WO2007135941A1 - 酢酸菌型セラミドの製造方法 - Google Patents

酢酸菌型セラミドの製造方法 Download PDF

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ceramide
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Shin Ogawa
Takahiro Oda
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Mizkan Group Corporation
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/02—Acetobacter

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ceramide. Specifically, it is efficient by improving the content of N-2′-hydroxypalmitoyl-sphinganine, which is a kind of ceramide (hereinafter sometimes referred to as acetic acid ceramide), in acetic acid bacteria. It relates to a manufacturing method.
  • Ceramide is a general term for a fatty acid amide bond to the amino group of sphingosin, which is a long-chain base, and is a kind of sphingolipid, which is widely distributed in microorganisms, animals and plants, and especially in humans, skin It is characteristically present as a component of organs and plays an important role in preventing moisture loss and skin dryness.
  • plant-derived ceramides such as wheat, rice and soybeans
  • skin beautifying effects such as moisturizing, preventing rough skin, and preventing wrinkles
  • plant-derived ceramide has a chemical structure different from that of animal-derived ceramides such as humans, and has a problem such as weak skin beautifying effect.
  • ceramide extracted from animal power such as bovine brain has a similar chemical structure to human ceramide (hereinafter sometimes referred to as human-type ceramide) and has a strong skin-beautifying effect, but it is a BSE problem.
  • human-type ceramide human-type ceramide
  • human use of ceramide derived from animals such as bovine brain by oral intake tended to be avoided.
  • the ceramide derived from microorganisms has a chemical structure similar to that of human ceramide, and is expected to be highly effective.
  • ceramides derived from microorganisms such as Sphingomonas who have no dietary experience have doubts about safety. The rest is taken away from oral intake.
  • acetic acid bacteria a kind of prokaryote, is a highly safe microorganism traditionally used in the production of vinegar and has been confirmed to contain acetic acid ceramide (for example, Non-patent document 3).
  • This acetic acid bacteria type ceramide has a structure in which sufinganin, which is a precursor of sphingosine at the sphingoid base part of ceramide derived from animals, and an amide bond with fatty acid, It has a structure common to ceramides and is expected to have strong physiological activities such as the effect of human skin.
  • the content of ceramide is estimated to be about 2 to 4 mg (3.5 to 7 / ⁇ ⁇ 0 1) ⁇ about dry cells. (See, for example, Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4).
  • acetic acid bacteria have a low growth ability, a low yield of acetic acid bacteria is one of the causes of poor production efficiency of acetic acid ceramide using acetic acid bacteria.
  • Non-Patent Document 1 “Fragrance Journal”, 23 ⁇ , p. 81-89, 1995
  • Non-patent document 2 “Bioindustry”, 19 ⁇ , p. 16-26, 2002
  • Non-patent document 3 Obihiro Lab., 23 ⁇ , p. 917-925, 1978
  • Non-patent literature 4 Doctoral dissertation, graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University, written by Eigo Goto, p. 11-41, 2001
  • Non-Patent Document 5 Lipid biochemistry research, 42 ⁇ , p.246-249, 2000
  • An object of the present invention is to develop a method for improving the content of acetic acid bacteria type ceramide in acetic acid bacteria, and to provide a method for efficiently producing acetic acid bacteria type ceramide which is expected to have a physiological effect such as a skin beautifying effect. About that. Means for solving the problem
  • the present inventor has determined that the content of ceramide in acetic acid bacteria can be increased by exposing the collected acetic acid bacteria to low pH and high temperature conditions after culturing the acetic acid bacteria.
  • the present invention was completed by finding that it significantly increases, further determining the optimum environmental conditions during the treatment, and examining the acetic acid bacteria used and their culture conditions.
  • the present invention relates to the following items.
  • Acetic acid bacteria in acetic acid bacteria characterized by holding acetic acid bacteria after culturing at pH 2.0 to 8.0 and Z or temperature 4 to 80 ° C for 3 hours to 7 days
  • Method for increasing ceramide content Method for increasing ceramide content.
  • Acetic acid bacteria in acetic acid bacteria characterized in that acetic acid bacteria after culturing is maintained at pH 2.0 to 4.5 and Z or temperature 30 to 70 ° C for 1 day to 4 days Method for increasing ceramide content.
  • Acetobacter malorum NCI1683 strain (FERM BP-10595) is used as the acetic acid bacterium. (1) to (3)! The method for increasing the ceramide content of acetic acid bacteria in acetic acid bacteria described in 1.
  • the ceramide content is 6 mg or more, preferably 7 mg or more, more preferably 9 mg or more, particularly preferably 11 mg or more and 20 mg or less per lg of dry cells.
  • the method for increasing the content of ceramide in acetic acid bacteria in acetic acid bacteria according to any one of (1) to (5).
  • the acetic acid bacterium used in the present invention is not particularly limited as long as it is an acetic acid bacterium that produces ceramide.
  • the genus Gluconacetobacter, G1 uconobacter, acetopacter Examples are acetic acid bacteria belonging to the genus (Acetobacter), the genus Asaia, or the genus Acidomonas.
  • Examples of acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconobacter include Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, and the like.
  • the acetic acid bacteria of the genus Acetobacter include Acetobacter tropicalis, Acetobacter indonesiensis, Acetobacter syzygii, Acetobacter syzygii, Acetobacter syzygii ⁇ Cibinongensis, Acetobacter orleanensis, Acetobacter orientalis, Acetobacter past eurianus, Acetobacter orleanensis, Acetobacter orleanensis, Acetobacter orleanensis, Acetobacter orleanensis, Examples include Acetobacter lovaniensis, Acetooacter aceti, Zose ⁇ nocuta ⁇ 'homohum cetobacter pomorum, Acetobacter malorum.
  • examples of the acetic acid bacteria belonging to the genus Asaia include Asaia bog orensis and Asaia siamensis.
  • examples of acetic acid bacteria belonging to the genus Acididomonas include acidomonas methanolicus.
  • acetic acid bacteria in addition to the above, acetic acid bacteria used for vinegar production, those isolated from the natural world, and preserved strains that can be stored and stored in existing microorganism preservation institutions Etc. can be used as appropriate.
  • acetic acid bacteria belonging to Acetobacter malorum have high growth ability and high acetic acid bacteria type ceramide content. Because of its particularly excellent growth, it is suitable for the efficient production of acetic acid ceramide.
  • Acetobacter malumum NCI1683 (FERM BP-10595) strain is suitable in the present invention. Used.
