KR101804317B1 - 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 및 이를 이용한 β-글루칸 생산 방법 - Google Patents

자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 및 이를 이용한 β-글루칸 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자외선 조사를 이용하여 제조된, 흑색 색소 없이 β-글루칸(β-glucan)을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주, 및 이를 이용하여 흑색 색소 없이 β-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 β-글루칸의 제조 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 면역증강용 조성물, 건강기능성 식품 및 화장료 조성물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 및 이를 이용한 β-글루칸 생산 방법{Aureobasidium pullulans YK1 produced by using UV and a producing method for β-glucan using the same}
본 발명은 자외선 조사를 이용하여 제조된, 흑색 색소 없이 β-글루칸(β-glucan)을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주, 및 이를 이용하여 흑색 색소 없이 β-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 미생물들은 전분 또는 포도당과 같은 탄소원과 효모 추출액, 염화암모늄, 폐당밀 등의 질소원을 포함하는 영양원과 적당한 환경에서 생육을 시작하며, 그 중에는 우리 생활에 필요한 고분자 중합체를 생산하는 미생물들도 있다. 미생물이 생산하는 고분자 중합체로는 풀루란(pullulan), 젤란(gellan), 잔탄(xanthan), 커드란(curdlan) 등의 교질화제, 유화제, 안정제 및 젤이 이에 속하며, 전기 고분자 중합체들은 식품산업 및 화공산업에 널리 사용되고 있다.
특히, 면역기능과 항암효능이 널리 알려져 있는 고분자 중합체인 β-글루칸(β-glucan)은 아가리쿠스 버섯과 상황버섯에 다량 함유가 되어 있는데, 원료물질을 해외에서 수입하거나 버섯을 인공 재배하여 원료로 하여 추출 및 분리, 정제를 통해 제품을 생산하는 실정이며, 제품화되기까지 60 일 정도의 장기간이 소요되고 상당히 고가이기 때문에 상품화와 다양한 응용제품 개발에 걸림돌이 되고 있다. 따라서, β-glucan을 생산하는 기술을 획기적으로 개발하여 생산단가를 보다 더 낮추거나, 원활한 원료공급을 확보해야 할 것이나, 이에 대한 국내의 관심과 기술은 전무한 실정이다.
β-글루칸은 최근 그 우수한 생체 조절 기능성, 예를 들면, 지질대사 개선작용, 정장작용, 혈당치 상승 억제 효과, 항종양 효과, 면역 증강 효과 등이 밝혀짐에 따라 그 용도 측면에서 주목되고 있는 소재이다.
β-글루칸의 구조는 β－1－2, 1－3, 1－4, 1－6－D－글루코피라노스(glucopyranose) 결합이 적어도 2종류 이상을 갖는 글루코오스의 중합체를 주성분으로 한다. β-글루칸은 미생물류, 담자균류, 식물의 세포벽에 주로 포함되어 있으며, 이러한 생물체의 골격인 세포벽을 구성하는 성분으로서 존재하고 있다.
동물의 면역계에 대한 활성 증진력과 같은 각종 생리활성을 갖는 β-글루칸은 여러 가지 종류의 식용버섯, 효모, 보리, 귀리 등에 함유되어 있는 것이 알려져 있다. 구체적으로, 면역증강작용, 항종양활성, 암세포증식 억제작용, 항알레르기작용, 항염증작용, 콜레스테롤 저하작용, 항혈전작용, 식물섬유작용, 혈압강하작용, 혈당강하작용, 간기능항진 등을 목적으로 하는 기능성 소재나 의약품 등으로서 이용하는 시도가 다수 행해지고 있다. 또한, 난소화성이기 때문에, 변비의 예방 및 개선을 위한 정장제, 또는 그 보습성을 이용하는 화장품 등, 폭 넓은 응용을 기대할 수 있는 다당류의 기능성 소재로서 기대되고 있다.
β-글루칸을 산업적으로 생산하기 위한 공정에 있어서는, 버섯류 유래의 β-글루칸이 사용되고 있으며, 다른 생물종 유래의 β-글루칸을 이용하는 시도는 적었다.
