JP2016111951A - ルミクロムの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ルミクロムをリボフラビンから効率的に製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るルミクロムの製造方法は、ミクロバクテリウム属微生物の菌体とリボフラビン過飽和液とを混和することにより、リボフラビンをルミクロムに変換する工程を含むことを特徴とする。【選択図】なし

Description

本発明は、ルミクロムをリボフラビンから効率的に製造するための方法に関するものである。

ルミクロムは青色の蛍光物質であり、光増感剤や着色剤などとして消毒殺菌装置や半導体素子などに適用されている重要な化合物である。

ルミクロムの製造方法としては、リボフラビンを光で分解した後、クロマトグラフィーで精製する方法や（非特許文献１）、有機化学的に合成する方法（非特許文献２，３）が知られている。また、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｊｉｓｈｅｎｇｅｌｌａ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｌｂａ ｓｐ．ｎｏｖ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． ＺＨ５８、およびＳｅｐｔｏｒｉａ ｐｉｓｔａｃｉａｒｕｍの菌体内にルミクロムが存在することが知られている（非特許文献４〜８）。

Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１６９巻，４５９〜４６１ページ（１９７９年） Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９巻，２０７０〜２０７４ページ（２００９年） Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１１巻，１０１０〜１０１１ページ（１９７２年） ＰＮＡＳ，９６巻，１２２７５〜１２２８０ページ（１９９９年） Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，１２巻，４７７〜４９０ページ（２０１４年） Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，４７巻，３６６〜３７０ページ（２００９年） Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．，２７巻，１９０２〜１９０５ページ（２０１３年） Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，７５巻，８８３〜８８９ページ（２０１２年）

上述したように、ルミクロムを製造する方法は知られていたが、光分解や有機合成による方法は収率が低い上に、クロマトグラフィーを用いるなど精製操作が煩雑であり、大量生産に適するものではなかった。また、菌体内にルミクロムを含む微生物も知られているが、菌体内に産生されるルミクロムでは製造効率は当然に低く、また、菌体内からルミクロムを精製するのにも手間がかかり、やはり大量生産に適するものではない。

そこで本発明は、ルミクロムをリボフラビンから効率的に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ミクロバクテリウム属微生物の菌体を用いれば、リボフラビンを高濃度で含む過飽和液からルミクロムを効率的に製造できることを見出して、本発明を完成した。

以下、本発明を示す。

［１］ ルミクロムを製造するための方法であって、
ミクロバクテリウム属微生物の菌体とリボフラビン過飽和液とを混和することにより、リボフラビンをルミクロムに変換する工程を含むことを特徴とする方法。

［２］ 上記リボフラビン過飽和液中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する上記［１］に記載の方法。

［３］ さらに、上記変換工程の前に、リボフラビンを含む培地中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する工程を含み、
上記変換工程において、菌体として、事前培養した上記ミクロバクテリウム属微生物の休止菌体を用いる上記［１］に記載の方法。

［４］ さらに、上記変換工程の前に、リボフラビンを含む培地中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する工程、および、
事前培養した上記ミクロバクテリウム属微生物の菌体に、凍結、乾燥、破砕および固定化から選択される１以上の処理を行う工程を含み、
上記変換工程において、菌体として、上記処理菌体を用いる上記［１］に記載の方法。

［５］ 上記の変換工程において、リボフラビンを添加し、リボフラビンの過飽和状態を維持する上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。

［６］ 上記ミクロバクテリウム属微生物として、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３）および／またはミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４）を用いる上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。

［７］ 上記ミクロバクテリウム属微生物として、ミクロバクテリウム・オキシダンス、ミクロバクテリウム・リクエファシエンス、ミクロバクテリウム・サペルダエ、ミクロバクテリウム・アエロラタム、ミクロバクテリウム・アラビノガラクタノリティカム、ミクロバクテリウム・エステラロマティクム、ミクロバクテリウム・ケラタノリチキューム、ミクロバクテリウム・マリティピカムおよびミクロバクテリウム・テスタセウムからなる群より選択される１種以上を用いる上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。

［８］ ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３）または ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４）。

