CN115820462A - 温州木犀及其在降解羽毛粉制备生物表面活性剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了温州木犀及其在降解羽毛粉制备生物表面活性剂中的应用，属于微生物技术领域。本发明温州木犀(Luteimonas Wenzhouensis)DF114，保藏号为CCTCC M 20221181。本发明的温州木犀DF114菌株不仅可以降解羽毛粉，而且可直接将羽毛粉转化为具有降低表面张力的物质，具有应用潜力。将筛选得到的温州木犀DF114应用于废弃羽毛的处理制备生物表面活性剂，不仅缓解了环境污染的压力，而且降低了生物表面活性剂的生产成本，使其用于清洗剂行业成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及温州木犀及其在降解羽毛粉制备生物表面活性剂中的应用。
背景技术
随着禽类养殖业的快速发展，全球每年产生超过1000万吨以上的羽毛，除了很少部分用作填充物、装饰品、饲料等以外，其余绝大部分被直接焚烧或丢弃，不仅造成环境污染和疾病传播，同时也造成极大的资源浪费。角蛋白是构成禽类羽毛的主要成分，由于二硫键、氢键和层间范德华力的作用，使羽毛的结构具有很强的稳定性，不溶于水、稀酸、稀碱，并能抵抗绝大多数蛋白酶水解。因此，寻找一种合适的方法将羽毛废弃物转化为可应用的成分，不仅具有经济效益，而且具有巨大的社会效益和环境效益。微生物法降解羽毛具有条件温和，能耗低，污染小，效率高等优点，并且能够将羽毛中的角蛋白转化成可以被生物利用、环境友好的产物，真正达到了废弃物增值利用的目的。微生物处理法主要是利用细菌、真菌和放线菌等微生物对羽毛进行降解。地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、短芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、耐盐芽胞杆菌等是目前较多被报道的羽毛降解细菌，降解羽毛的真菌主要是假丝酵母，而放线菌的研究主要集中在链霉菌属。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种羽毛降解细菌及其应用，本发明分离出一株直接降解羽毛的细菌菌株，并利用该菌株发酵处理羽毛废弃物，获得表面活性物质，反应条件温和，处理成本低，对环境友好。
基于此，本发明的第一个目的是提供一株温州木犀(Luteimonas wenzhouensis)DF114，于2022年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC M 20221181。该菌菌落为棕色，表面湿润，革兰氏染色呈阴性，好氧，不动，杆状细菌，生物安全等级为1级。
本发明的第二个目的是提供一种制剂，包含上述的温州木犀DF114或其发酵液。
本发明的第三个目的是提供温州木犀DF114在以下所述一项或多项中的应用：
(1)降解羽毛；
(2)制备生物表面活性剂；
(3)制备角蛋白酶。
优选地，所述的角蛋白酶为羽毛角蛋白酶。
优选地，所述的羽毛可以是鸭毛、鸡毛或鹅毛，更进一步可以说是废弃的鸭毛、鸡毛或鹅毛。
优选地，所述的生物表面活性剂是羽毛为底物用温州木犀DF114发酵培养获得的。
本发明的第四个目的是提供一种降解羽毛的方法，将温州木犀DF114接种于含羽毛或羽毛粉的培养基中培养。
优选，所述的培养基成分包括：羽毛或羽毛粉，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4。
优选地，所述的培养基成分及其含量如下：羽毛粉10-160g·L-1，K2HPO4 1.4g·L-1，KH2PO4 0.7g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO4 0.1g·L-1，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明温州木犀DF114可以降解羽毛粉，在羽毛粉80.0g L-1的条件下，对膨化羽毛粉降解率可达78.34％以上；
(2)同时本发明温州木犀DF114在初始pH 7.46，pH 7.97降解羽毛粉26天后降解液的表面张力从初始的43.95±0.25mN/m，43.71±0.78mN/m分别降低到31.95±1.58mN/m，25.34±1.87mN/m；无菌空白初始pH 7.46，pH 7.97降解羽毛粉26天后降解液的表面张力从初始的43.97±0.15mN/m，43.81±0.34mN/m分别降低到42.97±0.58mN/m，42.74±0.58mN/m。
(3)温州木犀DF114是天然存在于自然界中的生物安全等级为(BSL-1)的无害菌(4级)，在生长过程中所产生的相关酶对羽毛起到有效降解作用，同时，利用羽毛降解产物为底物，不仅将羽毛完全转化为可利用的产物，而且制备对环境友好的蛋白质和表面活性物质；
(4)本发明首次提出菌种温州木犀DF114具有降解羽毛且同时制备表面活性剂的能力；保藏说明
Luteimonas wenzhouensis DF114，于2022年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC M20221181。
附图说明
图1为本发明温州木犀Luteimonas wenzhouensis DF114降解羽毛粉前和后的现象；
图2为本发明温州木犀Luteimonas wenzhouensis DF114在不同温度条件下的生长曲线；
图3为本发明温州木犀Luteimonas wenzhouensis DF114对羽毛粉的降解率；
图4为温州木犀Luteimonas wenzhouensis DF114在pH 7.46，pH 7.97条件下对羽毛粉降解26天后的表面张力。
具体实施方式
以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
实施例1菌株的分离、鉴定和培养
1、分离
菌种来源：本菌种来源于堆肥中，经纯化获得菌株DF114。
2、鉴定
(1)菌落形态、生理生化鉴定：观察将菌株DF114在LB平板上进行划线分离，于37℃下恒温培养48h，观察菌落的形状、颜色、表面质地、菌落边缘等并记录。该菌菌落为棕色，表面湿润，革兰氏染色呈阴性。