그러나, β-글루칸이 나타내는 다양한 생리 활성에도 불구하고, β-글루칸을 구성하는 β-1,3 글루코시드 결합 위치 및 결합 이후의 아미노화, 인산화, 메틸화, 아세틸화 등의 수식 유무에 대한 작용 메커니즘이 아직 연구되지 않았고, 이로 인해 생리활성에 미치는 영향 또한 보고된 바 없다. 따라서, 일반적으로 천연물 유래로서, 버섯의 자실체 또는 균사체에 함유되어 있는 β-글루칸은 그 생육 및 재배 조건에 따라 포함되는 β-글루칸의 함량이나 분자량 등이 크게 차이가 있어 추출 결과로서 얻어지는 β-글루칸의 경우 고분자체와 저분자체가 혼재하는 등 품질이 일정하지 않아 실용화하기 어려운 단점이 있다.
이에 비해, 미생물이 생산하는 고분자 물질은 이제까지 다양한 구조와 성질을 갖는 것이 밝혀져 왔고, 그 중에는 식물성 고분자에서 볼 수 없는 독특한 성질의 생리활성과 비교할 만한 특성을 가지는 것에 대하여 보고되고 있다.
미생물 유래 β-글루칸은 면역증강을 통한 다양한 암에 대한 항암활성(Wagner 등, 1988), 항세균성 및 항바이러스 활성(Bohn & BeMiller, 1995)이 우수하고, 상처 치료효과와 피부재생 효과(Jamas 등, 1991)가 탁월해 항염증 및 피부의 노화방지 효과가 확인되었으며, 이밖에 혈압강하작용 (Chang & Miles, 1991), 혈당강하작용 (Chang & Miles, 1987) 등의 다양한 약리학적 효능이 발표되어 의약품 산업 및 건강보조식품, 화장품 산업 등에의 응용이 기대되고 있다. 또한, 이들 β-글루칸은 점성, 젤 형성능, 열 안정성, pH 안정성 및 유화 활성 (Hamada, 1987) 등이 뛰어나 식품, 화장품 및 다양한 공업 용도로서 주목받고 있다.
현재까지, 애그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 매크로포모프시스 속(Macrophomopsis sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.) 및 아우레오바시디움속(Aureobasidium sp.) 등이 β-글루칸을 생산하는 미생물로서 보고되어 있다. 이러한 미생물들은 액체영양배지 중에서 진탕 배양할 수 있으므로, 재배를 통한 버섯류의 배양에 비해, 산업적으로 간편하고 효율적인 양산화가 가능하다는 장점을 가진다.
이 중, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)와 같은 미생물은 β-글루칸을 균체 밖으로 방출하여 그 배양액 중에 고농도로 축적되기 때문에, 균체로부터 추출하지 않고 고농도의 β-글루칸 조성물로서 이용할 수 있다. 또한, 균체를 포함하는 배양물을 이용함으로써, 균체에 포함되는 다른 유용 성분도 동시에 함유한 복합적인 효과를 기대하는 기능성 소재로 하는 것도 가능하다.
그렇지만, 일반적으로 흑효모로 불리는 아우레오바시디움 속의 균들은, 배양액에 멜라닌 유사 물질의 흑색 색소가 축적되어 이를 분비하므로 암녹색을 나타내, 배양물이나 배양액을 그대로 사용하는 음식품이나 화장품 등으로서는 외관 등의 문제로 제품화에 한계가 있다는 단점을 가질 수 있다. 때문에, 정제과정을 거쳐서 흑색 색소를 제거하는 것도 가능하지만, 일반적으로 공정상 복잡한 과정을 수반하게 되어, 천연물 유래의 β-글루칸을 그대로 추출하는 것은 곤란하다.
이를 위해, β-글루칸을 산업적으로 대량생산함에 있어서, 흑색 색소를 생산하지 않으면서도, β-글루칸 생산성이 높은 아우레오바시디움 풀루란스의 개량을 위해 다양한 연구들이 진행되고 있다.
