KR102189084B1

KR102189084B1 - 흑효모 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102189084B1
Application number: KR1020140114049A
Authority: KR
Inventors: 성수현; 정재준; 구세광
Original assignee: 주식회사 아리바이오
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2020-12-10
Also published as: KR20150028201A

Abstract

본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다. 화장료 조성물은 피부 주름, 피부 미백, 피부 탄력, 안면 처짐, 피부 보습, 피부 윤기, 다크써클 및 피부 각질을 포함하는 피부상태를 개선시키는 데 우수한 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 항산화 활성도 나타내므로 피부노화를 방지하고 건강한 피부를 유지하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흑효모 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물{A cosmetic composition for improving skin conditions comprising culture fluids of Aureobasidium pullulans}

본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 생명과학이 발달함에 따라 노화에 관한 연구는 여러 방향에서 접근되고 있으며 한층 가속화되고 있다. 특히, 피부에서 일어나는 노화는 관찰이 용이하여 더욱 많은 관심의 대상이 되고 있다.

피부가 노화됨에 따라 나타나는 대표적인 징후는, 피부 주름이 증가하고 탄력이 감소하며 피부의 윤기가 감소하며 피부 결이 거칠어지며 피부색이 황색화되고 부분적인 색소침착 등이 나타나는 것이다. 이러한 피부 노화는 내인적 요인에 의한 자연 노화와 외인적 요인, 특히 일광에 의한 광 노화로 나눌 수 있다. 일광에 노출이 많은 안면이나 목덜미, 손등 등에서 나타나는 광 노화는 피부가 두꺼워지고 변성된 탄성섬유가 축적되며, 반대로 햇빛에 노출되지 않은 부위는 자연노화 과정에 의해 피부가 위축되고, 기능저하, 피부의 두께 감소 등이 관찰된다.

피부 노화의 징후 중 가장 눈에 띄고 관심의 대상이 되고 있는 것은 주름이다. 주름은 이마, 눈 주위, 미간, 입 주위 등의 안면이나 머리, 목덜미, 손발 등의 신체 각 부위에 생기며, 30세 전후부터 눈에 띄기 시작하여 나이가 들어감에 따라 그 수나 깊이, 범위가 증가해간다. 주름의 발생에 관여하는 외인적 요인 중 자외선의 영향은 앞서 기술한 바 있고 이외에도 물리적, 화학적 자극 등에 의한 피부의 스트레스도 주름의 원인이 될 수 있다. 이러한 내외적 요인에 의해 각질층 수분량의 저하, 각질층의 비후, 표피의 위축, 진피의 교원 섬유 및 탄력 섬유의 변성 등이 피부의 3차 구조의 변화를 유발하여 탄력성이나 신축성이 저하되어 피부 주름이 형성된다.

피부 노화 및 주름은 피부 중 진피와 연관되어 있다. 진피는 점탄성을 갖는 강하고 탄력적인 조직으로, 피부를 탄력적이고 유연하게 하며 콜라겐과 엘라스틴 등 섬유성 단백질로 되어있다. 콜라겐은 피부의 결합조직을 구성하는 주요성분이며, 진피성분의 90%를 차지하는 섬유 단백질이다. 자체의 탄력성은 적으나 엘라스틴과 함께 피부에 탄력성을 제공한다. 엘라스틴은 피부의 진피층에서 콜라겐을 지지하고 고정해주는 역할을 담당하며, 탄력이 강한 섬유 단백질로 진피성분의 2-3%를 차지한다. 피부탄력에 기여하는 중요한 요소이며, 피부세포 노화를 방지하는 역할을 수행한다. 건강한 피부는 콜라겐과 엘라스틴 조직이 촘촘하고 균일하게 구성되어 있어 피부표피를 안정적으로 건강하게 유지시켜주는 반면에, 손상 및 노화된 피부의 진피는 콜라겐과 엘라스틴 조직이 파괴되어 피부 표피에 잔주름과 손상을 만든다.

또한, 일반적으로 건강한 피부에서는 수분이 약 10% 이상 존재하며 각질층의 수분상태는 표피층 이하에서 공급되는 수분과 피부표면으로부터 증발되는 수분 그리고 각질층의 수분함유 능력에 따라 결정된다. 각질층의 수분은 분자 유동성, 즉 케라틴 측쇄에 대한 물분자의 결합력에 따라 0-35% 존재하는 결합수(bound water)와, 그 이상 존재하는 자유수(free water)로 구분된다. 각질층은 각질세포와 지질로 구성되어 있고, 각질세포의 구조는 주로 케라틴 거대분자(keratin macromolecule)로 이루어진 세포질과 이를 둘러싸고 있는 각질 세포막으로 구성되어 있다. 각질형성세포는 분화함에 따라 핵이 없어지고 점점 납작해지면서 세포 내 소기관들이 사라지고 각질세포가 된다. 각질 세포를 구성하는 물질 중 가장 많은 것은 케라틴이며, 케라틴은 각질 세포의 80-90%를 차지하며, 각질세포막과 서로 교차결합되어 마이크로피브릴(macrofibril)을 형성한다.

이런 피부의 노화로 인한 특징들은 장기간에 걸쳐 일어나는 미세한 변화의 축적이기 때문에 피부 노화를 지연 또는 방어하는 효능을 가진 기능성 화장품에 대한 소비자의 요구가 증가되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 피부 주름, 탄력, 미백 및 보습 등에 유효한 효과를 나타내는천연물 소재의 기능성 화장품을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액이 피부 주름, 피부 탄력, 피부 미백, 안면 처짐, 피부 보습, 피부 윤기 및 다크써클 등에 유효한 효능을 나타냄으로써 피부 노화를 방지하고, 피부 상태를 개선시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 흑효모 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 흑효모 배양액은 효모추출물(Yeast Extract-배지) 0.2 중량%, 설탕 2.5 중량%, 비타민C 0.5 중량%, 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량%를 포함하는 배지에 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001(KCCM 10307)를 접종하고 1차 배양하는 단계와; 1차 배양 후 미강 1.75 중량%, 설탕 2.0 중량%, 비타민C 0.2 중량%, 인산수소칼륨 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량%를 포함하는 배지에 1차 배양물을 접종하고 2차 배양하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 흑효모 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 피부 주름, 탄력, 미백 및 보습 등에 유효한 효과를 나타내는천연물 소재의 기능성 화장품을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액이 피부 주름, 피부 탄력, 피부 미백, 안면 처짐, 피부 보습, 피부 윤기 및 다크써클 등에 유효한 효능을 나타냄으로써 피부 노화를 방지하고, 피부 상태를 개선시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 흑효모 배양액은, 흑효모의 생장에 필요한 성분을 함유하는 배양배지에 흑효모를 접종하고 배양하여 수득한 배양액을 의미한다. 상기 배양액에는 베타-글루칸 등 피부상태 개선에 유용한 성분들이 포함되어 있다(표 1 참조).

