CN114717153B - 嗜温鞘氨醇杆菌在降解羽毛粉产生生物表面活性剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了嗜温鞘氨醇杆菌在降解羽毛粉产生生物表面活性剂的应用，属于微生物技术领域。本发明嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)9H，保藏号为CCTCC NO:M 2022114。本发明的Sphingobacterium thalpophilum 9H菌株降解羽毛粉条件温和，所产角蛋白酶活性高，并且可直接将羽毛粉转化为具有降低表面张力的生物表面活性物质。将筛选得到的嗜温鞘氨醇杆菌9H利用废弃羽毛粉产生角蛋白酶和生物表面活性剂，不仅缓解了环境污染的压力，而且降低了生物表面活性剂的生产成本，使其用于清洗剂行业成为可能。

Description

嗜温鞘氨醇杆菌在降解羽毛粉产生生物表面活性剂的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及嗜温鞘氨醇杆菌在降解羽毛粉产生生物表面活性剂的应用。
背景技术
我国禽类养殖规模巨大，羽毛占家禽体重的5-10％左右，每年能够产生数百万吨的羽毛废弃物，除了一部分用作填充物、装饰品、饲料等，其余绝大部分被直接焚烧或丢弃，造成环境污染和疾病传播的同时也造成了极大的资源浪费。角蛋白是构成禽类羽毛的主要成分，由于二硫键、氢键和层间范德华力的作用，使羽毛具有很强的机械稳定性，不溶于水、稀酸、稀碱,并能抵抗大多数蛋白酶水解。因此，寻找一种合适的方法将羽毛废弃物转变化可以应用的成分，不仅具有经济效益，而且具有巨大的社会效益和环境效益。微生物法降解羽毛，具有条件温和，能耗低，污染小，效率高等优点，并且能够将羽毛中的角蛋白转化成可以被生物利用、环境无害的产物，真正达到了有机废弃物的减量增值效果。微生物处理法主要是利用细菌、真菌和放线菌等微生物对羽毛进行降解。地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、短芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、耐盐芽胞杆菌等是目前较多被报道的羽毛降解细菌，降解羽毛的真菌主要是假丝酵母，而放线菌的研究主要集中在链霉菌。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种羽毛降解细菌及其应用，本发明分离出一株生产直接降解羽毛的细菌菌株，并利用该菌株发酵处理羽毛废弃物，反应条件温和，需要成本低，对环境友好。
基于此，本发明的第一个目的是提供一株嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumthalpophilum)9H，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022114。
该菌菌落为淡黄色，表面湿润，边缘整齐，好氧菌，革兰氏染色呈阴性，测定菌株的16S rDNA部分序列，进行系统发育学分析。
本发明的第二个目的是提供一种制剂，包含上述的嗜温鞘氨醇杆菌9H或其活性酶或代谢物。
本发明的第三个目的是提供嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)在以下所述一项或多项中的应用：
(1)生产角蛋白酶；
(2)降解角蛋白；
(3)制备生物表面活性剂。
优选地，所述的角蛋白为羽毛角蛋白。
优选地，所述的嗜温鞘氨醇杆菌为嗜温鞘氨醇杆菌9H，其保藏编号为：CCTCC NO：M2022114。
优选地，所述的生物表面活性剂是以角蛋白为底物培养嗜温鞘氨醇杆菌获得的。
本发明的第四个目的是提供一种培养嗜温鞘氨醇杆菌的方法，将嗜温鞘氨醇杆菌接种于含羽毛或羽毛粉的培养基培养，所述的培养基成分包括：羽毛或羽毛粉，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4。
优选地，所述的羽毛粉培养基成分及其含量如下：羽毛粉10-160g·L-1，K2HPO41.4g·L-1，KH2PO40.7 g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO40.1g·L-1，pH 7.0。
优选地，所述的嗜温鞘氨醇杆菌为嗜温鞘氨醇杆菌9H，其保藏编号为：CCTCC NO：M2022114。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明嗜温鞘氨醇杆菌Sphingobacterium thalpophilum9H可以降解羽毛粉，7天降解率可达59％以上；
(2)同时本发明嗜温鞘氨醇杆菌Sphingobacterium thalpophilum9H降解羽毛粉8天后降解液的表面张力从初始的47.6±0.2mN/m降低到35.15±0.7mN/m；