따라서, 본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않는 동시에 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있는 균주를 제조하기 위해 노력한 결과, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1)는 바이오폴리머 및 β-글루칸을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 β-글루칸의 제조 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있는, 자외선 조사를 이용하여 제조된 흑색 색소 없이 β-글루칸(β-glucan)을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주, 및 이를 이용하여 흑색 색소 없이 β-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것이다.을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 제 1항의 균주를 배양하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)의 배양액으로부터 바이오폴리머 또는 β-글루칸을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오폴리머 또는 β-글루칸의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 면역증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 건강기능성 식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 제조방법에 의해 생산된 β-글루칸은 면역증강용 조성물, 건강기능성 식품 및 화장료 조성물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주의 18S rRNA 염기서열을 분석 후, 이를 동정한 결과를 나타내는 표이다.
도 2는 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주 및 아우레오바시디움 풀루란스 모균주의 흑색 색소 생산을 비교하기 위한 배양액을 확인한 도이다.
도 3은 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주 및 아우레오바시디움 풀루란스 모균주의 바이오폴리머(biopolymer) 및 β-글루칸 생산 효과를 확인한 도이다.
도 4는 배지 내 수크로오즈(sucrose) 농도에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 확인한 도이다.
도 5는 배지 내 옥살산(oxalic acid) 농도에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주를 제공한다.
상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 서열번호 1로 기재되는 18S rRNA를 가지며, 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된 균주인 것이 바람직하다.
상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 생산하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 바이오폴리머는 플루란(pullulan) 및 β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 흑색 색소를 생산하지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 흑색 색소는, 아우레오바시디움 속 균주의 고유 특성으로서, 배양액에 멜라닌 유사 물질의 흑색 색소를 분비하여 축적되므로, 아우레오바시디움 속 균주가 생산하는 β-글루칸을 포함하는 면역증강용 조성물, 건강기능식품 또는 화장료 조성물의 생산에 있어서, 배양물이나 배양액을 그대로 사용하는 음식품이나 화장품 등으로서는 외관 등의 문제로 제품화에 한계가 있다는 단점을 가질 수 있다. 때문에, 정제과정을 거쳐서 흑색 색소를 제거하는 것도 가능하지만, 일반적으로 공정상 복잡한 과정을 수반하게 되어, 천연물 유래의 β-글루칸을 그대로 추출하는 것은 곤란하므로, 흑색 색소를 생산하지 않으면서 β-글루칸을 유의적으로 생산하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스 IMS822 균주(한국생명공학연구원 생물자원센터, 수탁번호: KCTC 11179BP)를 모균주로 하고, 자외선을 조사하여 바이오폴리머 생산 최적 배지에서 색소를 생성하지 않고 바이오폴리머(biopolymer)의 생산량이 가장 높은 변이 균주를 선별하여, 이를 아우레오바시디움 풀루란스 YK1로 명명하였다. 상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1의 18S rRNA 염기서열을 분석하여 이를 동정한 결과, 아우레오바시디움 풀루란스 균주들과 99% 이상의 상동성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12656BP를 부여받았다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 모균주와 비교하기 위하여, 동일한 조건에서 각각의 균주를 배양한 후, 배양시간에 따른 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량을 확인한 결과, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 검은색 색소를 생산하지 않아 배지의 색이 모균주의 배양액과 다른 것을 확인하였고(도 2 참조), 108 시간의 배양 동안 바이오폴리머 및 이에 포함된 β-글루칸을 생산하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
따라서, 본 발명의 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 β-글루칸의 제조 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주를 배양하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)의 배양액으로부터 바이오폴리머 또는 β-글루칸을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오폴리머 또는 β-글루칸의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 i)의 배양은 탄소원 농도는 2 내지 12%(w/v)인 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 구체적으로 5 내지 11%(w/v)인 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로 8 내지 10%(w/v)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 탄소원은 포도당(glucose), 수크로오즈(sucrose) 또는 갈락토오즈(galactose)와 같이 아우레오바시디움 속 균주가 β-글루칸을 생산하기 위한 배지에 포함되는 탄소원으로서 당업계에 공지된 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 구체적으로 수크로오즈를 포함하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 i)의 배양은 유기산의 농도가 0.5 내지 1.5 g/ℓ(w/v)인 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 구체적으로 0.7 내지 1.4 g/ℓ(w/v)인 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로 1.0 내지 1.2 g/ℓ(w/v)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 유기산은 옥살산(oxalic acid), 숙신산(succinic acid) 또는 푸마르산(fumalic acid)와 같이 아우레오바시디움 속 균주가 β-글루칸을 생산하기 위한 배지에 포함되는 유기산으로서 당업계에 공지된 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 구체적으로 옥살산을 포함하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 숙신산 또는 푸마르산을 유기산으로 포함하는 경우에는 옥살산을 포함하는 경우에 비해 β-글루칸의 생산량이 적으므로, β-글루칸 생산 효과가 적다.
