的木质素生物降解研究长期未能突破。 由于广泛的生长条件和良好的环境适应能力，细菌在木质素降解方面深受研究人员的关 注，成为国际上的研究热点之一。海洋沉积物是地球上最大的有机碳库，以木质素、纤维 素、半纤维素为主的结构性聚合物是陆源有机质的重要组成成分，约占海洋埋藏有机质的 三分之一，因此，木质素的微生物降解被认为是全球碳循环的重要过程之一。以此推测， 富含木质素的海洋沉积物环境必然富含木质素降解菌，然而，目前来源于海洋沉积物环境 的木质素降解菌的研究报道较少。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海洋沉积物物来 源的木质素降解菌。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种上述海洋沉积物 物来源的木质素降解菌的应用。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该株海洋沉积物来源的木质素 降解菌，其特征在于：该海洋沉积物物来源的木质素降解菌为太平洋鼠尾菌DBX666，并 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19599，保藏日期为2020年04月22日；所述的水莱茵海默氏菌SX46的序列如SEQ ID NO.1 所示。
本发明提供一种富集上述的海洋沉积物来源的木质素降解菌的富集方法，其特征在 于：通过采用富集培养基进行海洋沉积物来源太平洋鼠尾菌的富集，所述富集培养基中的 氮源为(NH4)2SO4、KNO3和酵母提取物，碳源为脱碱性木质素。
本发明提供一种筛选如上述的海洋沉积物来源太平洋鼠尾菌的筛选方法，其特征在 于：通过采用筛选培养基进行海洋沉积物来源的木质素降解菌的筛选，所述筛选培养基是 在海生菌肉汤2216培养基的基础上加入苯胺蓝制备而成，所述筛选培养基包括有海生菌 肉汤2216粉末37.4g，苯胺蓝0.2g，琼脂15g。
本发明提供一种应用如上述的海洋沉积物物来源的木质素降解菌在生产木质素降解 酶中的应用，其特征在于：所述木质素降解酶包括木质素过氧化物酶、锰氧化物酶和漆酶。
进一步地，所述海洋沉积物物来源的木质素降解菌在生产木质素降解酶的过程中将所 述鼠尾菌DBX666接种至以脱碱木质素为唯一碳源的产酶培养基中，所述产酶培养基是以 碱性木质素为唯一碳源，其含量为1～5g/L，所述产酶培养基配方包括：K2HPO4，0.1g；KH2PO4，0.4g；(NH4)2SO4，0.7125g；KNO3，0.63125g；酵母提取物，0.1g；脱碱木 质素，1～5g，调节培养基的pH为7.0。
本发明还提供一种应用如上述的海洋沉积物物来源的木质素降解菌在降解木质素中 的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明采用富集法对木质素降解菌进行复 壮与驯化，增加了木质素降解细菌的分离效率，并且，本发明所采用的富集培养基与已报 道的木质素降解菌分离培养基明显不同，本专利的培养基含有较低浓度的酵母提取物，这 保证了木质素降解菌前期生长所需的营养物质供应，当酵母提取物被利用完毕时，木质素 降解菌继而可以利用木质素为碳源进行生长，而不能利用木质素的菌株则因为缺乏碳源不 能生长而被淘汰，本发明提供的菌株DBX666能够在成本较低的培养基中良好生长，且具 有较强的木质素降解能力，具有较强的应用价值，实现了海洋微生物资源最大利用化。
保藏说明
1、海洋沉积物物来源太平洋鼠尾菌为DBX666，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年04月22日，保藏号为CGMCC No.19599，分类命名鼠尾菌Muricaudasp。
附图说明
图1为本发明实施例1中菌株DBX666在鉴别培养基上产生透明圈的结果图；
图2为本发明实施例3中菌株DBX666的生长曲线和COD降解曲线表；
图3为本发明实施例3中不同培养时间菌株DBX666产酶曲线。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1木质素降解菌DBX666的获取
(1)木质素降解菌的富集培养
取5g沉积物加入到装有100mL富集培养基的锥形瓶中，8℃，150转/min培养15天，即获得第1代富集培养物；将第1代的富集培养物按1％接种量接种至装有新鲜富集培养 基的锥形瓶中，8℃，150转/min培养14天，即获得2代富集培养物；将第2代的富集培 养物按1％接种量接种至装有富集培养基的锥形瓶中，8℃，150转/min培养14天，即获得 第3代富集培养物，所述的的沉积物来源于东太平洋某站位沉积物样品，所述的富集培养 基配方为(g/L)：K2HPO4，0.1g；KH2PO4，0.4g；(NH4)2SO4，0.7125g；KNO3，0.63125g； 酵母提取物，0.1g；脱碱木质素，1g。调节培养基的pH为7.0。
(2)木质素降解菌的筛选与纯化
用富集培养基将第3代富集培养物进行系列梯度稀释后，涂布于固体鉴别培养基上， 至于20℃培养箱中培养。根据脱色圈大小及菌落形态差异挑取菌落划线纯化2-3代，获得 具有木质素降解功能的纯菌株DBX666，所述的固体鉴别培养基配方为(g/L)：海生菌肉汤 2216粉末37.4g，苯胺蓝0.2g，琼脂15g。如图1所示，菌株DBX666在鉴别培养基上能 够形成明显的透明圈。
实施例2木质素降解菌DBX666菌株的分子鉴定及命名保藏
(1)菌株分子鉴定
