CN111491644A - 包含出芽短梗霉菌株的培养物或者提取物的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物 - Google Patents

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Abstract

本说明书中公开具有改善微细粉尘引起的皮肤损伤的用途的组合物，其为作为有效成分包含出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans)；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的组合物。所述组合物具有促进角质细胞分化标记以及颗粒层紧密连接标记的表达的效果，强化皮肤屏障功能，具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果，因此对改善微细粉尘引起的皮肤损伤具有优秀的效果。

Description

包含出芽短梗霉菌株的培养物或者提取物的用于改善微细粉 尘引起的皮肤损伤的组合物
技术领域
本发明涉及一种作为有效成分包含出芽短梗霉菌株、其破碎物、其培养物或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物。
背景技术
最近随着对化学原料、昆虫以及动物性原料的遏制，有必要寻求从环境由来的绿色生物功效材料。微生物资源与石油、水等不同，可以再生产，由此被分类为可持续使用的资源，由于利用适应多种环境的微生物固有的特性，因此研究以及工业使用可能性非常高。
一方面，周知皮肤起到身体和环境之间的屏障作用，而且长期露出于微细粉尘时，屏障功能会下降。尤其，微细粉尘相比毛孔小20倍，而能够容易侵入到皮肤，因此因微细粉尘而在短期内引起初期老化、水分不足、增加小皱纹和皱纹，长期的话因无法修复的皮肤损伤，皮肤丧失从环境因素保护身体的功能，同时还能够引起皮肤癌等严重的疾病。
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)还统称为黑酵母(black yeast)，是从土壤、空气中发现的微生物中的一个，环境适应性卓越。周知出芽短梗霉在低湿度、高温、高的太阳光照射、甚至存在放射性核素(radionuclides)的环境下也能生存、生长，如人的皮肤般生成黑色素，而从紫外线或者游离基(free radical)中保护自己，并向菌体周围生成普鲁兰多糖(pullulan)等β-葡聚糖等，从而从外部环境中保护自己(N.A.Yurlova etal.2008.Studies in Micrology 61:39-49)。周知普鲁兰多糖具有抗氧化、特应性皮肤的保护效果等，然而对微细粉尘的皮肤保护效果却尚未公布。
【现有技术文献】
【专利文献】
(专利文献1)KR10-2009-7010923 A1
发明内容
技术问题
一方面，本发明的目的在于，提供一种出芽短梗霉菌株的新用途。
另一方面，本发明的其他目的在于，提供一种对改善微细粉尘引起的皮肤损伤具有优秀效果的出芽短梗霉GJW菌株。
技术方案
一方面，本发明提供一种作为有效成分包含出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物。
另一方面，本发明提供一种对改善微细粉尘引起的皮肤损伤具有优秀效果的出芽短梗霉GJW菌株。
发明效果
一方面，本发明的出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物具有促进角质细胞分化标记以及颗粒层紧密连接标记的表达的效果，强化皮肤屏障功能，具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果，因此对改善微细粉尘引起的皮肤损伤具有优秀的效果。
附图说明
图1是出芽短梗霉GJW菌株的皮肤细胞稳定性的示意图；
图2是处理出芽短梗霉GJW菌株的培养物提取物的皮肤角质细胞中，角蛋白1(keratin 1)相对表达量的示意图；
图3是处理出芽短梗霉GJW菌株的培养物提取物的皮肤角质细胞中，claudin-4相对表达量的示意图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
一方面，本发明提供一种作为有效成分包含出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物。
本发明的出芽短梗霉菌株可以为保藏号KCCM12142P的出芽短梗霉GJW菌株，具体地，具有由序列号：1表示的18S rRNA。所述菌株可以是进行培养并离心分离培养物之后，利用灭菌的生理食盐水进行清洗，然后分散到溶剂，例如灭菌乳中，进行冻结干燥，制成冻结干燥粉末形态来使用。