  • Acetobacter maliorum NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683) strain
  • FERM BP-10595 is an acetic acid bacterium isolated from Russian fermented food Smetana, the ubiquinone type is Q9, and the sequence of 16S rRNA is perfectly matched. Acetobacter malorum) (for example, “International Journal of Systematic and Evolutionary Micro biology”, 52 p, p. 1551— 1558, 2002), and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Sakaihigashi, 1-chome, 1-chome, 1-chome, 305-8566, Ibaraki Prefecture, Japan) 2006 Deposited under the accession number FERM BP-10595 dated April 7,
  • the acetic acid bacteria belonging to Gluconacetobacter hansenii also have high growth ability and acetic acid, as in the case of Acetobacter malomm. It is suitable for efficient production of acetic acid ceramide because it has a high fungus-type ceramide content and is particularly excellent in growth in acetic acid-containing medium as described later. Hansenii NCI1468 (Glue onacetobacter hansenii NCI1468) strain (FERM BP-10596) is preferably used in the present invention.
  • the Dalconacetobacter ⁇ ⁇ Hansenii NCI1468 (Gluconacetobacter hansenii NCI1468) strain (FERM BP-10596) is an acetic acid bacterium isolated from Nata de coco, the ubiquinone type is Q10, and the sequence of 16S rRNA is completely Is a strain identified as Gluconacetobacter hansenii, and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan) Deposit number FERM BP-10596 dated April 7, 2006 at 1-chome, 1-chome, 1-chome 6).
  • acetic acid bacteria after acetic acid bacteria are cultured and collected, they can be treated at a low pH and at a high temperature to significantly improve the content of acetic acid ceramide in the acetic acid bacteria. .
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc. is used as the medium, and if necessary, a medium containing an appropriate amount of a micronutrient source required for acetic acid bacteria to grow.
  • a synthetic medium or a natural medium may be used.
  • the carbon source include various carbohydrates including glucose and sucrose.
  • the nitrogen source natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
  • the pH of the medium is usually suitably in the range of pH 2.5 to 7, and more preferably in the range of pH 2.7 to 6.5.
  • the pH is determined using various acids, bases, buffers, etc. Can be adjusted.
  • the amount of ethanol added is generally about 0.5-8 volume Z volume%.
  • a medium in which acetic acid is assimilated by adding acetic acid to the medium is more preferably used.
  • the ethanol concentration is about 0.3 volume Z volume% or less. More desirably, it should be 0.1 volume Z volume% or less.
  • the concentration of acetic acid (salt) that should be added in the form of acetate may be appropriately selected according to the acetic acid bacterium to be used. A volume percentage is selected.
  • a method for culturing acetic acid bacteria a stationary culture method, a shaking culture method, an aeration and agitation culture method, and the like can be used. It is possible to adopt the method used for cultivation of acetic acid bacteria, and cultivate the acetic acid bacteria under aerobic conditions, and the culture temperature is usually around 30 ° C.
  • acetic acid bacteria collected by collecting the culture fluid force cultured by the above method are suspended in a solution and treated at low pH and high temperature to thereby contain ceramide in the acetic acid bacteria.
  • the amount can be significantly improved.
  • any solution for suspending acetic acid bacteria any solution such as water, a buffer solution, or a culture solution can be used. It should be noted that by setting the pH of the solution for suspending acetic acid bacteria to 2.0 to 8.0, the content of acetic acid ceramide in acetic acid bacteria can be further increased significantly. preferable. If the pH is less than 2.0, the effect of increasing the content of acetic acid ceramide in acetic acid bacteria is weakened, which is not preferable. Further, even if the pH is raised above 8, it is the same and is not preferable. A more preferred pH is 2.0 to 4.5. Particularly preferably, the pH is 2 to 3.
  • acetic acid and citrate which are organic acids
  • hydrochloric acid and sulfuric acid which are inorganic acids, and salts thereof.
  • the treatment method is not particularly limited, for example, a state of leaving without shaking, aeration, stirring, etc., and the treatment period is preferably 3 hours to 7 days. If the treatment period is less than 1 day, the effect of increasing the content of acetic acid ceramide in acetic acid bacteria is weakened, which is not preferable. The same is true for a treatment period longer than 7 days. Further preferred is 1 to 4 days.
  • the temperature at the time of treatment is not particularly limited as long as the effect of increasing the content of acetic acid ceramide is obtained.
  • a temperature range of 4 ° C to 80 ° C is exemplified.
  • a preferable temperature range is 4 ° C to 70 ° C.
  • the preferred temperature range is 30 ° C to 80 ° C, particularly 40 ° C to 70 ° C, and particularly preferably 60 ° C to 70 ° C.
  • the acetic acid bacteria whose content of acetic acid bacteria-type ceramide has been increased by performing the static treatment as described above is subjected to a treatment such as washing and drying as necessary, and then, as it is or after crushing treatment. It can be used in various ways after any processing.
  • the acetic acid bacteria type ceramide can be extracted from the acetic acid bacteria and purified.
  • a known lipid extraction method can be carried out, and there is no particular limitation.
  • acetic acid bacteria obtained by the above culture are collected, and then ethanol, acetone
  • the ceramide quantification method in the present invention includes the reaction of a lipid extract in the presence of pyridine and benzyl chloride to introduce a benzoyl group, and an ultraviolet wavelength of 230 nm by high performance liquid chromatography.
  • the detection method below and the method of detecting the lipid extract by high performance liquid chromatography using a light scattering detector can be mentioned.
  • the ceramide content in the cells can be significantly increased, and that the ceramide content is 6 to 18.59 mg of acetic acid bacteria per lg of dried cells. ing
  • the acetic acid bacteria-type ceramide thus prepared can be used as a composition that can be expected to have strong and physiological effects such as improvement of skin function.
  • Acetobacter ⁇ ⁇ ⁇ Marolarum NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683) strain (F ERM BP—10595) in 5 ml of YPG liquid medium (glucose 3 wt Z volume 0 / o, polypeptone 0.3 wt Z volume%, yeast extract 0 5% by weight Z volume%, PH 6.5) was inoculated, and cultured at 30 ° C for 48 hours with shaking at 120rpm, before culturing.
  • the prepared preculture was added to 1 L of YPG liquid medium and sodium acetate was added to a final concentration of 0.8 wt Z volume% (pH adjusted to 6.5 with 1N hydrochloric acid).
  • 2 0 wt Z volume% aqueous solution of sodium acetate was adjusted so that the sodium acetate is 0.8 wt Z capacity 0/0 at a final concentration of 2 Ritsuta Ichiyo Jafua containing the prepared by adding.)