采用常规的分子克隆方法进行菌株DBX666 16S rDNA基因扩增与测定，操作步骤如 下：①DNA模版制备：用接种环挑取单菌落至含有100μl无菌水的0.2mL PCR管中，98℃煮沸15min，获得PCR扩增用DNA模版。②PCR扩增：菌株的16S rDNA扩增体系(50ul) 包括高保真Taq酶0.5μl，10×Buffer 5μl，dNTP 4μl，上游引物(1492R)1μl，下游引物(27F) 1μl，DNA模板1μl，去离子水37.5μl；PCP反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃终延伸5min。③琼脂糖凝胶电 泳检测：取5μl扩增产物液进行琼脂糖凝胶(1％浓度)电泳检测。④PCR产物纯化：利用 DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化(具体操作按相关产品说明书进行)。⑤连接反 应：连接体系(10μl)包括PCR纯化产物4μl，pMD18-T 1ul，solutin I 5μl，16℃连接3-4 h。⑥转化：将感受态细胞(50μl)置于冰上融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴15min， 42℃水浴中热击45s，快速将转化体系转移到冰浴中放置2min；向转化体系中加入500μl 无菌LB培养基，混匀，37℃，200转/min震荡培养1h；吸取200μl培养菌液至含有氨苄 青霉素的LB平板上，涂布均匀后，将平板放置于37℃培养箱中，倒置培养过夜。⑦鉴定 与测序：挑取LB平板上的克隆子，采用PCR法进行鉴定。随机选取3个PCR鉴定阳性 的转化子送测序公司测序。测序结果提交EzTaxon网站，确定菌株的分类地位。
(2)菌株DBX666的16S rDNA序列及菌株保藏信息
所述菌株DBX666的16S rDNA基因序列如序列表所示，基因全长为1448bp。EzTaxon网站同源性分析显示，该菌与Muricauda aquimarina(海水鼠尾菌)的同源性最高(98.48％)， 为潜在新种。
实施例3：菌株DBX666在木质素降解中的应用
(1)菌株DBX666木质素降解效率的测定
将菌株DBX666接种于产酶培养基培养至对数生长期(OD600＝0.6-0.8)，所述产酶培养 基是以碱性木质素为唯一碳源，其含量为1～5g/L，产酶培养基配方包括：K2HPO4，0.1g； KH2PO4，0.4g；(NH4)2SO4，0.7125g；KNO3，0.63125g；酵母提取物，0.1g；脱碱木 质素，1～5g，调节培养基的pH为7.0。取菌液按1:100比例接种于产酶培养基培养基， 20℃、150转/min震荡培养，隔24h取菌液，测定菌株的木质素降解率。在产酶培养基中， 木质素作为唯一碳源贡献了全部COD负荷，因此采COD的去除表征木质素的降解率。COD 的测定采用国标法中铬酸盐法(GB11914-89)。
菌株DBX666对木质素降解效率如图2所示，随着培养时间的延长，溶液中的COD 含量逐渐降低，并培养后的第8天到达最低水平，此时木质素的降解率累积达80％。
(2)酶活力的测定
定时采集培养液，4℃，10000g转速离心5分钟，收集上清即为粗酶液，用于酶活力的测定。
①菌株DBX666产木质素酶特定的测定
分别在培养的第1～8天每隔24小时采集一次样品，制备粗酶液。以不接种菌种的富 集培培养基为空白对照；每个样品设3个重复。
酶活定义：每分钟催化1μmol底物形成产物所需酶量定义为1个酶活单位(U)，用U/L 表示。
②木质素过氧化物酶(LiP)活性的测定
采用藜芦醇法进行Lip活性的测定，具体测定方法为：取2mM VA 30μL、50mM酒石酸钠缓冲液(pH＝2.5)139μL、粗酶液30μL于酶标板中混匀，继而加入0.4mM H2O2 1μL启 动反应，设置30℃反应条件，使用酶标仪记录反应液在1min内OD310nm值。
③锰过氧化物酶(MnP)活性的测定
采用二价锰氧化法测定MnP活性，具体测定方法为：取1mM MnSO4 30μL、50mM 丙二酸钠缓冲液(pH＝4.5)的139μL，粗酶液30μL于酶标板中混匀，继而加入0.4mM H2O2 1μL启动反应，设置30℃反应条件，使用酶标仪记录反应液在1min内的OD270nm值。
④漆酶(Lac)活性的测定
采用ABTS法测定Lac活性，具体测定方法为：取1mM ABTS 30μL、100mM醋酸 钠缓冲液(pH＝5)的140μL，粗酶液30μL于酶标板中混匀，设置30℃反应条件，使用酶标 仪记录反应液在1min内的OD420nm值。
菌株DBX666在富集培养基中培养10天内产生的Lip、MnP和Lac 3种木质素降解酶的活性值变化规律如图3所示。从图中可以看出，该菌在各阶段产3种酶的活性高低顺序 为LiP>MnP>Lac。该菌株的Lip活性第4天达到峰值(247.6U/L)，第5天开始急剧下降； 该菌株的MnP酶活性在第5天达到峰点(150.5/L)；该菌的Lac活在第3天达到峰点 (20.8U/L)。由此推断，该菌株对木质素的降解是由3种酶协同完成，但LiP和MnP在木 质素降解过程发挥了主要作用。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 一株海洋沉积物来源的木质素降解菌及其在降解木质素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> DBX666
<400> 1
gatgaacgct agcggcaggc ctaacacatg caagtcgagg ggcagcggga aaaagcttac 60
tttttcgccg gcgaccggcg cacgggtgcg gaacgcgtat ggaacctgcc cctgtcaggg 120
gaatagccca gggaaacttg gattaatgcc ccatggtatc gttatatcgc atgatattac 180