所述菌株的破碎物可以是将菌株本身利用化学或者物理性力量进行破碎来获得的产物。
所述菌株的培养物与培养物的形态无关，可以是指包含培养液的且包含培养菌株的培养基中含有的一部分或者全部物质的物质，例如，可以是指包含作为菌株培养的结果物的代谢物或者分泌物的物质或者其破碎物，菌株本身也可以包含在培养物内。根据本发明的一实施例，所述培养物可以是在包含土豆提取物(potato extract)以及右旋糖(dextrose)的培养基中进行培养的。
所述提取物可以是指将菌株本身、菌株的破碎物、菌株的培养物或者其混合物不分提取方法、提取溶剂、提取的成分或者提取物的形态，进行提取并获得的产物，是包括所有的提取后能够通过其他方法进行加工或者处理来获得的物质的广义的概念。具体地，所述提取物可以为乙醇馏分物。
本发明的组合物以组合物整体重量为基准，可以包含0.001至30重量％的出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物。具体地，以组合物整体重量为基准，可以包含0.001重量％以上、0.01重量％以上、0.1重量％以上、0.5重量％以上、1重量％以上、1.5重量％以上或者2重量％以上，可以包含30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、15重量％以下、10重量％以下或者5重量％以下。
本发明的微细粉尘为肉眼无法看到的非常小的物质，其作为在大气中长时间悬浮或者飘浮的颗粒状的物质，可以是指粒径10μm以下的物质。尤其，将粒径2.5μm以下的颗粒状的物质称为超微细粉尘，本发明的微细粉尘也包括超微细粉尘。所述粒径可以是指各个颗粒直径的平均值。粉尘是包括来自自然的沙、土以及花粉等物质，或者来自工业生产的碳、碳的燃烧物、金属盐以及重金属等物质的物质，微细粉尘通常由22％的有机碳化合物、8％的碳元素、22％的硝酸盐、15％的硫酸盐、15％的土壤地壳成分、18％的其他物质构成。
本发明的微细粉尘引起的皮肤损伤是指刺激源为微细粉尘的皮肤损伤。所述皮肤损伤作为包含皮肤功能的下降或者弱化的广义的概念，具体可以包括皮肤屏障(Skinbarrier、角质层(Stratum corneum))功能的下降、皮肤保湿力的下降或者皮肤皱纹的生成等。所述皮肤屏障由死亡的角质细胞(Coneocyte)和细胞间脂质(Intercellular lipid)构成，作为从外部刺激中保护皮肤，并防止水分从皮肤蒸发的皮肤保护膜，在皮肤健康中起到核心功能。因此，皮肤屏障功能下降，则有可能皮肤变干燥，促进老化，增加皱纹。
本发明的改善微细粉尘引起的皮肤损伤可以是皮肤屏障功能的强化、皮肤保湿或者抗老化以及皱纹的改善。
本发明的组合物可以增进角蛋白1(keratin 1)或者claudin-4的表达。所述角蛋白1为角质细胞分化标记中的一个，角蛋白为在动物的细胞内制造中间纤维的中间纤维蛋白质的一员，尤其是在皮肤等表皮细胞中制造角质纤维的重要组成蛋白质。所述角蛋白1的表达程度高，则可以判断为皮肤细胞，具体为皮肤角质细胞的分化活跃。所述claudin-4作为颗粒层紧密连接(tight junction)标记，为对作为紧密连接蛋白质的一种的claudin蛋白质进行编码的基因中的一个。所述颗粒层为在哺乳类的表皮(角质化的中层扁平上皮)中存在的层中的一个，所述紧密连接作为细胞间的连接环，起到填充细胞和细胞之间的间距，调节小物质的移动的功能，还起到调节细胞和细胞之间的物质的透过，并维持细胞的极性的作用，在皮肤屏障功能中起到重要作用。本发明的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物通过促进皮肤角质细胞的分化，促进颗粒层紧密连接基因表达，从而强化皮肤屏障功能，具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果。
根据本发明的一实施例，在皮肤角质细胞处理微细粉尘分散液(对照群)时，其相比未处理微细粉尘分散液的无处理群，作为角质细胞分化标记的角蛋白1以及作为颗粒层紧密连接标记的claudin-4的表达量减少约40％，由此确认到因微细粉尘而角质细胞分化以及颗粒层紧密连接表达减少，引起皮肤屏障功能的下降、增加皮肤干燥、促进皮肤老化以及皱纹生成等皮肤损伤(实验例2和3、图2和3)。另外，在处理有微细粉尘分散液的皮肤角质细胞中处理本发明的出芽短梗霉菌株的培养液提取物时，角蛋白1的表达量以及claudin-4的表达量分别增加约50％以上，其相比处理普鲁兰多糖的情况，发生了增加。由此，确认到本发明的出芽短梗霉菌株的培养液提取物具有优秀的促进角质细胞分化的效果，并强化微细粉尘引起的损伤的皮肤屏障功能，从而具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果(实验例2和3、图2和3)。