(2)分子生物学方法鉴定
将菌株进行纯培养、菌株总DNA的提取、16S rDNA的PCR扩增(引物为27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)及将扩增产物送到北京擎科生物科技有限公司广州分公司进行序列测定，将正反序列拼接获得16S rDNA基因序列长度为1472bp，如SEQ ID NO.1所示。测定结果在NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行BLAST比对，该菌株与革兰氏阴性菌-温州木犀菌株(Luteimonas wenzhouensisstrain YD-1)的同源性为98.52％，最终将筛选到的菌株命名为温州木犀(Luteimonaswenzhouensis)DF114，于2022年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC M20221181。
(3)培养：LB固体培养基先划线活化菌种，然后接种到LB液体培养基中活化20h，然后分别接菌液100μL到4瓶50mL的LB培养基中，分别在25℃，30℃，35℃，40℃培养，转速180rpm，检测不同时间的OD600。
温州木犀DF114的生长曲线如图2。
SEQ ID NO.1
实施例2温州木犀DF114降解羽毛粉
1、膨化羽毛粉制备过程
膨化机开机预热30分钟，电机75千瓦，电流在150A左右，然后将除杂质，水分在13％左右的鸭毛均匀上料，加热温度400℃，开机后下降到350℃左右。出料米黄色为正常。
2、温州木犀DF114降解羽毛粉
从LB固体培养基挑选温州木犀DF114到LB液体培养基中，在180rpm、37℃条件下培养20h后，分别取1mL细菌培养液到50mL含不同培养基的羽毛粉(羽毛粉80.0g·L-1，K2HPO41.4g·L-1，KH2PO4 0.7g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO4 0.1g·L-1，pH 7.0，溶剂为水)中。相同条件下，以未加入细菌作为对照，设置3个平行，在180rpm、37℃下培养，降解后收集培养基中的固体，清洗干净后80℃烘干称重，计算羽毛粉的降解率，计算公式如下：
羽毛粉降解率(％)＝(M0-Mt)/M0×100％ 公式(1)
其中，M0：羽毛粉初始的质量(g)；Mt：反应t时间时的剩余羽毛粉的质量(g)。
结果如图3所示，本发明温州木犀DF114对经膨化处理的羽毛的降解率可达78.34％以上。
实施例3温州木犀DF114降解羽毛粉的发酵液表面张力的测定
在含160g L-1膨化羽毛粉(制备方法同实施例2)的培养基(膨化羽毛粉160.0g L-1，K2HPO4 1.4g L-1，KH2PO4 0.7g L-1，NaCl 0.5g L-1，MgSO4 0.1g L-1，pH 7.46，溶剂为水)，(膨化羽毛粉160.0g L-1，K2HPO4 1.4g L-1，KH2PO4 0.7g L-1，NaCl 0.5g L-1，MgSO4 0.1g L-1，pH 7.97，溶剂为水)，初始接菌量20％和温度30℃的条件下，测定温州木犀DF114 4对羽毛粉降解初始(0d)及第26天(26d)的表面张力，以不加菌液的相同膨化羽毛粉培养基作为对照，设置3个平行。
结果如图4所示，温州木犀DF114在初始pH 7.46，pH 7.97降解羽毛粉26天后降解液的表面张力从初始的43.95±0.25mN/m，43.71±0.78mN/m分别降低到31.95±1.58mN/m，25.34±1.87mN/m。无菌空白组初始pH 7.46，pH 7.97羽毛粉溶液的初始表面张力分别为43.97±0.15mN/m，43.81±0.34mN/m，摇26天后的表面张力分别为42.97±0.58mN/m，42.74±0.58mN/m，基本不变。
本发明将利用Luteimonas wenzhouensis DF114降解羽毛粉来制备生物表面活性剂，既可以经济地解决由废丢弃羽毛造成的环境问题，又可以满足工业上对生物表面活性剂的需求，具有重要的研究意义和应用价值。
以上实施实例对本发明应用在不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.温州木犀(Luteimonas wenzhouensis)DF114，保藏编号为：CCTCC M 20221181。
2.一种制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的温州木犀DF114或其发酵液。
3.权利要求1所述的温州木犀DF114在以下所述一项或多项中的应用：
(1)降解羽毛；
(2)制备生物表面活性剂；
(3)制备角蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的角蛋白酶为羽毛角蛋白酶。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物表面活性剂是以羽毛为底物用温州木犀DF114发酵培养制得的。
6.根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于，所述的羽毛是鸭毛、鸡毛或鹅毛，优选是废弃的鸭毛、鸡毛或鹅毛。
7.一种降解羽毛的方法，其特征在于，将权利要求1所述的温州木犀DF114接种于含羽毛或羽毛粉的培养基中培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培养基成分包括：羽毛或羽毛粉，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的培养基成分及其含量如下：羽毛粉10-160g·L-1，K2HPO4 1.4g·L-1，KH2PO4 0.7g·L-1，NaCl 0.5g·L-1，MgSO4 0.1g·L-1。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的羽毛是鸡毛、鸭毛或鹅毛，优选是废弃的鸭毛、鸡毛或鹅毛。
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