WO2014013793A1 - βグルカンの製造方法 - Google Patents

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重信 三浦
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Miura Shigenobu
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    • C12N1/145—Fungal isolates
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -glucan having an excellent immunity enhancing effect.
  • ⁇ -glucan ( ⁇ -1,3-1,6-glucan) has recently been attracting attention due to its immune enhancing effect.
  • ⁇ -glucan has a function of activating macrophages that attack infectious cells and cancer cells in the body, NK cells, T cells, killer T cells, etc., increasing immunity and resistance, It has the effect of eliminating bacteria and foreign matter that have entered inside, and suppressing disease.
  • NK cells macrophages that attack infectious cells and cancer cells in the body
  • T cells T cells
  • killer T cells etc.
  • It has the effect of eliminating bacteria and foreign matter that have entered inside, and suppressing disease.
  • there are actions such as allergy suppression, malignant tumor suppression such as cancer, blood glucose level decrease, diuretic effect, blood pressure adjustment, blood cholesterol level and triglyceride level decrease Has been.
  • ⁇ -glucan There are two methods for producing ⁇ -glucan: extraction from baker's yeast and mushrooms and cultivation of black yeast (Aureobasidium pullulans) and accumulation in the medium. It is said that there is an advantage that it is more water-soluble than those derived from these organisms and has a high effect due to the molecular structure in which 1.6 chains are branched at a high density.
  • lactic acid bacteria is not a mycologically defined bacterial name, but is defined as gram-positive bacilli and cocci that ferment sugar and produce only lactic acid or lactic acid / acetic acid / alcohol / carbon dioxide. It is derived from applying the family name Lactobacteriaceae.
  • lactic acid-producing bacteria belonging to the genus Bacillus are sometimes called sporic lactic acid bacteria, but are not classified as general lactic acid bacteria.
  • Patent Document 1 a product containing a combination of ⁇ -glucan and lactic acid bacteria has been developed, and in particular, a composition that combines enterococcus faecalis, which is a lactic acid bacterium, has the effect of enhancing immunity against influenza and preventing its progression.
  • ⁇ -glucan is not toxic, but excessive intake may cause diarrhea. For this reason, in order to obtain a sufficient immune enhancing effect, it is considered preferable to ingest lactic acid bacteria or the like having different immunostimulation mechanisms and ⁇ -glucan in combination.
  • Lactic acid bacteria to be mixed with ⁇ -glucan are usually cultured in a medium in which a sugar source such as glucose is added with a nutrient source such as yeast extract, inorganic salts, vitamins, etc., and sterilized under high temperature and high pressure. Those separated from the medium by microfiltration, centrifugation or the like are used. This product takes the form of a powder diluted with powdered dextrin or the like, but is very expensive.
  • lactic acid bacteria such as Lactobacillus and Lactococcus
  • lactic acid-producing bacteria belonging to the genus Bacillus such as Sporolactocillus are produced in large quantities by lactic acid fermentation when industrially producing lactic acid. ing.
  • These lactic acid-producing bacteria are separated from the medium using a flocculant or a filter aid after the lactic acid fermentation is completed, and most of them are discarded as they are.
  • the present invention is intended to provide a method for producing ⁇ -glucan having an excellent immune enhancing effect at a lower cost.
  • lactic acid-producing bacteria including general lactic acid bacteria and Bacillus lactic acid-producing bacteria
  • lactic acid-producing bacteria which are wastes of lactic acid fermentation
  • the present inventor efficiently and impurityally cultured black yeast, which is a ⁇ -glucan-producing bacterium capable of growing using a waste lactic acid-producing bacterium having finished lactic acid fermentation as the only nitrogen source, under appropriate conditions. It was found that a ⁇ -glucan culture solution with a small amount can be produced.
  • the present invention has been completed based on this finding.
  • the method for producing ⁇ -glucan according to the present invention comprises a step of culturing black yeast (Aureobasidium lanpullulans) using a lactic acid-producing bacterial cell and / or a derivative thereof as a nutrient and causing the black yeast to produce ⁇ -glucan. It is characterized by having.
  • lactic acid-producing bacteria is used as a general term for bacteria capable of producing lactic acid, and includes not only lactic acid-producing bacteria belonging to the genus Bacillus, but also general lactic acid bacteria and lactic acid-producing bacteria belonging to the genus Bacillus. Used in a broad sense to encompass.
  • the black yeast is preferably capable of growing using lactic acid-producing bacteria and / or derivatives thereof as the only nitrogen source.
  • Aureobasidium pullulans MRB001 strain (accession number: NITE BP-1386) is particularly preferably used. This stock was deposited on July 5, 2012 to the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) .
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • Bacillus coagulans can be used as the lactic acid-producing bacterium. It should be noted that using Bacillus coagulans in combination with ⁇ -glucan to enhance the effect of immune enhancement or the like has not been disclosed at all in literatures known so far.
  • the ⁇ -glucan-containing composition containing ⁇ -glucan obtained by the production method according to the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the ⁇ -glucan obtained by the production method according to the present invention is superior to the conventional ⁇ -glucan in immunopotentiating effect. This is because the ⁇ -glucan obtained by the production method according to the present invention contains lactic acid. This is probably because DNA fragments containing the CpG motif contained in the cell walls of the producing bacteria are mixed.
  • black yeast which is Aureobasidium pullulans MRB001 (Aureobasidium pullulans MRB001) strain (accession number: NITE BP-1386) is also one aspect of the present invention.
  • a ⁇ -glucan containing a large amount of CpG motif as a cell wall component and having an immune enhancing effect as a raw material, and ⁇ -glucan having an immune enhancing effect, etc. Can be cultured at low cost and in large quantities without using other nitrogen sources such as rice bran. Therefore, according to the present invention, it is possible to obtain a highly pure product capable of synergistically exerting the immunity enhancing effect of lactic acid producing bacteria and ⁇ -glucan.
  • the present invention can be utilized as an effective utilization method of lactic acid-producing bacteria discarded in large quantities from lactic acid fermentation for the production of polylactic acid monomers which have been attracting attention as bioplastics in recent years and are expected to be produced in large quantities. For this reason, the use range of ⁇ -glucan and lactic acid-producing bacteria currently used in some health foods and pet foods can be inexpensively extended to livestock feed and the like.
  • the present invention is also useful for preventing avian influenza and the like and is expected to have a large economic ripple effect.