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 흑효모는 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001(KCCM 10307)일 수 있다. 상기 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001은 2001년 8월 8일자로 한국 미생물보존센터에 기탁되어 기탁번호 KCCM 10307을 부여받은 흑효모이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 흑효모 배양액은 β-1,3/1,6-글루칸을 포함한다. 하나의 특정예에서 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001이 생산한 것이다.

상기 β-1,3/1,6-글루칸은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서 X는 젖산기이다)

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 흑효모 배양액은 공지된 다양한 배양방법을 통하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 흑효모 배양액은 무중력 혹은 미세중력(microgravity) 하에서 배양하여 수득된 것이다. 무중력 혹은 미세중력 배양방식은, 중력이 존재하는 배양환경에서 균체가 유체역학 스트레스(Hydrodynamic Stress)를 받는 것을 줄일 수 있고, 또한 Wall Impacts를 줄일 수도 있다. 또한, 무중력 환경에서는 3차원적인 배치가 제한 없이 가능하고, 특히 효모의 경우 세균과 달리 출아법으로 분열함에 있어서 극성이 없어지면서, 어느 방향에서나 출아를 하게 된다. 이러한 이점에 따라, 본 발명에서는 무중력 혹은 미세중력 배양기(도 40 참조)를 이용하여 흑효모를 부유배양(혹은 3차원 배양)으로 흑효모 배양액을 수득할 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 무중력 배양기의 모식도를 도 27에 나타내었다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 미백 개선, 피부 탄력 개선, 안면 처짐 개선, 피부 보습 개선, 피부 윤기 개선, 피부 노화 방지(예컨대, 광 노화에 의한 피부 주름 형성 및 피부 경화 억제), 다크써클 개선 및 피부 각질 개선으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 흑효모 배양액을 사용한 그룹에서는 상기에서 언급한 피부상태가 현저히 개선되었으며, 부작용이 발생하지 않아 안전성이 있음이 확인되었다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물에는 흑효모 배양액이 30-90 중량%로 함유된다. 하나의 특정예에서, 본 발명의 화장료 조성물에는 흑효모 배양액이 40-80 중량%로 함유된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 스킨, 세럼, 로션, 에멀전, 크림, 에센스, 화장수, 파운데이션, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 스프레이 및 파우더로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는다.

발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은, 유효 성분으로서의 흑효모 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 오일, 파우더 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 흑효모 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

(ii) 본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름, 피부 미백, 피부 탄력, 안면 처짐, 피부 보습, 피부 윤기, 다크써클 및 피부 각질을 포함하는 피부상태를 개선시키는 데 우수한 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 항산화 활성도 나타내므로 피부노화를 방지하고 건강한 피부를 유지하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시험 제품 사용에 따른 주름 파라미터의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 2는 시험 제품 사용 후의 피부 주름의 미세지형(Micro-relief)을 보여준다(좌: 디지털 이미지, 우: PRIMOS 3D 이미지).
도 3은 시험 제품 사용에 따른 피부 탄력의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 4는 시험 제품 사용에 따른 피부 처짐의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 5는 시험 제품 사용에 따른 피부 처짐의 변화를 보여주는 이미지이다.
도 6은 시험 제품 사용에 따른 피부 수분량의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 7은 시험 제품 사용에 따른 피부 윤기의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 8은 시험 제품 사용에 따른 피부 다크써클의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 9는 시험 제품 사용에 따른 피부 다크써클의 변화를 보여주는 이미지이다(좌: 사용 전, 우: 사용 2주 후)
도 10은 시험 제품 사용에 따른 피부 각질의 변화를 보여준다(Mean±SEM. *p<0.05 vs. 사용 전).
도 11은 시험 제품 사용에 따른 피부 각질 상태를 보여주는 이미지이다.
도 12는 시험 제품의 효능에 대한 감각 프로파일(Sensorial profile)을 보여준다(긍정적 응답, %).
도 13은 시험 제품의 사용성에 대한 감각 프로파일(Sensorial profile)을 보여준다(긍정적 응답, %).
도 14는 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 육안평가 결과 I을 보여준다(Mean±SEM).
도 15는 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 육안평가 결과 II를 보여준다(Mean±SEM).
도 16은 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 피부 거칠기(R1)의 변화를 보여준다(Mean±SEM, *p<0.05 vs.사용 전,†p<0.05 vs. 대조군).
도 17은 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 최대 피부 거칠기(R2)의 변화를 보여준다(Mean±SEM, *p<0.05 vs.사용 전,†p<0.05 vs. 대조군).
도 18은 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 평균 피부 거칠기(R3)의 변화를 보여준다(Mean±SEM, *p<0.05 vs.사용 전,†p<0.05 vs. 대조군).
도 19는 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 매끄러운 거칠기(Smooth Roughness, R4)의 변화를 보여준다(Mean±SEM, *p<0.05 vs.사용 전).
도 20은 시험 제품 사용에 따른 시험군과 대조군의 산술평균 거칠기(R5)의 변화를 보여준다(Mean±SEM, *p<0.05 vs.사용 전).
도 21은 시험 제품의 효능에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(수분 증가, 긍정적 응답, %).
도 22는 시험 제품의 효능에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(부드러움 증가, 긍정적 응답, %).
도 23은 시험 제품의 효능에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(윤기 증가, 긍정적 응답, %).
도 24는 시험 제품의 효능에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(탄력 증가, 긍정적 응답, %).
도 25는 시험 제품의 효능에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(주름의 감소, 긍정적 응답, %).
도 26은 시험 제품의 사용성에 대한 비교 감각 프로파일을 보여준다(긍정적 응답, %).
도 27은 흑효모 배양액 제조에 이용 가능한 무중력 배양기의 모식도이다.
도 28은 아스코르브산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 29는 아스코르브산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 SOD 유사 활성을 보여주는 그래프이다.
도 30은 올레아놀산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 히알루로니다아제 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 31은 올레아놀산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 엘라스타아제 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 32는 올레아놀산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 콜라게나아제 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 33은 올레아놀산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 MMP-1 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 34는 코지산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 티로시나아제 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 35는 코지놀산(A) 및 흑효모 배양액(B)의 멜라닌 형성 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 36은 흑효모 배양액 제조공정의 모식도이다.
도 37은 각 시험물질 처리에 따른 체중변화를 보여준다.
도 38은 각 시험물질 처리에 따른 피부 replica에 형성된 주름을 보여준다.
도 39는 각 시험물질 처리에 따른 주름의 평균 길이의 변화를 보여준다.
도 40은 각 시험물질 처리에 따른 주름의 평균 깊이의 변화를 보여준다.
도 41은 각 시험물질 처리에 따른 피부 부종 스코어의 변화를 보여준다
도 42는 각 시험물질 처리에 따른 피부 MPO 활성의 변화을 보여준다.
도 43은 각 시험물질 처리에 따른 피부 IL-1β 수준의 변화를 보여준다.
도 44는 각 시험물질 처리에 따른 피부 IL-10 수준의 변화를 보여준다.
도 45는 각 시험물질 처리에 따른 등쪽 피부 조직의 조직학적 이미지를 보여준다.
도 46은 각 시험물질 처리에 따른 등쪽 피부 조직의 면역조직화학적 이미지를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 흑효모 배양액을 함유하는 화장품의 제조

