PL243327B1 - Sposób otrzymywania biomasy bakterii z gatunku Propionibacterium freudenreichii oraz szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii, korzystnie Propionibacterium freudenreichii B/00319 (PCM), zawierającej witaminę B12 z wykorzystaniem ekstraktu z wytłoków jabłkowych. Przedmiotem zgłoszenia jest także szczep bakterii Propionibacterium freu denreichii.

Description

Bakterie z rodzaju Propionibacterium są źródłem metabolitów o dużym znaczeniu przemysłowym i prozdrowotnym - wytwarzają np. witaminę B12 (kobalamina). Witamina B12 odpowiada za szereg funkcji w organizmie człowieka. Do najważniejszych z nich należą: wytwarzanie kwasów nukleinowych (DNA), synteza mieliny (osłonka włókien nerwowych), produkcja ciałek krwi czy pozyskiwanie energii. Optymalna dzienna dawka spożycia kobalaminy dla kobiet i mężczyzn powyżej 14 roku życia wynosi 4 μg. Jej niedobory w organizmie skutkują m.in. anemią, chorobami metabolicznymi i neurologicznymi. Przemysłowa produkcja witaminy B12 odbywa się głównie dzięki syntezie mikrobiologicznej, z udziałem zmodyfikowanego genetycznie szczepu Pseudomonas denitrificans. Wykorzystywanie GMO do produkcji żywności i innych produktów powszechnego użytku budzi szereg kontrowersji, zwłaszcza w odbiorze społecznym. Z tego powodu wciąż trwają poszukiwania nowych, opłacalnych sposobów pozyskiwania kobalaminy z udziałem mikroorganizmów, jednak bez ingerencji w ich genom. Propionibacterium freudenreichii jest jedynym mikroorganizmem ze statusami GRAS (Generally Recognised as Safe) i QPS (Qualified Presumption of Safety), który posiada zdolność syntezy aktywnej postaci witaminy B12, co czyni go unikalnym kandydatem do komercyjnej produkcji tego związku i mikrobiologicznego wzbogacania produktów spożywczych oraz pasz w tę witaminę. Niedobór witaminy B12 jest szczególnie powszechny w krajach rozwijających się, przede wszystkim z powodu niewystarczającego spożycia pokarmów pochodzenia zwierzęcego, co wynika z rosnącej popularności diety wegańskiej. Według WHO niedobory witaminy B12 mogą stanowić istotny problem zdrowotny na całym świecie. W związku z tym istnieje uzasadnione prawdopodobieństwo wzrostu zapotrzebowania na witaminę B12, jako suplementu diety. Trwałym rozwiązaniem problemu niedoboru witaminy B12 może być wzbogacanie produktów pochodzenia roślinnego, bogatą w kobalaminę biomasą bakterii propionowych uzyskaną z ekstraktu z wytłoków jabłkowych.

Wydajne pozyskiwanie metabolitów drogą naturalną wymaga zastosowania odpowiednich składników pożywek hodowlanych, których koszt wpływa na opłacalność procesu. Jako składnik podłoża można zastosować np. odpady przemysłowe. Do tanich i powszechnie dostępnych surowców odpadowych zalicza się wytłoki jabłkowe (produkcja soków) oraz ekstrakt z wytłoków jabłkowych (pozyskiwanie pektyny), które mogą stanowić cenne źródło węgla, składników mineralnych (fosfor, potas, magnez, kobalt) oraz witamin. Ze względu na niską zawartość związków azotowych, odpady te należy wzbogacać źródłem tego pierwiastka (ekstrakt drożdżowy, pepton). Biotechnologiczne wykorzystanie wytłoków jabłkowych, poza zmniejszeniem kosztów podłoży mikrobiologicznych, umożliwia również ich częściową biodegradację, co przyczynia się do poprawy jakości środowiska naturalnego.