本发明的另一方面，可以涉及一种改善皮肤损伤的方法，其包括向需要改善微细粉尘引起的皮肤损伤的个体投入包含出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的组合物的步骤。本发明的一方面，所述方法的投入可以根据本说明书中记载的投入方法以及投入容量来进行。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种由微细粉尘引起的皮肤损伤导致的皮肤疾病的预防、改善或者治疗方法，其包括向需要预防、改善或者治疗由微细粉尘引起的皮肤损伤导致的皮肤疾病的个体投入包含出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的组合物的步骤。本发明的一方面，所述方法的投入可以根据本说明书中记载的投入方法以及投入容量来进行。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用途，所述用途用于制造由微细粉尘引起的皮肤损伤导致的皮肤疾病的预防、改善或者治疗用药学组合物。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用途，所述用途用于制造用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的化妆品组合物。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用途，所述用途用于制造用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的食品组合物。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物改善微细粉尘引起的皮肤损伤的用途。
本发明的又一其他方面，可以涉及一种出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物的用途，所述用途用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤。
如上所述一方面，所述组合物可以是药学组合物、化妆品组合物或者食品组合物。
所述药学组合物可以将所述组合物作为有效成分，添加常用的无机或者有机载体，从而以固体、半固体或者液状形态剂型化为口服剂或者非口服剂。
作为用于所述口服的制剂可以举出片剂、丸药、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、散剂、小颗粒剂、粉剂、乳浊剂、糖浆剂、丸剂等。另外，作为用于所述非口服的制剂可以举出注射剂、滴剂、软膏、乳液、喷剂、悬浮剂、乳剂、栓剂等。为了使本发明的有效成分成为剂型化，通过一般方法就能容易进行剂型化，可以适当使用表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、其他常用的助剂。
根据本发明的药学组合物对改善微细粉尘引起的皮肤损伤的效果优秀，从而可以有效用于由微细粉尘引起的皮肤损伤导致的皮肤疾病的治疗以及预防中。作为所述由微细粉尘引起的皮肤损伤导致的皮肤疾病有特应性皮炎(atopic dermatitis)、干皮病(xeroderma)、牛皮癣(psoriasis)、鱼鳞藓(ichthyosis)、粉刺等，然而并不局限于此。
所述药学组合物可以以口服、非口服、直肠、局部、硬皮、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下等进行投入。
另外，所述活性成分的投入量可以根据接受治疗的对象的年龄、性别、体重和所要治疗的特定疾病或者病状、疾病或者病状的严重程度、投入路径以及处方人的判断而不同。针对基于所述因子决定的投入量，在本领域技术人员的水平内。通常，投入量可以为0.001mg/kg/日至2000mg/kg/日，具体为0.5mg/kg/日至1500mg/kg/日。
所述化妆品组合物可以提供为适用于局部的所有剂型。例如，可以提供为在液相、水相分散油相获得的乳剂、在油相分散水相获得的乳剂、悬浮液、固体、凝胶、粉末、浆糊、发泡(foam)或气溶胶组合物的剂型。所述剂型的组合物可以通过本领域的通常的方法来制造。