1. 흑효모 배양액의 제조

흑효모의 1차 배양 및 2차 배양을 통하여 흑효모 배양액을 제조하였다. 구체적으로, 효모추출물(Yeast Extract-배지) 0.2 중량%, 설탕 2.5 중량%, 비타민C 0.5 중량%, 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량% 및 물 96.419 중량%를 포함하는 배지에 흑효모 A. pullulans SM-2001 0.001 중량%를 접종하고, 25℃의 온도에서 24시간 동안 1차 배양하였다. 이후, 미강 1.75 중량%, 설탕 2.0 중량%, 비타민C 0.2 중량%, 인산수소칼륨 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량% 및 물 95.36 중량%를 포함하는 배지에 1차 배양물 0.01 중량%를 접종하고 2차 배양하였다. 이후, 121℃에서 15분간 멸균하고, 배액액:물을 1:3으로 혼합한 후 여과보조제로 셀라이트를 사용하여 세라믹 여과 하였다. 121℃에서 15분간 멸균하고 80℃로 냉각한 다음 비타민C를 전체 부피의 0.02% 첨가하여 흑효모 배양액을 수득하였다. 흑효모 배양액의 제조공정도를 도 36에 나타내었다.

상기 흑효모 배양액의 구성성분은 다음과 같았다.

구성성분	함량
물	97.50%
베타글루칸	0.15%
다당체	0.60%
단백질	0.09%
지방	0.00%	비타민C 0.02 %
당류	1.51%	기타 : 0.13%
총액	100%

2. 흑효모 배양액을 함유하는 화장품 제조

실험에 사용한 세럼을 다음과 같이 제조하였다. 수용성 원료(흑효모 포함)의 무게를 잰 후 균일하게 가열하여 혼합하고, 지용성 원료(부틸렌글라이콜 포함)의 무게를 잰 후 균일하게 가열하여 혼합하였다. 수용성 원료와 지용성 원료를 혼합하고 유화시킨 다음, 충분히(18℃) 냉각되면 탈기 후 걸러주었다. 소량의 샘플을 채취하여 품질 검사를 한 다음 용기에 충진하여 흑효모 배양액을 함유하는 세럼을 제조하였다.

실시예 2: 흑효모 배양액 함유-안티에이징 세럼에 대한 피부 주름, 탄력, 안면 처짐, 보습, 윤기, 다크써클 및 각질 개선 효과 평가

1. 시험 목적

본 시험의 목적은 눈가 주름이 SOP 기준으로 4등급 이상이고 눈 밑에 다크써클을 가진 35-55세의 여성 피험자 10명을 대상으로 시험제품의 피부 주름, 탄력, 안면 처짐, 보습, 윤기, 다크써클 및 각질 개선효과를 평가하기 위함이다.

2. 시험 제품

제품명: 상기 실시예 1에서 제조한 흑효모 배양액 함유-안티에이징 세럼

유효성분: 흑효모 배양액 70%

사용방법: 1일 2회 (아침, 저녁), 세안 후 스킨 다음 단계에서 시험제품을 2회 펌핑하여(약 0.5g) 안면 전체에 골고루 펴 바르고 가볍게 두드리면서 흡수시키도록 하였다.

3. 시험 방법

본 시험은 시험 목적에 적합한 피험자들을 대상으로 시험 제품을 안면 부위에 2주간 사용하도록 하였다. 피험자는 본 연구소를 방문하여 세안 후 입실하고 20분 동안 항온항습 조건(22±2℃, 50±5%)에서 안정을 취한 후 시험에 참여하였다. 평가는 제품 사용 전, 사용 2주 후 시점에서 피부 주름, 탄력, 안면 처짐, 수분, 윤기, 다크써클, 각질 측정 및 피험자에 의한 설문 평가를 실시하였다.

