KR20190058344A

KR20190058344A - 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양물 또는 추출물을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20190058344A
Application number: KR1020180143544A
Authority: KR
Inventors: 명길선; 나혜원; 김용진
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2019-05-29
Also published as: WO2019098808A3; US11504409B2; WO2019098808A2; CN111491644A; US20200384046A1

Abstract

본 명세서에는, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선 용도를 갖는 조성물이 개시된다. 상기 조성물은, 각질세포 분화 마커 및 과립층 밀착연접 마커 발현을 촉진시키는 효과가 있어, 피부 장벽 기능을 강화시키고, 피부 보습, 항노화 및 주름 억제의 효과가 있는바, 미세먼지에 의한 피부 손상을 개선하는 데에 우수한 효과를 갖는다.

Description

아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양물 또는 추출물을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN DAMAGE BY FINE DUST COMPRISING CURTURE OR ITS EXTRACT OF AUREOBASIDIUM PULLULANS}

본 명세서에는 아우레오바시디움 풀루란스 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물이 개시된다.

최근 화학 원료, 곤충 및 동물성 원료를 지양하게 됨에 따라 환경 유래 친 바이오 효능 소재를 찾을 필요가 대두되고 있다. 미생물 자원은 석유, 물 등과는 달리 재생산할 수 있다는 점에서 지속 가능한 자원으로 분류되고, 다양한 환경에 적응한 미생물 고유의 특성을 이용하므로 연구 및 산업적 적용 가능성이 매우 높다.

한편, 피부는 신체와 환경 사이의 장벽 역할을 하는데 미세먼지에 자주 노출 될수록 장벽 기능이 저하되는 것으로 알려져 있다. 특히 미세먼지는 모공보다 20배 더 작기 때문에 피부에 쉽게 침투할 수 있어, 미세먼지는 단기적으로는 조기 노화, 수분 부족, 잔주름과 주름을 증가시키고, 장기적으로는 되돌릴 수 없는 피부 손상으로 인해 피부가 환경적 요소들로부터 몸을 보호하는 기능을 상실하면서 피부암과 같은 심각한 병을 초래할 수도 있다.

아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)는 통칭 흑효모(black yeast)라고도 하며 토양, 공기 중에서 발견되는 미생물 중 하나로 환경적응력이 뛰어나다. 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)는 낮은 습도, 고온, 높은 태양광 조사, 심지어 방사성 핵종(radionuclides)가 있는 환경에서도 생존, 생장할 수 있는데, 사람의 피부처럼 멜라닌 색소를 생성해 자외선이나 유기 프리 라디칼(free radical)에 대해서 스스로를 보호하고 균체 주변으로 풀루란(pullulan)과 같은 베타글루칸 등을 생성하여 외부 환경에 대해 자신을 보호하는 것으로 알려졌다(N.A. Yurlova et al. 2008. Studies in Micrology 61: 39-49). 풀루란의 효과는 항산화, 아토피에 의한 피부 보호 효과 등이 알려져 있지만 미세먼지에 대한 피부 보호 효과는 알려져 있지 않았다.

KR10-2009-7010923 A1

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 다른 목적은, 미세먼지에 의한 피부 손상을 개선하는 데에 우수한 효과를 갖는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주를 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 유효성분으로 하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 미세먼지에 의한 피부 손상을 개선하는 데에 우수한 효과를 갖는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주를 제공한다.

일 측면에 있어서, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물은, 각질세포 분화 마커 및 과립층 밀착연접 마커 발현을 촉진시키는 효과가 있어, 피부 장벽 기능을 강화시키고, 피부 보습, 항노화 및 주름 개선의 효과가 있는바, 미세먼지에 의한 피부 손상을 개선하는 데에 우수한 효과를 갖는다.

