CN105132320A

CN105132320A - 高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法

Info

Publication number: CN105132320A
Application number: CN201510559188.8A
Authority: CN
Inventors: 张宏刚; 李莉
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-02
Also published as: CN105132320B

Abstract

本发明公开了一种高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法，该培养基含有麦麸、豆粕、甘蔗糖蜜、活性炭、碳酸钙和β-环状糊精。生产工艺为在培养基中接种乳杆菌发酵，在45～55℃下烘干，可获得发酵产物。本发明培养基可显著促进乳杆菌繁殖，可实现乳杆菌的高密度发酵，活菌密度可达7.5*10¹⁰ CFU/g，并能延长菌类的存活时间，显著提高了发酵产物乳杆菌的保质期；且本发明原料成本低廉，生产工艺简单；因此，本发明为实现乳杆菌高密度培养和规模化培养奠定了基础。

Description

高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法

技术领域

本发明涉及一种培养基特别涉及以低廉物料进行高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法。

背景技术

微生态饲料添加剂是用已知有益的微生物经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人、畜安全有益的活菌制剂，并用于饲料的添加剂，一般简称为微生态制剂，目前市售的微生态制剂有液态和固态两种。乳酸菌作为微生态制剂中较重要的一类，可以调节肠道功能紊乱，维持肠道菌种平衡；应用于饲料中，可以促进生长，防治疾病和改善禽产品品质。

目前乳酸菌类微生态制剂已有较多产品。其中以液态发酵形式的产品居多，但成本较高，易受反馈控制，活菌量难以提高。且液态产品发酵后，菌株极易失活，从而导致产品货架期短，影响产品市场推广。另一类常见发酵形式为固态发酵，而现阶段固态发酵培养基成本较高，部分固态发酵过程中，菌种难以耐受烘干及后期低水分保存，从而菌量难以提高。本发明提供了一种高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基，本发明使用低廉的原料，简单的工艺方法，具有发酵菌量高、产品保存期长等特点。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明在研究培养基中，发现以廉价的农副产品和工业下脚料等简单的原料按一定的配比进行乳杆菌的培养配方简单，且价格便宜，本发明在进行配方的研究中进行了一系列的实验，最后得出了这一配方最适合培养乳杆菌属。应用该培养基所得发酵菌量高、产物干燥后发酵菌的存活时间长等特点，同时培养简便易行、经济效果显著

本发明的目的在于提供一种高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种高密度固态发酵培养乳杆菌的方法。

本发明的再一目的在于提供一种饲料添加剂的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种固态发酵培养乳杆菌的培养基，该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸15％～25％，豆粕19％～29％，甘蔗糖蜜1％～3％，活性炭1％～3％，碳酸钙2％～4％，β-环状糊精2％～6％和水40％～50％。

一种固态发酵培养乳杆菌的培养基，该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％和水45％。

进一步的，上述乳杆菌为植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101，其保藏编号为CGMCCNo.11156。

一种固态发酵培养乳杆菌的方法，该方法为将乳杆菌菌种按3～5％v/v的接种量接种到上述所述的培养基中混匀，于30～37℃的条件下密闭发酵即可。

进一步的，上述发酵时间为24～72h。

一种饲料添加剂的制备方法，该方法为将乳杆菌菌种按3～5％v/v的接种量接种到权利要求上述所述的培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～55℃烘干3.7～5.2h，即可。

进一步的，上述发酵时间为24～72h。

进一步的，上述烘干的温度为50℃，烘干的时间为4.1h。

上述菌株植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏中心于2015年7月23日收到申请人提供的菌株，保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCCNo.11156，建议的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，已于2015年7月23日鉴定保藏的菌株是存活的。

本发明的有益效果是：

本发明培养基可显著促进乳杆菌繁殖，可实现乳杆菌的高密度发酵，活菌密度可达7.5*10¹⁰CFU/g，并能延长菌类的存活时间，显著提高了发酵产物乳杆菌的保质期。

本发明简单易行，生产成本低，经济效益好。用简单易行的培养基培养生产乳酸杆菌属，除用于保健食品外，还可用于肠道调整剂和动物保护产品及饲料添加剂。

具体实施方式

优选的，上述乳杆菌为植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101，其保藏编号为CGMCCNo.11156。