<3-1. 피부 주름 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 눈가 부위의 주름을 3D 피부 촬영장치인 PRIMOS^ㄾcompact(GFM,Germany)를 이용하여 촬영하였고, 저장된 이미지의 주름 파라미터 값(Ra, Rmax, Rz, Rp)을 분석하였다(표 2).

<3-2. 피부 탄력 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 Cutometer^ㄾ(C+K, Germany)를 이용하여 뺨 정면의 피부 탄력을 측정하였고, 파라미터 중 R2(Gross elasticity) 값을 취하여 분석하였다.

<3-3. 안면 처짐 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 디지털 카메라 D90(Nikon, Japan)으로 좌측 뺨 측면의 Moire Topography을 촬영한 이미지를 분석 소프트웨어 Image-pro^ㄾplus(USA)를 이용하여 안면 처짐의 변화 정도(각도)를 분석하였다.

<3-4. 피부 수분 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 Corneometer^ㄾ(C+K,Germany)를 이용하여 뺨 정면의 수분량을 3회 측정한 후 평균값을 구하였다

<3-5. 피부 윤기 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 Glossmeter^ㄾ(Delfin,Finland)를 이용하여 뺨 정면의 윤기를 3회 측정한 후 평균값을 분석하였다.

<3-6. 다크써클 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 Spectrophotometer^ㄾ(Minolta,Japan)를 이용하여 눈 밑 다크써클(색소침착 부위) 부위를 3회 측정하고, L* value(백색도) 값의 평균값을 분석하였다.

<3-7. 피부 각질 측정>

제품 사용 전과 사용 2주 후 시점에서 뺨 정면 부위의 각질을 Black D-squame^ㄾ (CuDerm, USA)에 부착시켜 Charmview^ㄾ (Moritex, Japan)로 700배 디지털 사진을 촬영하였다. 촬영한 디지털 이미지를 BMI 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 각질의 면적(픽셀, 1X10^-4)을 구하였다.

<3-8. 피험자에 의한 설문 평가>

효능과 사용성 종합 설문평가는 사용 2주 후 시점에서 피험자가 직접 문답 하도록 하였다. 평가는 1-5점 척도(1, 매우 그렇지 않다; ~5, 매우 그렇다)로 이루어졌으며, 긍정적인 답변(4, 5번 선택)을 분석하였다.

<3-9. 피부 안전성 평가>

각 평가 시점마다 문진과 시험자의 관찰에 의해 주관적 피부 자극감과 객관적 피부 자극을 평가하였다.

<3-10. 통계 분석>

모든 데이터의 통계적 유의성은 SPSS Package Program 11.5의 paired t-test방법을 이용하였으며, 제품 사용 전과 비교 시 사용 후 각 평가시점에서 통계적으로 유의한 변화 여부를 분석하였다. 유의수준은 p값을 0.05 미만으로 설정하였다.

증감율(▲, 증가; ▼, 감소)은 다음의 계산식에 의해 산출하였다.

4. 시험 결과

<4-1. 피험자 특징>

본 시험은 제외기준 및 선정기준에 준하는 37-46세(평균 42.1±3.3세)의 여성 피험자 10명이 시험 종료 시까지 전 과정을 성실히 수행하였다.

피험자의 피부 특성은 설문에 의해 조사되었으며, 분석 결과는 다음과 같다 (표 3).

<4-2. 피부 주름 파라미터 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 Rz, Rp 파라미터가 유의하게 개선되었으며(p<0.05),Ra, Rmax 파라미터는 감소하는 경향을 보였다(표 4 및 도 1, 2).

<4-3. 피부 탄력 파라미터 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05, 표 5 및 도 3).

<4-4. 안면 처짐 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05, 표 6 및 도 4, 5).

<4-5. 피부 수분 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05, 표 7 및 도 6).

<4-6. 피부 윤기 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05, 표 8 및 도 7, 8).

<4-7. 다크써클 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 L* value(백색도) 가 유의하게 개선되었다(p<0.05, 표 9 및 도 8, 9).

<4-8. 피부 각질 분석>

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 감소되었다(p<0.05, 표 10 및 도 10, 11).

<4-9. 피험자에 의한 설문 평가>

효능 설문 평가

평가 결과, 제품 사용 2주 후 시점에서 '촉촉해짐', '매끄러워짐' 항목에 대해 피험자의 70-80%가, '탄력 개선', '윤기 개선'은 60%가, '눈가 주름 개선', '다크서클 개선', '피부 색 밝고 환해짐'은 50%가 긍정적인 평가를 하였다(표 11 및 도 12).

사용성 설문 평가

평가 결과, '흡수력', '색', '만족도', '발림성' 항목에 대해 피험자의 50-80%가 긍정적인 답변을 하였다(표 12 및 도 13).

<4-10. 피부 안전성 평가>

평가 결과, 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다(표 13).

5. 요약 및 결론

1) 피부 주름 파라미터 분석 결과, Rz, Rp 파라미터가 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

2) 피부 탄력 파라미터(R2) 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

3) 안면 처짐 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

4) 피부 수분량 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

5) 피부 윤기 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

6) 다크써클 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).

7) 피부 각질 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 사용 2주 후 시점에서 유의하게 감소되었다(p<0.05).

8) 효능 설문 평가 결과, 제품 사용 2주 후 시점에서 '촉촉해짐', '매끄러 워짐' 항목에 대해 피험자의 70-80%가, '탄력 개선', '윤기 개선'은 60% 가, '눈가 주름 개선', '다크서클 개선', '피부 색 밝고 환해짐'은 50%가 긍 정적인 평가를 하였다. 또한, 사용성 설문 평가 결과, '흡수력', '색', '만족도', '발림성' 항목에 대해 피험자의 50-80%가 긍정적인 답변을 하였다.

9) 피부 안전성 평가 결과, 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.

상기의 결과는, 본발명의 화장료 조성물이 피부 주름, 탄력, 안면 처짐, 보습, 윤기, 다크 써클 및 각질 개선에 유의한 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.