상기 단계 i)의 배양에 있어서, 짜페크-독스(Czapeck-Dox) 또는 바이오폴리머 생산최적화 배지(W/T optimization medium)와 같이 아우레오바시디움 속 균주가 β-글루칸을 생산하기 위한 배지로서 당업계에 공지된 것이라면 배양 배지로서 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 상기 배지의 조성에 효모 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract) 또는 펩톤(peptone)과 같은 물질을 추가적으로 첨가하는 것은 균주의 생육속도 및 균체량의 증가에는 영향을 줄 수 있으나, 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량은 저하시키므로, 바람직하지 않다.
상기 단계 i)의 배양에 있어서, 공기 주입량, 배지 혼합 속도(agitation speed) 및 pH 조정 등의 배양 조건은 균체량의 증가에는 영향을 줄 수 있으나, 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량에는 영향을 미치지 않는다.
상기 단계 ii)의 바이오폴리머는 플루란(pullulan)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 흑색 색소를 생산하지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 흑색 색소는, 아우레오바시디움 속 균주의 고유 특성으로서, 배양액에 멜라닌 유사 물질의 흑색 색소를 분비하여 축적되므로, 아우레오바시디움 속 균주가 생산하는 β-글루칸을 포함하는 면역증강용 조성물, 건강기능식품 또는 화장료 조성물의 생산에 있어서, 배양물이나 배양액을 그대로 사용하는 음식품이나 화장품 등으로서는 외관 등의 문제로 제품화에 한계가 있다는 단점을 가질 수 있다. 때문에, 정제과정을 거쳐서 흑색 색소를 제거하는 것도 가능하지만, 일반적으로 공정상 복잡한 과정을 수반하게 되어, 천연물 유래의 β-글루칸을 그대로 추출하는 것은 곤란하므로, 흑색 색소를 생산하지 않으면서 β-글루칸을 유의적으로 생산하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 생산 조건을 최적화하기 위해, 수크로오즈(sucrose)의 양 또는 옥살산(oxalic acid)의 변화에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 확인을 확인한 결과, 10%(w/v) 수크로오즈 및 1.2 g/ℓ(w/v) 옥살산의 농도에서 아우레오바시디움 풀루란스 YK1를 배양하였을 때, 모균주의 최적 배양조건에서 생산되는 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량보다 높은 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
따라서, 본 발명의 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 β-글루칸의 제조 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 면역증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액 유효성분으로 함유하는, 건강기능성 식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 제조방법에 의해 생산된 β-글루칸은 면역증강용 조성물, 건강기능성 식품 및 화장료 조성물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 ( Aureobasidium pullulans YK1 ) 변이 균주의 제조
<1-1> 아우레오바시디움 풀루란스 UV 변이 균주의 제조 및 분리
본 발명의 실시예를 수행하기 위해서, 아우레오바시디움 풀루란스 모균주로부터 자외선(UV)을 조사처리하여 UV 변이균주를 제조하고, 이를 선별하였다.