도 1는, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주의 피부 세포 안정성을 나타낸 도이다.
도 2는, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주의 배양물 추출물을 처리한 피부각질세포에서의 상대적 케라틴 1(keratin 1) 발현량을 나타낸 도이다.
도 3은, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주의 배양물 추출물을 처리한 피부각질세포에서의 상대적 클라우딘 4(claudin 4) 발현량을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 유효성분으로 하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주는 기탁번호가 KCCM12142P 인 아우레오바시디움 풀루란스 GJW 균주일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA를 갖는 것일 수 있다. 상기 균주는 배양하여 배양물을 원심분리한 다음, 멸균된 생리식염수로 세척한 후 용매, 예컨대 멸균유에 분산시키고 동결건조하여 동결건조분말 형태로 제조하여 사용될 수 있다.

상기 균주의 파쇄물은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물일 수 있다.

상기 균주의 배양물은 배양물의 형태를 불문하고 배양액을 포함한, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 일부 또는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고, 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 배양물은 감자 추출물(potato extract) 및 덱스트로스(dextrose)를 포함하는 배양 배지에서 배양한 것일 수 있다.

상기 추출물이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 균주의 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 추출하여 얻어진 산물을 의미할 수 있으며, 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다. 구체적으로, 상기 추출물은 에탄올 분획물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 30 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로는, 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상 또는 2 중량% 이상 포함할 수 있으며, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 10 중량% 이하 또는 5 중량% 이하 포함할 수 있다.

본 발명의 미세먼지는, 인간의 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날리는 입자상의 물질로서, 입경 10 ㎛ 이하의 물질을 의미할 수 있다. 특히 입경이 2.5 ㎛ 이하인 입자상의 물질은 초미세먼지라 하는데, 본 발명의 미세먼지는 초미세먼지도 포함하는 것이다. 상기 입경은 각 입자 지름의 평균값을 의미할 수 있다. 먼지는 모래, 흙 및 꽃가루와 같은 자연에서 유래한 물질 또는 탄소, 탄소 연소물, 금속 염 및 중금속과 같은 산업공정으로부터 유래한 물질 등을 포함하는 물질이며, 미세먼지는 일반적으로 유기 탄소화합물 22%, 탄소 원소 8%, 질산염 22%, 황산염 15%, 토양지각성분 15%, 기타 18%로 구성되어 있다.

본 발명의 미세먼지에 의한 피부 손상은 자극원이 미세먼지인 피부 손상을 말한다. 상기 피부 손상이란, 피부기능의 저하 또는 약화를 포함하는 광의의 개념으로서, 구체적으로는, 피부 장벽(Stratum corneum, Skin barrier) 기능의 저하, 피부 보습력의 저하 또는 피부 주름 생성 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 장벽은 죽은 각질세포(Coneocyte)와 세포간 지질(Intercellular lipid)로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당을 한다. 따라서, 피부 장벽 기능이 저하되면 피부가 건조해지고 노화가 촉진되며 주름이 증가할 수 있다.

본 발명의 미세먼지에 의한 피부 손상 개선은 피부 장벽 기능 강화, 피부 보습 또는 항노화 및 주름 개선일 수 있다.