本発明方法で用いる溶媒は菌の培養などに適した中性付近の水溶媒であるので、本発明方法は安全に実施することができる。また、原料であるリボフラビンを飽和濃度超含む過飽和液を用いてもルミクロムの生産に支障はなく、リボフラビンを連続的または断続的に添加して過飽和状態を維持することができ、しかも目的化合物であるルミクロムの水溶性は低く沈殿するので、ルミクロムの継続的な製造が可能である。さらに、本発明方法では副生成物がほとんど問題とならず、沈殿を回収した上で再結晶など簡便な方法で精製することにより、高純度のルミクロムが容易に得られる。このように本発明は、ルミクロムの工業的な大量生産にも適するものとして、産業上非常に有用である。

図１は、本発明方法により得られた培養液と、ルミクロム標準品のＨＰＬＣチャートである。 図２は、本発明方法により得られたルミクロムと、ルミクロム標準品の¹Ｈ−ＮＭＲチャートである。 図３は、本発明方法により得られたルミクロムと、ルミクロム標準品の¹³Ｃ−ＮＭＲチャートである。 図４は、ミクロバクテリウム属微生物の培養液のｐＨとルミクロムの生産量との関係を示すグラフである。 図５は、ミクロバクテリウム属微生物の休止菌体を用いた場合における緩衝液のｐＨとルミクロム生産量との関係を示すグラフである。 図６は、ミクロバクテリウム属微生物の休止菌体を用いた場合における菌体量と、リボフラビンからルミクロムへの変換に要した時間との関係を示すグラフである。

以下、本発明を実施の順番に従って説明する。

１． 事前培養工程
本工程の実施は任意ではあるが、後記の変換工程の前に、リボフラビンを含む培地中、ミクロバクテリウム属微生物を事前に培養することが好ましい。例えば、特に後述する休止菌体や処理菌体を用いる場合には、かかる事前培養を行うことにより、リボフラビンをルミクロムに変換する反応に関与する酵素が誘導され、ルミクロムのより一層効率的な製造が可能になる。

リボフラビンは以下の化学構造を有し、ビタミンＢ₂とも呼ばれるものであり、多くの酸化還元反応において必須の補酵素として炭水化物の代謝に関わっている。リボフラビンは発酵法などにより製造されており、その入手は容易である。

本工程で用いる培地は、リボフラビンの他、ミクロバクテリウム属微生物の培養に適する成分を含む。そのような成分は適宜選択すればよいが、例えば、グルコースやフルクトースなどの炭素源；酵母エキス、ペプトン、トリプトンなどの一般的栄養成分；硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸鉄などのミネラル成分；リン酸水素二カリウムなどのミネラル成分などを挙げることができる。また、液体培地のみならず、寒天やジェランガムなどを含む固体培地を用いてもよい。

本工程で用いる培地にはリボフラビンを添加する。当該培地中におけるリボフラビンの濃度は、飽和濃度以下であってもよいし、続く変換工程と同様に飽和濃度超であってもよく、適宜調整すればよい。その濃度は、例えば、培地に対して０．０２ｍｇ／ｍＬ以上とすることができる。当該濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、ミクロバクテリウム属微生物のルミクロム産生能の向上という目的がより確実に発揮される。当該濃度としては０．０４ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。

本工程で用いる培地のｐＨは、ミクロバクテリウム属微生物の培養に適したものに調整することが好ましい。例えば、５．０以上、１１．０以下とすることができる。当該ｐＨとしては、５．５以上または６．０以上がより好ましく、６．５以上がさらに好ましく、７．５以上が特に好ましい。また、ｐＨが高過ぎるとリボフラビンが分解するおそれがあり得るので１０．０以下がより好ましく、９．５以下がさらに好ましく、９．０以下が特に好ましい。

本発明では、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物を用いる。ミクロバクテリウム属微生物は、ミクロバクテリウム科に属する細菌である。