gattaaagat ttatcggaca gggatggcca tgcgtaccat tagttagttg gtgaggtaac 240
ggcttaccaa ggcagcgatg gttaggggcc ctgagagggg gatcccccac actggtactg 300
agacacggac cagactccta cgggaggcag cagtgaggaa tattggacaa tgggcgggag 360
cctgatccag ccatgccgcg tgcaggatga cggccctatg ggttgtaaac tgcttttata 420
cgggaagaaa tgcgcccacg tgtgggcgtc tgacggtacc gtaagaataa ggaccggcta 480
actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtccgagc gttatccgga atcattgggt 540
ttaaagggtc cgtaggcggg cctgtaagtc aggggtgaaa gtttgtggct caaccataaa 600
attgcctttg atactgcagg tcttgagtca tggtggggtc gccggaacat gtggtgtagc 660
ggtgaaatgc atagatatca catagaacac cgatcgcgaa ggcaggtggc caaccatgta 720
ctgacgctga tggacgaaag cgtgggtagc gaacgggatt agataccccg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tggatactag ctgtggggac ttcggtctcc gtggccaagc gaaagtgata 840
agtatcccac ctggggagta cgttcgcaag aatgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt accagggctt 960
aaatgcaggc tgcatggggt ggagacaccc ctttcttcgg accgcctgca aggtgctgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt caggttaagt cctataacga gcgcaacccc 1080
taccgttagt tgccagcatg tcaagatggg gactctaacg ggactgccgg tgcaaaccgt 1140
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cacagttcgg atcggggtct gcaactcgac cccgtgaagc tggaatcgct agtaatcgga 1320
tatcagccat gatccggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagccat 1380
ggaagccggg agtgcctgaa gtccgtcacc gcaaggagcg gcctagggca aaatcggtaa 1440
ctagggct 1448

Claims (7)

1.一株海洋沉积物来源的木质素降解菌，其特征在于：该株海洋沉积物来源的木质素降解菌为太平洋鼠尾菌DBX666，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.19599，保藏日期为2020年04月22日；所述的太平洋鼠尾菌DBX666的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种富集如利要求1所述的海洋沉积物来源的木质素降解菌的富集方法，其特征在于：通过采用富集培养基进行海洋沉积物来源的木质素降解菌的富集，所述富集培养基中的氮源为(NH4)2SO4、KNO3和酵母提取物，碳源为脱碱性木质素。
3.根据权利要求2所述的富集海洋沉积物来源的木质素降解菌的富集方法，其特征在于：所述富集培养基配方包括有：K2HPO4，0.1g；KH2PO4，0.4g；(NH4)2SO4，0.7125g；KNO3，0.63125g；酵母提取物，0.1g；脱碱木质素，1g，调节培养基的pH为7.0。
4.一种筛选如利要求1所述的海洋沉积物来源的木质素降解菌的筛选方法，其特征在于：通过采用筛选培养基进行海洋沉积物来源太平洋鼠尾菌的筛选，所述筛选培养基是在海生菌肉汤2216培养基的基础上加入苯胺蓝制备而成，所述筛选培养基包括有海生菌肉汤2216粉末37.4g，苯胺蓝0.2g，琼脂15g。
5.一种应用如权利要求1所述的海洋沉积物来源的木质素降解菌在生产木质素降解酶中的应用，其特征在于：所述木质素降解酶包括木质素过氧化物酶、锰氧化物酶和漆酶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述海洋沉积物物来源的木质素降解菌在生产木质素降解酶的过程中将所述鼠尾菌DBX666接种至以脱碱木质素为唯一碳源的产酶培养基中，所述产酶培养基是以碱性木质素为唯一碳源，其含量为1～5g/L，所述产酶培养基配方包括：K2HPO4，0.1g；KH2PO4，0.4g；(NH4)2SO4，0.7125g；KNO3，0.63125g；酵母提取物，0.1g；脱碱木质素，1～5g，调节培养基的pH为7.0。
7.一种应用如权利要求1所述的海洋沉积物物来源的木质素降解菌在降解木质素中的应用。
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