  • the method for producing ⁇ -glucan according to the present invention includes a step of culturing black yeast (Aureobasidium pullulans) using a lactic acid-producing bacterial cell and / or a derivative thereof as a nutrient and causing the black yeast to produce ⁇ -glucan. Is.
  • the lactic acid-producing bacteria are not particularly limited as long as they are capable of producing lactic acid.
  • general lactic acid bacteria Bacillus lactic acid-producing bacteria (hereinafter also referred to as Bacillus lactic acid-producing bacteria), and the like. Is used.
  • Bacillus lactic acid-producing bacteria are known to contain many unique base sequences called CpG motifs in the cell wall DNA.
  • Lactic acid bacteria accumulate lactic acid in the medium in conjunction with cell growth.
  • Lactic acid bacteria include homolactic acid bacteria that produce only lactic acid as a final product and heterolactic acid bacteria that simultaneously produce non-lactic acid such as alcohol and acetic acid, and homolactic acid bacteria are used for normal lactic acid production.
  • homolactic acid bacteria are used for normal lactic acid production.
  • lactic acid bacteria include Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc 6 genera. These are all Gram-positive bacteria and all produce large amounts of lactic acid by fermentation. Many lactic acid bacteria produce L lactic acid, but there are strains that produce D lactic acid in the genus Lactobacillus, and there are strains that produce L lactic acid and D lactic acid at a certain ratio.
  • Bacillus lactic acid-producing bacteria that mainly produce D-lactic acid include Bacillus levolalacticus and Sporolactobacillus. These are also handled in the same manner as general lactic acid bacteria, and can be used to produce D-lactic acid.
  • Bacillus lactic acid-producing bacteria that mainly produce L-lactic acid
  • Bacillus coagulans examples include Bacillus coagulans.
  • the strains that are generally used for lactic acid fermentation and are easily available include lactic acid bacteria such as Lactobacillus genus and Lactococcus genus that produce L lactic acid, and D lactic acid.
  • lactic acid bacteria such as Lactobacillus genus and Lactococcus genus that produce L lactic acid, and D lactic acid.
  • Bacillus lactic acid-producing bacteria such as Bacillus revolacticas and Sporolactobacillus, Bacillus coagulans producing L-lactic acid, and the like.
  • strains belonging to Bacillus coagulans are capable of lactic acid fermentation at a high temperature, and thus are less likely to contaminate bacteria, and are easily separated from lactic acid fermentation media as compared with general lactic acid bacteria.
  • Bacillus coagulans was used as a nutrient source, it was also confirmed that the productivity of ⁇ -glucan by black yeast was high.
  • Lactic acid fermentation is usually performed as follows. That is, in order to carry out lactic acid fermentation using a general lactic acid bacterium, the main component is a carbon source such as starch, liquefied starch, saccharified starch, crude sugar, glucose, yeast extract, peptone, soybean hydrolysate, corn steep liquor, Add a small amount of other nutrients that serve as a nitrogen source, and if necessary, prepare a medium containing inorganic salts such as potassium dihydrogen phosphate and magnesium sulfate, vitamins, etc. Add and perform fermentation at an appropriate temperature using the neutralizing agent such as calcium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydroxide, etc. under anaerobic conditions at a temperature matched to the lactic acid bacteria to be used. .
  • the neutralizing agent such as calcium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydroxide, etc. under anaerobic conditions at a temperature matched to the lactic acid bacteria to be used. .
  • Bacillus lactic acid-producing bacteria such as Bacillus coagulans
  • the sugar concentration of the main component starch, liquefied starch, saccharified starch, crude sugar, glucose, etc. is relatively low, Aerobic in medium supplemented with small amounts of yeast extract, peptone, soy hydrolyzate, corn steep liquor, and other nutrients, and if necessary, inorganic salts such as potassium dihydrogen phosphate and magnesium sulfate, vitamins, etc. Incubate to.
  • Lactic acid can be produced in the medium by such fermentation. Also, when the aerobic culture is completed, the cells and the medium are separated, and then, after adding a small amount of other nutrients to the medium with a high carbon source concentration, the cells are added and anaerobically added. Lactic acid fermentation may be performed as well.
  • the appropriate temperature is generally 50 ° C. or higher, and 55 ° C. or higher depending on the strain. For this reason, since the culture medium is hardly contaminated with bacteria, it is suitable particularly when the cells are used as a target product.
  • wet cells In order to obtain wet cells from the medium after fermentation, the wet cells can be easily separated by separation with a desk-type centrifugal separator, pressure filtration with a filter having a pore size of 1 ⁇ m or less, vacuum filtration, cross-flow filtration, etc. Obtainable.
  • the yield of wet cells is generally several to several tens of grams per 1 L of medium.
  • the black yeast is a strain belonging to Aureobasidium pulpulans.
  • the black yeast is a kind of mold that can be easily separated from soil, plant surface, and the like, and generally produces pullulan.
  • the water-soluble ⁇ -glucan ( ⁇ -1,3-1, 6-glucan) is known (see Journal of Biotechnology, Vol. 88, No. 12, 634-641, 2010).
  • the black yeast strain is not particularly limited and may be appropriately selected from known strains, such as those disclosed in JP-A-2006-75076 and JP-A-2009-56391. It may be a strain subjected to a mutation treatment so as not to substantially produce a melamine pigment. Among them, the black yeast is preferably one that can grow using a lactic acid-producing bacterium and / or its derivative as a sole nitrogen source, and moreover, the lactic acid-producing bacterium and / or its derivative is the only one. A mutant strain that is mutated so as to exhibit high productivity when grown as a nitrogen source is more preferable. By using such a mutant strain, a large amount of ⁇ -glucan can be produced inexpensively and efficiently.
  • Such a mutant is a strain with excellent growth by subjecting the parent black yeast to general mutation treatment, and then growing the lactic acid-producing bacteria and / or its derivatives as the only nitrogen source. Can be obtained by selecting.
  • the screening of excellent strains of black yeast can be performed as follows. That is, aureobasidium that produces ⁇ -glucan on an agar medium containing a carbon source such as sucrose, a wet cell of lactic acid producing bacteria as a nitrogen source, ascorbic acid for adjusting pH, and its sodium salt, etc.
  • the parent strain of pullulans is subjected to mutation treatment, a strain having good growth is selected, inoculated into a liquid medium containing a lactic acid-producing bacterium as the only nitrogen source, shake-cultured, and a strain having a high ⁇ -glucan-producing ability is selected.