本発明では、リボフラビンからルミクロムへの変換能の高いミクロバクテリウム属微生物を選択して用いればよい。例えば、ミクロバクテリウム・オキシダンス（Ｍ．ｏｘｙｄａｎｓ）、ミクロバクテリウム・リクエファシエンス（Ｍ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ミクロバクテリウム・サペルダエ（Ｍ．ｓａｐｅｒｄａｅ）、ミクロバクテリウム・アエロラタム（Ｍ．ａｅｒｏｌａｔｕｍ）、ミクロバクテリウム・アラビノガラクタノリティカム（Ｍ．ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ミクロバクテリウム・エステラロマティクム（Ｍ．ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、ミクロバクテリウム・ケラタノリチキューム（Ｍ．ｋｅｒａｔａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ミクロバクテリウム・マリティピカム（Ｍ．ｍａｒｉｔｙｐｉｃｕｍ）およびミクロバクテリウム・テスタセウム（Ｍ．ｔｅｓｔａｃｅｕｍ）の活性は、本発明者らにより実験的に確認されている。これら種に属する微生物としては、例えば、各種に属する基準株を用いることができる。

また、具体的な菌株としては、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８およびミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９を挙げることができる。これら菌株は、特に高いルミクロム産生能を有する。これら菌株は、それぞれ下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 寄託機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
（ｉｉ） 受託日： ２０１４年１１月２６日
（ｉｉｉ） 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３，ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４

上記のミクロバクテリウム ｓｐ．菌株の優れたルミクロム産生能は、本発明者らの実験により確認されている。また、ミクロバクテリウム属に属し、且つ各菌株と形態的特徴や生化学的特徴が共通する微生物であれば、優れたルミクロム産生能を有すると考えられる。

本工程における培養条件は、使用するミクロバクテリウム属微生物に合わせて適宜調整すればよい。

例えば培養温度を１６℃以上、３７℃以下とすることができ、より好ましくは２５℃以上、３５℃以下であり、さらに好ましくは２８℃以上、３２℃以下である。また、培養時間はミクロバクテリウム属微生物が十分に活性化されるまでとすればよいが、例えば、５時間以上、５０時間以下とすることができる。

２． リボフラビンからルミクロムへの変換工程
本工程では、ミクロバクテリウム属微生物の菌体とリボフラビン過飽和液とを混和することにより、リボフラビンをルミクロムに変換する。ミクロバクテリウム属微生物の菌体による作用機構は必ずしも明らかではないが、少なくとも以下の反応が触媒される。

本工程では、飽和濃度を超えるリボフラビンを含むリボフラビン過飽和液を用いる。ミクロバクテリウム属微生物の菌体を用いれば、高濃度のリボフラビンの存在下においても当該微生物の培養などが阻害されることはなく、ルミクロムを効率的に製造することが可能である。

本工程では、リボフラビンの過飽和液を用いる。本発明において「リボフラビン過飽和液」とは、本工程の実施温度における溶解度を超える量のリボフラビンを含む液体をいう。即ち、リボフラビン過飽和液には、リボフラビンが飽和状態で溶解していることに加え、さらに不溶状態のリボフラビンが含まれる。リボフラビン過飽和液は、本工程の実施温度における溶解度を超える量のリボフラビンを水に加え、十分に混和させることにより調製することができる。

リボフラビンの溶解度は必ずしも高くはなく、２０℃における溶解度は０．０７ｍｇ／ｍＬであり、２５℃において０．０８２５ｍｇ／ｍＬである。よって本工程では、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以下程度のリボフラビンを含む過飽和液を用いる。当該割合としては、２ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、５ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、また、１６ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。

リボフラビン過飽和液中のリボフラビンは、上記の反応によりルミクロムに変換されるので、当該液中のリボフラビン濃度は継時的に低下する。また、本発明で用いるミクロバクテリウム属微生物の菌体のルミクロム産生能は、高濃度のリボフラビンによっても悪影響を受けない。さらに、ルミクロムの水溶媒に対する溶解度は低く、生成したルミクロムは沈殿して同じく同菌体のルミクロム産生能に悪影響を及ぼさない。よって、リボフラビン過飽和液にはリボフラビンを追加添加してリボフラビンの過飽和状態を維持することにより、ルミクロムの製造効率をより一層高めることも可能である。