所述化妆品组合物除了所述物质之外，在不破坏主要效果的范围内，具体还可以含有能够对主要效果起到协同效应的其他成分。根据本发明的化妆品组合物可以包含选自由维生素、高分子肽、分子多糖以及神经鞘脂类而成的群中的物质。另外，根据本发明的化妆品组合物可以包含保湿剂、润滑剂、表面活性剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机以及无机颜料、香料、凉感剂或者止汗(制汗)剂。对于所述成分的混合量，本领域技术人员可以在不破坏本发明的目的以及效果的范围内容易进行选定，其混合量以组合物整体重量为基准，可以为0.001至5重量％，具体为0.01至3重量％。
如上所述一方面，所述药学组合物或者化妆品组合物可以为皮肤外用剂组合物。例如，可以为霜、软膏。
所述食品组合物可以为健康食品组合物，可以为可以举出茶类、乳制品类、泡菜类、酿造食品类的需要发酵的发酵食品组合物。对所述食品组合物的剂型不作特别限定，例如，可以剂型化为片剂、丸药、软质以及硬质胶囊剂、颗粒剂、饮品剂、焦糖、减脂棒、茶包等。各个剂型的食品组合物除了有效成分之外，还可以按照剂型或者使用目的，方便本领域技术人员选定本领域中通常使用的成分进行混合，而且与其他原料同时使用时，可以引起协同效应。对所述有效成分决定的投入量，在本领域技术人员的水平内，可以根据所要投入的对象的年龄、健康状态、并发症等多种因素而不同。
以下，通过实施例以及实验例说明本发明。以下实施例以及实验例是为了有助于理解本发明而仅作为示例的目而提供的，并不由此限定本发明的范畴以及范围。
【实施例1】菌株的分离以及鉴别
从济州岛葛札瓦(Gotjawal)地形的伏石蕨分离出出芽短梗霉，其分离方法如下。
首先，将采集的伏石蕨在灭菌蒸馏水清洗一次以去除杂质，沉浸到相对于重量10倍的磷酸盐缓冲液(PBS；phosphate buffered saline)之后，以250rpm的速度反应1小时。然后，在生理盐水以10倍、100倍的比率稀释所述PBS溶液之后，接种到PDA(土豆提取物(potato extract)4g/L、右旋糖(dextrose)20g/L、琼脂(agar)15g/L)中。接着，将接种的培养基在25-30℃下培养2日至7日，并将看到微生物菌落(colony)的菌株继代培养至少2次至最多4次，最终分离出单一菌株。
对分离的菌株的鉴别是使用以下表1的ITS1引物、ITS4引物，并通过18S rRNA碱基序列分析来实施的。在基因库(Gene Bank)检索经分析的碱基序列的结果，确认到与出芽短梗霉F3-3-60的18S rRNA碱基序列具有94％的相似性，并命名为出芽短梗霉GJW，并于2017年10月31日将所述菌株保藏给作为保藏机关的韩国微生物培养中心，得到保藏号KCCM12142P。
【表1】
序列号：2 ITS1 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'
序列号：3 ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'
【实施例2】出芽短梗霉GJW的培养液以及提取物的制造
将出芽短梗霉GJW菌株接种到培养基(土豆提取物(potato extract)4g/L、右旋糖(dextrose)20g/L)中，在30℃、120rpm条件下培养5日，获得培养液。
然后，在所述出芽短梗霉GJW菌株培养液中加入等量的乙醇进行反应，在4℃下静置1日，获得培养液的乙醇馏分。然后，通过离心分离分离沉淀物，进行冻结干燥，获得培养液提取物。
【实施例3】微细粉尘的捕集以及提取
对微细粉尘的捕集是利用了低容量空气采样器(Sensidyne,Gillian,Low VolumeAir Sampler,FL,U.S.A.)，对于过滤组合件(Filter pack)则是每个测定日的上午10点左右替换过滤器和溶蚀器，采集试料约24小时。从2014年2月1日至2014年2月28日为止，在首尔的顺风地区(位于京畿道龙仁市处仁区，韩国外国语大学外国学综合研究中心生活馆6层屋顶)每日捕集微细粉尘，测定时间则是从打开真空泵启动计时器，关闭真空泵时记录计时器的时间。将采集流量设为16.7L/min，测定开始时，利用流量计(型号(Model)4143，TSIInc.)测定流量，测定结束时，再次测定流量。对于过滤组合件中的特氟龙(Teflon)过滤器，在试料采集前和后测定重量。在测定特氟龙过滤器的重量前，在相对湿度40％的干燥器(NIKKO，Japan)恒重24小时之后，利用显示小数点5位数的电子秤(DVC215CD,Ohaus)测定重量两次，记录平均值。即便采集试料之后，在测定重量之前，在干燥器恒重24小时之后，测定重量两次，与采集之前的重量进行比较，算出质量浓度。将特氟龙过滤器浸湿在1mL的乙醇之后，加入14mL的净化水(DW)，在使过滤器的气溶胶捕集面接触水面的状态下，关闭盖子之后，利用超声波清洗器供给超声波30分钟，由此进行了微细粉尘的提取。在过滤步骤中为了使水分带来的误差最小化，在干燥器(decicator)放置48小时完全去除过滤器的水分之后，利用能够测定到0.1mg的超精密秤(Mettler Toledo Company)称重过滤器的重量，称量过滤器的提取之前、之后的重量。