  • the mutation treatment is not particularly limited, and examples thereof include ultraviolet irradiation treatment and mutagenicity inducer treatment.
  • the mutagenicity-inducing agent is not particularly limited, and for example, commonly used mutagenizing agents such as nitrosoguanidine, ethidium bromide, ethyl methanesulfonate, sodium nitrite and the like can be used.
  • the parent strain to be subjected to the mutation treatment is not particularly limited as long as it belongs to Aureobasidium pullulans, and it may be newly isolated from nature, or it may be a stock strain that has been conventionally known to produce ⁇ -glucan. Good. Examples of such stocks include Aureobasidium pullulans ATCC 9348, ATCC 3092, ATCC 42023, IFO 4464, IFO 4466, IFO 6353, IFO 7757, and the like.
  • a colony on the agar medium After the mutation treatment, select a colony on the agar medium based on its size.
  • the strain selected based on the size of the colony is further cultured in a flask containing a liquid medium containing lactic acid-producing bacteria as the only nitrogen source to confirm the production of ⁇ -glucan, which is more productive than the parent strain. It is preferable to select a high strain.
  • the present inventor succeeded in obtaining the Aureobasidium pullulans MRB001 (Aureobasidium pullulans MRB001) strain (accession number: NITE BP-1386) by such a screening method.
  • the selected mutant strain should be inoculated into a sterilized liquid medium containing sucrose, rice bran, sodium ascorbate, etc., shaken at 20-30 ° C for several days, aseptically aliquoted, frozen and stored. Thus, it can be used as an inoculum with good reproducibility.
  • the following method can be used to cultivate black yeast using a lactic acid-producing bacterium as a nitrogen source and cause the black yeast to produce ⁇ -glucan. That is, black yeast is inoculated into a liquid medium in which an appropriate amount of a lactic acid-producing bacterium as a nitrogen source and a small amount of ascorbic acid are added to a carbon source such as sucrose, and shaking culture is performed using, for example, a flask. Do.
  • the concentration of each component may be appropriately determined in consideration of the properties of the culture medium to be the product. For example, it is generally about 10 to 20 g / L sucrose and about 1 to 3 g / L sodium ascorbate. .
  • the form of the lactic acid-producing bacterium to be added to the liquid medium is not particularly limited.
  • the microbial cells of the lactic acid-producing bacteria may be dead cells, live cells, wet cells, or dry cells.
  • lactic acid-producing bacteria Since the appropriate addition amount of lactic acid-producing bacteria varies depending on the bacterial species and its form, it is preferable to determine the optimal amount in advance by experiments. If the amount of lactic acid-producing bacteria added is small, the nitrogen source will be insufficient, and if it is too much, the production amount of ⁇ -glucan will decrease.
  • a small amount of nutrients such as rice bran may be added within a range that does not affect the taste quality, product specifications, and the like.
  • the addition amount is about 1 to 4 g / L.
  • the addition of rice bran is not necessary when using a mutant strain as black yeast to be subjected to culture.
  • the pH of the liquid medium is usually 4.5 to 6 without any pH adjustment as long as the composition is as described above, and can be used as it is for black yeast culture as it is. It is preferable to adjust to a pH suitable for culturing.
  • the pH suitable for black yeast culture is 5-6.
  • the culture temperature is usually 20-30 ° C., preferably 24-25 ° C.
  • DO is 15% or more of the saturation concentration before inoculation, preferably Adjust to keep 20% or more.
  • the production amount of ⁇ -glucan is about 2 to 4 g / L in shaking culture using a flask, and is 6 g / L or more when using a jar fermenter.
  • a culture apparatus that is capable of aeration and capable of stirring the medium to some extent may be used.
  • a culture apparatus for example, a general stirring type fermenter, an air lift type fermenter, or the like is used.
  • the air flow rate may be appropriately adjusted according to the size and type of the fermenter.
  • an air lift type fermenter with less power is preferable because it has relatively inexpensive equipment and is economically advantageous.
  • the black yeast culture solution containing ⁇ -glucan produced as described above has a higher conversion rate from raw material (sucrose) to ⁇ -glucan than black yeast culture solution cultured in conventional rice bran medium or the like. Turned out to be expensive. Furthermore, there is no influence on the taste quality by medium components such as rice bran, and since components (particularly cell wall components) from lactic acid bacteria are included, it is expected to have a high immune enhancing effect.
  • the DNA fragment containing the CpG motif contained in the cell wall of the lactic acid producing bacteria is effectively incorporated into the side chain of ⁇ -glucan produced by black yeast and the mammalian cells that have taken it It is presumed that it is adsorbed on the surface together with ⁇ -glucan, thereby stimulating the immune system more effectively.
  • the black yeast culture solution using the lactic acid-producing bacterium thus produced as a nitrogen source can be sterilized by an arbitrary method and then used as a product as a ⁇ -glucan-containing composition.
  • a lactic acid-producing bacterium isolated from a lactic acid fermentation medium may be further added to a black yeast culture solution, regardless of whether it is a living cell or a dead cell, to obtain a product.
  • the form of the product may be in the form of a liquid as it is in the culture solution, but is preferably processed so that it can be easily taken orally. For example, it may be powdered by a method such as spray drying, or other solid substances. Or you may mix in a liquid thing.
  • lactic acid in the medium was measured using high performance liquid chromatography.
  • ⁇ -glucan was quantified by referring to the method described in JP-A-2006-75076. Furthermore, ⁇ -glucan was also quantified using the phenol sulfate method (Anal Bichem., 339 (1),) 69-72 (2005)) as a simple quantitative method.
  • defatted rice bran obtained from Thailand was used as the rice bran.
  • ⁇ Test Example 1 Culture of Lactic Acid-Producing Bacteria (Bacillus coagulans) Bacillus coagulans IFO12714, a Bacillus lactic acid-producing bacterium, was inoculated into a 5000 mL jar fermenter charged with 1000 mL of a medium having the composition shown in Table 1 below. The aerobic culture was performed at an aeration rate of 1.0 vvm and a stirring speed of 400 rpm for 8 hours.
  • the lactic acid concentration at the end of fermentation was 108 g / L. This medium was subjected to high-speed centrifugation (6000 G, 10 minutes) to obtain 80.1 g of precipitated Bacillus wet cells (dry cell weight was about 20%).
  • these cells are inoculated into a liquid medium (rice bran medium) having the composition shown in Table 3 below, and cultured at 24 ° C. for 5 days.
