JP5610728B2 - 微生物醗酵生産物の製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。
特許文献1及び2において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン/酢酸エチル又はヘキサン/クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。
しかし、スクラレオールから微生物変換により得られる培養液中には、ジオール体の他に未反応のスクラレオールやスクラレオリド、微生物、培地成分等が混在しているため、酢酸エチルを用いた溶剤抽出法ではジオール体のみの分離・精製は非常に困難であった。
そのため、培養液を特定範囲の目開きのフィルターを用いて濾過することにより菌体を分離後、フィルター上の残渣をエタノールに溶解して再度濾過等する方法により、ジオール体を高純度で回収する方法が報告されている(特許文献3)。
一方、菌体をフィルターで分離後、エタノールに溶解して濾過する方法は、2度の濾過を必要とすることからやはり製造工程が煩雑である。
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用いることができ、バッチ式、連続式のいずれを用いることもできる。遠心分離の条件としては、温度は5〜60℃であるのが好ましい。遠心力は培養物中の固形分量により適宜設定できるが、500〜20000Gが好ましく、1000〜10000Gがより好ましい。処理時間は、加速度により適宜設定できるが、1〜60分が好ましく、2〜30分がより好ましい。遠心分離に用いられる回転数は、例えば円筒型の場合、2000〜12000r/min、更に3000〜12000r/min、特に7000〜12000r/minが好ましい。
水分を一部除去した後の培養物(以下、「沈殿物」ともいう)中の水分は80質量%以下が好ましく、70質量%以下がより好ましく、60質量%以下がさらに好ましい。
また、混合後の溶剤のSP値が前記範囲となるように、SP値7.5〜9.0の範囲外にある溶剤をも適宜組み合わせて、SP値が前記範囲となるように調製して用いてもよい。SP値7.5〜9.0の範囲内にある溶剤を用いることで、ジオール体の抽出時間を短縮化できると共に抽出時の溶剤の使用量を低減できるので、作業効率も向上する。
静置分離は、10〜60分行い、溶剤相を分取することが好ましい。静置分離の温度は特に規定されないが、0〜80℃であることが好ましく、20〜65℃であることがより好ましい。
また、遠心分離は、前述の条件を用いることができるが、分離の状態により適宜条件を調整することができる。
精製工程で晶析を行う場合、その方法は特に制限されないが、例えば、前記得られた溶剤相又は濾過液を、必要により活性炭濾過や精密濾過等の不純物除去操作を行った後、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法がある。晶析に用いられる有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられ、メタノール、エタノール、イソプロパノールが好ましく、特にエタノールが好ましい。これら有機溶剤は単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。
貧溶媒の添加による場合は、ヘキサンや水を用いることが好ましい。
更に、得られたジオール体は、酸性触媒、例えばp−トルエンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸又は酸性イオン交換体等を用いて、種々の溶媒中で脱水環化により化合物Aに変換することができる。
Ascomycete sp.KSM−JL2842(FERM P−20759)株を2.1%YMブロスに1白金耳植菌し、25℃にて3日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、2.1%YMブロス、0.1%硫酸マグネシウムからなる培地に0.3%植菌し、30L培養槽にて液温24℃、空気通気量0.5vvm、攪拌速度200r/minにて3日通気撹拌培養を行った。その後、10%Tween80(登録商標)、20%スクラレオールからなる基質を、培養液中のスクラレオール濃度が5%になるように添加し、基質添加から4日間1N NaOHおよび1N HClによるpH6.0制御の通気撹拌培養を行い、培養液を得た。なお、当該培養液には、ジオール体2.4%、スクラレオール0.3%、水分96.5%、その他固形分(菌体等)0.6%が含まれていた。
スクラレオール、スクラレオリド及びジオール体は、培養液から酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー(GC)分析を行い、その含有量を測定した。GC分析装置は6890N GC System(Agilent technologies社)で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはFID(Flame Ionization Detector)(Agilent technologies社)を使用し、注入口温度を250℃とし、注入法をスプリットモード(スプリット比100:1)とし、トータルフローを200mL/分とし、カラム流速を0.4mL/分とし、カラムはDB−WAX(φ0.1mm×10m)(J&W社)を使用し、オーブン温度を250℃とした。
ジオール体の結晶のにおい評価は、パネル7名により次に示す基準に従って行い、その平均値をにおい評価値とした。
5:微生物培養液のにおいが強く残っている
4:微生物培養液のにおいがやや強く残っている
3:微生物培養液のにおいが少ない
2:微生物培養液のにおいが微少
1:微生物培養液のにおいが無い
ジオール体抽出液の色の評価は、抽出液を遠心分離(装置:HITACHI CR22GII、ローター:R9AF2、条件:7420r/min、5分)して微生物を除去した後、得られた上澄み液の波長420nmにおける吸光度(装置:SHIMADZU UV−2450)、およびGC分析によりジオール体の濃度(g/L)を測定した。次いで、吸光度をジオール体の濃度(g/L)で除して、その値が小さいほど色相良好とした。
ジオール体の結晶の色は、測色色差計ZE−2000型(日本電色工業(株))で測定し、黄色味を示す値(b値)が小さいほど色相良好とした。
上記[微生物変換]で得られた培養液500mLに、トルエン(SP値8.9)500mLを加え、15分間混合(液温25℃)してジオール体を溶解し、30分の静置分離により微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を60〜80℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、70℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表1に示す。
トルエンを酢酸エチル(SP値9.1)又はヘキサン(SP値7.3)に代えた以外は、実施例1と同様についてジオール体の結晶を得た。結果を表1に示す。
上記[微生物変換]で得られた培養液500mLを円筒型の遠心分離機(装置:HITACHI CR22GII)を用い、25℃にて3000Gの加速度で5分間処理し、沈殿物を得た。沈殿物中の水分は60質量%であった。トルエン(SP値8.9)500mLに、前記培養液の沈殿物を加え、15分間混合(液温25℃)してジオール体を溶解し、同じ遠心分離機を用い、25℃にて6000Gの加速度で10分間処理し、微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を60〜80℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、70℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表1に示す。
上記[微生物変換]で得られた培養液500mLに、トルエン(SP値8.9)125mLを加え、15分間混合(液温60℃)してジオール体を溶解し、30分の静置分離により微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を60〜80℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、70℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表1に示す。
トルエンを4−メチル−2−ペンタノン(SP値8.4)に代えた以外は、実施例2と同様についてジオール体の結晶を得た。結果を表1に示す。
Claims (5)
- 前記溶剤のSP値が8.0〜9.0〔(cal/cm3)1/2〕の範囲内である、請求項1記載の製造方法。
- 前記溶剤が、シクロヘキサン、4−メチル−2−ペンタノン、キシレン及びトルエンから選ばれる1種又は2種以上である請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記溶剤のSP値が8.4〜8.9〔(cal/cm 3 ) 1/2 〕の範囲内である、請求項1記載の製造方法。
- 微生物が含まれたままの培養物と前記溶剤とを混合する前に、培養物中の水分を80質量%以下に低減する工程を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
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