リボフラビンの追加添加の態様は特に制限されず、リボフラビンの消費やルミクロムの産生状況をモニタリングするなどしつつ適宜添加すればよい。例えば、リボフラビンの追加添加は単回でもよいし、連続的でもよいし、また、２回以上断続的でもよい。なお、本発明において「リボフラビンの過飽和状態を維持する」とは、本工程を通じて過飽和状態を維持することを意味するものではなく、ルミクロムが十分に産生された後はリボフラビンの追加添加は停止し、リボフラビンを完全または略完全に消費させることが好ましい。

本工程で用いられるミクロバクテリウム属微生物の菌体は、リボフラビン過飽和液と混和することによりリボフラビンをルミクロムに変換できるものであれば、特に制限されない。例えば、ミクロバクテリウム属微生物を培養しつつリボフラビンをルミクロムに変換してもよいし、また、ミクロバクテリウム属微生物の休止菌体や処理菌体を用いてもよい。以下、具体的な態様につきそれぞれ説明する。

（１） 培養による変換
ミクロバクテリウム属微生物を培養しつつリボフラビンをルミクロムに変換する場合には、ミクロバクテリウム属微生物の生育に必要な培地に対して過飽和となる量のリボフラビンを添加し、ミクロバクテリウム属微生物と混和した上で培養すればよい。本工程で用いる培地成分としては、上記事前培養工程で説明した培地成分を用いることができる。即ち、本工程では、事前培養工程で使用できる培地に、飽和濃度超のリボフラビンを添加して用いればよい。但し、本工程ではルミクロムを得ることを目的としているので、ルミクロムを分離し易いよう液体培地を用いることが好ましい。

ミクロバクテリウム属微生物を培養する条件は、リボフラビンを飽和濃度超含む培地を必須的に用いる以外は上記事前培養と同様にすればよい。

使用する菌体の量は、適宜調整すればよい。培養による変換を行う場合には菌数は培養により増加するので、例えば濁度が０．１以上、２．５以下の培養液を、リボフラビン過飽和培地に対して０．１容量％以上、１０容量％以下添加するのみでも十分である。

（２） 休止菌体による変換
本発明者らによる実験的知見によれば、ミクロバクテリウム属微生物が増殖しない休止状態でリボフラビン過飽和液と混和してもリボフラビンをルミクロムに変換することができる。

本発明において「休止菌体」とは、増殖しない状態にある菌体をいい、生存しているか死んでいるかは問わない。例えば、上記事前培養工程で事前培養したミクロバクテリウム属微生物を培地から分離し、培地成分を含まないリボフラビン過飽和液と混和すればよい。

使用するミクロバクテリウム属微生物の休止菌体の量は、適宜調整すればよい。少なくとも懸濁状態にあるとはいえない程度に水分を除去した状態で、リボフラビン過飽和液に対して２質量％以上、６質量％以下程度添加すればよい。

この場合に使用するリボフラビン過飽和液は、リボフラビンをルミクロムに変換する反応に関与する酵素が良好に働くように、緩衝液などを用いてｐＨを調整することが好ましい。当該ｐＨは、ミクロバクテリウム属微生物を培養するための培地のｐＨと同様にすればよい。

（３） 処理菌体による変換
本工程で用いる菌体としては、上記事前培養工程で事前培養したミクロバクテリウム属微生物の処理菌体であってもよい。処理菌体としては、例えば、凍結菌体、破砕菌体、乾燥菌体、固定化菌体などを挙げることができる。これら処理菌体は、生菌に比べて保存が容易であり、安定供給が可能であるという利点がある。

ミクロバクテリウム属微生物の菌体の処理の条件は、適宜決定すればよい。例えば凍結の場合には、−２００℃以上、０℃未満程度で、１日以上、５０日以下程度冷却すればよい。破砕の場合には、ガラスビーズなどを用いて菌体を破砕した後、破砕菌体を遠心分離などで集めればよい。乾燥の場合には、凍結乾燥したり、アセトンを用いて乾燥したり、或いは流下式の乾燥機でミクロバクテリウム属微生物の事前培養液を加熱乾燥するなどすればよい。菌体を固定化する方法としては、担体結合法、架橋法、包括法、複合法といった公知方法を用いることができる。