본 발명의 조성물은 케라틴 1(keratin 1) 또는 클라우딘 4(claudin 4)의 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 케라틴 1은 각질세포 분화마커 중 하나로, 케라틴은 동물의 세포 내에서 중간섬유를 만드는 중간섬유 단백질의 일원이며, 특히 피부 등과 같은 표피세포에서는 각질섬유를 만드는 중요 구성 단백질이다. 상기 케라틴 1의 발현 정도가 높으면, 피부 세포, 구체적으로는 피부 각질세포의 분화가 활발한 것으로 판단할 수 있다. 상기 클라우딘 4는 과립층 밀착면접(tight junction) 마커로서, 밀착연접 단백질의 한 종류인 클라우딘(claudin) 단백질을 코딩하는 유전자 중 하나이다. 상기 과립층은 포유류의 표피(각질화한 중층편평상피)에 존재하는 층의 하나이고, 상기 밀착연접(tight junction)은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 기능을 하며, 세포와 세포 간의 물질투과를 조절하고 세포의 극성을 유지하는 역할도 담당하고, 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 본 발명의 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물은 피부 각질세포 분화를 촉진하고 과립층 밀착연접 유전자 발현을 촉진시킴으로써, 피부 장벽 기능을 강화하고 피부 보습, 항노화 및 주름 개선 효과가 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 피부각질세포에 미세먼지 분산액 처리 시(대조군), 각질세포 분화 마커인 케라틴 1(keratin 1) 및 과립층 밀착연접 마커인 클라우딘 4(claudin 4)의 발현량이 미세먼지 분산액을 처리하지 않은 무처리군에 비해 약 40%로 감소하였는바, 미세먼지에 의해 각질세포 분화 및 과립층 밀착 연접 발현이 감소되어 피부 장벽 기능이 저하되고 피부 건조함이 증가되며 피부 노화 및 주름 생성을 촉진하는 등 피부 손상이 일어남을 확인하였다(실험예 2 및 3, 도 2 및 3). 또한, 미세먼지 분산액이 처리된 피부각질세포에 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물 처리 시, 케라틴 1 발현량 및 클라우딘 4 발현량이 각각 약 50% 이상 증가하는데, 이는 풀루란을 처리한 경우보다 증가한 것이다. 이로써, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물은 우수한 각질세포 분화 촉진 효과를 나타내며 미세먼지에 의해 손상된 피부 장벽 기능을 강화시킴으로써 피부 보습, 항노화 및 주름 개선 효과가 있음을 확인하였다(실험예 2 및 3, 도 2 및 3).

상기와 같은 측면에서, 상기 조성물은, 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제, 환제, 과립제, 연, 경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 미세먼지에 의한 피부 손상을 개선시키는 효과가 우수하여 미세먼지에 의한 피부 손상에 의해 유발되는 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 미세먼지에 의한 피부 손상에 의해 유발되는 피부질환으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma), 건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001 mg/kg/일 내지 2000 mg/kg/일, 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 1500 mg/kg/일이다.

상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 구체적으로는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 상기 약학적 조성물 또는 화장료 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 예컨대, 크림, 연고일 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강 식품 조성물일 수 있으며, 다(茶)류, 유제품류, 김치류, 양조 식품류를 예로 들 수 있는 발효가 필요한 발효 식품 조성물일 수 있다. 상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 환제, 연질 및 경질 캅셀제, 과립제, 드링크제, 캐러멜, 다이어트바, 티백 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예를 통하여 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 균주의 분리 및 동정

아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)를 제주도 곶자왈 지형의 콩짜개 덩굴에서 분리하였으며 그 분리 방법은 다음과 같다.

먼저, 채집된 콩짜개 덩굴을 멸균 증류수에 1회 세척하여 이물질을 제거하고 중량 대비 10배의 phosphate buffered saline(PBS)에 침지 시킨 후 250 rpm의 속도로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기의 PBS용액을 생리식염수에 10배, 100배 비율로 희석 한 후 PDA(potato extract 4g/L, dextrose 20g/L, agar 15 g/L)에 접종하였다. 그런 다음, 접종된 배지를 25~30℃에서 2일에서 7일까지 배양하고 미생물 집락(colony)이 보이는 균주를 최소 2회에서 최대 4회까지 계대 배양하여 단일 균주를 최종 분리하였다.

분리된 균주의 동정은 하기 표 1의 ITS1 프라이머, ITS4 프라이머를 사용하여 18S rRNA 염기서열분석을 통해 실시하였다. 분석된 염기서열을 Gene Bank에서 검색한 결과 아우레오바시디움 풀루란스 F3-3-60의 18S rRNA염기서열과 94% 유사성을 가지는 것을 확인하고 아우레오바시디움 풀루란스 GJW으로 명명하고, 상기 균주를 2017년 10월 31일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하고 기탁번호 KCCM12142P 를 부여받았다.