W stanie techniki znane są techniki hodowli bakterii Propionibacterium freudenreichii na różnych podłożach. W publikacji K. Piwowarek i in., „Research on the ability of propionic acid and vitamin B12 biosynthesis by Propionibacterium freudenreichii strain T82”; Antonie van Leeuwenhoek (2018) 111: 921-932; doi.org/10.1007/s10482-017-0991-7 ujawniono wyniki badań, w których uzyskiwano biomasę bakterii Propionibacterium freudenreichii, a następnie określano potencjał biosyntezy kwasu propionowego i witaminy B12 przez szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii T82 w pożywce zawierającej różne źródła węgla. Wykorzystano również wytłoki jabłkowe będące odpadem z produkcji soku jabłkowego. W publikacji P. Deptula i in., „Food-Like Growth Conditions Support Production of Active Vitamin B12 by Propionibacterium freudenreichii 2067 without DMBI, the Lower Ligand Base, or Cobalt Supplementation”, Front. Microbiol., 08.03.2017, doi.org/10.3389/fmicb.2017.00368 ujawniono badania, których celem było określenie poziomu produkcji białek i metabolitów, w zależności od warunków wzrostu i potencjału P. freudenreichii do syntezy witaminy B12. Masayuki Taniguchi i in., „Production of a Mixture of Antimicrobial Organic Acids from Lactose by Co-Culture of Bifidobacterium longum and Propionibacterium freudenreichii”; 1998, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 62: 8, 1522-1527, DOI: 10.1271/bbb.62.1522 ujawnili wyniki badań uzyskane dla wspólnej hodowli P. freudenreichii i B. longum na pożywce serwatkowej i pożywce TPY, w wyniku której laktoza została bezpośrednio przekształcona w mieszaninę kwasów octowego i propionowego.

Żadna publikacja znana w stanie techniki nie dotyczy jednak sposobu uzyskiwania biomasy bakteryjnej Propionibacterium freudenreichii, a zwłaszcza nie wspomina ani nie sugeruje możliwości zagospodarowania ekstraktu z wytłoków jabłkowych.

Celem niniejszego wynalazku było zatem opracowanie sposobu uzyskania wartościowej biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii zawierającej witaminę B12 z wykorzystaniem ekstraktu z wytłoków jabłkowych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii , charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) prowadzi się hodowlę wstępną, podczas której biomasę bakterii namnaża się w podłożu pełnym, w temperaturze 30 ± 1°C do momentu uzyskania gęstości optycznej OD równej 2,0, a następnie oddziela się masę bakteryjną,

b) uzyskaną masą bakteryjną zaszczepia się podłoże hodowlane i prowadzi się hodowlę biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii przez 120 godzin, w temperaturze 37 ± 1°C, w pH obojętnym,

c) zbiera się komórki bakterii Propionibacterium freudenreichii, przy czym w etapie b) stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą: wodny ekstrakt z wytłoków jabłkowych o stężeniu cukrów 2,5%, w tym korzystnie 2,0% cukrów bezpośrednio redukujących, ekstrakt drożdżowy, korzystnie w stężeniu 10 g/dm³, pepton, korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, wodorofosforan dipotasu, korzystnie w stężeniu 1,5 g/dm³, diwodorofosforan potasu, korzystnie w stężeniu 2,5 g/dm³, chlorowodorek L-cysteiny, korzystnie w stężeniu 0,4 g/dm³, i biotynę, korzystnie w stężeniu 0,0002 g/dm³.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie a) stosuje się pożywkę (VL) zawierającą: glukozę, korzystnie w stężeniu 1 g/dm³, ekstrakt mięsny, korzystnie w stężeniu 3 g/dm³, pepton korzystnie w stężeniu 10 g/dm³, chlorek sodu korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, ekstrakt drożdżowy, korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, i chlorowodorek L-cysteiny, korzystnie w stężeniu 0,4 g/dm³.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku, korzystnie, podłoże hodowlane stosowane w etapie b) otrzymuje się poprzez:

a. otrzymanie ekstraktu z wytłoków jabłkowych, poprzez zmieszanie wytłoków jabłkowych z wodą destylowaną, ogrzewanie w temperaturze 75°C, usunięcie materiałów nierozpuszczalnych, korzystnie poprzez sączenie i wirowanie, oraz rozcieńczenie wodą do uzyskania stężenia cukrów wynoszącego 2,5%, a następnie

b. dodanie następujących substancji:

ekstrakt drożdżowy [10 g/dm³], pepton [5 g/dm³], wodorofosforan dipotasu [1,5 g/dm³], diwodorofosforan potasu [2,5 g/dm³], chlorowodorek L-cysteiny [0,4 g/dm³] i biotyna [0,0002 g/dm³].

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem dostępu B/00319.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie a) masę bakteryjną oddziela się poprzez odwirowanie hodowli przy 10 000 obr./min.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) hodowle prowadzi się w warunkach stacjonarnych.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) zobojętnia się środowisko hodowlane w odstępach 12-godzinnych, korzystnie poprzez dodawanie NaOH.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) pożywkę zaszczepia się inokulum poprzez zawieszenie masy bakteryjnej w podłożu hodowlanym, przy czym korzystnie stosunek objętościowy inokulum do podłoża hodowlanego wynosi 1 : 9.

Innym przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem dostępu B/00319.