【实施例4】角质形成细胞的培养
角质形成细胞株(Human normal epidermal keratinocytes)是从龙沙公司(Lonza,Inc.位于美国马里兰州沃克斯维尔)购买并继代培养之后，在CO2培养器(CO2incubator)在37℃、5％CO2条件下进行了培养。使用了在500ml的KBM-2(KBMTM-2，CC-3103)培养基包括BPE(牛垂体提取物；Bovine pituitary extract)、人表皮生长因子(humanepidermal growth factor，hEGF)、胰岛素(Insulin)、皮质醇(Hydrocortisone)、硫酸庆大霉素(Gentamycin Suflate)、肾上腺素(Epinephrine)、转铁蛋白(Transferrin)的培养液。培养时维持最大90％左右的汇合(confluency)，然后进行了继代培养(subcultivation)。
【实施例5】在皮肤角质细胞处理微细粉尘以及出芽短梗霉菌株的培养液提取物
使用6-孔板向以所述实施例4的角质形成细胞培养中的细胞培养条件在3X105细胞数/孔(cells/well)的条件下培养的细胞以50μg/ml处理所述实施例3中获得的微细粉尘，并培养24小时，将其作为对照群使用(以下，“无处理群”表示未处理所述微细粉尘分散液的皮肤角质细胞)。另外，将通过与如上相同的方法处理50μg/ml浓度的微细粉尘和50μg/ml浓度的所述实施例2的出芽短梗霉GJW提取物的细胞，以及作为比较例的处理50μg/ml浓度的微细粉尘和50μg/ml浓度的周知由出芽短梗霉生成的普鲁兰多糖的细胞分别培养24小时。
【实验例1】出芽短梗霉菌株的培养液提取物的皮肤细胞稳定性的确认
为了确认在所述实施例2获得的出芽短梗霉菌株的培养液提取物对皮肤细胞是否具有稳定性，进行如下所述实验。
将在所述实施例2获得的出芽短梗霉菌株的培养液提取物溶解在净化水(DW)之后，处理到皮肤角质形成细胞中，确认是否对细胞的生物活性产生影响。将2X 105cells/mL浓度的皮肤细胞在96细胞培养板(well cell culture plate)分别分株100μL，并培养24小时之后，在此分别以10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL浓度处理出芽短梗霉菌株的培养液提取物，并进一步培养24小时。按照各个浓度反复实验3次。细胞的生物活性是利用MTT比色法(MTT assay)进行比较的，并利用将无处理群的生物活性视为100％时的提取物处理群的生物活性进行表示。
其结果，确认到所述出芽短梗霉菌株的培养液提取物对皮肤细胞的生长不产生影响，因此对皮肤细胞具有稳定性(参考图1)。
【实验例2】出芽短梗霉菌株的培养液提取物对角质细胞分化的促进效果
为了确认在所述实施例2获得的出芽短梗霉菌株的培养液提取物对皮肤角质细胞分化的促进效果，进行了如下所述实验。
从在所述实施例5的无处理群、处理微细粉尘而且均未处理出芽短梗霉菌株的培养液提取物以及普鲁兰多糖的皮肤角质细胞(以下，称为“对照群”)、处理微细粉尘以及出芽短梗霉菌株的培养液提取物的皮肤角质细胞(相当于图2的“出芽短梗霉培养液提取物”)和处理微细粉尘分散液之后处理普鲁兰多糖的皮肤角质细胞(相当于图2的“普鲁兰多糖”)分别去除培养液，利用2ml的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)清洗细胞之后，使用Trizol试剂(Trizol reagent，Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分离细胞内的RNA。然后，将分离的RNA用QIAGEN公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt,QIAGEN,Valencia,CA)再次进行纯化后，用Agilent公司的生化分析仪2100型仪器(Agilent 2100BioAnalyzer，Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)确认RNA的质量(quality)。利用Invitrogen公司的逆转录试剂盒(Superscript Reverse Transcriptase(RT)kit,Invitrogen,Carlsbad,CA)从上述RNA合成cDNA。
