JP2014083019A - 微生物を用いる鉄含有量の少ない没食子酸含有組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物培養物から得られた粗結晶を60℃以上の熱水で溶解した上で再度晶析を行うという安価かつ簡易な工程で精製を行うにもかかわらず、鉄含有量が少なく没食子酸含有量が多い組成物を高収率で得る方法を開発した。
【選択図】なし
Description
また、没食子酸や没食子酸エステルは防食剤としても有用であることが知られており(特開平9−296200)、没食子酸を原料として合成されるピロガロールや没食子酸エステルを縮合させたフェノール樹脂は、電子情報材料(絶縁性高分子材料)として有用であることが知られている(特開2011−111543)。一方、半導体加工用の絶縁性高分子材料は、微量の金属不純物が不良品の原因となるため、非常に低いレベルにまで金属不純物を低減させる必要があることが知られている(特開2001−201868)。
〔1〕以下の工程を含む、鉄含有量が10ppm以下である没食子酸含有組成物の製造方法:
(1)微生物により没食子酸含有組成物を培養液中で製造する工程、
(2)前記培養液中に没食子酸含有組成物の結晶を生成させる工程、
(3)前記結晶を60℃以上の熱水で溶解して没食子酸含有溶液を得る工程、
(4)前記没食子酸含有溶液中に没食子酸含有組成物の結晶を生成させる工程、および
(5)前記結晶を母液から分離して、鉄含有量が10ppm以下である没食子酸含有組成物を得る工程。
〔2〕前記組成物の鉄含有量が0.1ppm以下である、前記〔1〕記載の方法。
〔3〕前記〔1〕または〔2〕に記載の方法により製造される、没食子酸含有組成物。
本発明の製造方法に係る没食子酸を産生する微生物としては、没食子酸を産生する微生物であれば何ら限定されないが、例えばプロトカテク酸の5位を酸化する酵素活性(以下、プロトカテク酸5位酸化活性という)を有する蛋白質を発現する微生物を用いることができる。当該微生物は、好ましくは、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を原料として没食子酸を産生できる微生物である。
例えば、テレフタル酸を原料として没食子酸を産生する微生物の場合、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ、テレフタル酸トランスポーター、およびプロトカテク酸5位酸化酵素を生産する能力を有する微生物であることが好ましい。
フタル酸を原料として没食子酸を産生する微生物の場合、フタル酸ジオキシゲナーゼ、フタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタレート4,5-シス-ジヒドロキシジオール・ジヒドロゲナーゼ、4,5-ジヒドロキシフタレート脱炭酸酵素、フタル酸トランスポーター、およびプロトカテク酸5位酸化酵素を生産する能力を有する微生物であることが好ましい。
イソフタル酸を原料として没食子酸を産生する微生物の場合、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼ、イソフタル酸トランスポーター、およびプロトカテク酸5位酸化酵素を生産する能力を有する微生物であることが好ましい。
なお、ロドコッカス属RHA1のように、プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現する微生物はパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力も有しているため、プロトカテク酸5位酸化酵素蛋白質を発現させた微生物を、パラヒドロキシ安息香酸を含む培地で培養することにより、パラヒドロキシ安息香酸から没食子酸を製造することができる。
また、例えばシュードモナス(Pseudomonas)属またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物等の公知の微生物株を変異処理し、没食子酸生産性を向上させるために選択した没食子酸高生産株を用いることも好適な例として挙げられる。
本発明の製造方法に係る微生物の培養液中においてインビトロで没食子酸を合成する場合、合成反応の前に、該培養液中の菌体から酵素を抽出する処理を行うことが好ましい。当該処理は、没食子酸合成に必要な酵素を菌体から抽出する処理であれば特に限定されないが、好ましくは、特開2009−213392に開示されている処理である。例えば、培養液から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕する処理、該破砕処理により得られる破砕物を水等で抽出する処理、該抽出物をさらに硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等により精製する処理等が挙げられる。そのような処理により得られる酵素タンパク質または菌体そのものは、適当な支持体に固定化して没食子酸合成反応に用いることもできる。また、そのような処理を行った後、没食子酸合成反応の前に、破砕された菌体を遠心分離等により除いてもよい。
なお、没食子酸合成に必要な酵素としては、例えば、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸もしくはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成するために必要な酵素、および/またはプロトカテク酸の5位を酸化する酵素が挙げられる。