処理菌体を用いる場合におけるリボフラビンからルミクロムへの変換条件は、休止菌体を用いる場合と同様にすることができる。

ミクロバクテリウム属微生物の菌体とリボフラビン過飽和液とを混和し、リボフラビンをルミクロムに変換するための反応時間は適宜調整すればよい。例えば、リボフラビンが完全に消費されるまでとすればよい。具体的には、小規模の予備実験で決定したり、また、クロマトグラフィーなどによりリボフラビンの消費が確認できるまでとすることができる。

３． 精製工程
上記変換工程によりリボフラビンをルミクロムに変換した後は、得られたルミクロムを精製することが好ましい。

ルミクロムは水溶媒に対する溶解性は低く、２５℃における溶解度は０．１３ｍｇ／ｍＬ程度であり、上記変換工程後は生成したルミクロムのほとんどが析出して沈殿するので、溶液から容易に分離することができる。また、フィルターの孔径や遠心分離における遠心力を調整することにより、菌体と分離することも可能である。さらに、本発明方法によれば副生物は問題にならないし、十分に反応を進めればリボフラビンも残留しない。よって、例えば、沈殿したルミクロムを濾過や遠心分離などで分離するのみでも、十分な純度を有するルミクロムが得られる。

しかし、純度をより高めるために、さらに精製することが好ましい。例えば、分離したルミクロムを水で洗浄したり、再結晶することができる。なお、上記のとおりルミクロムは反応系から固体として分離されるため、クロマトグラフィーなど工業的な大量生産に適さない精製方法を用いる必要はない。

再結晶に用いる溶媒としては、ルミクロムを適度に溶解できるものであれば特に制限されないが、例えば、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；ピリジンなどのピリジン系溶媒などが好ましい。これらの水混和性有機溶媒を用いれば、貧溶媒として水が使用できる。即ち、ルミクロムを上記水混和性有機溶媒に溶解した後に、水を加えることによりルミクロムの析出を促進することが可能である。もちろん、貧溶媒を用いずに、上記溶媒のルミクロム高濃度溶液を冷却することにより結晶化してもよい。

以上のとおり、本発明方法によればルミクロムを非常に効率的に製造することができる。また、本発明方法で得られるルミクロムは不純物が少なく高純度であるので、光学材料などにも適している。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

実施例１： 本発明に係る微生物の発見
（１） ルミクロム産生菌の分離
表１に示す組成を有するリボフラビン含有培地Ａに、富山県射水市と京都府京都市で採取した土壌を添加し、高濃度のリボフラビン存在下でも生育可能な微生物をスクリーニングした。

リボフラビン含有培地で生育が確認された微生物を、表２に示す組成に加えて寒天（１．５ｇ）を含む固体培地で培養し、コロニーを分離した。

分離した各コロニーを、表２に示す組成を有する液体培地Ｂ（５ｍＬ）に植菌し、波長６００ｎｍの光を用いた濁度測定でＯＤ値が約２．０になるまで増殖させた。次に、当該培養液（０．１ｍＬ）を、液体培地Ｂ（１０ｍＬ）にリボフラビン（０．３８ｍｇ，０．１ｍＭ）を溶解した培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した。当該培養液を２５℃、２２，３００×ｇで３分間遠心分離し、得られた上清液を以下の条件のＨＰＬＣで分析した。
ＨＰＬＣシステム： 島津製作所社製「ＬＣ−２０ＡＰ」
カラム： ナカライテスク社製「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈ＭＳ−ＩＩ ｃｏｌｕｍｎ」（２．０×１５０ｍｍ）
カラム温度： ５０℃
移動相： ２５％メタノールを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
流速： ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長： ２５４ｎｍ

その結果、図１に示すとおり、分離した菌のうち２菌株の培養液から、ルミクロム標準品と同様に１３．９ｍｉｎに新たなピークが認められた。なお、上記ＨＰＬＣ条件において、リボフラビンのピークは３．７ｍｉｎに認められた。