  • a liquid medium rice bran medium
  • Strains that seemed to be produced were selected, and the precipitate obtained by adding an equal amount of ethanol to the medium was analyzed by a simple quantitative method to quantify ⁇ -glucan.
  • the strain that produced the most ⁇ -glucan accumulated 5.2 g / L of ⁇ -glucan in the medium. This strain was used in the following experiments.
  • the obtained bacterial cells are suspended in PBS (phosphate buffered saline) to obtain a solution of about 1000 CFU / mL, and 0.2 mL Was applied to an agar medium plate, subjected to ultraviolet irradiation with an ultraviolet lamp (irradiation time: 2 to 10 minutes), and cultured on an agar plate at 24 ° C. for 4 days. Plates with clear colonies were further cultured at 4 ° C. for 3 days to form thick film spores. A colony having a white appearance was selected from such colonies to obtain a mutant strain in which no melanin pigment was produced.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the Aureobasidium pullulans MR01 was inoculated into a 300 mL Erlenmeyer flask charged with 100 mL of the medium shown in Table 3, and cultured with shaking at 25 ° C. for 3 days at a stirring speed of 150 rpm. This was used as a seed for:
  • ⁇ Test Example 3 Acquisition of mutant strain of black yeast Aureobasidium pullulans MR01 obtained in Test Example 2 was suspended in PBS (phosphate buffered saline) and about 1000 CFU / mL. A 0.2 mL portion of the solution was applied to a plate of an agar medium having the composition shown in Table 4 below, and was subjected to ultraviolet irradiation treatment with an ultraviolet lamp. The irradiation time was 2 to 5 minutes. When the cells were cultured as they were on an agar plate at 24 ° C. for 6 days, it was observed that smaller white colonies in the rice bran medium were formed. 100 such colonies were selected in order from the largest.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the strain showing the highest ⁇ -glucan production amount was named MRB001 strain, and cultured by shaking in a 300 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of the medium having the composition shown in Table 7 below at 24 ° C. for 3 days. The solution was aliquoted and stored frozen at -80 ° C.
  • the MRB001 strain was cultured with shaking in a medium having the composition shown in Table 8 below at 24 ° C. for 4 days, the amount of ⁇ -glucan produced was examined by a simple quantitative method, and the optimum amount of wet cells was determined. The obtained results are shown in Table 9 below.
  • the time course of the culture is shown in Table 12 below.
  • the concentration of ⁇ -glucan was measured by the ⁇ -glucan quantitative method described in JP-A-2006-75076.
  • the ⁇ -glucan concentration on the 6th day was 8.8 g / L.
  • the concentration of ⁇ -glucan was measured by the ⁇ -glucan quantitative method described in JP-A-2006-75076. At this time, when the residual sugar was measured by the phenol-sulfuric acid method, it was 2.0 g / L.
  • the ⁇ -glucan concentration on day 5 after the start of culture was 7.4 g / L.
  • the concentration of ⁇ -glucan was measured by the ⁇ -glucan quantitative method described in JP-A-2006-75076. At this time, when the residual sugar was measured by the phenol-sulfuric acid method, it was 1.8 g / L.

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Abstract

　本発明は、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造する方法を提供することを目的とし、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させるようにした。

Description

βグルカンの製造方法
　この発明は、免疫増強効果に優れたβグルカンの製造方法に関するものである。
　βグルカン（β－１，３－１，６－グルカン）は、近時、その免疫増強効果により注目されている物質である。すなわち、βグルカンには、体内の感染細胞やガン細胞等を攻撃するマクロファージや、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞等を活性化させる働きがあり、免疫力・抵抗力を高めて、身体の中に侵入した細菌や異物を排除したり、発病を抑制したりする効果を有している。また、これらの効果が発現する結果、アレルギー抑制、ガン等の悪性腫瘍抑制、血糖値の降下、利尿効果、血圧調整、血中コレステロール値と中性脂肪値の低下等の作用があることも報告されている。