실시예 3: 흑효모 배양액 함유-안티에이징 세럼의 피부 주름 개선 효과 평가

1. 시험 목적

본 시험은 주름이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 30-65세 이상의 여성을 대상으로 12주간 시험제품을 사용하게 하여 제품의 주름개선 효과 및 피부 안전성을 평가하기 위함이다.

2. 시험 제품

2-1. 제품명: 상기 실시예 1에서 제조한 흑효모 배양액 함유-안티에이징 세럼

(1) 시험군(A): 흑효모 배양액(Aureobasidium pullulans ferment) 70% 함유

(2) 대조군(B): 정제수 70% 함유

2-2. 제품의 성상: 에센스

2-3. 제품의 보관: 실온 보관

2-4. 제품의 유효 성분: 흑효모 배양액(Aureobasidium pullulans ferment) 70%

2-5. 제품의 사용 횟수: 2회/일

2-6. 제품의 사용 방법

12주 동안 1일 2회(아침, 저녁), 제품 A와 B를 2번 펌핑하여 안면 부위에 고루 펴 바른다. 피험자는 block randomization을 통해 두 그룹으로 나누어 A그룹은 좌측에 시험군(제품 A), 우측에 대조군(제품 B)을 사용하게 하고, B그룹은 좌측에 대조군(제품 B), 우측에 시험군(제품 A)을 사용하게 하였다.

3. 시험 방법

<3-1. 피험자 선정>

본 시험은 30세 이상의 피험자 선정 기준에 부합하고 제외 기준에 부합하지 않는 여성 피험자 20명 이상을 대상으로 하였다. 피부 주름은 더마프로 피부과학연구소의 SOP에 따라 주름이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 피험자를 대상으로 시험의 목적과 방법, 기대 효능과 이상반응을 설명하여 참여의사를 보이는 자는 시험 참가 동의서를 작성하고 시험에 참여하도록 하였다.

<3-2. 시험 방법>

평가는 제품 사용 전 및 제품 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 눈꼬리 주름의 육안 평가와 VISIA^ㄾ(Canfield,USA)를 이용한 사진 촬영 및 Skin Visiometer^ㄾSV600(C+K,Germany)을 이용한 피부 주름 파라미터(R-value) 측정, 피험자에 의한 설문평가 그리고 시험자의 관찰과 문진을 통해 피부 주름 효과 및 피부 안전성을 평가하였다.

4. 통계 분석

육안평가 자료 및 기기평가 자료는 SPSS Package Program 11.5(IBM, USA)을 이용하여 유의성을 검증하였다. 동일 피험자에게서 반복 측정한 데이터들에 존재하는 상호의존성(교호작용)을 고려하기 위해 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을 적용하였다. 각 시점별 군간 비교는 공분산분석(ANCOVA)을 이용하여 제품 사용 전 두 군간의 차이를 보정하여 확인하였고, 시점별 전후 비교는 RM ANOVA을 이용하여 확인하였다. 설문평가 분석시 효능평가는 두 군의 비모수적 평균값을 비교하기 위해 Mann-Whitney U-test를 이용하였고, 사용성 종합평가는 Chi-Square test를 이용하였다. 통계학적 유의수준은 p값을 0.05 미만으로 설정하였다.

5. 시험 결과

<5-1. 피험자 피부 특성>

본 시험은 제외기준 및 선정기준에 준하는 30-65세의 여성 피험자 총 21명(평균 49.4±5.1세)이 참여하여 시험 종료 시까지 전 과정을 성실히 수행하였다. 피험자의 피부 특성은 설문에 의해 조사되었으며, 분석 결과는 다음과 같다(표 14-16).

<5-2. 피부 주름 개선 효과 평가>

5-2-1. 육안평가

평가는 10단계(Grade 0-9)로 2명의 시험자가 제품 사용 전과 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 피부 주름 상태를 독립적으로 평가하였다(표 17 및 18). '군간'과 '주간변화' 사이에 교호작용이 있는지를 검증하고자 RM ANOVA를 이용하여 분석하였다(표 19 및 도 14, 15).

각 시점별 군간 차이는 ANCOVA를 이용하여 분석하였고, 각 시점별 전후 변화는 RM ANOVA를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다(표 20 및 21).

(1) 각 시점별 군간 비교

분석 결과, 제품 사용 후 모든 평가 시점에서 시험군과 대조군 사이에 유의한 차이는 없었다(표 20).

(2) 각 시점별 전후 변화 비교

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 시험군과 대조군 모두 제품 사용 12주 후 시점에서 피부 주름이 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다(표 21).

5-2-2. Visiometer^ㄾ를 이용한 R-value 측정

제품 사용 전과 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 Skin Visiometer^ㄾSV600을 이용한 시험군과 대조군의 주름 파라미터 R-value(R1-R5)를 측정하여 피부 주름을 평가하였다(표 22). '군간'과 '주간변화' 사이에 교호작용이 있는지를 검증하고자 RM ANOVA를 이용하여 분석하였다(표 23 및 도 16-20).

5가지 주름 파라미터 중 R2의 경우 표 10의 Group*Week(군간*주간변화)에서 볼 수 있듯이 교호작용이 유의하게 나타나 시점변화에 따른 R-value가 군간 서로 다르게 변화함을 알 수 있었다.

R4의 경우 Group*Week(군간*주간변화)의 교호작용은 유의하게 나타나지 않았지만 시점별(WEEK)로 유의한 차이가 있음을 알 수 있었다.

각 시점별 군간 차이는 ANCOVA를 이용하여 분석하였고, 각 시점별 전후 변화는 RM ANOVA를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다(표 24 및 25).

(1) 각 시점별 군간 비교

분석 결과, R1, R2는 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 나머지 파라미터(R3, R4, R5)는 군간 유의차는 없었다(표 24).

(2) 각 시점별 전후 변화 비교

분석 결과, 시험군의 경우 파라미터 중 R4는 제품 사용 8주, 12주 후 시점에서, R1, R2, R3는 제품 사용 12주 시점에서 유의하게 감소하였다(p<0.05). 대조군은 모든 파라미터가 거의 변화가 없었다(표 25).