（２） 生成化合物の確認
上記実施例１（１）で見出した２菌株を、１ｍＭ（３．８ｍｇ）リボフラビンを含む液体培地Ｂ（１０ｍＬ）に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後、培養液を４℃、２２０×ｇで５分間遠心して沈殿画分を回収した。この条件では、菌体は上清画分に懸濁状態で含まれていた。当該沈殿画分を水で洗浄し、乾燥した後、ＮＭＲで分析した。その結果、図２と図３のとおり、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ共に、ルミクロム標準品とよく一致した。得られた生成物のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５）δ２．２７ａｎｄ２．３３（ｅａｃｈ３Ｈ，ｓ），７．８８ａｎｄ８．０６（１Ｈ，ｓ），１３．９７（２Ｈ，ｂｒ）
¹³Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５）δ２０．２０，２０．７８，１２７．５３，１３０．０７，１３１．３９，１３９．４７，１４０．２０，１４３．４０，１４５．１８，１４８．０６，１５２．１６，１６２．４１

これらの結果から、本研究で見出した２菌株は培養液中で沈殿になるほど高濃度にルミクロムを生成することが明らかになった。このように、上記２菌株により水中でリボフラビンをルミクロムに変換した場合には副生成物が問題にならず、また、ルミクロムの水溶性は低いことからその精製は極めて容易であった。なお、リボフラビンの水に対する溶解度は２５℃で０．０８２５ｍｇ／ｍＬ（０．２２ｍＭ）と低く、上記の培養ではリボフラビンは過飽和状態であった。この点でも、上記２菌株を用いれば、ルミクロムをリボフラビンから効率的に製造できるといえる。

（３） 本発明菌株の同定
上記のとおりリボフラビンからルミクロムへの変換能力が優れている２菌株の１６ｓＲＮＡの塩基配列を決定した。各塩基配列を配列番号１，２に示す。また、これら２菌株の形態学的性質と生理生化学的性質を表３に示す。

１６ｓＲＮＡ分析の結果から２菌株ともミクロバクテリウム属に属すると推定され、形態学的性質と生理生化学的性質もミクロバクテリウム属微生物の性質とよく一致した。従って、上記２菌株は、いずれもミクロバクテリウム属微生物であると同定し、これらの微生物をミクロバクテリウム ｓｐ． ＴＰＵ３５９８およびミクロバクテリウム ｓｐ． ＴＰＵ３５９９と命名した。また、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８とミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９は、２０１４年１１月２６日に特許微生物寄託センターに寄託した。受託番号は、それぞれＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３とＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４である。

実施例２： 培養によるルミクロムの製造実験
表４に示す組成を有する液体培地（５ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を一白金耳植菌して３０℃で１６時間振盪培養した。

次に、この培養液（５ｍＬ）を、表４に示す組成を有し且つリボフラビン（３．８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を含む液体培地Ｃ（５００ｍＬ）に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を４℃、２２０×ｇで２０分間遠心分離して沈殿を集めた。この条件では、菌体は上清画分に懸濁状態で存在し、沈殿とは分離された。得られた沈殿画分を、さらに４℃、２２，３００×ｇで１０分間遠心分離して、十分に脱水した粗生成物（２．８ｇ）を集め、次にジメチルスルホキシド（３００ｍＬ）に懸濁し、８０℃に加熱して生成物を溶解した。この溶解液を２５℃、２２，３００×ｇで５分間遠心分離して不溶な物質を除いた後、水（９００ｍＬ）を加えて再結晶した。再結晶した化合物のＮＭＲスペクトルはルミクロムとよく一致した。

以上の方法で得られたルミクロムの結晶は２．４ｇ（９．９ｍｍｏｌ，使用したリボフラビンに対するモル収率は９８％）であった。このように、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を過飽和のリボフラビンを含む培地で培養することにより、高純度のルミクロムを高い変換率で得られることが証明された。

実施例３： 培養によるルミクロムの生産に与えるｐＨ条件の検討
リボフラビンからルミクロムへの変換反応において、過飽和と溶解度以下でその他の反応条件の影響に違いは見られないと考えられることから、本実施例における条件検討にあたっては、分析が容易な溶解度以下のリボフラビン濃度で実験を行った。

表４に示す組成を有する液体培地Ｃ（５ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を植菌し、波長６００ｎｍの光を用いた濁度測定でＯＤ値が約２．０になるまで増殖させた。次に、当該培養液（０．１ｍＬ）を、ｐＨ５．０から９．０の液体培地Ｃ（１０ｍＬ）にリボフラビン（０．３８ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ）を溶解した培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した。当該培養液を２５℃、２２，３００×ｇで３分間遠心分離し、得られた上清液をＨＰＬＣで分析した。１０時間後の各培養液に含まれるリボフラビンとルミクロムの量を図４に示す。