　このβグルカンの製造方法には、パン酵母やキノコ類からの抽出法と、黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養してその培地中に蓄積させる方法があるが、黒酵母に由来するβグルカンは他の生物に由来するものよりも水溶性が高く、また１．６鎖が高密度に分岐された分子構造に由来して効果も高いという利点があるといわれている。
　乳酸菌やバシラス属の乳酸生産菌の免疫増強効果についても既に公知となっており、報告例も多い。これらの乳酸を生産する菌は、細胞壁の構成成分としてＣｐＧモチーフと呼ばれる特有の塩基配列（ＤＮＡ断片）を比較的多く有することが知られている。このＣｐＧモチーフが直接哺乳類の免疫システムを刺激して、マクロファージや、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞等を活性化させ、各種の感染に対する防衛機構を増強すると考えられている。
　なお、「乳酸菌」とは菌学的に定義された細菌名ではなく、その定義は、糖を発酵し、乳酸のみ、又は、乳酸・酢酸・アルコール・炭酸ガスを生産するグラム陽性の桿菌及び球菌に対してLactobacteriaceaeという科名を適用したことに由来する。
　また、バシラス属の乳酸生産菌は、有胞子性乳酸菌と呼ばれることもあるが、一般的な乳酸菌には分類されない。
　バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の持つ生理活性効果についても既に広く知られており、プロバイオティクスに関する有用性も見出されている。また、一般の乳酸菌と同様、本菌株の安全性も広く認められている（非特許文献１、２）。
　また、βグルカンと乳酸菌を組み合わせて配合した製品も開発されており、特に、乳酸球菌であるエンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）を組み合わせた組成物がインフルエンザに対する免疫力を高め、重症化を防ぐ効果を持つと報告されている（特許文献１）。
特開２００５－２２００６５号公報
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2(3),101-110 Food Chem Toxicol, 47(6), 1231-1238 (2009)
　従来の黒酵母を用いたβグルカンの製法では、培地の栄養源として糖の他に米糠のような天然物質を用いる必要がある。しかし、米糠等は製品中に不純物として残存し、後工程で分離することは難しい。そして、このような不純物の存在は、食感、味質に影響する。
　また、βグルカンには毒性はないが、大量に摂取しすぎると下痢の症状を引き起こすこともある。このため、充分な免疫増強効果を得るためには、免疫賦活の作用機序が異なる乳酸菌等とβグルカンとを組み合わせて摂取するのが好ましいと考えられている。
　βグルカンと混合する乳酸菌としては、通常、グルコース等の糖源に酵母エキス等の栄養源と、無機塩、ビタミン等を添加した培地により菌体を培養し、これを高温高圧下に滅菌して、精密濾過、遠心分離等により培地と分離したものが用いられる。この製品は、粉末デキストリン等により希釈した粉末等の形態をとるが、非常に高価である。
　また、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属等の一般的な乳酸菌や、スポロラクトバシラス属等のバシラス属の乳酸生産菌は、工業的に乳酸を製造する際に乳酸発酵により大量に生成することが知られている。これらの乳酸を生産する菌は、乳酸発酵の終了後に凝集剤や濾過助剤等を使って培地より分離され、大部分はそのまま廃棄されている。
　そこで本発明は、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造する方法を提供すべく図ったものである。
　本発明者は、このような乳酸発酵の廃棄物である乳酸生産菌（一般の乳酸菌及びバシラス属の乳酸生産菌を包含する。）をβグルカン培養の栄養源として用いることができるならば、経済的にβグルカンと乳酸生産菌の効果を併せ持った製品を創製できると考えた。そして、本発明者は、乳酸発酵を終えた廃乳酸生産菌を唯一の窒素源として生育することができるβグルカン生産菌である黒酵母を適当な条件下で培養することにより、効率よくかつ不純物が少ないβグルカン培養液を生産できることを見出した。本発明は、当該知見に基づき完成に至ったものである。
　すなわち本発明に係るβグルカンの製造方法は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有することを特徴とする。なお、本発明において、「乳酸生産菌」は、乳酸を生産することが可能な菌の総称として用いられ、バシラス属の乳酸生産菌だけではなく、一般的な乳酸菌及びバシラス属の乳酸生産菌を包含した広義の意味で用いられる。
　前記黒酵母は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものであることが好ましい。
　このような黒酵母のなかでも、特にアウレオバシジウム・プルランス　ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１３８６）が好適に用いられる。当該株は、平成２４年７月５日に独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されたものである。
　前記乳酸生産菌としては、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）を用いることができる。なお、バシラス・コアギュランスとβグルカンとを組み合わせて用いて免疫増強等の効果を上げることは、これまでに公知となった文献等には全く開示されていない。
　本発明に係る製造方法により得られたβグルカンを含有するβグルカン含有組成物もまた、本発明の一つである。本発明に係る製造方法により得られたβグルカンは、従来のβグルカンに比べて免疫増強効果に優れたものであるが、これは本発明に係る製造方法により得られたβグルカンには、乳酸生産菌の細胞壁に含まれるＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片が混在しているためであると考えられる。
　更に、アウレオバシジウム・プルランス　ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１３８６）である黒酵母もまた、本発明の一つである。
　このような構成を有する本発明によれば、細胞壁の成分としてＣｐＧモチーフが多く含まれ、免疫増強効果を持つ乳酸生産菌を原料として、同様に免疫増強等の効果を持つβグルカンを、夾雑物として残存する米糠等の他の窒素源を用いずに、安価に、かつ、大量に培養することができる。従って、本発明によれば、乳酸生産菌とβグルカンの免疫増強効果を相乗的に発揮しうる、純度の高い製品を得ることができる。
　また、本発明は、近年バイオプラスチックとして注目され、大量に生産が見込まれるポリ乳酸のモノマー製造のための乳酸発酵から大量に廃棄される乳酸生産菌の有効な利用法として活用できる。このため、現在は健康食品やペットフードの一部に使用されているβグルカン及び乳酸生産菌の利用範囲を、家畜飼料等にまで廉価に広げることができる。また、本発明は、鳥インフルエンザ等の予防にも有用であり、経済的波及効果も大きいと期待される。
　以下に本発明を詳述する。
　本発明に係るβグルカンの製造方法は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有するものである。
　前記乳酸生産菌としては、乳酸を生産することが可能な菌であれば特に限定されず、例えば、一般的な乳酸菌やバシラス属の乳酸生産菌（以下、バシラス属乳酸生産菌ともいう。）等が用いられる。これらの乳酸生産菌は、細胞壁のＤＮＡ中にＣｐＧモチーフと呼ばれる特有の塩基配列を多く含有することが知られている。
　一般的な乳酸菌は、菌体の増殖と連動して乳酸を培地中に蓄積する。乳酸菌には、乳酸のみを最終産物として生産するホモ乳酸菌と、アルコールや酢酸等の乳酸以外のものを同時に生産するヘテロ乳酸菌があり、通常の乳酸製造にはホモ乳酸菌が用いられる。また、菌の形状から、乳酸球菌と乳酸桿菌とがあるが、工業的には乳酸桿菌が多く使用されていると推測される。
　代表的な乳酸菌としては、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、リューコノストック属（Leuconostoc）の６属が挙げられる。これらは全てグラム陽性の菌であり、いずれも発酵によって多量の乳酸を生産する。多くの乳酸菌はＬ乳酸を生産するが、ラクトバシラス属のなかには、Ｄ乳酸を生産する菌株もあり、また、Ｌ乳酸とＤ乳酸とを一定の割合で生産する菌株もある。
　主にＤ乳酸を生産するバシラス属乳酸生産菌としては、バシラス・レボラクティカス（Bacillus laebolacticus）、スポロラクトバシラス属（Sporolactobacillus）が挙げられる。これらも一般的な乳酸菌と同様に扱い、Ｄ乳酸を生産するために用いることができる。