然后，通过利用以下表2的引物的实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR：realtime-reverse transcription polymerase chain reaction)定量分析角蛋白1的表达程度。对于基因的表达图谱变化，则利用Applied Biosystems公司的Taq Man基因表达系统(TaqMan gene expression assay kit,Applied Biosystems,Foster City,CA)，用实时PCR评价细胞的基因变化。在图2中示出该结果。图2的mRNA相对表达量表示将无处理群中的角蛋白1mRNA表达量视为1时的角蛋白1mRNA表达量。以上利用的Q-RT-PCR和实时PCR都是按照LifeTechnology发布的标准协议实施的，具体地，将在95℃下处理20秒钟后、在95℃下处理3秒以及在60℃下处理30秒的工序进行40周期。
【表2】
序列号：4 Ker1F 5'-AGG TCG ATT TGT CCC AGC CTT ACC G-3'
序列号：5 Ker1R 5'-ATG TCA TGT GGG TGG TGG TCA CTG C-3'
如图2所示，在皮肤角质细胞处理微细粉尘分散液时，角蛋白1的表达量减少约40％，由此可以确认到因微细粉尘而抑制皮肤角质细胞的分化，导致皮肤损伤。在因所述微细粉尘引起的受损的皮肤角质细胞处理所述实施例2中制造的出芽短梗霉菌株的培养液提取物时，角蛋白1的表达量增加50％以上，其相比处理普鲁兰多糖的情况促进表达。因此，可以确认到本发明的出芽短梗霉菌株的培养液提取物具有优秀的促进角质细胞分化的效果，强化微细粉尘引起的受损的皮肤屏障功能，从而具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果。
【实验例3】出芽短梗霉菌株的培养液提取物对颗粒层紧密连接标记表达的促进效果
为了确认所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株的培养液提取物对颗粒层紧密连接标记表达的促进效果，进行了如下所述实验。
利用与所述实验例2相同的方法，从无处理群、处理微细粉尘而且均未处理出芽短梗霉菌株的培养液提取物以及普鲁兰多糖的皮肤角质细胞(以下，称为“对照群”)、处理微细粉尘以及出芽短梗霉菌株的培养液提取物的皮肤角质细胞(相当于图3的“出芽短梗霉培养液提取物”)和处理微细粉尘以及普鲁兰多糖的皮肤角质细胞(相当于图的“普鲁兰多糖”)分别分离细胞内的RNA之后，测定claudin-4mRNA表达量，在图3中示出该结果。在此使用的引物序列如以下表3所示。图3的mRNA相对表达量表示将无处理群中的claudin-4mRNA表达量视为1时的claudin-4mRNA表达量。
【表3】
序列号：6 Claudin-4F 5'-GTG TAA GGT GCT ACC GCT GAT TC-3'
序列号：7 Claudin-4R 5'-AGG GCC ATT CTG GAG TCA CA-3'
如图3所示，在皮肤角质细胞处理微细粉尘分散液时，作为颗粒层屏障的紧密连接的构成成分之一的claudin-4的基因表达量减少约40％，由此可以确认到因微细粉尘而抑制颗粒层紧密连接标记的表达，导致皮肤损伤。在因所述微细粉尘引起的受损的皮肤角质细胞处理所述实施例2中制造的出芽短梗霉菌株的培养液提取物时，claudin-4的表达量增加约50％，其相比处理普鲁兰多糖的情况更高。因此，可以确认到本发明的出芽短梗霉菌株的培养液提取物具有优秀的促进颗粒层紧密连接标记的表达的效果，强化微细粉尘引起的受损的皮肤屏障功能，从而具有皮肤保湿、抗老化以及改善皱纹的效果。
以下说明根据本说明书的一方面的组合物的剂型例，然而还可以应用为其他多种剂型，而且其并不是用于限定本发明，而仅是用于具体说明。
【剂型例1】柔软性化妆水
混合0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、3重量％的甘油、2重量％的丁二醇、2重量％的丙二醇、0.1重量％的聚羧乙烯、10重量％的乙醇、0.1重量％的三乙醇胺以及剩余量的防腐剂、微量色素、微量香料以及微量净化水，并按照通常的柔软性化妆水制造方法进行制造。
【剂型例2】营养性化妆水
混合0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、4重量％的蜂蜡、1.5重量％的聚山梨醇酯60、0.5重量％的山梨坦倍半油酸酯、5重量％的液状石蜡、5重量％的角鲨烷、5重量％的辛酸/癸酸甘油三酯、3重量％的甘油、3重量％的丁二醇、3重量％的丙二醇、0.1重量％的聚羧乙烯、0.2重量％的三乙醇胺、剩余量的防腐剂、微量色素、微量香料以及微量净化水，并按照通常的营养性化妆水制造方法进行制造。