Bardziej szczegółowo, sposób otrzymywania biomasy bakterii według wynalazku cechuje się tym, że hodowlę bakterii Propionibacterium freudenreichii prowadzi się w kolbach Erlenmayera w podłożu składającym się z ekstraktu z wytłoków jabłkowych, który zawiera 2,5% cukrów (w tym 2,0% cukrów bezpośrednio redukujących - fruktozy i glukozy), ekstraktu drożdżowego [10 g/dm³], peptonu [5 g/dm³], wodorofosforanu dipotasu [1,5 g/dm³], diwodorofosforanu potasu [2,5 g/dm³], chlorowodorku L-cysteiny [0,4 g/dm³] i biotyny [0,0002 g/dm³].

a. Bakterie Propionibacterium freudenreichii namnaża się w podłożu VL zawierającym glukozę [1 g/dm³], ekstrakt mięsny [3 g/dm³], pepton [10 g/dm³], chlorek sodu [5 g/dm³], ekstrakt drożdżowy [5 g/dm³], i chlorowodorek L-cysteiny [0,4 g/dm³] w kolbach Erlenmayera w warunkach stacjonarnych w temperaturze 30 ± 1°C do wartości OD (gęstość optyczna) równej 2,0.

b. Inokulum bakterii przygotowuje się poprzez odwirowanie określonej objętości hodowli przygotowanej zgodnie z punktem a) przy 10000 obr./min przez 10 minut, dwukrotne przemycie biomasy komórkowej jałowym roztworem soli fizjologicznej, a następnie zawieszenie biomasy bakteryjnej w jałowym podłożu z ekstraktem z wytłoków jabłkowych zawierającym 2,5% cukrów, tak aby posiew inokulum do podłoża wynosił 10% obj.

c. Ekstrakt z wytłoków jabłkowych przygotowuje się poprzez zmieszanie 1000 g wytłoków jabłkowych z 1000 cm³ wody destylowanej, po czym całość poddaje się ogrzewaniu (ekstrakcji) przez 30 minut w temperaturze 75°C. Materiały nierozpuszczalne usuwa się poprzez sączenie i wirowanie, a jako podstawę podłoża stosuje się uzyskany supernatant (ekstrakt). W wyniku tego procesu otrzymuje się ekstrakt zawierający około 4,0% cukrów. Pożywkę zawierającą 2,5% cukrów przygotowuje się poprzez rozcieńczenie ekstr aktu przy użyciu wody destylowanej.

d. Namnażanie bakterii Propionibacterium freudenreichii prowadzi się w podłożu z ekstraktem z wytłoków jabłkowych zawierającym 2,5% cukrów, suplementowanym dodatkowo: ekstraktem drożdżowym [10 g/dm³], peptonem [5 g/dm³], wodorofosforanem di-potasu [1,5 g/dm³], diwodorofosforanem potasu [2,5 g/dm³], chlorowodorkiem L-cysteiny [0,4 g/dm³] i biotyną [0,0002 g/dm³]. Hodowlę prowadzi się w kolbach Erlenmayera przez 120 godzin w temperaturze 37 ± 1°C, zobojętniając środowisko hodowlane z użyciem NaOH w odstępach 12-godzinnych.

e. Biomasę odwirowuje się przy 10 000 obr./min przez 10 minut.

Korzystne w produkcji biomasy i biosyntezy witaminy B12 przez bakterie Propionibacterium freudenreichii podłoże przygotowuje się poprzez uzyskanie ekstraktu z wytłoków jabłkowych, rozpuszczenie w nim odpowiednich naważek ekstraktu drożdżowego, peptonu, wodorofosforanu dipotasu, diwodorofosforanu potasu, chlorowodorku L-cysteiny, ustalenie pH podłoża na poziomie 7,0 ± 0,1; sterylizację pożywki w temperaturze 117°C oraz dodanie do podłoża (po procesie sterylizacji) wodnego roztworu biotyny z zastosowaniem jałowych filtrów strzykawkowych.

Etap hodowli namnażającej w podłożu o zdefiniowanym wyżej składzie korzystnie prowadzi się przez 120 godzin, co pozwala uzyskać plon biomasy komórkowej na poziomie około 3 gs.s./dm³. W kilogramie biomasy stwierdzono 15 μg witaminy B12.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładzie stosowania.