　主にＬ乳酸を生産するバシラス属乳酸生産菌としては、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）が挙げられる。
　これらの乳酸生産菌のうち、乳酸発酵の効率を考えると、一般的に乳酸発酵に用いられ入手容易な菌株としては、Ｌ乳酸を生産するラクトバシラス属やラクトコッカス属等の乳酸菌、Ｄ乳酸を生産するバシラス・レボラクティカスやスポロラクトバシラス属等のバシラス属乳酸生産菌、Ｌ乳酸を生産するバシラス・コアギュランス等が挙げられる。これらのなかでもバシラス・コアギュランスに属する菌株は、高温での乳酸発酵が可能なので雑菌汚染の可能性が低く、乳酸発酵培地からの分離も一般の乳酸菌と比較して容易である。また、バシラス・コアギュランスを栄養源とした場合、黒酵母によるβグルカンの生産性が高いことも確認された。
　乳酸発酵は通常以下のようにして行われる。すなわち、一般的な乳酸菌を用いて乳酸発酵を行うには、デンプン、液化デンプン、糖化デンプン、粗糖、グルコース等の炭素源を主成分に、酵母エキス、ペプトン、大豆加水分解物、コーンスチープリカー、その他の窒素源となる栄養成分を少量添加し、必要であればリン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩、ビタミン等を添加してなる培地を用意し、これに乳酸菌のシード培養液を添加し、用いる乳酸菌に合わせた温度で、嫌気性の条件下において、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム等の中和剤を用いて発酵中のｐＨを適正値にコントロールして発酵を行う。
　一方、バシラス・コアギュランス等のバシラス属乳酸生産菌を用いて乳酸発酵を行うには、まず、主成分のデンプン、液化デンプン、糖化デンプン、粗糖、グルコース等の糖濃度を比較的低くし、これに酵母エキス、ペプトン、大豆加水分解物、コーンスチープリカー、その他の栄養成分を少量添加し、必要であればリン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩、ビタミン等を添加した培地で好気的に培養する。次いで、主成分の炭素源を追加投入し、嫌気状態にして適温に保ち、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム等の中和剤を用いて発酵中のｐＨを適正値にコントロールして発酵を行う。このような発酵により培地中に乳酸を生産させることができる。また、好気培養が終了した時点で菌体と培地とを分離し、続いて、炭素源の濃度の高い培地にその他の栄養成分を少量追加してから、菌体を添加して嫌気的に保ち、同様に乳酸発酵を行ってもよい。バシラス・コアギュランスを培養する場合には、一般的に適温は５０℃以上、菌株によっては５５℃以上である。このため、培地が雑菌汚染されにくいので、特に菌体を目的物とする場合には好適である。
　発酵終了後の培地から湿菌体を得るには、デスク型の遠心式セパレータによる分離や、１μｍ以下の孔径のフィルタによる加圧濾過、減圧濾過、クロスフロー濾過等により、容易に湿菌体を得ることができる。湿菌体の収量は、一般的に培地１Ｌに対して数～数十グラムである。
　前記黒酵母は、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する菌株である。前記黒酵母は、土壌、植物表面等から簡単に分離できるカビの一種であり、一般的にプルランを生産するが、培養条件により細胞外に水溶性のβグルカン（β－１，３－１，６－グルカン）を生産することが知られている（生物工学会誌　第８８巻　第１２号　６３４－６４１，２０１０参照）。
　前記黒酵母の菌株としては特に限定されず、公知の菌株から適宜選択して用いてもよく、特開２００６－７５０７６号公報や、特開２００９－５６３９１号公報等に示されているような、メラミン色素を実質的に生産しないように変異処理を施した菌株であってもよい。なかでも、前記黒酵母としては、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものが好ましく、更に、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育させた場合に、高い生産性を示すように変異させた変異株がより好ましい。このような変異株を用いることにより、大量のβグルカンを安価にかつ効率的に生産することができる。
　このような変異株は、親株である黒酵母に一般的な変異処理を施した後、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育させて、生育が優良な菌株を選択することにより得ることができる。
　より詳細には、黒酵母の優良株のスクリーニングは以下のようにして行うことができる。すなわち、スクロース等の炭素源や、窒素源としての乳酸生産菌の湿菌体、ｐＨ調整用のアスコルビン酸や、そのナトリウム塩等を含有する寒天培地上で、βグルカンを生産するアウレオバシジウム・プルランスの親株に対し変異処理を施し、生育の良い株を選択し、乳酸生産菌を唯一の窒素源とする液体培地に接種して振盪培養を行い、βグルカン生産能の高い菌株を選択する。
　前記変異処理としては特に限定されず、例えば、紫外線照射処理や、変異原性誘発薬剤処理が挙げられる。
　前記変異原性誘発薬剤としては特に限定されず、例えば、ニトロソグアニジン、エチディウムブロマイド、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸ナトリウム等の一般的に用いられる変異処理剤を用いることができる。
　変異処理を施す親株は、アウレオバシジウム・プルランスに属する菌体であれば特に限定されず、自然界より新たに分離されたものでもよく、従来βグルカンを生産することが知られている保存株でもよい。このような保存株としては、例えば、アウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ　９３４８株、ＡＴＣＣ　３０９２株、ＡＴＣＣ　４２０２３株、ＩＦＯ　４４６４株、ＩＦＯ　４４６６株、ＩＦＯ　６３５３株、ＩＦＯ　７７５７株等が挙げられる。
　変異処理後は、その大きさに基づき寒天培地上のコロニーを選択する。コロニーの大きさに基づいて選択された菌株は、更に乳酸生産菌を唯一の窒素源とする液体培地を仕込んだフラスコ中で振盪培養し、βグルカンの生産を確認し、親株よりも生産性の高い菌株を選択するのが好ましい。
　本発明者は、このようなスクリーニング方法により、アウレオバシジウム・プルランス　ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１３８６）を取得することに成功した。
　選択された変異株は、スクロース、米糠、アスコルビン酸ナトリウム等を含み滅菌した液体培地に接種して２０～３０℃で数日間振盪培養を行い、無菌的に小分けして凍結し保存しておくことにより、再現性よく種菌として用いることができる。
　乳酸生産菌を窒素源として黒酵母を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させるには、例えば、以下の方法を用いることができる。すなわち、スクロース等の炭素源に、窒素源としての乳酸生産菌を適当量と、少量のアスコルビン酸とを添加してなる液体培地に、黒酵母を植菌し、例えばフラスコを用いて振盪培養を行う。
　各成分の濃度については、製品となる培養液の性状を考慮して適宜決定すればよいが、例えば、一般的には、スクロース１０～２０ｇ／Ｌ、アスコルビン酸ナトリウム１～３ｇ／Ｌ程度である。
　前記液体培地へ添加する乳酸生産菌の形態としては特に限定されず、例えば、乳酸生産菌の菌株を適当な培地で培養して得られる培養物、培養物から分離した菌体、当該菌体の破砕物、溶解物、抽出物、これらを分画したもの等であってもよい。また、前記乳酸生産菌の菌体は、死菌体であっても、生菌体であってもよく、湿菌体であって、乾燥菌体であってもよい。
　乳酸生産菌の適切な添加量は菌種やその形態により異なるので、実験により予め最適量を決めておくことが好ましい。乳酸生産菌の添加量が少なければ窒素源不足となり、多すぎてもβグルカンの生産量が減少する。
　更に、必要があれば、味質、製品の規格等に影響のない範囲で、米糠等の栄養成分を少量添加してもよい。このように米糠を補助的に添加する場合、その添加量は１～４ｇ／Ｌ程度である。しかし、培養に供する黒酵母として変異株を用いる場合は、米糠の添加は不要である。
　前記液体培地のｐＨは、上記の組成であれば特にｐＨの調整を行わなくとも通常は４．５～６となり、そのまま黒酵母の培養に用いることができるが、更に、アスコルビン酸等で黒酵母の培養に好適なｐＨに調整することが好ましい。なお、黒酵母の培養に好適なｐＨは５～６である。培養温度は、通常２０～３０℃であり、好ましくは２４～２５℃である。