  • 1% of the mentor was inoculated, and the aeration rate was 0.5 liter Z minutes, rotation speed was 500 rpm, and aeration and agitation at 48 ° C. for 48 hours to obtain 1 liter of the culture solution after completion of the culture.
  • the culture solution obtained here is centrifuged at 8, 0 OOg for 5 minutes to recover acetic acid bacterial cells, resuspended in 1/6 volume of culture supernatant (pH 4.2), and concentrated 6-fold bacterial cells. A liquid was prepared.
  • the bacterial cell suspension was centrifuged to collect the cells, and then resuspended and collected with 10 ml of deionized water to wash the cells and freeze-dry them.
  • the total lipid obtained by concentrating to dryness by sucking the organic solvent was added to a 0.4N aqueous solution of sodium hydroxide and then subjected to weak alkali decomposition to recover the recovered alkali-stable lipid.
  • This benzoyl derivative was detected by UV absorption at 230 nm using high performance liquid chromatography.
  • a standard prepared using a purified product of N-2, -hydroxypalmitoylsphinganin (acetic acid ceramide), which was separately purified from Dalconacetobacter zylinas NBRC15237 (Glucon acetobacter xylinus NBRC15237).
  • the curve was used to quantify acetic acid ceramide.
  • the content of acetic acid bacteria type ceramide per lg dry acetic acid bacteria was calculated, and the effect of the treatment was compared.
  • Table 1 shows the amount of dry acetic acid bacteria per liter of medium (gZ liters), the content of acetic acid ceramide per lg of dry acetic acid bacteria (mgZg), and the acetic acid bacteria per liter of medium. The results of determining the amount of ceramide produced (mgZ litter) were shown. (Table 1: Effect of pH)
  • the pH is preferably 2.0 to 8.0, more preferably 2.0 to 4.5, and particularly preferably 2.0 to 3.0.
  • Acetobacter malorum NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683) strain (FERM BP-10595) was added to YPG medium to a final concentration of 0.8% sodium acetate for 48 hours. Cultivate the culture broth obtained here, 8000
  • a 6-fold bacterial cell concentrate was prepared.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the cells were collected, washed, freeze-dried, the amount of dry acetic acid cells per liter of the medium (gZ liters), and the acetic acid bacteria per lg of dry acetic acid cells.
  • the ceramide content (mgZg) and the production amount of acetic acid ceramide per 1 liter of medium (mgZ liter) were determined. Table 2 shows the results. (Table 2: Effect of acetic acid)
  • the amount of dry acetic acid cells per liter of medium (gZ liters) and the acetic acid bacteria per lg of dry acetic acid cells were the same as in Example 1.
  • the amount of ceramide content (mgZg) and the amount of acetic acid ceramide produced per liter of medium (mgZ liter) were determined as “before treatment”.
  • Acetobacter malorum NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683) strain (FERM BP-10595) was added to YPG medium to a final concentration of 0.8% sodium acetate for 48 hours. Incubate and centrifuge the resulting culture solution at 8,000 Og for 5 minutes to recover the acetic acid cells. Resuspend in 1/6 volume of culture supernatant to obtain a 6-fold concentrated cell solution. Prepared.
  • the 6-fold concentrated bacterial cell solution was adjusted to pH 3 with 6N hydrochloric acid in the same manner as in Example 2, and left in an incubator at each temperature shown in Table 3 for 4 days.
  • Example 1 According to the method described in Example 1, the cells after high-temperature treatment were collected and washed, the recovered cells were freeze-dried, and dried acetic acid cells per 1 liter of the medium. The amount of acetic acid bacteria ceramide (mgZg) per liter of dried acetic acid microbial cells (mgZg) and the amount of acetic acid bacteria ceramide produced per 1 liter of medium (mgZ liters) were determined. Table 3 shows the results. It was. (Table 3: Effect of temperature)
  • the ceramide content increased remarkably by a factor of 8 or more compared to the case of temperature of 4 ° C, and the ceramide production amount was also significantly correlated. Increase was confirmed.
  • a preferable temperature is 30 to 70 ° C., and 60 to 70
  • Acetobacter malorum NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683) strain (FERM BP-10595) was cultured for 48 hours in a medium in which sodium acetate was added to YPG medium to a final concentration of 0.8%.
  • the culture broth obtained here was centrifuged at 8,000 Og for 5 minutes to recover the acetic acid bacterial cells, and resuspended in 1/6 volume of the culture supernatant to prepare a 6-fold bacterial cell concentrate. .
  • Example 4 Effect of processing time
  • the treatment time is preferably 3 hours to 7 days, and more preferably 1 day to 4 days.
  • Example 2 the strain of Dalconacetobacter Hansenii NCI1468 (Gluconace tobacter hansenii NCI1468) (FERM BP-10596) was added to the YPG medium with sodium acetate to a final concentration of 0.8%. The resulting culture is centrifuged at 8, OOOg for 5 minutes to recover the acetic acid cells and resuspended in 1/6 volume of culture supernatant to give 6-fold bacteria. A body concentrate was prepared.