(3)嗜温鞘氨醇杆菌Sphingobacterium thalpophilum是天然存在于自然界中的生物安全等级为(BSL-1)的无害菌(4级)，在生长过程中所产生的相关酶对羽毛起到有效地降解作用，同时，利用羽毛降解产物为底物，不仅将羽毛完全转化为可利用的产物，而且产生对环境无害的蛋白质和表面活性物质；
(4)本发明首次提出菌种嗜温鞘氨醇杆菌Sphingobacterium thalpophilum具有降解羽毛且同时产表面活性剂的能力；
(5)本发明还研究了嗜温鞘氨醇杆菌Sphingobacterium thalpophilum高效降解羽毛的原料，发现对经膨化处理的羽毛的降解率可达90％以上。
保藏说明
本发明的嗜温鞘氨醇杆菌9H(Sphingobacterium thalpophilum 9H)，于2022年2月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022114。
附图说明
图1为本发明Sphingobacterium thalpophilum 9H降解羽毛粉前和降解羽毛粉后的现象；
图2为本发明Sphingobacterium thalpophilum 9H在不同温度条件下的生长曲线；
图3为本发明Sphingobacterium thalpophilum 9H在不同培养基条件下对羽毛粉的降解率；
图4为本发明Sphingobacterium thalpophilum 9H对不同羽毛粉的降解率；
图5为在160g·L-1羽毛粉，初始接菌量20％和温度30℃条件下，本发明Sphingobacterium thalpophilum 9H对羽毛粉降解8天后的表面张力。
具体实施方式
以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
实施例1嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)9H的分离、鉴定和培养
1、分离
菌种来源：本菌种来源于湛江农家院富含羽毛废弃物的土壤中，具体分离方法如下：
(1)菌株的富集培养
称取10g土壤样品和1g鸭羽毛加入到100mL羽毛培养基(K2HPO41.4 g·L-1，KH2PO40.7g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO40.1g·L-1，其余为水，各成分混合灭菌制备得到)中，37℃、180r/min振荡培养7d；再取其培养液10mL转入羽毛培养基中，37℃、180r/min振荡培养7d。
(2)初筛
取1mL最终得到的筛选培养基菌液逐步稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，取适当稀释后的菌液100μL涂布于羽毛粉培养基平板上(每个梯度3个平行)，37℃培养箱倒置培养3d，筛选出生长的单菌落，划线纯化多次。
(3)摇瓶复筛
将初筛得到的菌种接种到种子培养基中37℃、180r/min振荡培养24h，之后以接种量2％转接到羽毛粉培养基(成分同步骤1)中，于37℃、180r/min振荡培养，观察对羽毛粉的降解情况。将细菌生长良好，羽毛粉大小变小，溶液变浑浊的菌作进一步分析(图1)。
2、鉴定
(1)菌落形态、生理生化鉴定：观察将菌株9H在LB平板上进行划线分离，于37℃下恒温培养48h，观察菌落的形状、颜色、表面质地、菌落边缘等并记录。菌落为淡黄色，表面湿润，边缘整齐，好氧菌，革兰氏染色呈阴性。酶法分析表明菌株9H能够产生角蛋白酶，并且可将羽毛转化为生物表面活性剂的潜力。
(2)分子生物学方法鉴定
将菌株9H进行纯培养、菌株总DNA的提取、16S rDNA的PCR扩增(引物为27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)及将扩增产物送到北京擎科生物科技有限公司广州分公司进行序列测定，将正反序列拼接获得16S rDNA基因序列长度为1424bp，如SEQ ID NO.1所示。测定结果在NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行BLAST比对，该菌株与革兰氏阴性杆菌-嗜温鞘氨醇杆菌属菌株(Sphingobacteriumthalpophilum strain S8SF4)的同源性为99％，最终将筛选到的菌株命名为Sphingobacterium thalpophilum 9H。并将Sphingobacterium thalpophilum 9H于2022年2月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022114。
(3)培养：LB固体培养基先划线活化菌种，然后挑取1环菌种到LB液体培养基中活化15h，然后分别接菌液100μL到4瓶50mL的LB培养基中，分别在25℃，30℃，35℃，40℃培养，转速180rpm，检测0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30h的OD600。菌株9H的生长曲线如图2。