5-2-3. 피험자에 의한 설문평가 결과

(1) 효능에 관한 설문 평가

효능에 관한 설문 평가 결과, '촉촉해짐', '부드러움', '눈가 탄력 증가', '(잔)주름 감소' 항목은 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군과 대조군 모두 피험자의 71-90%가 긍정적인 응답을 하였으며, 모든 항목에서 군간 유의차는 없었다(표 26-30 및 도 21-25).

(2) 사용성에 관한 설문 평가

사용성 설문 평가 결과, 시험군은 '흡수력', '만족도' 항목에서 61~66%의 피험자가, 대조군은 '흡수력' 항목에서 피험자의 76%가 긍정적인 응답을 하였으며, 군간 유의차는 없었다(표 31 및 도 26).

<5-3. 피부 안전성 평가>

본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다(표 32).

6. 결과 요약

1) 피부 주름 육안평가 분석 결과, 군간 유의차는 없었으나, 각 시점별 제품 사용 전과 비교 시 시험군과 대조군 모두 제품 사용 12주 후 시점에서 피부 주름이 감소하는 경향을 보였다.

2) 피부 주름 파라미터(R-value) 분석 결과, R1, R2는 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 나머지 파라미터(R3, R4, R5)는 군간 유의차는 없었다. 각 시점별 제품 사용 전과 비교 시 시험군의 경우 파라미터 중 R4는 제품 사용 8주, 12주 후 시점에서, R1, R2, R3는 제품 사용 12주 시점에서 유의하게 감소하였다(p<0.05). 또한, 대조군은 모든 파라미터가 거의 변화가 없었다.

3) 효능 설문 평가 결과, '촉촉해짐', '부드러움', '눈가 탄력 증가', '(잔)주름 감소' 항목은 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군과 대조군 모두 피험자의 71-90%가 긍정적인 응답을 하였으며, 모든 항목에서 군간 유의차는 없었다.

4) 사용성 설문 평가 결과, 시험군은 '흡수력', '만족도' 항목에서 61~66%의 피험자가, 대조군은 '흡수력' 항목에서 피험자의 76%가 긍정적인 응답을 하였으며, 군간 유의차는 없었다.

5) 피부 안전성 평가 결과 본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.

실시예 4: 흑효모 배양액의 항노화, 주름 개선, 미백 및 보습 효과 평가

1. 항산화 활성

<1-1> DPPH 라디칼 소거 활성 측정

0.2 mM DPPH(1,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, MO, USA) 95% 에탄올 용액(1 ㎖)을 샘플(2 ㎖)에 첨가하였다. 각 샘플 용액을 최종 농도 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖(흑효모 배양액) 및 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/㎖(아스코르브산)가 되도록 증류수로 희석하고, 샘플들을 교반하여 주었다. 10분 후 UV/Vis 분광 광도계(Bekman, Germany)를 사용하여 525 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 각 샘플의 자유 라디칼 소거 활성을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

DPPH 라디칼 소거 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도 X 100}

결과는 IC₅₀(DPPH를 50% 감소시키는 데 필요한 농도)으로 얻었으며, 아스코르브산을 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 28에 나타난 바와 같이, 아스코르브산 및 흑효모 배양액 처리군에서 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) DPPH 소거능의 증가가 각각 6.25 및 12.5 μg/㎖에서부터 인정되어, 아스코르브산 및 흑효모 배양액의 DPPH 자유 라디칼 소거능에 대한 IC₅₀이 각각 6.84±1.03 및 46.48±10.76 μg/㎖로 산출되었다.

<1-2> SOD 유사 활성 측정

각 샘플 용액을 최종농도 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖(흑효모 배양액), 및 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/㎖(아스코르브산)가 되도록 증류수로 희석하고, 샘플(0.2 ㎖)을 Tris-HCl 버퍼[50 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane(Sigma, MO, USA) 및 10 mM EDTA(Sigma, MO, USA), pH 8.5](3 ㎖)와 7.2 mM 피로갈롤(pyrogallol, Merck, NJ, USA)(0.2 ㎖)로 25℃에서 10분 동안 교반하였다. 교반 후, 1 N HCI을 첨가하여 반응을 멈추어 주었다. 반응액 중에서, 산화 피로갈롤을 420 nm에서 검출하였다. 각 샘플의 SOD 유사 활성을 하기 수학식 2에 따라 계산하였다

[수학식 2]

SOD 유사 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(피로갈롤의 산화를 50% 감소시키는 데 필요한 농도)으로 얻었으며, 아스코르브산을 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 29에 나타난 바와 같이 아스코르브산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) SOD 유사활성이 12.5 및 25 μg/㎖에서부터 인정되어, SOD 유사 활성에 대한 IC₅₀이 각각 65.17±12.15 및 132.95±45.53 μg/㎖로 산출되었다.

2. 항주름 효과

<2-1> 하알로로니다아제(Hyaluronidas) 억제 활성

본 실험은 문헌 Arch Dermatol Res. 2011;303:247-252에 보고된 방법에 따라 실시하였다. 흑효모 배양액(12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖)의 억제 활성을 올레아놀산(oleanolic acid; 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/㎖)과 비교하였다. 온전한 소화되지 않은 히알루론산의 600 nm 값을 100%로 하였다. 600 nm에서의 OD값을 96 웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 15분 후에 측정하고, 각 샘플의 히알루로니다아제 억제 활성을 하기 수학식 3에 따라 계산하였다.

[수학식 3]

히알루로니다아제 억제 활성(%) = [100-{[(시료첨가구의 흡광도 + 무첨가구 흡광도/무첨가구 흡광도] X 100}

결과는 IC₅₀(히알루로니다아제 활성의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다.

그 결과, 도 30에 나타난 바와 같이, 올레아놀산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 히알루로니다아제의 활성 억제가 6.25 및 12.5 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 33.34±3.16 및 50.88±16.89 μg/㎖로 산출되었다.