【剂型例3】营养霜
混合0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、10重量％的蜂蜡、1.5重量％的聚山梨醇酯60、0.5重量％的山梨坦倍半油酸酯、10重量％的液状石蜡、5重量％的角鲨烷、5重量％的辛酸/癸酸甘油三酯、5重量％的甘油、3重量％的丁二醇、3重量％的丙二醇、0.2重量％的三乙醇胺以及剩余量的防腐剂、微量色素、微量香料以及微量净化水，并按照通常的营养霜制造方法进行制造。
【剂型例4】膜剂
混合0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、13重量％的聚乙烯醇、0.2重量％的羧甲基纤维素钠、0.1重量％的尿囊素、5重量％的乙醇、0.3重量％的壬基苯基醚以及剩余量的防腐剂、微量色素、微量香料以及微量净化水，并按照通常的膜剂制造方法进行制造。
【剂型例5】局部投入用药剂(贴片剂)的制造
按照以下表3中记载的组分，通过通常的方法制造局部投入用药剂(贴片剂)。
【表4】
Figure GDA0002546193320000131
【剂型例6】散剂的制造
混合2g的实施例2的出芽短梗霉培养液、1g的乳糖之后，填充到密封袋里，制造出散剂。
【剂型例7】片剂的制造
混合100mg的实施例2的出芽短梗霉培养液、100mg的玉米淀粉、100mg的乳糖、2mg的硬脂酸镁之后，按照通常的片剂的制造方法进行压片，制造出片剂。
【剂型例8】胶囊剂的制造
混合100mg的实施例2的出芽短梗霉培养液、100mg的玉米淀粉、100mg的乳糖、2mg的硬脂酸镁之后，按照通常的胶囊剂的制造方法填充到明胶胶囊，制造出胶囊剂。
【剂型例9】丸的制造
混合1g的实施例2的出芽短梗霉培养液、1.5g的乳糖、1g的甘油、0.5g的木糖醇之后，按照通常的方法制成1丸为4g。
【剂型例10】颗粒的制造
混合150g的实施例2的出芽短梗霉培养液、50mg的大豆提取物、200mg的葡萄糖、600mg的淀粉之后，添加100mg的30％乙醇，在60℃下进行干燥，形成颗粒之后，填充到袋里。
【剂型例11】饮品剂
混合50mg的实施例2的出芽短梗霉培养液、10g的葡萄糖、0.6g的柠檬酸以及25g的液状低聚糖之后，添加300ml的净化水，向每瓶填充200ml。填充到瓶里之后，在130下杀菌4-5秒，能够制造出饮料。
【剂型例12】焦糖剂型
混合50mg的实施例2的出芽短梗霉培养液、1.8g的玉米糖浆(corn syrup)、0.5g的脱脂牛奶、0.5g的大豆卵磷脂、0.6g的黄油、0.4g的植物性硬化油、1.4g的糖、0.58g的人造黄油以及20mg的食盐，从而能够成形焦糖。
以上详细陈述了本发明内容的特定部分，对于本技术领域中具有常规知识的技术人员而言，应明确所述具体陈述仅是优选的实施形态，并不由此限定本发明的范围。因此，本发明的实际上的范围应由权利要求和其等价物而定。
【保藏号】
保藏机关名：韩国微生物培养中心(国外)
保藏号：KCCM12142
保藏日期：20171031
【微生物保藏证明】
Figure GDA0002546193320000151
Figure GDA0002546193320000161
<110> 株式会社爱茉莉太平洋
<120> 包含出芽短梗霉的培养物或者其提取物的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物
<130> OF18P156PCT
<150> KR 10-2017-0155017
<151> 2017-11-20
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 574
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18S rRNA
<400> 1
ggggactgcg gaggatcatt aagagtaagg gtgctcagcg cccgacctcc aaccctttgt 60
tgttaaaact accttgttgc tttggcggga ccgctcggtc tcgagccgct ggggattcgt 120
cccaggcgag cgcccgccag agttaaacca aactcttgtt attaaaccgg tcgtctgagt 180
taaaattttg aataaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300
tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc ctgttcgagc gtcattacac 360