구체적으로, 아우레오바시디움 풀루란스 IMS822 균주(한국생명공학연구원 생물자원센터, 수탁번호: KCTC 11179BP)를 짜페크-독스(Czapeck-Dox) 액체 배지에서 48 시간 동안 전배양(pre-incubation)하였다. 전배양 후, 상기 균주를 YM 평판배지(Yeast-Malt medium)에 획선도말하고 클린 벤치(clean bench) 내의 UV 램프(산쿄덴키 사, 일본; 30 W, 200~280 ㎚)를 이용하여, 약 30 ㎝ 거리에서 30 분간 자외선을 조사한 후, 모균주의 바이오폴리머 생산최적화 배지(W/T potimization medium)에 균주를 옮겨 28℃ 온도의 진탕 배양기에서 140 rpm의 조건으로 72 시간 동안 배양하였다. 배양 개시 후, 48 시간 이상 배양한 결과, 색소를 생산하지 않는 14 개의 균주를 선별하여, 이들 균주를 모균주의 바이오폴리머 생산 최적 배지에서 배양하였다. 배양 후, 바이오폴리머 생산 최적 배지에서 색소를 생성하지 않고 바이오폴리머(biopolymer)의 생산량이 가장 높은 변이 균주를 선별하였고, 선별한 균주는 계대 배양한 후 20% 글리세롤 저장액(glycerol stock)을 통해 -70℃에서 유지 및 보관하였다. 상기 짜페크-독스(Czapeck-Dox) 액체 배지, YM 평판배지 및 모균주의 바이오폴리머 생산최적화 배지(W/T optimization medium)는 각각 하기 [표 1]에 기재된 조성에 따라 제조하였다.
본 발명에서 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양을 위해 사용한 배지의 조성
조성(단위) 배지명
짜페크-독스
배지		 W/T optimization
medium		 YM
평판배지
수크로오즈 (g)
(sucrose)		 30.00 100.00 -
KNO3 (g) 3.00 4.00 -
K2HPO4 (g) 1.00 1.00 -
MgSO4·7H2O (g) 0.50 0.50 -
KCl (g) 0.50 0.50 -
FeSO4 (g) 0.01 0.01 -
옥살 산 (g)
(oxalic acid)		 - 0.70 -
효모-추출물 (g)
(Yeast-extract)		 - - 3.0
말트-추출물 (g)
(Malt-extract)		 - - 3.0
펩톤 (g)
(peptone)		 - - 5.0
덱스트로즈 (g)
(Dextrose)		 - - 10.0
증류수 (ℓ) 1.00 1.00 1.0
최종 pH 7.3±0.2 7.3±0.2 6.2±0.2
<1-2> 18S rRNA 를 통한 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 동정
UV 조사로 얻은 돌연변이주가 모균주와 유전학적 동일성을 가지는지 확인하기 위하여, 선별한 균주의 유전체 DNA를 분리하고 18S rRNA 염기서열을 분석하여 동정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 색소를 생성하지 않고 바이오폴리머의 생산량이 높은 것으로 선별한 균주를 수득하여, ZR Fungal/Bacterial DNA Kit™(ZYMO RESEARCH 사, 미국)를 사용하여 제조사가 제공하는 프로토콜을 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 ITS1 프라이머 및 ITS4 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 균주의 18S rRNA 서열을 증폭하였다. 그런 다음, 증폭한 균주의 18S rRNA는 DNA 염기서열 분석기인 ABI PRISM 3730XL(Applied Biosystems 사, 미국)을 사용하여 서열 분석하였다. 분석한 균주의 18S rRNA 염기서열은 NCBI (National Centers for Biological Information)의 유전자 은행(Genebank)를 통해 다른 균주와의 염기서열 상동성을 추적하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 UV 조사로 얻은 아우레오바시디움 풀루란스 돌연변이주는 아우레오바시디움 풀루란스 균주들과 99% 이상의 상동성을 나타내는 것을 통해, 아우레오바시디움 풀루란스 돌연변이주가 모균주와 동일한 아우레오바시디움 풀루란스 속 균주들과 근연한 위치에 있는 균주임을 확인하였다(도 1). 이에, 상기 돌연변이주를 아우레오바시디움 풀루란스로 동정하여, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 12656BP).