<2-2> 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성

엘라스타아제 억제 분석을 흑효모 배양액(5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖) 또는 올레아놀산(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μg/㎖)의 존재 또는 부존재 하에서 p-니트로 아닐린의 방출을 측정하여 수행하였다. 96 웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하고, 각 샘플의 엘라스타아제 억제 활성을 하기 수학식 4에 따라 계산하였다.

[수학식 4]

엘라스타아제 억제 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(엘라스타아제 활성의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다.

그 결과, 도 31에 나타난 바와 같이, 올라아놀산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 엘라스타아제의 활성 억제가 6.25 및 12.5 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 29.36±7.57 및 56.29±23.06 μg/㎖로 산출되었다.

<2-3> 콜라게나아제 억제 활성

콜라게나아제 억제 분석을 문헌 Fresenius' J Analy Chem. 1063;203:397-398에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 0.15 ㎖의 콜라게나아제(1 mg/㎖; Sigma, MO, USA)를 2 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-pro-leu-gly-pro-d-ar(Sigma, MO, USA) 0.25 ㎖와 0.1 ㎖의 흑효모 배양액(12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖; in 0.1M Tris-HCl 버퍼(pH7.5))의 혼합용액에 첨가하고, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 6% 시트르산0.5 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 에틸 아세테이트 1.5 ㎖을 첨가한 후에 320 nm에서 흡광도를 측정하고, 각 샘플의 콜라게나아제 억제 활성을 하기 수학식 5에 따라 계산하였다.

[수학식 5]

콜라게나아제 억제 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(콜라게나아제 활성의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다. 올레아놀산을 기준(standard)으로서 사용하였다.

그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이, 올레아놀산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 콜라게나아제의 활성 억제가 12.5 및 25 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 70.49±21.08 및 107.21±38.82 μg/㎖로 산출되었다.

<2-4> MMP-1 억제 활성

20 μl의 타입-I 콜라겐(기질; Sigma, MO, USA)을 희석된 각 흑효모 배양액(12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖) 또는 올레아놀산(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200μg/㎖) 80 μl와 혼합하였다. 이후, 희석된(0.2 U/㎖) MMP-1 100 μl를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 빛이 없는 상태에서 1-2시간 동안 상온에서 인큐베이션 하였다. 형광을 495 nm(여기) 및 515 nm(방출)에서 측정하였다. 모든 희석액은 0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50 mM CaCl₂ 및 2 mM 아지드화 나트륨을 함유하는 반응버퍼를 사용하여 제조하였다. 본 실험에서는 MMP-1 없이 기질과 억제제를 함유하는 버퍼를 대조군으로 사용하였다. 각 샘플의 MMP-1 억제 활성을 하기 수학식 6에 따라 계산하였다.

[수학식 6]

MMP-1 억제 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(MMP-1 활성의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다.

그 결과, 도 33에 나타난 바와 같이, 올레아놀산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) MMP-1 활성 억제가 12.5 및 25 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 71.93±24.93 및 244.31±74.71μg/㎖로 산출되었다.

3. 미백 효과

<3-1> 티로시나아제 억제 활성

흑효모 배양액(12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/㎖) 표본(0.05 ㎖)을 0.5 ㎖의 L-DOPA(Sigma,MO,USA) 용액(1.25 mM) 및 0.9 ㎖의 소듐 아세테이트 버퍼 용액(0.05M, pH6.8)과 혼합하고, 25℃에서 10분간 전배양 하였다. 이후, 버섯 티로시나아제(333 U/㎖; Sigma, MO, USA)의 수용액 0.05 ㎖을 상기 혼합액에 첨가하였다. 이 용액을 즉시 도파크롬(dopachrome)에 대하여 모니터링 하고, 각 샘플의 티로시나아제 억제 활성을 하기 수학식 7에 따라 계산하였다.

[수학식 7]

티로시나아제 억제 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(티로시나아제 활성의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다. 코지산(Kojic acid, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 μg/㎖)을 기준으로 사용하였다.

그 결과, 도 34에 나타난 바와 같이, 코지산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 티로시나아제 활성 억제가 1.25 및 12.5 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 2.94±1.04 및 53.17±24.17 μg/㎖로 산출되었다.

<3-2> 멜라닌 형성 분석

세포(B16F10, ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(Gibco, NJ, USA), 100 유닛/㎖ 페니실린(Sigma, MO, USA) 및 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(Sigma, MO, USA)이 보충된, 2 nM의 L-글루타민을 함유하는 DMEM(Sigma??Aldrich, USA)에서 37℃에서 CO2 배양기에서 배양하였다. 매 2일마다 배지를 바꾸어 주었다. 70% 컨플루언시에 도달 시에 세포를 모으고, 계수한 다음 웰에 접종하였다. 멜라닌 양은 문헌 의 내용을 약간 변경하여 측정하였다. B16F10 흑색종 세포를 2 X 10⁵ 세포/웰로 접종하고, 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 100 nM의 α-MSH(alpha-melanocyte stimulating hormone, Sigma, USA)의 존재 또는 부존재 하에서, 세포를 50, 100, 200, 400, 800 및 1,600 μg/㎖의 흑효모 배양액에 72시간 동안 노출시켰다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 10% DMSO를 함유하는 1N NaOH 800 μl로 80℃에서 1시간 동안 용해하였다. 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플의 멜라닌 생산 억제 활성을 하기 수학식 8에 따라 계산하였다.

[수학식 8]

멜라닌 생산 억제 활성(%) = [100-{(시료첨가구의 흡광도/α-MSH 처리 대조군의 흡광도) X 100}

결과는 IC₅₀(멜라닌 생산의 백분율 억제가 50%일 때의 농도)으로 표현하였다. 코지산(25, 50, 100, 200, 400 및 800 μg/㎖)을 기준으로 사용하였다.

그 결과, 도 35에 나타난 바와 같이, 코지산 및 흑효모 배양액 처리군에서 각각 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 흑색종 세포의 멜라닌 생산 억제가 100 및 400 μg/㎖에서부터 인정되어, IC₅₀이 각각 610.39±150.22 및 1,867.96±288.80 μg/㎖로 산출되었다.