  • Example 2 According to the method described in Example 1, the cells after standing treatment were collected and washed, and the collected cells were freeze-dried, and dried acetic acid bacteria per 1 liter of the medium. Body mass (gZ liter), acetic acid ceramide content per mg lg of dried acetic acid bacteria (mgZg), and acetic acid ceramide production per mg liter of medium (mgZ liter) were determined and compared with those before treatment The results are shown in Table 5. (Table 5: Ceramide production test in the genus Dalconacetopactor)

Abstract

【課題】酢酸菌において、セラミドを高含有化することにより、美肌効果などの生理作用が期待されている酢酸菌型セラミドを効率良く生産する方法を提供する。 【解決手段】培養終了後の酢酸菌を、ｐＨ２．０～８．０、温度４～７０°C、３時間～７日間保持することによって、酢酸菌中の酢酸菌型セラミドを従来の１０～３０倍と高濃度で含有化させることができる酢酸菌型セラミドの増加方法を開発した。用いる酢酸菌はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｍａｌｏｒｕｍ　ＮＣＩ１６８３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５９５）、または、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｎｓｅｎｉｉ　ＮＣＩ１４６８）株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５９６）が好ましい。

Description

明 細 書
酢酸菌型セラミドの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、セラミドの製造方法に関する。具体的には、セラミドの一種である N— 2' ーヒドロキシパルミトイルースフィンガニン (以下、酢酸菌型セラミドと称する場合もある )の酢酸菌体中の含有量を向上させることによる効率的な製造方法に関する。
背景技術
[0002] セラミドは、長鎖塩基であるスフインゴシンのァミノ基に脂肪酸がアミド結合したもの の総称であって、スフインゴ脂質の一種であり、微生物や動植物に広く分布しており、 ヒトにおいては特に皮膚器官の構成成分として特徴的に存在し、水分の損失及び皮 膚の乾燥を防ぐなどの重要な役割を果たして 、る。
[0003] なお、小麦、米、大豆等の植物由来のセラミドを経口摂取することにより、保湿、肌 荒れ防止改善、シヮ防止改善等の美肌効果があることが知られているが (例えば、非 特許文献 1及び非特許文献 2参照）、植物由来のセラミドは、ヒトなどの動物由来のセ ラミドとは化学構造が異なり、美肌効果が弱いなどの問題があった。
[0004] 一方、牛脳などの動物力も抽出したセラミドは、ヒトのセラミド (以下、ヒト型セラミドと 称する場合もある）と化学構造が似ており、美肌効果は強いのであるが、 BSE問題な どにより、牛脳などの動物由来のセラミドを経口摂取などによってヒトが利用すること は敬遠される傾向があった。
[0005] また、微生物由来のセラミドはその化学構造がヒト型セラミドに類似し、その高い効 果が期待されている力 例えば、スフインゴモナスなどの食経験のない微生物由来の セラミドは安全性に疑問が残り、経口摂取が敬遠されている。
[0006] 一方、原核生物の一種である酢酸菌は、伝統的に食酢の製造に利用されている安 全性の高い微生物であり、酢酸菌型セラミドを含有することが確認されている（例えば 、非特許文献 3参照)。
[0007] この酢酸菌型セラミドは、動物由来のセラミドのスフインゴイド塩基部分のスフインゴ シンの前駆体であるスフインガニンと脂肪酸がアミド結合した構造を有しており、ヒト型 セラミドに共通する構造を持って 、て、ヒトの美肌効果などの生理活性が強 、ことが 期待されている。
[0008] 以上のことから、伝統的に食酢の製造に利用されている安全性の高い酢酸菌を用 Vヽ、高 ヽ付加価値を持った酢酸菌型セラミドを効率良く生産することが求められて ヽ た。
[0009] しかし、例えば、食酢醸造に用いられる代表的な酢酸菌においては、セラミドの含 有量は 2〜4mg (3. 5〜7 /Ζ ΠΙ01)Ζ 乾燥菌体程度であると推定され (例えば、非特 許文献 3及び非特許文献 4参照）、決して満足できるものではな力つた。
[0010] また、酢酸菌は増殖能力が低いので、酢酸菌の収量が少ないことも、酢酸菌を用い た酢酸菌型セラミドの製造効率が悪い原因のひとつであった。
[0011] なお、これまでに酢酸菌型セラミドの酢酸菌中の含有量を増加させた改良例として は、酢酸菌をエタノール添加培地で培養した場合に、エタノールを添加しない培地 で培養した場合に比べて、セラミド含有量が約 2倍に増加することが開示されていた 力 S (例えば、非特許文献 5参照）、さらに、酢酸菌中の酢酸菌型セラミドの含有量を向 上させ、また、酢酸菌の増殖を促進させて、酢酸菌型セラミドをより効率的に製造す る方法を開発することが求められていた。
非特許文献 1 :「フレダランス'ジャーナル（Fragrance Journal)」、 23卷、 p. 81〜8 9、 1995年
非特許文献 2 :「バイオインダストリ一（Bioindustry)」、 19卷、 p. 16〜26、 2002年 非特許文献 3 :帯大研報、 23卷、 p. 917〜925、 1978年
非特許文献 4:岩手大学大学院連合農学研究科博士論文、後藤英嗣著、 p. 11〜4 1、 2001年
非特許文献 5 :脂質生化学研究、 42卷、 p. 246- 249、 2000年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の目的は、酢酸菌において酢酸菌型セラミド含有量を向上させる方法を開 発し、美肌効果などの生理作用が期待されている酢酸菌型セラミドを効率良く製造 する方法を提供することに関する。 課題を解決するための手段
[0013] 本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、酢酸菌を培養後、集菌した酢 酸菌体を低 pH及び高温状態に曝すことにより、酢酸菌中のセラミド含有量が顕著に 増加することを見出し、さらに該処理中の最適環境条件を求め、また、用いる酢酸菌 やその培養条件についても検討して、本発明を完成した。
[0014] すなわち、本発明は以下の各項に関する。
[0015] (1)培養終了後の酢酸菌を、 pH2. 0〜8. 0及び Z又は温度 4〜80°Cで 3時間〜 7 日間保持することを特徴とする酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[0016] (2)培養終了後の酢酸菌を、 pH2. 0〜4. 5及び Z又は温度 30〜70°Cで 1日〜4 日間保持することを特徴とする酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[0017] (3)酢酸を含有し、エタノールを 0. 3容量 Z容量％以下で含有する培地で培養した 酢酸菌を用いることを特徴とする上記（1)または（2)に記載の酢酸菌中の酢酸菌型 セラミド含有量の増加方法。