　ジャーファーメンターを用いて培養する場合は、フラスコを用いた場合と同様の培地成分、温度で、通気量・回転数を調整して、ＤＯが植菌前の飽和濃度の１５％以上、好ましくは２０％以上を保つように調整する。培養開始後に徐々に培養液の粘度が上昇し、通常４～６日で残糖がなくなり培養が終了する。培養終了時はＤＯの上昇により判断することができる。βグルカンの生産量は、フラスコを用いた振盪培養では２～４ｇ／Ｌ程度であり、ジャーファーメンターを用いた場合は６ｇ／Ｌ以上である。
　βグルカンを工業的に大量生産するためには、通気ができて培地をある程度撹拌できる形式の培養装置を用いればよい。このような培養装置としては、例えば、一般的な撹拌式のファーメンターや、エアリフトタイプのファーメンター等が用いられる。通気量はファーメンターの大きさ、形式に合わせて適宜調整すればよい。特に動力の少ないエアリフトタイプのファーメンターは、設備も比較的安価であり、経済上の利益を考慮すると好適である。
　以上のようにして製造されたβグルカンを含有する黒酵母の培養液は、従来の米糠培地等で培養された黒酵母培養液と比較して、原料（シュークロース）からβグルカンへの転化率が高いことが判明した。更に米糠等の培地成分による味質への影響もなく、乳酸菌からの成分（特に細胞壁成分）が含まれるために、免疫増強効果も高いことが期待される。
　乳酸菌成分による相乗効果については、乳酸生産菌の細胞壁に含まれるＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片が、黒酵母により生産されたβグルカンの側鎖等に効果的に取り込まれ、それを摂取した哺乳類の細胞表面にβグルカンとともに吸着し、これによってより効果的に免疫系が刺激されるものと推測される。
　このようにして製造された乳酸生産菌を窒素源とする黒酵母の培養液は、任意の方法により滅菌した後に、βグルカン含有組成物として、そのまま製品とすることができる。また、黒酵母の培養液に、乳酸発酵培地から分離された乳酸生産菌を、生菌体、死菌体に拘わらず、更に添加して製品としてもよい。製品の形態としては、培養液のままの液体状であってもよいが、経口摂取し易いように加工することが好ましく、例えばスプレードライ等の方法により粉末としてもよく、また、他の固体物又は液体物に混入してもよい。
　以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
　以下において、培地中の乳酸は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定された。また、βグルカンの定量は、特開２００６－７５０７６号公報に記載の方法を参照して行った。更に、簡易定量法としてフェノール硫酸法（Anal Bichem., 339 (1), 69-72 (2005)）を用いたβグルカンの定量も行った。また、以下において、米糠としては、タイランドで入手した脱脂米糠を用いた。
＜試験例１＞乳酸生産菌（Bacillus coagulans）の培養
　下記表１に示す組成の培地１０００ｍＬを仕込んだ５０００ｍＬジャーファーメンターに、バシラス属乳酸生産菌であるBacillus coagulans IFO12714を植菌し、５０℃、通気量１．０ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで８時間好気培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで、下記表２に示す組成の培地２０００ｍＬを同じジャーファーメンターに追加し、撹拌回転数５０ｒｐｍで嫌気的に２５時間培養して乳酸発酵を進めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　発酵終了時の乳酸濃度は１０８ｇ／Ｌであった。この培地を高速遠心分離（６０００Ｇ、１０分間）にかけ、沈殿したBacillus湿菌体８０．１ｇ（乾燥菌体重量は約２０％）を得た。
＜試験例２＞黒酵母の分離と培養
　土壌、食品工場、澱粉工場、植物表面等から採取した微生物サンプルをポテトデキストロース寒天培地に塗布し、得られた多くの微生物コロニーの中から目視により黒酵母に近いと思われる性状（粘性のある白色又はややピンク色のコロニーであり、放置すると茶色～黒色に変化する）のものを選択し分離した。
　次に、これらの菌体を下記表３に示す組成の液体培地（米糠培地）に植菌して、２４℃で５日間培養し、その中で培地の粘度が高く明らかに増粘多糖類を生産していると思われる菌株を選択し、培地と等量のエタノールを添加することにより得られる沈殿物を簡易定量法により分析しβグルカンを定量した。この中で、最も多くβグルカンを生産した菌株は、５．２ｇ／Ｌのβグルカンを培地中に蓄積していた。以下の実験では、本菌株を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、特開２００５－７５０７６号公報に記載の方法を参照して、得られた菌体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して１０００ＣＦＵ／ｍＬ程度の溶液とし、その０．２ｍＬを寒天培地のプレートに塗布して、紫外線ランプによる紫外線照射処理（照射時間は、２～１０分間）を行い、そのまま寒天プレート上で２４℃、４日間培養した。明確なコロニーを形成したプレートを更に４℃で３日間培養して、厚膜胞子を形成させた。このようなコロニーの中から外観が白色のコロニーを選別し、メラニン色素が生成されない変異株を得た。
　この微生物を同定し、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）であることを確認し、Aureobasidium pullulans MR01と命名した。
　当該Aureobasidium pullulans MR01を、表３に示した培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコに植菌し、２５℃で３日間、撹拌回転数１５０ｒｐｍで振盪培養した。これを以下のシードとして用いた。
＜試験例３＞黒酵母の変異株の取得
　試験例２で得られたアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans MR01）菌体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して１０００ＣＦＵ／ｍＬ程度の溶液とし、その０．２ｍＬを下記表４に示す組成の寒天培地のプレートに塗布して、紫外線ランプによる紫外線照射処理を行った。照射時間は、２～５分間とした。そのまま、寒天プレート上で２４℃、６日間培養したところ、米糠培地におけるより小さい白色のコロニーが形成されるのが観察された。このようなコロニーを大きいものから順に１００株選別した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、それぞれのコロニーから釣菌し、下記表５に示す組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコに植菌し、２４℃で４日間振盪培養を行い、βグルカンの蓄積量を簡易定量法により調べた。結果を下記表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　これらの菌株うち、βグルカン生産量の最高値を示した株をＭＲＢ００１株と命名して、下記表７に示す組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコで２４℃、３日間振盪培養し、培養液を小分けして－８０℃で凍結保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＭＲＢ００１株を、下記表８に示す組成の培地で２４℃、４日間振盪培養し、簡易定量法によりβグルカン生産量を調べ、湿菌体の最適添加量を決定した。得られた結果を下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示す結果より、乳酸生産菌（バシラス属乳酸生産菌の湿菌体）の添加量には、最適値があることが分かる。
＜試験例４＞
　下記表１０に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　次に、下記表１１に示す組成の培地２７００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　培養の経時変化を下記表１２に示す。βグルカンの濃度は特開２００６－７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に示す結果より、バシラス属乳酸生産菌であるBacillus coagulansの、乳酸発酵後の死菌体（湿菌体）を唯一の窒素源として、黒酵母にβグルカンを生産させることが可能であることが明らかとなった。