서열번호 2	ITS1	5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'
서열번호 3	ITS4	5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'

[ 실시예 2] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) GJW의 배양액 및 추출물 제조

아우레오바시디움 풀루란스(A. pullulans) GJW 균주를 배양 배지 (potato extract 4g/L, dextrose 20g/L)에 접종하고 5일 동안 30℃, 120 rpm 조건에서 배양하여 배양액을 획득하였다.

그 후, 상기 아우레오바시디움 풀루란스(A. pullulans) GJW 균주 배양액에 동량의 에탄올 넣어 반응시키고 4℃에서 1일간 정치시켜 배양액의 에탄올 분획을 얻었다. 이후 침전물은 원심분리를 통하여 분리하고 동결건조시켜 배양액 추출물을 수득하였다.

[ 실시예 3] 미세먼지 포집 및 추출

미세먼지의 포집은 로우 볼륨 에어 샘플러(Sensidyne, Gillian, Low Volume Air Sampler, FL, U.S.A.)를 이용하였고, Filter pack은 매 측정일 오전 10시 전후에 필터와 디누더를 교체하여 약 24시간 동안 시료를 채취하였다. 2014년 2월 1일부터 2014년 2월 28일까지 서울의 풍하지역(경기도 용인시 처인구 소재, 한국외국어대학교 외국학 종합연구센터 생활관 6층 옥상)에서 매일 미세먼지를 포집하였으며, 측정시간은 진공펌프를 켜면서 타이머를 작동시키고 진공펌프를 끌 때 타이머의 시간을 기록하였다. 채취 유량은 16.7L/min으로 하여 측정 시작시 유량계(Model 4143, TSI Inc.)로 유량을 측정하고 측정이 끝날 때 다시 유량을 측정하였다. filter pack에 들어가는 Teflon 필터는 시료 채취 전과 후에 무게를 측정하였다. Teflon 필터의 무게를 측정하기 전 24시간 동안 상대습도 40%의 데시케이터(NIKKO, Japan)에 항량시킨 후 소수점 5자리가 표시되는 전자저울(DVG215CD, Ohaus)에 무게를 두 번 측정하여 평균값을 기록하였다. 시료를 채취한 후에도 무게를 측정하기 전에 데시케이터에서 24시간 항량시킨 후 무게를 두 번 측정하여 채취 전에 측정한 무게와 비교하여 질량농도를 산출하였다. 미세먼지의 추출은 Teflon 필터를 1mL의 에탄올에 적신 후 14mL의 DW를 넣어 필터의 에어로졸 포집면이 수면에 닿도록 한 상태에서 뚜껑을 닫은 후 초음파 세척기로 30분간 초음파를 주어 실행하였다. 여과단계에서 수분에 의한 오차를 최소화하기 위하여 건조기(decicator)에서 48시간 동안 필터의 수분을 완전히 제거한 후, 0.1mg까지 측정할 수 있는 초정밀저울계(Mettler Toledo Company)를 이용하여 필터의 무게를 칭량하여 필터의 추출 전, 후 무게를 칭량하였다.

[ 실시예 4] 각질형성세포의 배양

각질형성세포주(Human normal epidermal keratinocytes)는 론자 사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO₂ 배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 500ml의 KBM-2(KBMTM-2, CC-3103) 배지에 BPE(Bovine pituitary extract), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 젠타마이신 설페이트(Gentamycin Suflate), 에피네프린(Epinephrine), 트랜스페린(Transferrin)을 포함한 배양액을 사용하였다. 배양 시 최대 90% 정도의 컨플루언시(confluency)를 유지하였으며, 그 이후에는 계대배양(subcultivation)하였다.