优选的，上述发酵时间为24～72h。

优选的，上述发酵时间为48h。

优选的，上述烘干的温度为50℃，烘干的时间为4.1h。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1植物乳杆菌GLM101的分离、筛选、鉴定及保存

1.1菌株的分离

取健康仔猪粪便样品，用无菌水分别进行10、100、1000倍稀释，分别取200μL涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时，挑取菌落，划线MRS培养基，经4次纯化后，挑取单菌落至MRS肉汤中培养至对数期，加入终浓度20％甘油，-70℃下保存备用。经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16SrDNA测序。

1.2菌株形态学特征鉴定

取纯化菌株(命名为GLM101)的单菌落，转接到MRS固体培养基(琼脂)上，于37℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株GLM101在MRS固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落。在显微镜下观察，为杆状。

1.3菌株的生理生化特征

挑取菌株GLM101在MRS固体培养基(琼脂)上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结果显示，GLM101为革兰氏阳性杆菌。

1.3.1API20NE鉴定特征

利用法国梅里埃API20NE标准鉴定系统测定菌株GLM101利用碳源及产酸情况，API20NE试验条是由20个含干燥底物或培养基的小管所组成。

1)API20NEAUX培养基成分：(NH₄)₂SO₄2g，琼脂1.5g，无机盐基础82.8mg，氨基酸250mg，维生素和营养物底物35.9mg，磷酸缓冲液0.04M加至1000ml，最终pH为7.0～7.2；

NaCl0.85％培养基：NaCl8.5g，H₂O1000mL。

2)在平板上培养菌株，以接种针从分离物的平板上挑取1～4份纯单个菌落至2ml含0.85％NaCl的培养基中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，所需浓度为0.5麦氏单位标准浊度。打开AUX培养基的安瓿管加入200μL(6～8滴)剩下的生理盐水菌悬液至安瓿，仔细混匀，但要避免有气泡产生。

3)盐水菌悬液和接种的AUX培养基分别加入相应的试验条小管，GLU，ADH和CIRE则用矿物油覆盖。

4)盖上培养盒，于30℃培养24小时后观察现象，结果如表1所示。

表1菌株GLM101生化鉴定结果

注：+：表示反应为阳性；-：表示反应为阴性；

从表1中可以看出，本发明菌株可以葡萄糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、硝酸钾、七叶灵、对硝基-D-甲基半乳糖为碳源。

1.3.2APIZYM鉴定特征

利用法国梅里埃APIZYM系统，可系统和快速地研究菌株GLM101产酶能力，APIZYM试验条是由20个小管所组成，它的底部是一个专门设计含有酶底物和缓冲液的支持物。步骤如下：

1)用2ml无菌蒸馏水挑新鲜细菌培养物制备一个菌悬液，其混浊度在McFarlandNo5和No6之间。

2)用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65微升)。

3)接种后，于37℃培养箱培养4小时。

4)培养后，加1滴ZYMA试剂和1滴ZYMB试剂。观察颜色并记录结果如表2所示：

表2.菌株GLM101生化鉴定结果

注：+：表示反应为阳性；-：表示反应为阴性；w:表示反应较弱。

从表2中可以看出，本发明菌株GLM101具有产白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、β-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶等功能。

1.4菌株的分子生物学鉴定

1)利用天跟细菌基因组提取试剂盒(TIANAMPBacteriaDNAKit)提取菌株GLM101的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株16SrDNA片段。

2)如上所述的引物对序列为，1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

3)菌株的16SrDNA测序的结果如SEQIDNO.1。在NCBI上比对后发现其与模式菌株Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917(T)的相似性达到为99.93％，综合菌株GLM101有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，我们将其命名为LactobacillusplantarumGLM101，于2015年年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.11156。

1.5菌株的功能筛选

1.5.1耐酸性试验。

1)实验菌株

实验选取前期从健康仔猪肠道、市售同类产品等来源分离纯化到乳酸菌菌株作为对照，经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16SrDNA测序等鉴定。16SrDNA测序比对分析结果见下表3。