< 실시예 2> 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β- 글루칸 (β- glucan ) 생산 효과 확인
본 발명에서 제조한 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 모균주와 비교하기 위하여, 동일한 조건에서 각각의 균주를 배양한 후, 배양시간에 따른 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조한 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주를 150 ㎖의 바이오폴리머 생산최적배지에 접종하여 종균 배양(seed culture)한 다음, 이를 5ℓ-배양기(5ℓ-jar, KBT 사)에 포함된 바이오폴리머 생산최적배지로 옮겨 총 108 시간 동안 회분 배양하였다. 5ℓ-배양기의 기본 배양조건은 300 rpm, 1 vv/m이며, pH는 보정하지 않았다. 먼저, 바이오폴리머의 정량을 위해서는 배양 후, 배양액을 50 ㎖을 수득하고, 10,000 rpm에서 20 분간 원심분리 한 다음, 상등액 10 ㎖을 수득하여, 에탄올 30 ㎖과 혼합하고, 바이오폴리머가 침전될 때까지 혼합(voltexing)하였다. 혼합한 용액은 GF/C 필터(Whatman 사)로 진공 여과(vacuum filtration)하고, 105℃에서 일정량이 될 때까지 건조한 후에, 건조된 바이오폴리머의 무게를 측정하였다.
β-글루칸의 정량을 위해서, 상기 배양한 배양액을 30 ㎖ 수득하여, 플루라나아제(pullulanase) 32 유닛(unit)을 포함하는 pH 5.0의 50 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액 30 ㎖ 및 pH 5.0의 100 mM 아세트산 나트륨 완충용액 90 ㎖과 혼합하였다. 혼합 후, 25℃, 200 rpm에서 24 시간 동안 진탕혼합하여 반응을 진행한 후, 450 ㎖의 에탄올을 첨가하여 다당류가 침전될 때까지 혼합하였다. 그런 다음, 혼합한 용액은 GF/C 필터(Whatman 사)로 진공 여과(vacuum filtration)하고, 105℃에서 일정량이 될 때까지 건조한 후에, 건조된 β-글루칸의 무게를 측정하였다. 대조군으로는, 아우레오바시디움 풀루란스 IMS822 모균주를 상기와 동일한 방법으로 배양한 후, 배양액 내의 바이오폴리머 및 β-글루칸을 정량하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에서 나타난 바와 같이, 아우레오바시디움 풀루란스 IMS822 모균주는 기존의 검은색 색소를 생산하는 반면, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주는 검은색 색소를 생산하지 않아 배지의 색이 다른 것을 확인하였다(도 2). 또한, 모균주는 108 시간의 배양 동안 26.5 g/ℓ-배지의 바이오폴리머를 생산하였으며, 그 중 6.1 g/ℓ-배지가 β-글루칸임을 확인한 반면, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 배양액은 22.6 g/ℓ-배지의 바이오폴리머를 생산하였으며, 그 중 4.9 g/ℓ-배지가 β-글루칸임을 확인하였다(도 3).
< 실시예 3> 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β- 글루칸 생산 조건 최적화
<3-1> 탄소원에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β- 글루칸 생산 조건 검토
본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주가 모균주와 비교하였을 때 색소를 생산하지 않으나, 모균주보다 적은 양의 바이오폴리머 및 β-글루칸을 생산하므로, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 생산 조건을 최적화하기 위해, 배지 내 탄소원인 수크로오즈의 양의 변화에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주를 5ℓ-배양기에서 회분 배양하였다. 상기 회분 배양시, 바이오폴리머 생산최적배지에서 배양하였으며, 수크로오즈의 양을 5%(w/v) 또는 10%(w/v)로 각각 첨가하는 것 외에는 상기 [표 1]에 기재된 조성을 따라 배지를 제조하였다. 총 108 시간 동안 회분 배양한 다음, 배양액을 수득하여 상기 <실시예 2>와 동일한 방법을 수행하여 배양액 내에 생산된 바이오폴리머 및 β-글루칸의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 10%의 수크로오즈를 첨가한 배지에서 배양한 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주가, 5%의 수크로오즈를 첨가한 배지에서 배양하였을 때와 비교하여, 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량이 높은 것을 확인하였다(도 4).