[0018] (4)酢酸菌として、ァセトパクタ^ ~·マローラム NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683)株（FERM BP— 10595)を用いることを特徴とする上記（1)〜（3)の!ヽ ずれ力 1項に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[0019] (5)酢酸菌として、ダルコンァセトバクタ^ ~·ハンゼ-ィ NCI1468 (Gluconacetobac ter hansenii NCI 1468)株（FERM BP— 10596)を用いることを特徴とする上 記（1)〜（3)の 、ずれか 1項に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方 法。
[0020] (6)セラミド含有量が乾燥菌体 lgあたり 6mg以上、好ましくは 7mg以上、更に好まし くは 9mg以上、特に好ましくは l lmg以上であって 20mg以下であることを特徴とする 上記（1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加 方法。
発明の効果
[0021] 本発明により、強い生理活性が期待されている酢酸菌型セラミドの酢酸菌中の含有 量を増加させることが出来、さらに酢酸菌の収量を増カロさせることも出来て、その結果 、酢酸菌型セラミドを従来以上に効率良く生産することが可能となった。 発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0023] 本発明で用いられる酢酸菌は、セラミドを生産する酢酸菌であれば特に限定はなく 、例えば、ダルコンァセトパクター属（Gluconacetobacter)、ダルコノバクター属（G1 uconobacter)、ァセトパクター属（Acetobacter)、アサイァ属 (Asaia)またはァシド モナス属 (Acidomonas)に属する酢酸菌が例示される。
[0024] さらに詳細には、ダルコンァセトパクター属（Gluconacetobacter)の酢酸菌として は、グノレコンァセトノクタ一 'ノヽンゼニイ (Gluconacetobacter hansenii)、グノレコン ァセトノ クタ一 ·ジァゾトロフィカス (Gluconacetobacter diazotrophicus)、グノレコ ンァセトノ クタ一'インタメティウス (Gluconacetobacter intermedius)、グノレコン ァセ卜ノ ク夕一 ·サッ； ^リ (Gluconacetobacter sacchari)、グノレ =ιンァセ卜ノ ク夕一 · ザイリナス（Gluconacetobacter xylinus)、ダルコンァセトパクター 'ヨーロッパェゥ ス (Gluconacetobacter europaeus)、グノレコンァセトノ クタ一'オボエディエンス ( Gluconacetobacter oboediensリなどカ 列示 れる。
[0025] また、ダルコノバクター属（Gluconobacter)の酢酸菌としては、ダルコノバクタ^ ~ · フラトゥリ (Gluconobacter frateurii)、グノレコノノ クタ一 ·セリナス (Gluconobacte r cerinus)などが例示される。
[0026] さらに、ァセトパクター属（Acetobacter)の酢酸菌としては、ァセトバクタ一'トロピ カリス（Acetobacter tropicalis)、ァセトパクター 'インドネシェンシス (Acetobact er indonesiensis)、ァセトノ クタ一'シシキイ（Acetobacter syzygii)、ァセトノ ク ~ ·シビノンゲンシス (Acetobacter cibinongensis)、ァセトパクタ^ ~ ·オリエンタリ ス（Acetobacter orientalis)、ァセ卜ノ クタ一-ノ スッジアヌス（Acetobacter past eurianus)、ァセトノクタ一 ·オノレレァネンシス (Acetobacter orleanensis)、ァセト ノ クタ一 ·ロバ-ェンシス (Acetobacter lovaniensis)、ァセトノ クタ一 ·ァセチ (Ac etooacter aceti)、 ズセ卜ノヽクタ ~~ 'ホモフム cetobacter pomorum)、 ズセ卜ノ クタ一 ·マローラム (Acetobacter malorum)などが例示される。
[0027] さらに、アサイァ属（Asaia)の酢酸菌としては、アサイァ'ボゴレンシス (Asaia bog orensis)、アサイァ ·シァメンシス (Asaia siamensis)などが例示される。 [0028] また、ァシドモナス属（Acidomonas)の酢酸菌としては、ァシドモナス'メタノリカス（ Acidomonas methanolicus などカ 列示 れる。
[0029] さらに、酢酸菌としては、上記のほか、食酢製造に用いられている酢酸菌ゃ、自然 界より分離されたもの、また既存の微生物保存機関に保存されていて分譲可能な保 存菌株などが適宜利用可能である。
[0030] なお、上記酢酸菌のうち、ァセトパクタ^ ~ ·マローラム（Acetobacter malorum)に 属する酢酸菌は、増殖能力が高ぐまた酢酸菌型セラミド含有量も高ぐさらに後述す る酢酸含有培地での増殖が特に優れて 、ることなどから、効率的な酢酸菌セラミドの 製造に適しており、中でもァセトバクタ一'マローラム NCI1683 (Acetobacter mal orum NCI1683)株（FERM BP— 10595)は、本発明において好適に用いられ る。
[0031] 該ァセトバクタ一.マローラム NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683)株
(FERM BP- 10595)は、ロシアの発酵食品であるスメタナから分離された酢酸菌 であり、ュビキノンタイプは Q9であって、 16SrRNAの配列が完全に一致することな どから、ァセトノ クタ一'マローラム (Acetobacter malorum) (例えば、「インターナ ショナノレ ジャーナノレ ·ォブ ·システマチック ·アンド ·エボリユーショナリ一'マイクロバイ ォロン■ ~" (International Journal of Systematic and Evolutionary Micro biology)」、 52卷、 p. 1551— 1558、 2002年参照）と同定された株であり、独立行 政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国〒 305— 8566茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 2006年 4月 7日付けで受託番号 FERM B P— 10595として寄託されている。
[0032] また、上記酢酸菌のうちダルコンァセトバクタ^ ~ ·ハンゼ-ィ（Gluconacetobacter hansenii)に属する酢酸菌についても、ァセトパクター 'マローラム（Acetobacter malomm)と同様に、増殖能力が高ぐまた酢酸菌型セラミド含有量も高ぐさらに後 述する酢酸含有培地での増殖が特に優れて 、ることなどから、効率的な酢酸菌セラ ミドの製造に適しており、中でもダルコンァセトバクタ一'ハンゼニイ NCI1468 (Glue onacetobacter hansenii NCI1468)株（FERM BP— 10596)は、本発明にお いて好適に用いられる。 [0033] 該ダルコンァセトバクタ^ ~ ·ハンゼニイ NCI1468 (Gluconacetobacter hansenii NCI1468)株（FERM BP— 10596)は、ナタデココから分離された酢酸菌であり 、ュビキノンタイプは Q10であって、 16SrRNAの配列が完全に一致することなどから 、グノレコンァセトノクタ一 'ノヽンゼニイ (Gluconacetobacter hansenii)と同定され た株であり、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 2006年 4月 7日付けで 受託番号 FERM BP— 10596として寄託されている。