＜試験例５＞
　下記表１３に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　次に、下記表１４に示す組成の培地３０００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　培養開始後、６日目のβグルカン濃度は、８．８ｇ／Ｌであった。βグルカンの濃度は特開２００６－７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。この時、フェノール硫酸法により残糖を測定したところ、２．０ｇ／Ｌであった。
＜試験例６＞
　下記表１５に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　次に、下記表１６に示す組成の培地３０００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　培養開始後、５日目のβグルカン濃度は、７．４ｇ／Ｌであった。βグルカンの濃度は特開２００６－７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。この時、フェノール硫酸法による残糖を測定したところ、１．８ｇ／Ｌであった。
　試験例５及び６の結果から、Bacillus湿菌体を窒素源として使用した培地では、米糠を用いた培地より、よりβグルカンの選択性の高い生産が可能であることがわかった。
　本発明によれば、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造することが可能となる。

Claims (6)

  1. 　乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有することを特徴とするβグルカンの製造方法。
  2. 　前記黒酵母は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものである請求項１記載のβグルカンの製造方法。
  3. 　前記黒酵母は、アウレオバシジウム・プルランス　ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１３８６）である請求項１記載のβグルカンの製造方法。
  4. 　前記乳酸生産菌は、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）である請求項１記載のβグルカンの製造方法。
  5. 　請求項１記載の製造方法により得られたβグルカンを含有することを特徴とするβグルカン含有組成物。
  6. 　アウレオバシジウム・プルランス　ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１３８６）である黒酵母。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018131398A (ja) * 2017-02-14 2018-08-23 株式会社Adeka 乳化組成物の乳化安定性向上剤、及びそれを含む化粧料組成物
KR20190032678A (ko) * 2017-09-18 2019-03-28 주식회사 아리바이오 멜라닌색소를 생산하지 않는 베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 풀루란스 균주
JP2020031580A (ja) * 2018-08-30 2020-03-05 株式会社アウレオ β−グルカン高産生菌株、β−グルカンの製造方法、及びβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016107140A1 (de) * 2016-04-18 2017-10-19 Gea Mechanical Equipment Gmbh Verfahren zur Gewinnung von zumindest einer oder mehrerer beta-Glucan-Verbindungen oder einer beta-Glucanhaltigen Feststoffsuspension aus Hefezellen
KR102205829B1 (ko) 2017-06-14 2021-01-21 기초과학연구원 신규한 비피도박테리움 비피덤 균주 및 균주 유래 다당체
EP3550027A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-09 Clariant International Ltd Process for the fermentation of ascomycota
JP7327023B2 (ja) 2019-09-12 2023-08-16 パナソニックホールディングス株式会社 膨張機およびランキンサイクル装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005220065A (ja) * 2004-02-05 2005-08-18 Aureo Co Ltd 免疫賦活剤
JP2010094078A (ja) * 2008-10-16 2010-04-30 Toshio Sekiguchi 発酵飼料の製造方法
WO2011043435A1 (ja) * 2009-10-08 2011-04-14 株式会社アウレオ インフルエンザウイルス感染症の治療剤
JP2011254789A (ja) * 2010-06-07 2011-12-22 Oobiken:Kk 有機醗酵飼料の製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3539180A1 (de) * 1985-11-05 1987-05-07 Consortium Elektrochem Ind Aureobasidium-pullulans-stamm, herstellungsverfahren und verwendung
JP4268105B2 (ja) 2004-09-09 2009-05-27 株式会社アウレオ β−グルカン含有組成物、その製造方法及び該組成物を含む飲食品若しくは皮膚用保湿剤
JP5429843B2 (ja) 2007-08-31 2014-02-26 独立行政法人物質・材料研究機構 八面体シート構造を有する光触媒材料

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005220065A (ja) * 2004-02-05 2005-08-18 Aureo Co Ltd 免疫賦活剤
JP2010094078A (ja) * 2008-10-16 2010-04-30 Toshio Sekiguchi 発酵飼料の製造方法
WO2011043435A1 (ja) * 2009-10-08 2011-04-14 株式会社アウレオ インフルエンザウイルス感染症の治療剤
JP2011254789A (ja) * 2010-06-07 2011-12-22 Oobiken:Kk 有機醗酵飼料の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAKOTO HIRATA: "Development of Recycling Technology for Organic Waste", OITA UNIVERSITY VENTURE BUSINESS LABORATORY ANNUAL REPORT, 2005, pages 48 - 52 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018131398A (ja) * 2017-02-14 2018-08-23 株式会社Adeka 乳化組成物の乳化安定性向上剤、及びそれを含む化粧料組成物
KR20190032678A (ko) * 2017-09-18 2019-03-28 주식회사 아리바이오 멜라닌색소를 생산하지 않는 베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 풀루란스 균주
KR102023317B1 (ko) 2017-09-18 2019-09-20 주식회사 아리바이오 멜라닌색소를 생산하지 않는 베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 풀루란스 균주
JP2020031580A (ja) * 2018-08-30 2020-03-05 株式会社アウレオ β−グルカン高産生菌株、β−グルカンの製造方法、及びβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法

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