[ 실시예 5] 피부각질세포에 미세먼지 및 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 균주의 배양액 추출물 처리

6-웰 플레이트를 사용하여 상기 실시예 4의 각질형성세포 배양에서의 세포배양조건으로 3 X 10⁵ 세포수/웰(cells/well)인 조건에서 배양한 세포에 상기 실시예 3에서 수득한 미세먼지를 50 ㎍/ml 처리하여 24시간 동안 배양하고, 이를 대조군으로 사용하였다(이하, '무처리군’은 상기 미세먼지 분산액이 처리되지 않은 피부각질세포를 나타낸다). 또한, 상기와 동일한 방법으로 50 ㎍/ml 농도의 미세먼지와 50 ㎍/ml 농도의 상기 실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 GJW 추출물을 처리한 세포, 비교예로 50 ㎍/ml 농도의 미세먼지와 아우레오바시디움 풀루란스에서 생성되는 것으로 알려진 풀루란(pullulan)을 50 ㎍/ml의 농도로 처리한 세포 각각을 24시간 배양하였다.

[ 실험예 1] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 균주의 배양액 추출물의 피부 세포 안전성 확인

상기 실시예 2에서 수득한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물이 피부 세포에 대해 안전성을 갖는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 2에서 수득한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 정제수(DW)에 용해시킨 후 피부각질형성세포에 처리하여 세포의 생활성에 영향을 미치는지 확인하였다. 2 X 10⁵ cells/mL 농도의 피부세포를 96 well cell culture plate에 각 100 μL씩 분주하고 24시간을 배양한 다음, 여기에 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 각각 10 ㎍/mL, 20 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL 농도로 처리하고 추가로 24시간을 배양하였다. 농도별로 3회 반복하여 실험하였다. 세포의 생활성은 MTT assay를 이용하여 비교하였고, 무처리군의 생활성을 100%로 보았을 때 추출물 처리군의 생활성을 표시하였다.

그 결과, 상기 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물은 피부 세포의 생장에 영향을 미치지 않아 피부 세포에 대해 안전성을 갖는 것을 확인하였다 (도 1 참조).

[ 실험예 2] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 균주의 배양액 추출물의 각질세포 분화 촉진 효과

상기 실시예 2에서 수득한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물의 피부 각질세포 분화 촉진 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 5의 무처리군, 미세먼지를 처리하되 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물 및 풀루란을 모두 처리하지 않은 피부각질세포(이하, '대조군'이라 함), 미세먼지 및 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 처리한 피부각질세포(도 2의 'A. pulluans 배양액 추출물'에 해당함) 및 미세먼지 분산액 처리 후 풀루란을 처리한 피부각질세포(도 2의 '풀루란'에 해당함) 각각에서 배양액을 제거하고 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 그럼 다음, 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트 사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

그 후, 하기 표 2의 프라이머를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 케라틴 1 발현 정도를 정량적으로 분석하였다. 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 상대적 mRNA 발현량은 무처리군에서의 케라틴 1(keratin 1) mRNA 발현량을 1로 보았을 때의 케라틴 1 mRNA의 발현량을 나타낸다. 상기에서 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하였다.

서열번호 4	Ker1F	5'-AGG TCG ATT TGT CCC AGC CTT ACC G-3'
서열번호 5	Ker1R	5'-ATG TCA TGT GGG TGG TGG TCA CTG C-3'

도 2에 나타낸 바와 같이, 피부각질세포에 미세먼지 분산액을 처리 시, 케라틴 1 발현량이 약 40%로 감소하는바, 미세먼지에 의해 피부 각질세포 분화가 억제되어 피부가 손상된다는 것을 알 수 있었다. 상기 미세먼지에 의해 손상된 피부각질세포에 상기 실시예 2에서 제조한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 처리하는 경우 케라틴 1 발현량이 50% 이상 증가하는데, 이는 풀루란을 처리한 경우보다 발현이 촉진된 것이다. 따라서, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물은 우수한 각질세포 분화 촉진 효과를 나타내며 미세먼지에 의해 손상된 피부 장벽 기능을 강화시킴으로써 피부 보습, 항노화 및 주름 개선 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

[ 실험예 3] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 균주의 배양액 추출물의 과립층 밀착연접 마커 발현 촉진 효과