[0034] 本発明においては、これらの酢酸菌を培養し、集菌した後、低 pH、高温処理して、 顕著に酢酸菌中の酢酸菌型セラミドの含有量を向上させることが可能となる。
[0035] 酢酸菌の培養方法については、特に制限がなぐ従来から実施されている方法が 採用可能である。
[0036] すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機物などを含有するものが用いられ、さ らに必要に応じて、酢酸菌が生育に要求する微量栄養源を適当量含有させたもので あれば、合成培地でも天然培地でも良い。例えば、炭素源としてはグルコースゃシュ 一クロースをはじめとする各種炭水化物などが挙げられる。また、窒素源としてはぺ プトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
[0037] 培地の pHは通常 pH2. 5〜7の範囲とするのが適しており、さらに pH2. 7〜6. 5の 範囲が好ましぐ pHは各種酸、各種塩基、緩衝液等を用いて調整することができる。
[0038] さらに、上記培地に、エタノールを添カ卩した培地を用いて培養することも可能であり
、エタノールの添加量としては、 0. 5〜8容量 Z容量％程度が一般的である。
[0039] また、本発明では、上記培地に酢酸を添加し酢酸が資化されるようにした培地がさ らに好適に用いられる。この場合、酢酸の資化が起きる条件としては、該培地にエタ ノールを殆ど含有させないように留意すべきであり、例えば、エタノールの濃度として は、 0. 3容量 Z容量％以下程度がよぐさらに望ましくは 0. 1容量 Z容量％以下とす るのがよい。また、酢酸は酢酸塩の形態で添加するのが望ましぐ酢酸 (塩)の濃度と しては、使用する酢酸菌に合わせて、適宜、選択すればよいが、 0. 5〜8重量 Z容 量％程度が選択される。
[0040] 酢酸菌の培養方法としては、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の従 来力 酢酸菌の培養に利用されている方法が採用可能であり、好気的条件下で酢 酸菌を培養し、培養温度は通常 30°C前後で行なうのが良!ヽ。
[0041] 培養終了後に、培養液力 酢酸菌体を集菌する方法については特に限定はなぐ 従来から行われて 、る遠心分離法や濾過膜を用いた濃縮法などが例示される。
[0042] 本発明にお 、ては、上記の方法で培養した培養液力 集菌して回収した酢酸菌を 、溶液中に懸濁し、低 pH、高温処理することによって酢酸菌中のセラミド含有量を顕 著に向上させることができる。
[0043] 酢酸菌を懸濁するための溶液としては、水、緩衝液、培養液など任意のものが利用 可能である。なお、酢酸菌を懸濁するための溶液の pHを 2. 0〜8. 0にすることによ つて、酢酸菌中の酢酸菌型セラミドの含有量をさらに顕著に増カロさせることができる ので好ましい。 pHを 2. 0未満とすると、酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量を高める 効果が弱くなり、好ましくない。また、 pHを 8より高めても同様であり、好ましくない。さ らに好適な pHは 2. 0〜4. 5である。特に好ましくは pH2〜3である。酢酸菌を懸濁 するための溶液の pHをこのような領域に調整するには、 pHを低下させることのできる 各種の酸や塩類などを用いればよぐ例えば、有機酸である酢酸やクェン酸、無機 酸である塩酸や硫酸などや、これらの塩類が例示される。
[0044] 処理方法としては、特に限定はなぐ例えば、振とう又は通気、攪拌などを行わずに 放置する状態が例示され、処理の期間としては 3時間〜 7日が好ましい。処理の期間 を 1日未満とすると、酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量を高める効果が弱くなり、好 ましくない。また、 7日よりも長く処理の期間をとつても同様であり、好ましくない。さら に好適なのは 1日〜 4日である。
[0045] さらに、処理する際の温度については、酢酸菌型セラミド含有量を高める効果が得 られる温度であれば特に制限はなぐ例えば 4°C〜80°Cの温度範囲が例示される。 好ましい温度範囲としては、 4°C〜70°Cが例示される。なお、これらの温度範囲にお いて、 30°Cよりも低い温度では、酢酸菌型セラミドの含有量を増加させる効果が弱く なり、好ましくなぐ 80°C以上の高温にすると、菌体重量が減少するため好ましくない 。したがって、好ましい温度範囲は 30°C〜80°C、特に 40°C〜70°Cであり、とりわけ 6 0°C〜70°Cが好ましい。 [0046] 上記の要領で静置処理を行って、酢酸菌型セラミドの含有量を高められた酢酸菌 は、必要に応じて洗浄、乾燥などの処理を行った後、そのまま、あるいは破砕処理な どの加工処理を行った後、種々に利用することが可能である。
[0047] さらに、必要に応じて、酢酸菌型セラミドを上記酢酸菌から抽出精製して利用するこ とも可能である。なお、上記の抽出精製方法としては、公知の脂質抽出方法を実施 することが可能であり、特に制限はない。
[0048] 例えば、上記培養によって得られた酢酸菌を集菌し、その後、エタノール、アセトン
、酢酸ェチル等の極性溶媒を用いて酢酸菌型セラミドを抽出し、有機溶媒中で再結 晶させる方法などがある。
[0049] なお、本発明でのセラミドの定量方法としては、脂質抽出物をピリジン、塩化べンゾ ィル存在下で反応させてベンゾィル基を導入し、高速液体クロマトグラフィーにて紫 外線波長 230nm下で検出する方法や脂質抽出物を高速液体クロマトグラフィーに て光散乱検出器を用いて検出する方法などが挙げられる。
[0050] 本発明によれば、菌体中のセラミド含有量を大幅に増加させることができ、セラミド 含有量が、乾燥菌体 lgあたり、 6〜18. 59mgの酢酸菌を得ることが実証されている
。具体的に【ま、 7mg以上、 9mg以上、 l lmg以上、 13mg以上、 14mg以上、 15mg 以上、 18mg以上のものが実際に得られており、上限についても 19mg以上、例えば
20mgのものも充分に期待することができる。
[0051] このようにして調製された酢酸菌型セラミドは、肌機能改善などの強 、生理作用が 期待できる組成物として利用可能である。
実施例
[0052] 以下の実施例及び試験例により、本発明をさらに詳細に説明する。
[0053] (実施例 1) 低 pH処理によるセラミド高含有ィ匕
ァセトパクタ^ ~ ·マローラム NCI1683 (Acetobacter malorum NCI1683)株（F ERM BP— 10595)を、 5mlの YPG液体培地（グルコース 3重量 Z容量0 /o、ポリべ プトン 0. 3重量 Z容量％、酵母エキス 0. 5重量 Z容量％、 PH6. 5)に植菌し、 30°C で 48時間、 120rpmにて振とう培養して前々培養を行った。
[0054] その後、前々培養液を 5mlの YPG液体培地に 2%植菌し、 30°Cで 24時間、 120r pmにて振とう培養して前培養を行った。