<3-2> 옥살산( oxalic acid ) 첨가량에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β- 글루칸 생산 조건 검토
아우레오바시디움 풀루란스의 바이오폴리머 생산에 있어서, 옥살산의 첨가에 의해 바이오폴리머의 생산량이 크게 좌우되므로, 배지 내에 첨가하는 옥살산의 양을 모균주의 최적배지조성으로서 알려진 0.7 g/ℓ보다 많은 양의 옥살산을 첨가한 배지에서 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주의 바이오폴리머 및 β-글루칸 생산 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주를 5ℓ-배양기에서 회분 배양하였다. 상기 회분 배양시, 바이오폴리머 생산최적배지에서 배양하였으며, 옥살산의 양을 0.7 g/ℓ 또는 1.2 g/ℓ로 각각 첨가하는 것 외에는 상기 [표 1]에 기재된 조성을 따라 배지를 제조하였다. 총 108 시간 동안 회분 배양한 다음, 배양액을 수득하여 상기 <실시예 2>와 동일한 방법을 수행하여 배양액 내에 생산된 바이오폴리머 및 β-글루칸의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 1.2 g/ℓ의 옥살산을 첨가한 배지에서 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주를 배양하였을 때, 108 시간 동안 32.1g/ℓ-배지의 바이오폴리머 생산량을 나타내었으며, 이 중 β-글루칸의 생산량은 11.9 g/ℓ-배지임을 확인함으로써, 1.2 g/ℓ의 옥살산을 첨가한 배지에서 본 발명의 변이균주를 배양하는 경우에 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량이 모균주의 최적 배양조건에서 생산되는 바이오폴리머 및 β-글루칸의 생산량보다 높은 것을 확인하였다(도 5).
본 발명에 따른, 자외선 조사를 이용하여 제조된 변이균주 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주는 아우레오바시디움 풀루란스의 고유 특성인 흑색 색소를 생산하지 않으면서, 바이오폴리머 및 β-글루칸(β-glucan)을 효과적으로 생산할 수 있으므로, 본 발명의 β-글루칸 제조방법은 면역증강용 조성물, 건강기능성 식품 및 화장료 조성물의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12656BP 20140819
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Aureobasidium pullulans YK1 produced by using UV and a producing method for b-glucan using the same <130> 2014p-08-019 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Aureobasidium pullulans <400> 1 cctgcggaag gatcattaaa gagtaagggt gctcagcgcc cgacctccaa ccctttgttg 60 ttaaaactac cttgttgctt tggcgggacc gctcggtctc gagccgctgg ggattcgtcc 120 caggcgagcg cccgccagag ttaaaccaaa ctcttgttat ttaaccggtc gtctgagtta 180 aaattttgaa taaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga 240 acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 300 aacgcacatt gcgccccttg gtattccgag gggcatgcct gttcgagcgt cattacacca 360 ctcaagctat gcttggtatt gggtgccgtc cttagttggg cgcgccttaa agacctcggc 420 gaggcctcac cggctttagg cgtagtagaa tttattcgaa cgtctgtcaa aggagaggac 480 ttctgccgac tgaaaccttt atttttctag gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc 540 tgaacttaag catatcaa 558

Claims (12)

  1. 수탁번호 KCTC 12656BP로 기탁된, 플루란(pullulan) 생산능을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 YK1(Aureobasidium pullulans YK1) 변이 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 변이 균주는 자외선 조사를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 β-글루칸(β-glucan)을 생산하는 것을 특징으로 하는, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 흑색 색소를 생산하지 않는 것을 특징으로 하는, 아우레오바시디움 풀루란스 YK1 변이 균주.
  5. i) 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)의 배양액으로부터 바이오폴리머를 수득하는 단계를 포함하는, 바이오폴리머의 제조 방법으로서,
    상기 바이오폴리머는 플루란(pullulan) 및 β-글루칸을 포함하는 것인, 바이오폴리머의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 제조 방법은 흑색 색소 없이 바이오폴리머를 생산하는 것을 특징으로 하는, 바이오폴리머의 제조 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 배양은 탄소원 농도는 2 내지 12%(w/v)이고, 유기산의 농도는 0.5 내지 1.5 g/ℓ(w/v)인 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이오폴리머의 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 탄소원은 수크로오즈(sucrose)이고, 상기 유기산은 옥살산(oxalic acid)인 것을 특징으로 하는, 바이오폴리머의 제조 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 면역증강용 조성물.
  11. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 건강기능성 식품.
  12. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물.
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