상기 실시예 2에서 수득한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물의 과립층 밀착연접 마커 발현 촉진 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실험예 2와 동일한 방법으로 무처리군, 미세먼지를 처리하되 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물 및 풀루란을 모두 처리하지 않은 피부각질세포 (이하, '대조군'이라 함), 미세먼지 및 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 처리한 피부각질세포(도 3의 'A. pulluans 배양액 추출물'에 해당함) 및 미세먼지 및 풀루란을 처리한 피부각질세포(도 3의 '풀루란'에 해당함) 각각에서 세포 내의 RNA를 분리한 뒤 클라우딘 4(claudin 4) mRNA 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이 때 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다. 도 3의 상대적 mRNA 발현량은 무처리군에서의 클라우딘 4 mRNA 발현량을 1로 보았을 때의 클라우딘 4 mRNA 발현량을 나타낸다.

서열번호 6	Claudin-4 F	5'-GTG TAA GGT GCT ACC GCT GAT TC-3'
서열번호 7	Claudin-4 R	5'-AGG GCC ATT CTG GAG TCA CA-3'

도 3에 나타낸 바와 같이, 피부 각질세포에 미세먼지 분산액을 처리 시, 과립층 장벽인 밀착연접(tight junction)의 구성성분 중 하나인 클라우딘 4 의 유전자 발현량이 약 40%로 감소하는바, 미세먼지에 의해 과립층 밀착연접 마커 발현이 억제되어 피부가 손상된다는 것을 알 수 있었다. 미세먼지에 의해 손상된 피부각질세포에 상기 실시예 2에서 제조한 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물을 처리하는 경우 클라우딘 4 발현량이 약 50% 증가하는데, 이는 풀루란을 처리한 경우보다 높다. 따라서, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양액 추출물은 우수한 과립층 밀착연접 마커 발현 촉진 효과를 나타내며 미세먼지에 의해 손상된 피부 장벽 기능을 강화시킴으로써 피부 보습, 항노화 및 주름 개선 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[ 제형예 1] 유연화장수

상기 실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 0.01 중량%, 글리세린 3 중량%, 부틸렌 글리콜 2 중량%, 프로필렌 글리콜 2 중량%, 카복시비닐폴리머 0.1 중량%, 에탄올 10 중량%, 트리에탄올아민 0.1 중량% 및 잔량의 방부제, 미량 색소, 미량 향료 및 미량 정제수를 혼합하여 통상의 유연화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

[ 제형예 2] 영양화장수

상기 실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 0.01 중량%, 밀납 4 중량%, 폴리소르베이트 60 1.5 중량%, 소르비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%, 유동파라핀 5 중량%, 스쿠알란 5 중량%, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5 중량%, 글리세린 3 중량%, 부틸렌 글리콜 3 중량%, 프로필렌 글리콜 3 중량%, 카복시비닐폴리머 0.1 중량%, 트리에탄올아민 0.2 중량%, 잔량의 방부제, 미량 색소, 미량 향료 및 미량 정제수를 혼합하여 통상의 영양화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

[ 제형예 3] 영양크림

상기 실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 0.01 중량%, 밀납 10 중량%, 폴리소르베이트 60 1.5 중량%, 소르비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%, 유동파라핀 10 중량%, 스쿠알란 5 중량%, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5 중량%, 글리세린 5 중량%, 부틸렌 글리콜 3 중량%, 프로필렌 글리콜 3 중량%, 트리에탄올아민 0.2 중량% 및 잔량의 방부제, 미량 색소, 미량 향료 및 미량 정제수를 혼합하여 통상의 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.

[ 제형예 4] 팩

상기 실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 0.01 중량%, 폴리비닐알콜 13 중량%, 소듐카복시메틸셀룰로스 0.2 중량%, 알란토인 0.1 중량%, 에탄올 5 중량%, 노닐페닐에테르 0.3 중량% 및 잔량의 방부제, 미량 색소, 미량 향료 및 미량 정제수를 혼합하여 통상의 팩 제조방법에 따라 제조하였다.