上記の方法により得られる培養液に、インビトロでの没食子酸合成反応のために適切な緩衝液(例えば、0.02〜0.2M程度のリン酸緩衝液(pH6〜10))に、反応原料となるプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を溶解したものが加えられる。これらの反応原料の濃度は、0.1mM〜1M程度が適当である。インビトロでの没食子酸合成反応の反応温度およびpHは特に限定されないが、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃が適当であり、反応液中のpHは5〜10、好ましくは6〜9付近とすることができる。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。
なお、反応時に酸化剤を添加すると、没食子酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、没食子酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜0.05%(W/V)、好ましくは0.005〜0.02%である。
本発明の製造方法に係る培養液を微生物菌体から分離する工程で使用する方法は限定されないが、膜濾過、濾過、デカンテーション、遠心分離などが用いられ、遠心分離が好ましい。分離時の温度は特に限定されない。微生物が産生した没食子酸含有組成物を精製する場合、培養後の培養液を菌体から分離し、以降の精製工程に用いる。一方、微生物が産生した酵素を利用して培養終了後にインビトロで没食子酸を合成する場合、必要に応じて培養液中の菌体の破砕処理等を行った後、インビトロでの没食子酸合成反応に用いる。当該合成反応の前に、破砕等の処理を加えた菌体から培養液を分離し、当該合成反応に用いることもできる。当該合成反応は、反応液への濃硫酸の添加等により停止することができる。必要に応じて、当該合成反応を行った培養液を菌体から分離し、以降の精製工程に用いる。
前記分離工程によって得られる培養液から没食子酸含有組成物を得る方法としては、一般的には、酢酸エチル等の有機溶剤による抽出、減圧濃縮、低温における没食子酸の析出(冷却晶析)、酸・アルカリ薬剤や各種塩類による析出等が用いられる。また、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法等を単独でまたは組み合わせることによっても没食子酸含有組成物を得ることができる。培養液中に生成された没食子酸塩に酸(好ましくは塩酸または硫酸)を作用させて遊離カルボン酸としてもよい。本発明の製造方法は、濃縮、冷却晶析等により得られる粗結晶を60℃以上の熱水で溶解した後に、当該溶解液を用いて再度晶析を行うことを特徴とする。
用いる熱水の量としては、没食子酸含有組成物の溶解に十分であり、かつ後の結晶生成工程に適切な量であれば、特に限定されない。没食子酸含有組成物の加熱溶解液中の不純物は、当該溶解液に活性炭を添加して吸着させることにより除去してもよい(活性炭処理)。前記溶解液から没食子酸含有組成物を得る方法としては、前記の培養液から没食子酸含有組成物を得る方法と同様の方法が挙げられるが、冷却晶析が特に好ましい。このような処理を経て得られた結晶を、鉄含有量の多い母液から分離することにより、鉄含有量の少ない結晶を得ることができる。
特開2009−213392に記載された、pUTCH_TPACB1およびpRTCH_HFM145_L200V_Y385Fを形質転換した組み換え大腸菌JM109(DE3)株を培養し、特開2009−213392に記載の方法に準拠して、反応液量を100mLとして、テレフタル酸から没食子酸をインビトロで合成した。
実施例1で得た没食子酸を含む培養液に濃硫酸を添加し、pHを5に調整することによって反応を停止させた。反応停止液を4000×gにて10分間、遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を減圧下、65℃で処理することによって濃縮を行い、8.3wt%の没食子酸を含む4.2gの濃縮液を得た。この濃縮液を50℃に保温、攪拌しながら濃硫酸を添加してpHを3.0に調整した後、4℃まで冷却し、没食子酸含有組成物の結晶を析出させた。結晶が析出したスラリー液を5A濾紙で濾過し、得られた濾滓を冷水でリンスして没食子酸含有組成物の湿粗結晶0.3gを得た。得られた粗結晶を乾燥させた後、結晶中の鉄含有量をICP−MSで分析した結果、53ppmであった。
実施例1で得た没食子酸を含む培養液に濃硫酸を添加し、pHを5に調整することによって反応を停止させた。反応停止液を4000×gにて10分間、遠心分離し、上清を回収した。得られた上清に2.3Lの酢酸エチル、350mlのHEPES緩衝液、および2N HCl 11.5mlを加えて、5分間激しく混和し、遠心分離(室温、5分、20000×g)を行った。二層に分離した培養液・酢酸エチル混和物の上層(酢酸エチル層)を回収し、真空遠心乾燥機で乾燥した。乾燥後、23ml アセトニトリルを加えて5分間激しく混和し、さらに440mlの水で希釈し、孔径0.2μmのフィルターで濾過した。得られた濾液に17mgの活性炭白鷺Aを添加し、1時間保持後、5A濾紙で加熱下、濾過し活性炭を除去した。得られた濾液を真空遠心乾燥機で乾燥し、黄褐色の結晶0.23g(単離収率67%)を得た。得られた結晶中の鉄含有量をICP−MSで分析した結果、45ppmであった。
Claims (3)
- 以下の工程を含む、鉄含有量が10ppm以下である没食子酸含有組成物の製造方法:
(1)微生物により没食子酸含有組成物を培養液中で製造する工程
(2)前記培養液中に没食子酸含有組成物の結晶を生成させる工程、
(3)前記結晶を60℃以上の熱水で溶解して没食子酸含有溶液を得る工程、
(4)前記没食子酸含有溶液中に没食子酸含有組成物の結晶を生成させる工程、および
(5)前記結晶を母液から分離して、鉄含有量が10ppm以下である没食子酸含有組成物を得る工程。 - 前記組成物の鉄含有量が0.1ppm以下である、請求項1記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法により製造される、没食子酸含有組成物。
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