表3.本发明菌株与相关分离所得乳酸菌菌株的鉴定对比结果

2)实验方法：设4个不同pH值处理，分别用HCl调节液体培养基至pH值为1.5、2.5、3.5、4.5。将表3中的各菌种以的4％(V/V)的接种量分别接种上述各处理，37℃静置培养。在接种初始及接种后30、60、90、120、150min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表4。

2)实验结果：

表4.菌株耐酸实验结果

由表4的实验结果可知，本发明分离的菌株在pH为1.5、2.5、3.5、4.5时的存活率分别为2.1％、66.9％、88.0％、95.1％，说明该菌具有较强的耐酸性，最低可以耐受pH范围为1.5～2.5，显著优于类似来源的对照菌株。

1.5.2抑菌试验。

采用牛津杯法做抑菌试验。将大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌分别涂布于MRS琼脂平板上，每杯分别加入0.2mL培养24h的表3中的乳酸菌培养液，恒温培养箱中培养，观察培养结果，测定各组中平皿内抑菌圈直径大小，实验重复3次，计算平均值，实验结果见表5。

表5.牛津杯检测各菌株对常见病原菌的抑制作用

由实验结果可知，本发明分离的菌株对常见致病指示菌有良好的抑制作用。

1.5.3耐受胆盐试验。

将表3中的各菌株分别培养16h后，在4℃12000g离心4分钟后收集菌体，用PBS溶液冲洗2次。加入含有胆盐0.7％(w/v)的PBS溶液中，37℃培养4h后，稀释至10^-4浓度涂布MRS平板，37℃厌氧培养48h后，观察MRS平板上菌落生长情况。

结果显示，在所有的实验平板中，菌株GLM101的存活量高，达到3.8*10⁸CFU/ml，对照菌株GLM344存活菌量为1.3*10⁸CFU/ml，GLM347存活菌量为1.1*10⁸CFU/ml。

实施例2高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基

1)基础培养基优化筛选

将多种配方的基础培养基(见表5)按照1％v/v的比例接种菌种GLM101，在37℃条件下培养48h后，检测各组中的活菌数(CFU/g)，检测结果如表6所示。

表6正交试验筛选最佳的基础培养基组分(百分号均表示质量百分比)

实验结果为三次重复实验取平均值。实验结果表明：组别6为最优基础配方组合(即基础配方为25％麦麸、30％豆粕、45％水)。后续的配方优化实验皆以此配比作为基础培养基。

2)糖成分的优化筛选

下面对上述基础培养基的糖成分作进一步的优化，将多种配方的培养基(见表6)按照1％v/v的比例接种菌种GLM101，在37℃条件下培养48h后，检测各组中的活菌数(CFU/g)，检测结果如表7所示。

表7培养基配方优化实验结果(百分号均表示质量百分比)

实验结果为三次重复实验取平均值。实验结果表明：麦麸、豆粕和甘蔗糖蜜组合为最佳配合。

3)优化后完整的培养基配方

高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基配方

在上述优化的基础上，进一步将培养基配方优化为：麦麸15％～25％，豆粕19％～29％，甘蔗糖蜜1％～3％，活性炭1％～3％，碳酸钙2％～4％，β-环状糊精2％～6％，含水量40％～50％，其中百分比均为质量百分比，即为本发明高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基配方。

其中，最优的培养基配方为：麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％，含水量45％，其中百分比均为质量百分比，即为本发明高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基配方。

上述培养基的配制方法：先按照常规方法配置基础培养基(麦麸、豆粕和水)，然后加入甘蔗糖蜜、活性炭、碳酸钙、β-环状糊精，搅拌均匀，115℃高压灭菌15min，冷却即可。其中原料中麦麸和豆粕均打碎过50目筛。

实施例3高密度固态发酵培养乳杆菌的方法

具体实验步骤如下：

1)菌种及其种子液制备

乳杆菌GLM101菌株在MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于MRS液体试管，37℃培养24后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养24后作为种子液。

MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。最适pH6.0，最适温度37℃，兼性厌氧。

2)接种

以4％v/v接种量将制备的种子液接种到配置的培养基中，混匀。本实施例用到2种培养基，一种是本发明高密度固态培养基(含麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％和水45％)，记为实验组；另一培养基作为对照组，培养基配方为98％基础配方+2％葡萄糖(见表6中的配方)。

3)发酵

将接好菌种的培养基在37℃的条件下密闭发酵，并在不同发酵时间点检测产物中活菌数目，当发酵48h后，将发酵产物在50℃烘干4h，同时将烘干的发酵产物放置不同时间后，再检测各时间点产物中活菌数目。

检测结果如下表所示：

表8不同发酵时间后乳杆菌的含量

注：----表示乳杆菌菌落数≦1.0*10⁶。

从表8中可以看出，发酵48h后产物中乳杆菌的活菌数可达7.5*10¹⁰CFU/g，即使将发酵后的产物烘干再放置20周后，其中的活菌数仍可达3.3*10¹⁰CFU/g，说明所述本发明培养基可显著促进乳杆菌繁殖，并延长菌类的存活时间，显著提高了乳杆菌的保质期。

实施例4最适烘干温度和时间的优化

最适烘干温度优化

为方便于运输以及延长保质期等，需对固态发酵后物料进行烘干处理，而考虑到乳杆菌的抗逆性能，进行如下温度递度的烘干试验：45℃、50℃、55℃、60℃进行最优条件的筛选。

按照实施例3所述的高密度固态发酵培养乳杆菌的方法，研究发酵后最佳的烘干温度和时间，具体温度和时间如下表所示：

表9烘干温度优化实验结果

从表9中可以看出，在45℃时烘干活菌数最高，但耗时多，综合成本高，而55℃时活菌数较低。50℃时活菌数相对较高，综合成本低。因此，选择50℃作为烘干的最终温度，烘干时间为4.1h。

实施例5一种饲料添加剂的制备方法

1)菌种及其种子液制备

将乳杆菌GLM101菌株在MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于MRS液体试管，37℃培养24后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养24后作为种子液。

MRS培养基，培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。最适pH6.0，最适温度37℃，兼性厌氧。

2)接种

以4％v/v接种量将制备的种子液接种到配置的培养基中，即本发明高密度固态培养基(含麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％和水45％)。

3)发酵

将接好菌种的培养基在37℃的条件下密闭发酵48h，然后将发酵产物在50℃烘干4.1h，即可。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>广州格拉姆生物科技有限公司

<120>高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1415

<212>DNA

<213>植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101

<400>1

gcgtgctatacatgcaagtcgacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgattta60

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Claims

1.一种固态发酵培养乳杆菌的培养基，其特征在于：该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸15%～25%，豆粕19%～29%，甘蔗糖蜜1%～3%，活性炭1%～3%，碳酸钙2%～4%，β-环状糊精2%～6%和水40%～50%。

2.一种固态发酵培养乳杆菌的培养基，其特征在于：该培养基含有以下质量百分比的成分：麦麸20%，豆粕24%，甘蔗糖蜜2%，活性炭2%，碳酸钙3%，β-环状糊精4%和水45%。

3.根据权利要求1或2所述的一种固态发酵培养乳杆菌的培养基，其特征在于：所述乳杆菌为植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101，其保藏编号为CGMCCNo.11156。

4.一种固态发酵培养乳杆菌的方法，其特征在于：该方法为将乳杆菌菌种按3～5％v/v的接种量接种到权利要求1～3任一所述的培养基中混匀，于30～37℃的条件下密闭发酵即可。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵时间为24～72h。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述乳杆菌为植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101，其保藏编号为CGMCCNo.11156。

7.一种饲料添加剂的制备方法，其特征在于：该方法为将乳杆菌菌种按3～5％v/v的接种量接种到权利要求1～3任一所述的培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～55℃烘干3.7～5.2h，即可。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵时间为24～72h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述烘干的温度为50℃，烘干的时间为4.1h。

10.根据权利要求7～9任一所述的方法，其特征在于：所述乳杆菌为植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101，其保藏编号为CGMCCNo.11156。