[ 제형예 5] 국소 투여용 약제( 패취제 )의 제조

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 국소 투여용 약제(패취제)를 제조하였다.

원료명	함량(중량%)
실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액	2.0
베타-1,3-글루칸	3.0
디에틸아민	0.7
아황산나트륨	0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)	1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 (Cetomacrogol 1000)	1.0
점성의 파라핀 오일	2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르 (Cetiol LC)	2.5
폴리에틸렌글리콜400	3.0
폴리아크릴산(Carbopol 934P)	1.0
정제수	잔량
계	100

[ 제형예 6] 산제의 제조

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 2g, 유당 1g을 혼합한 후 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[ 제형예 7] 정제의 제조

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 100mg, 옥수수전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[ 제형예 8] 캡슐제의 제조

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 100mg, 옥수수전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[ 제형예 9] 환의 제조

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 1g, 유당 1.5g, 글리세린 1g, 자일리톨 0.5g을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조하였다.

[ 제형예 10] 과립의 제조

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 150g, 대두추출물 50mg, 포도당 200mg, 전분 600mg을 혼합한 후, 30% 에탄올 100mg을 첨가하여 섭씨 60 에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

[ 제형예 11] 드링크제

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진한다. 병에 충진한 후 130 에서 4~5 초간 살균하여 음료를 제조할 수 있다.

[ 제형예 12] 캬라멜 제형

실시예 2의 아우레오바시디움 풀루란스 배양액 50mg, 옥수수 시럽(corn syrup) 1.8g, 탈지우유 0.5g, 대두 레시틴 0.5g, 버터 0.6g, 식물성 경화유 0.4g, 설탕 1.4g, 마가린 0.58g, 및 식염 20mg을 혼합하여 캬라멜 성형을 할 수 있다.

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12142

20171031

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN DAMAGE BY FINE DUST COMPRISING CURTURE OR ITS EXTRACT OF AUREOBASIDIUM PULLULANS <130> 18p630ind <150> KR 10-2017-0155017 <151> 2017-11-20 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 574 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA <400> 1 ggggactgcg gaggatcatt aagagtaagg gtgctcagcg cccgacctcc aaccctttgt 60 tgttaaaact accttgttgc tttggcggga ccgctcggtc tcgagccgct ggggattcgt 120 cccaggcgag cgcccgccag agttaaacca aactcttgtt attaaaccgg tcgtctgagt 180 taaaattttg aataaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa 240 gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300 tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc ctgttcgagc gtcattacac 360 cactcaagct atgcttggta ttgggtgccg tccttagttg ggcgcgcctt aaagacctcg 420 gcgaggcctc accggcttta ggcgtattag aatttattcg aacgtctgtc aaaggagagg 480 acttctgccg actgaaacct tttatttttc taggttgacc tcggatcagg tagggatacc 540 cgctgaactt aagcatatca ataaggcgga ggaa 574 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ker1F <400> 4 aggtcgattt gtcccagcct taccg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ker1R <400> 5 atgtcatgtg ggtggtggtc actgc 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin-4 F <400> 6 gtgtaaggtg ctaccgctga ttc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin-4 R <400> 7 agggccattc tggagtcaca 20

Claims

아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 또는 상기 균주, 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 유효성분으로 하는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 기탁번호가 KCCM12142P 인 아우레오바시디움 풀루란스 GJW인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 서열로 표시되는 18S rRNA를 갖는 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 에탄올 분획물인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 30 중량%로 포함되는, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 손상 개선은 피부 장벽 기능 강화인 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 손상 개선은 피부 보습인 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 손상 개선은 항노화 및 주름 개선인 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 케라틴 1(keratin 1) 또는 클라우딘 4(claudin 4)의 발현을 증가시키는 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인, 미세먼지에 의한 피부 손상 개선용 조성물.
기탁번호가 KCCM12142P 인 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GJW 균주.
제13항에 있어서,
상기 균주는 미세먼지에 의한 피부 손상 개선 기능을 가지는 것인, 균주.