図４に示す結果のとおり、ｐＨ５．０でもルミクロムの生成は確認されたが、ｐＨが７．０以上であればルミクロムが効率的に産生されることが明らかとなった。

実施例４： 培養によるルミクロムの製造実験
上記実施例２と同様に、表４に示す組成を有し且つリボフラビン（３．８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を含む液体培地Ｃ（５００ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。２４時間培養した後、さらにリボフラビン（３．８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を追加し、引き続き３０時間培養を継続した。この培養液から上記実施例２と同様にして反応生成物の再結晶化をジメチルスルホキシド（５００ｍＬ）と水（１５００ｍＬ）を用いて行った。その結果、再結晶した化合物のＮＭＲスペクトルはルミクロムとよく一致した。

以上の方法で得られたルミクロムの結晶は４．７ｇ（１９．４ｍｍｏｌ，モル収率：９６％）であり、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を過飽和のリボフラビンを含む培地にさらにリボフラビンを追加して培養することでも高純度のルミクロムを得ることが可能であった。

実施例５： 休止菌体によるルミクロムの製造実験
表４に示す組成を有し且つリボフラビン（３８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を含む液体培地Ｃ（１０００ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を一白金耳植菌して３０℃で１６時間振盪培養した。この培養液を４℃、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して集菌し、菌体を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。この洗浄菌体を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０，５００ｍＬ）に懸濁し、さらにリボフラビン（３．８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を添加して、３０℃で２４時間振盪反応した。そして、上記実施例２と同様の方法で反応生成物を集めて再結晶した。その結果、再結晶した化合物のＮＭＲスペクトルはルミクロムとよく一致した。

以上の方法で得られたルミクロムの結晶の収量は２．４ｇ（９．９ｍｍｏｌ）であり、使用したリボフラビンに対するモル収率は９８％であった。かかる結果より、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株の休止菌体によりリボフラビンを処理する方法でも、高純度のルミクロムを高い変換率で製造できることが明らかとなった。

実施例６： 休止菌体によるルミクロムの生産に与えるｐＨ条件の検討
表４に示す組成を有し且つリボフラビン（０．３８ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ）を含む液体培地Ｃ（１０ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を一白金耳植菌して３０℃で１６時間振盪培養した。この培養液を４℃、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して集菌し、図５に示す各１０ｍＭ緩衝液で菌体を洗浄した。この洗浄菌体を洗浄に用いたものと同じ緩衝液（１０ｍＬ）に懸濁し、さらにリボフラビン（１８．８ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を添加して、３０℃で２４時間振盪反応した。当該反応液を２０％ジメチルスルホキシド溶液で希釈し、ＨＰＬＣで分析した。８時間後の各反応液に含まれるルミクロムの量を図５に示す。

図５に示す結果のとおり、ｐＨ５．０でもルミクロムの生成は確認されたが、ｐＨが６．０以上であればルミクロムが効率的に産生されることが明らかとなった。但し、緩衝液の成分によってルミクロムの産生量が変化する場合があった。

実施例７： 休止菌体反応によるルミクロムの生産に与える菌体量の検討
上記実施例６において、事前培養したＴＰＵ３５９８株の湿重量を１９７ｍｇ、３９４ｍｇ、または５９１ｍｇとし、それぞれ１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＬ）に懸濁し、１８．８ｍｇから１１２．８ｍｇのリボフラビン（５ｍＭから３０ｍＭ）を添加して、３０℃で反応した。添加したリボフラビンがすべてルミクロムへと変化するために要した時間と使用した菌体量との関係を図６に示す。