[0055] 調製した上記前培養液を、 1リツターの YPG液体培地に、酢酸ナトリウムを最終濃 度 0. 8重量 Z容量％になるように添加した培地（1N塩酸にて pHを 6. 5に調整した 2 0重量 Z容量％酢酸ナトリウム水溶液を、酢酸ナトリウムが最終濃度で 0. 8重量 Z容 量0 /0となるように、添加して調製した。）の入った 2リツタ一容ジャーフアーメンターに 1 %植菌して、通気量を 0. 5リツター Z分、回転数 500rpmにて、 28°Cで 48時間、通 気攪拌培養し、培養終了後の培養液 1リツターを得た。ここで得られた培養液を 8, 0 OOgで 5分間遠心分離して酢酸菌体を回収し、 6分の 1容量の培養上清 (pH4. 2)で 再懸濁して 6倍菌体濃縮液を調製した。
[0056] この 6倍菌体濃縮液を 15mlのファルコンチューブに 5mlづっ分注し、 6N塩酸、又 は、 6N水酸ィ匕ナトリウム溶液を添カ卩して、夫々、最終 pHが 2〜8の各 pHとなるように 調整した。また、上記の pH調整を行わない試験区の pHは 4. 2であった。そして、こ れらのファルコンチューブを 40°Cで保温しつつ、 4日間静置した。
[0057] その後、菌体懸濁液を遠心して集菌後、さらに 10mlの脱イオン水で再懸濁、集菌 することにより、菌体を洗浄して、凍結乾燥した。
[0058] 凍結乾燥終了後、酢酸菌体量 (g)を測定した。
[0059] さらに、凍結乾燥して得られた酢酸菌体を、それぞれ 10mg計りとつて、公知のブラ ィ'ディヤー（Bligh— dyer)法に従い、クロ口ホルム：メタノール：水 = 1： 2 : 0. 8の組 成の有機溶媒にて全脂質の抽出を行った。
[0060] その後、有機溶媒を吸引して濃縮乾固して得られた全脂質に、 0. 4Nの水酸ィ匕カリ ゥム溶液を加えて弱アルカリ分解を行 ヽ、回収したアルカリ安定脂質を無水ピリジン 及び塩化ベンゾィル存在下にて 70°Cで 10分反応させ、スフインゴ脂質やホパノイド 化合物を含んだベンゾィル誘導体を精製した。
[0061] このベンゾィル誘導体を高速液体クロマトグラフィーにて紫外吸光 230nmの波長を 検出した。この際、別途にダルコンァセトバクタ一'ザイリナス NBRC15237 (Glucon acetobacter xylinus NBRC15237)株から精製した、 N— 2，—ヒドロキシパルミ トイルースフィンガニン (酢酸菌型セラミド)精製品を用いて作成した標準曲線を用い て、酢酸菌型セラミドを定量した。 [0062] 得られた酢酸菌型セラミドの定量値をもとに、 lg乾燥酢酸菌体あたりの酢酸菌型セ ラミドの含有量を算出して、処理の効果を比較した。
[0063] 尚、高速液体クロマトグラフィーの移動相にはへキサン:イソプロパノール = 100 : 1 の溶媒を用い、流速は lmlZ分とした。
[0064] 表 1には、培地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当 りの酢酸菌型セラミド含有量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド 生産量 (mgZリツター）を求めた結果を示した。（表 1 :pHの効果）
[0065] なお、上記の静置処理を行わずに、直ちに凍結乾燥した後、上記と同様にして、培 地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸菌型 セラミド含有量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量 (mgZ リツター）を求めたものを「処理前」とした。
[0066] [表 1]
Figure imgf000011_0001
[0067] 表 1の結果から、酢酸菌懸濁液の pHを 2. 0〜8. 0のいずれの値に調整した場合 においても、処理前と比較して、セラミド含有量力 倍以上に増加し、それに相関して セラミド生産量が増加した。
[0068] さらに、 pHを 4. 5以下に低下させた場合には、 pH8. 0の場合と比較して、セラミド 含有量が 4倍以上に増加し、それに相関してセラミド生産量も顕著に増加することが 確認された。
[0069] 以上の結果から、 pHは 2. 0〜8. 0が良ぐさらに好ましい pHは 2. 0〜4. 5、特に 好ましくは 2. 0〜3. 0であることが確認できた。
[0070] (実施例 2) 酢酸の効果
実施例 1と同様にして、ァセトバクタ一'マローラム NCI1683 (Acetobacter malo rum NCI1683)株（FERM BP— 10595)を、 YPG培地に酢酸ナトリウムを最終 濃度 0. 8%になるように加えた培地で 48時間培養し、ここで得られた培養液を 8, 00
Ogで 5分間遠心分離して酢酸菌体を回収し、 6分の 1容量の培養上清で再懸濁して
6倍菌体濃縮液を調製した。
[0071] その後、 99. 5%酢酸を用いて、最終濃度が 5%となるように添加し、以下、 40°Cで
、 4日間静置した。尚、最終濃度を 5%となるように酢酸を添加した場合、菌体濃縮液 の pHは 3. 5となった。
[0072] 実施例 1と同様にして、菌体を集菌、洗浄を行い、凍結乾燥を行い、培地 1リツター 当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸菌型セラミド含有 量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量 (mgZリツター）を 求め、表 2に結果を示した。（表 2 :酢酸の効果）
なお、上記の静置処理を行わずに、直ちに凍結乾燥した後、実施例 1と同様にして 、培地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸 菌型セラミド含有量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量（ mgZリツター）を求めたものを「処理前」とした。
[0073] [表 2]
Figure imgf000012_0001
表 2の結果から、酢酸を添加して pHを低下させることにより、処理前と比較してセラ ミド含有量が 25倍と顕著に増加することが確認できた。このことから、セラミド含有量 増加のための pH低下に用いることが可能な酸は塩酸に限定されないことが確認され た。
[0075] (実施例 3) 高温処理によるセラミド高含有ィ匕
実施例 1と同様にして、ァセトバクタ一'マローラム NCI1683 (Acetobacter malo rum NCI1683)株（FERM BP— 10595)を、 YPG培地に酢酸ナトリウムを最終 濃度 0. 8%になるように加えた培地で 48時間培養し、ここで得られた培養液を 8, 00 Ogで 5分間遠心分離して酢酸菌体を回収し、 6分の 1容量の培養上清で再懸濁して 6倍菌体濃縮液を調製した。
[0076] その後、実施例 2と同様にして 6N塩酸により上記 6倍菌体濃縮液を pH3に調整し、 表 3に示す各温度のインキュベーターの中に 4日間静置した。
[0077] 実施例 1記載の方法に従って、高温処理後のサンプルについて、菌体を集菌、洗 浄を行い、回収した菌体について凍結乾燥を行なって、培地 1リツター当りの乾燥酢 酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸菌型セラミド含有量 (mgZg)、 及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量 (mgZリツター）を求め、表 3に結 果を示した。（表 3 :温度の影響）
[0078] なお、上記の静置処理を行わずに、直ちに凍結乾燥した後、実施例 1と同様にして 、培地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸 菌型セラミド含有量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量（ mgZリツター）を求めたものを「処理前」とした。