实施例2不同培养基对菌株9H降解羽毛效率的影响
LB固体培养基先划线活化菌种，然后挑取1环菌种到LB液体培养基中在37℃，150rpm下活化15h，然后分别接活化好的菌株取1mL菌液到下面20mL的不同培养基(1-3号培养基)中，设置3个平行，在150rpm 37℃下培养，7天后收集培养基中的固体，清洗干净后80℃烘干称重，根据公式1计算羽毛粉的降解率。
1号培养基：羽毛粉10.0g·L-1，K2HPO41.0g·L-1，KH2PO40.4 g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，121℃灭菌20min。
2号培养基：羽毛粉10.0g·L-1，K2HPO41.4 g·L-1，KH2PO40.7 g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO40.1 g·L-1，pH 7.0，121℃灭菌20min。
3号培养基：羽毛粉10.0g，K2HPO41.5 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，NaCl 1.0g·L-1，MgSO40.2 g·L-1，pH 7.0，121℃灭菌20min。
羽毛粉降解率(％)＝(M0-Mt)/M0×100％ 公式(1)
其中，M0：羽毛粉初始的质量(g)；Mt：反应t时间时的剩余羽毛粉的质量(g)。
结果如图3所示，本发明菌株在1-3号培养基的培养下，对灭菌60min制备的羽毛粉降解效率分别为59％，63.55％，63.75％。
实施例3不同处理得到的羽毛粉对菌株9H降解羽毛效率的影响
1、不同处理得到的羽毛粉的制备过程
用清水将鸭毛清洗干净，然后121℃分别灭菌20min、40min、60min。灭菌后放入80℃的烘箱烘干，然后用搅拌机打碎备用。
膨化羽毛粉制备过程：膨化机开机预热30分钟，电机75千瓦，电流在150左右，然后将除杂质，水分在13％左右的羽毛均匀上料，加热温度400℃，开机后下降到350℃左右。出料米黄色为正常。
2、菌株9H降解不同处理得到的羽毛粉
LB固体培养基先划线活化菌种，然后挑取1环菌种到LB液体培养基中在37℃，150rpm下活化15h，然后取活化好的菌株1mL菌液到100mL含不同处理得到的羽毛粉的2号培养基(羽毛粉20.0g·L-1，K2HPO41.4 g·L-1，KH2PO40.7 g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO40.1g·L-1，pH 7.0)中，以加入未经高温灭菌或膨化的羽毛粉作为对照，设置3个平行，在150rpm、37℃下培养，7天后收集培养基中的固体，清洗干净后80℃烘干称重，计算羽毛粉的降解率，计算方法同实施例2。
结果如图4所示，本发明菌株9H对经膨化处理的羽毛的降解率可达90％以上。
实施例4菌株9H降解羽毛粉的发酵液表面张力的测定
在含160g·L-1膨化羽毛粉(制备方法同实施例3)的培养基(膨化羽毛粉160.0g·L-1，K2HPO41.4 g·L-1，KH2PO40.7 g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO40.1g·L-1，pH 7.0)，初始接菌量20％和温度30℃的条件下，测定菌株9H对羽毛粉降解初始(0d)及第8天(8d)的表面张力，以不加菌液的相同膨化羽毛粉培养基作为对照，设置3个平行。
结果如图5所示，菌株9H降解羽毛粉8天后降解液的表面张力从初始的47.6±0.2mN/m降低到35.15±0.7mN/m。无菌空白组羽毛粉溶液的初始表面张力为46.5±0.19mN/m，摇8天后的表面张力为46.2±0.14mN/m，基本不变。
本发明将利用Sphingobacterium thalpophilum 9H降解羽毛粉来制备生物表面活性剂，既可以环境友好，经济地解决由丢弃羽毛造成的环境问题，又可以满足工业上对生物表面活性剂的需求，具有重要的研究意义。
以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 广东省科学院生物与医院工程研究所
<120> 嗜温鞘氨醇杆菌在降解羽毛粉产生生物表面活性剂的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 嗜温鞘氨醇杆菌9H(Sphingobacterium thalpophilum)
<400> 1
ggagggacta tactgcagtc ggacgggatc catcgatagc ttgctatcaa tggtgagagt 60
ggcgcacggg tgcgtaacgc gtgagcaacc tgcctccatc agggggatag cctctcgaaa 120
gagagattaa caccgcataa cataatgttc cggcatcgga ggattattaa atatttatag 180