図６の結果のとおり、使用する休止菌体の量が多いほど、短時間でもリボフラビンをルミクロムへ効率的に変換できる傾向が認められた。

実施例８： 凍結菌体によるルミクロムの製造実験
上記実施例４と同じ方法で調製した洗浄菌体を−２０℃で２８日間保存した後、凍結菌体を５００ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この懸濁液に、リボフラビン（３．８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を添加して、上記実施例４と同様に３０℃で２４時間振盪反応した後、反応生成物を再結晶して２．４ｇ（９．９ｍｍｏｌ）のルミクロムを得た。この結果より、リボフラビン含有培地で培養した菌体は、凍結保存した後も高純度のルミクロムを得るために使用できることが明らかになった。

実施例９： 破砕菌体によるルミクロムの製造実験
表４に示す組成を有し且つリボフラビン（３８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を添加した液体培地Ｃ（１０００ｍＬ）にミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８株を一白金耳植菌して３０℃で１６時間振盪培養した。この培養液を４℃、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して集菌し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。さらに、洗浄した菌を同緩衝液に懸濁し、多検体細胞破砕機（安井器械社製「マルチビーズショッカー」）を用い、菌体を２，７００ｒｐｍで６分間破砕した。次に、菌体破砕液を４℃、２２，３００×ｇで１０分間遠心分離して沈殿を集めた。この破砕菌体を用いて、上記実施例４と同様に１．９ｇのリボフラビンと３０℃で２４時間振盪反応し、反応生成物を再結晶して１．２ｇのルミクロムを得た。

この結果より、破砕などの方法で処理した菌体でも高純度のルミクロムを得るために使用できることが明らかになった。

実施例１０： 様々なミクロバクテリウム属微生物によるルミクロムの製造実験
上記実施例でミクロバクテリウム属微生物がリボフラビンをルミクロムに変換する能力に優れていると推定されたので、表５に示す９種類のミクロバクテリウム属の微生物について、リボフラビンをルミクロムに変換する能力を調べた。具体的には、１００ｍＭのリボフラビンを含み且つ表２または表４の組成を有する培地（それぞれ培地Ｂと培地Ｃという）を用いて、それぞれ上記実施例１（１）および実施例１（２）と同様の方法で４８時間培養した。培養液を２５℃、２２，３００×ｇで遠心分離し、その上清を上記実施例１（１）と同様の条件のＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣチャートのピークの面積比と、別途、市販のルミクロムとリボフラビンを用いて作成した検量線から、ルミクロムの収率を算出した。結果を表５に示す。

表５に示す結果のとおり、何れのミクロバクテリウム属微生物もリボフラビンをルミクロムに変換する能力を有しており、リボフラビンからルミクロムへの変換に有効であることが実証された。

Claims (8)

1. ルミクロムを製造するための方法であって、
   ミクロバクテリウム属微生物の菌体とリボフラビン過飽和液とを混和することにより、リボフラビンをルミクロムに変換する工程を含むことを特徴とする方法。
2. 上記リボフラビン過飽和液中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する請求項１に記載の方法。
3. さらに、上記変換工程の前に、リボフラビンを含む培地中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する工程を含み、
   上記変換工程において、菌体として、事前培養した上記ミクロバクテリウム属微生物の休止菌体を用いる請求項１に記載の方法。
4. さらに、上記変換工程の前に、リボフラビンを含む培地中、上記ミクロバクテリウム属微生物を培養する工程、および、
   事前培養した上記ミクロバクテリウム属微生物の菌体に、凍結、乾燥、破砕および固定化から選択される１以上の処理を行う工程を含み、
   上記変換工程において、菌体として、上記処理菌体を用いる請求項１に記載の方法。
5. 上記の変換工程において、リボフラビンを添加し、リボフラビンの過飽和状態を維持する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 上記ミクロバクテリウム属微生物として、ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３）および／またはミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４）を用いる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 上記ミクロバクテリウム属微生物として、ミクロバクテリウム・オキシダンス、ミクロバクテリウム・リクエファシエンス、ミクロバクテリウム・サペルダエ、ミクロバクテリウム・アエロラタム、ミクロバクテリウム・アラビノガラクタノリティカム、ミクロバクテリウム・エステラロマティクム、ミクロバクテリウム・ケラタノリチキューム、ミクロバクテリウム・マリティピカムおよびミクロバクテリウム・テスタセウムからなる群より選択される１種以上を用いる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９８（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７３）または ミクロバクテリウム ｓｐ．ＴＰＵ３５９９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７４）。