[0079] [表 3]
rir
ism. 又 乾燥酢酸菌体量 セラミド含有量 セラミド生産量 処理前 1. 90 0. 40 0. 76
4。C 1. 84 1. 23 2. 3
10°C 1. 9 1 1. 43 2. 7
20°C 1. 78 4. 06 7. 2
30°C 1. 73 9. 43 1 6. 3
3 7。C 1. 67 1 1. 70 1 9. 5
40°C に 64 1 3. 1 7 2 1 . 6
45°C 1. 64 1 3. 90 22. 7
50°C 1. 58 14. 53 23. 0
60。C 1. 42 1 8. 35 26. 1
70°C 1. 28 1 8. 59 23. 8
[0080] 表 3の結果から、酢酸菌懸濁液の温度を 4°C〜70°Cのいずれの値に調整した場合 においても、処理前と比較して、セラミド含有量が 3倍以上に増加し、それに相関して セラミド生産量も増カロした。
[0081] さらに、温度を 30°C以上に調整することにより、温度 4°Cの場合と比較して、セラミド 含量が 8倍以上と顕著に増加し、それに相関してセラミド生産量も顕著に増加するこ とが確認された。
[0082] 以上の結果から、好ましい温度としては、 30〜70°Cであることが認められ、 60〜70
°Cでは 18mg以上にまで含有量が増加した。
[0083] (実施例 4) 処理時間の効果
試験例 1と同様にして、ァセトバクタ一'マローラム NCI1683(Acetobacter malo rum NCI1683)株（FERM BP— 10595)を、 YPG培地に酢酸ナトリウムを最終 濃度 0.8%になるように加えた培地で 48時間培養し、ここで得られた培養液を 8, 00 Ogで 5分間遠心分離して酢酸菌体を回収し、 6分の 1容量の培養上清で再懸濁して 6倍菌体濃縮液を調製した。
その後、試験例 2と同様にして 6N塩酸により上記 6倍菌体濃縮液を pH3に調整し、 40°Cでインキュベーターの中に表 4に示す間静置した。
[0084] 実施例 1記載の方法に従って、高温処理後のサンプルについて、菌体を集菌、洗 浄を行い、回収した菌体について凍結乾燥を行なって、その後、実施例 1と同様にし て、菌体を集菌、洗浄を行い、凍結乾燥を行い、培地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体 量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸菌型セラミド含有量 (mgZg)、及び、 培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量 (mgZリツター）を求め、表 4に結果を示 した。（表 4 :処理時間の影響）
[0085] なお、上記の静置処理を行わずに、直ちに凍結乾燥した後、実施例 1と同様にして 、培地 1リツター当りの乾燥酢酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸 菌型セラミド含有量 (mgZg)、及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量（ mgZリツター）を求めたものを「処理前」とした。
[0086] [表 4]
Figure imgf000015_0001
[0087] 表 4の結果から、処理時間を 3時間以上とすることによって、処理前と比較して、酢 酸菌中のセラミド含有量が 3倍以上に増加し、それに伴いセラミド生産量も増力!]した。 さらに、 1日以上処理することにより、 3時間処理した場合と比較して、セラミド含量が 6倍以上増加し、セラミド生産量も顕著に増加することが確認できた。
[0088] 一方、 7日以上処理しても、顕著なセラミド含有量の増加は確認出来な力つた。
[0089] 以上の結果から、処理時間としては、 3時間〜 7日が好ましいこと、さらに好ましくは 、 1日〜 4日であることが確認された。
[0090] (実施例 5) ダルコンァセトパクター属菌株でのセラミド生産試験
実施例 1と同様にして、ダルコンァセトバクタ一'ハンゼニイ NCI1468 (Gluconace tobacter hansenii NCI1468)株（FERM BP— 10596)を、 YPG培地に酢酸 ナトリウムを最終濃度 0. 8%になるようにカ卩えた培地で 48時間培養し、ここで得られ た培養液を 8, OOOgで 5分間遠心分離して酢酸菌体を回収し、 6分の 1容量の培養 上清で再懸濁して 6倍菌体濃縮液を調製した。
[0091] その後、 99. 5%酢酸を用いて、最終濃度が 5%となるように添加し、以下、 37°Cで 、2日間静置した。
[0092] 実施例 1記載の方法に従って、静置処理後のサンプルについて、菌体を集菌、洗 浄を行い、回収した菌体について凍結乾燥を行なって、培地 1リツター当りの乾燥酢 酸菌体量 (gZリツター）、乾燥酢酸菌体 lg当りの酢酸菌型セラミド含有量 (mgZg)、 及び、培地 1リツター当りの酢酸菌型セラミド生産量 (mgZリツター）を求め、処理前 のものと比較した結果を表 5に示した。（表 5 :ダルコンァセトパクター属でのセラミド生 産試験）
[0093] [表 5]
Figure imgf000016_0001
[0094] 表 5の結果から、ァセトパクター属の酢酸菌だけでなぐダルコンァセトパクター属の 酢酸菌においても、本方法によりセラミド含有量が増大することが確認でき、それに 伴いセラミド生産量も顕著に増加した。このことから、いずれの酢酸菌においても、本 方法を用いることが可能であることが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] 培養終了後の酢酸菌を、 pH2. 0〜8. 0及び Z又は温度 4〜80°Cで 3時間〜 7日 間保持することを特徴とする酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[2] 培養終了後の酢酸菌を、 pH2. 0〜4. 5及び Z又は温度 30〜70°Cで 1日〜 4日 間保持することを特徴とする酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[3] 酢酸を含有し、エタノールを 0. 3容量 Z容量％以下で含有する培地で培養した酢 酸菌を用いることを特徴とする請求項 1または 2に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミ ド含有量の増加方法。
[4] 酢酸菌として、ァセトパクタ^ ~ ·マローラム NCI1683 (Acetobacter malorum N
CI1683)株（FERM BP— 10595)を用いることを特徴とする請求項 1〜3のいずれ 力 1項に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[5] 酢酸菌として、ダルコンァセトバクタ^ ~·ハンゼ-ィ NCI1468 (Gluconacetobacte r hansenii NCI 1468)株（FERM BP— 10596)を用いることを特徴とする請求 項 1〜3のいずれか 1項に記載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
[6] セラミド含有量が乾燥菌体 lgあたり 7〜18. 59mg、好ましくは 9〜18. 59mg更に 好ましくは 11〜18. 59mgであることを特徴とする請求項 1〜5のいずれか 1項に記 載の酢酸菌中の酢酸菌型セラミド含有量の増加方法。
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