gatggagatg ggctcgcgtg acattagcta gttggtgggg taacggccca ccaaggcgac 240
gatgtctagg ggctctgaga ggagaatccc ccacactggt actgagacac ggaccagact 300
cctacgggag gcagcagtaa ggaatattgg tcaatgggcg gaagcctgaa ccagccatgc 360
cgcgtgcagg atgactgccc tatgggttgt aaactgcttt tgtccgggaa taaacctcct 420
tacgagtagg gagctgaatg taccggaaga ataaggatcg gctaactccg tgccagcagc 480
cgcggtaata cggaggatcc gagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggtgcgtagg 540
cggcccgtta agtcaggggt gaaatacggt ggctcaacca tcgcagtgcc tttgatactg 600
acgggcttga atccatatga agtgggcgga ataagacaag tagcggtgaa atgcatagat 660
atgtcttaga actccgattg cgaaggcagc tcactaagct ggtattgacg ctgatgcacg 720
aaagcgtggg gatcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgataa 780
ctcgatgttg gcgatagaca gccagcgtcc cagcgaaagc gttaagttat ccacctgggg 840
agtacgcccg caagggtgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggaggagc 900
atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg gcttgaaagt tagtggagga 960
tgcagagacg catccgtcct tcgggacacg aaactaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020
cgtgccgtga ggtgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctatgt ttagttgcca 1080
gcatgttatg gtggggactc taaacagact gcctgtgcaa acagtgagga aggtggggac 1140
gacgtcaagt catcatggcc cttacgtccg gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac 1200
agcgggcagc tagctggcaa cagcatgcta atctctaaaa gccgttcaca gttcggatcg 1260
gggtctgcaa ctcgaccccg tgaagttgga ttcgctagta atcgcgtatc agcaatgacg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca agccatgaaa gttgggggta 1380
cctaaagcat gttaccgcaa ggagcggtca ggtattccct atgg 1424

Claims (4)

1.一株嗜温鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium thalpophilum）9H，其保藏编号为：CCTCCNO: M 2022114。
2.一种制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的嗜温鞘氨醇杆菌9H。
3.权利要求1所述的嗜温鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium thalpophilum）在以下所述一项或多项中的应用：
（1）降解羽毛粉；
（2）制备生物表面活性剂。
4.一种培养嗜温鞘氨醇杆菌的方法，其特征在于，将权利要求1所述的嗜温鞘氨醇杆菌接种于含羽毛或羽毛粉的培养基培养，所述的培养基成分及其含量如下：羽毛粉10-160g·L-1，K2HPO4 1.4 g·L-1，KH2PO4 0.7 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，MgSO4 0.1g·L-1，pH 7.0。
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