Przykład

Biomasę bakterii Propionibacterium freudenreichii namnaża się w podłożu VL (o następującym składzie: glukoza [1 g/dm³], ekstrakt mięsny [3 g/dm³], pepton [10 g/dm³], chlorek sodu [5 g/dm³], ekstrakt drożdżowy [5 g/dm³], i chlorowodorek L-cysteiny [0,4 g/dm³]) w kolbie Erlenmayera w warunkach stacjonarnych w temperaturze 30°C ± 1 przy pH pożywki równym 7,0 ± 0,1 do uzyskania OD (gęstość optyczna) równego 2,0. Następnie 25 cm³ hodowli odwirowuje się przez 10 minut przy 10 000 obr./min, odwirowaną biomasę dwukrotnie przepłukuje się jałową solą fizjologiczną, zawiesza w 25 cm³ jałowego podłoża z ekstraktem z wytłoków jabłkowych oraz suplementami i ilościowo przenosi do 225 cm³ tego podłoża znajdującego się w kolbie Erlenmayera. Hodowlę produkcyjną prowadzi się w podłożu składającym się z ekstraktu z wytłoków jabłkowych, który zawiera 2,5% cukrów, ekstraktu drożdżowego [10 g/dm³], peptonu [5 g/dm³], wodorofosforanu dipotasu [1,5 g/dm³], diwodorofosforanu potasu [2,5 g/dm³], chlorowodorku L-cysteiny [0,4 g/dm³] i biotyny [0,0002 g/dm³] przez 120 godzin w warunkach stacjonarnych w temperaturze 37 ± 1°C, zobojętniając środowisko hodowlane w odstępach 12-godzinnych. Hodowla pozwala na otrzymanie plonu biomasy komórkowej na poziomie około 3 gs.s./dm³. Kilogram substancji komórkowej zawiera około 15 μg witaminy B12. Objętościowa wydajność biosyntezy witaminy B12 wynosi 0,045 μg/dm³. Stopień wykorzystania cukrów bezpośrednio redukujących z ekstraktu z wytłoków jabłkowych wynosi ponad 98%, a związków azotowych 64%.

Claims (9)

1. Sposób otrzymywania biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) prowadzi się hodowlę wstępną, podczas której biomasę bakterii namnaża się w podłożu pełnym, w temperaturze 30 ± 1°C do momentu uzyskania gęstości optycznej OD równej 2,0, a następnie oddziela się masę bakteryjną,

b) uzyskaną masą bakteryjną zaszczepia się podłoże hodowlane i prowadzi się hodowlę biomasy bakterii Propionibacterium freudenreichii przez 120 godzin, w temperaturze 37 ± 1°C, w pH obojętnym,

c) zbiera się komórki bakterii Propionibacterium freudenreichii, przy czym w etapie b) stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą: wodny ekstrakt z wytłoków jabłkowych o stężeniu cukrów 2,5%, w tym korzystnie 2,0% cukrów bezpośrednio redukujących, ekstrakt drożdżowy, korzystnie w stężeniu 10 g/dm³, pepton, korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, wodorofosforan dipotasu, korzystnie w stężeniu 1,5 g/dm³, diwodorofosforan potasu, korzystnie w stężeniu 2,5 g/dm³, chlorowodorek L-cysteiny, korzystnie w stężeniu 0,4 g/dm³, i biotynę, korzystnie w stężeniu 0,0002 g/dm³.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) stosuje się pożywkę (VL) zawierającą: glukozę, korzystnie w stężeniu 1 g/dm³, ekstrakt mięsny, korzystnie w stężeniu 3 g/dm³, pepton korzystnie w stężeniu 10 g/dm³, chlorek sodu korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, ekstrakt drożdżowy, korzystnie w stężeniu 5 g/dm³, i chlorowodorek L-cysteiny, korzystnie w stężeniu 0,4 g/dm³.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże hodowlane stosowane w etapie b) otrzymuje się poprzez:

a. otrzymanie ekstraktu z wytłoków jabłkowych, poprzez zmieszanie wytłoków jabłkowych z wodą destylowaną, ogrzewanie w temperaturze 75°C, usunięcie materiałów nierozpuszczalnych, korzystnie poprzez sączenie i wirowanie, oraz rozcieńczenie wodą do uzyskania stężenia cukrów wynoszącego 2,5%, a następnie

b. dodanie następujących substancji:

ekstrakt drożdżowy [10 g/dm³], pepton [5 g/dm³], wodorofosforan dipotasu [1,5 g/dm³], diwodorofosforan potasu [2,5 g/dm³], chlorowodorek L-cysteiny [0,4 g/dm³] i biotyna [0,0002 g/dm³].

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem dostępu B/00319.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) masę bakteryjną oddziela się poprzez odwirowanie hodowli przy 10 000 obr./min.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) hodowle prowadzi się w warunkach stacjonarnych.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) zobojętnia się środowisko hodowlane w odstępach 12-godzinnych, korzystnie poprzez dodawanie NaOH.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) pożywkę zaszczepia się inokulum poprzez zawieszenie masy bakteryjnej w podłożu hodowlanym, przy czym korzystnie stosunek objętościowy inokulum do podłoża hodowlanego wynosi 1 : 9.

9. Szczep bakterii Propionibacterium freudenreichii zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem dostępu B/00319.