cactcaagct atgcttggta ttgggtgccg tccttagttg ggcgcgcctt aaagacctcg 420
gcgaggcctc accggcttta ggcgtattag aatttattcg aacgtctgtc aaaggagagg 480
acttctgccg actgaaacct tttatttttc taggttgacc tcggatcagg tagggatacc 540
cgctgaactt aagcatatca ataaggcgga ggaa 574
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS1
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS4
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ker1F
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aggtcgattt gtcccagcct taccg 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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atgtcatgtg ggtggtggtc actgc 25
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<223> Claudin-4 F
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gtgtaaggtg ctaccgctga ttc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Claudin-4 R
<400> 7
agggccattc tggagtcaca 20
PCT/RO/134表
Figure QDA0002500339160000011

Claims (14)

1.一种用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，作为有效成分包含出芽短梗霉菌株；其破碎物；其培养物；或者所述菌株、破碎物或者培养物的提取物。
2.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述菌株为保藏号KCCM12142P的出芽短梗霉GJW。
3.根据权利要求2所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述菌株具有由序列号：1的序列表示的18S rRNA。
4.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述提取物为乙醇馏分物。
5.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述有效成分以组合物整体重量为基准，包含0.001至30重量％。
6.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述皮肤损伤的改善是强化皮肤屏障功能。
7.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述皮肤损伤的改善是使皮肤保湿。
8.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述皮肤损伤的改善是抗老化以及改善皱纹。
9.根据权利要求1所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述组合物增加角蛋白1或者claudin-4的表达。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述组合物为药学组合物。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述组合物为化妆品组合物。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的用于改善微细粉尘引起的皮肤损伤的组合物，其中，所述组合物为食品组合物。
13.一种保藏号为KCCM12142P的出芽短梗霉GJW菌株。
14.根据权利要求13所述的菌株，其中，所述菌株具有改善微细粉尘引起的皮肤损伤的功能。
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