4. 인 비보 피부 보습 효과

<4-1> 실험동물

192마리의 수컷 ICR 마우스(6주령, SLC, JAPAN)를 순응 7일 후에 실험에 사용하였다. 동물을 4마리씩 우리(20-25℃, 습도 40-45%)에 할당하였다. 명암주기는 12:12시간이었고, 정상적인 설치류 식이를 공급하였다. 순응 후, 마우스를 각 시점(30분, 1, 2, 4, 8 및 24시간)에서 4개의 그룹으로 분류하였다(체중을 기준으로 각 시점 당 8마리).

<4-2> 처리

100 μl의 증류수 또는 흑효모 배양액을 털을 짧게 깍은 등부 피부(2 X 3 cm)에 직접적으로 도포하였다. 처리 30분 후, 코튼 볼로 남아있는 샘플을 모두 제거하였다.

<4-3> 피부 수분량 측정

시험 물질 노출 0.5, 1, 2, 4, 8 및 24시간 후, 2 X 3 cm 피부 샘플을 제거하고, 피부 수분 함량(%)을 자동화 수분분석기(Ohaus, MB23, NJ, USA)로 측정하였다. 매체 대조군과 비교한 백분율 변화를 하기 수학식 9에 따라 계산하였다.

[수학식 9]

증류수 대조군과 비교한 백분율 변화(%) = [((시험 물질 처리 그룹의 데이터 - 증류수 처리 대조군의 데이터)/증류수 처리 대조군의 데이터) X 100]

<4-4> 실험 결과

증류수 처리군과 비교하여, 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 피부 수분 함량의 증가, 즉 보습 효과가 흑효모 배양액 처리군에서 각각 처리 30분 후부터 인정되었으며, 처리 후 4시간까지 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 피부 수분 함량의 증가가 각각 인정되었다(표 33).

흑효모 배양액 도포군에서는 대조군에 비해 처리 30분, 1, 2, 4, 8 및 24시간 후의 피부 수분 함량이 각각 26.82, 32.79, 24.76, 14.28, 6.62 및 3.36%의 변화를 나타내었다.

5. 통계 분석

모든 인 비트로 데이터를 5번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D로 표현하였고, 피부 수분 함량은 각 시점에서 8마리의 마우스 피부의 평균 ± S.D로 계산하였다. 다른 투여량 그룹에 대한 다중비교분석을 실시하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-significant differences(LSD) multi-comparison test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U(MW) test를 수행하였다. 각 인 비트로 분석의 IC₅₀ 값은 Probit법으로 계산하였고, 통계학적 분석은 SPSS(Release 14K, SPSS Inc., USA; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다.

실시예 5: 흑효모 배양액의 광 노화 개선 효과 평가

1. 검체 명

<시험 물질>

상기 실시예 1에서 제조한 흑효모 배양액 함유 마스크 팩(Mask B)

<대조 물질>

SK-II Facial Treatment Mask^TM(SK-II; Pitera^TM- Saccharomycopsis ferment filtrate 함유 patch; P&G, 도쿄, 일본;

Miskin Algae Hydrogel Patch(Mask A; 아리바이오, 서울, 한국;

Miskin General Hydrogel Patch(Mask C; 아리바이오, 서울, 한국.

2. 실험개요

피부 광노화는 UVB의 장기적 노출에 의해 유발되며, 교원섬유(collagen fiber)의 손상, 비정상적인 탄력섬유의 진피 내 축적, 진피 바탕질을 형성하는 glycosaminoglycans의 축적에 따른 피부 주름(wrinkle) 형성과 불규칙적인 피부 색소 침착 등이 특징적으로 유발된다. 이러한 UVB에 의한 피부 광 노화는 털이 없는(hairless) 마우스에서 지속적인 UVB 조사에 의해서도 쉽게 유발되어, 현재 피부 광노화 예방 또는 치료 물질의 개발에 UVB 조사 털이 없는 마우스 모델이 흔히 이용되고 있다. 본 실험에서는 흑효모 배양액을 함유한 마스크 팩(Mask B)의 피부 광 노화에 대한 보호 및 치료 효과를 기존 상업적으로 이용되고 있는 패치들 - SK-II Facial Treatment Mask, Miskin Algae Hydrogel Patch(Mask A) 및 Miskin General Hydrogel Patch(Mask C)과 비교하여, UVB 유발 hairless 마우스 모델을 이용하여 평가하였다.

본 실험에서 피부 광 노화는 hairless 마우스에 0.18J/cm²의 UVB를 주 3회씩 15주간 조사하여 유발하였으며, 1×1 cm의 SK-II, Mask A, B 및 C를 둔부 근처 부위의 등쪽 피부에 매일 1회씩 10분간, 15주 동안 부착시키고, 체중 및 증체량, 주름 형성 및 피부 중량을 기준으로 한 피부 부종의 변화를 평가하였으며, 피부 내 myeloperoxidase(MPO) 활성, 염증 유발성 사이토카인(IL-1β and IL-10) 함량의 변화를, 패치 적용 피부 부위의 조직병리학적 변화와 함께 측정하여, 항염 효과를 평가하였고, glutathione(GSH) 함량, 지질과산화(Malondialdehyde; MDA 수준), superoxide anion 생산량, Nox2(gp91phox) 및 GSH 환원효소 mRNA 발현, nitrotyrosine(NT) 및 4-hydroxynonenal(HNE) 면역반응성의 변화를 관찰하여, 항산화 방어 시스템의 변화를 평가하였다. 또한, matrix metalloprotease(MMP)-1, MMP-9 및 MMP-13 mRNA 발현, 진피 내 MMP-9 면역반응성, 표피 각질세포에서 ㅇ아앞아폽토시스 마커- caspase-3 및 cleaved poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 면역반응성의 변화 역시 관찰하였다. 본 실험에서 Mask B의 효과를 SK-II, Mask A 및 C와 각각 비교 평가하였다.

3. 실험동물

대략 100마리의 HR-1 hairless 마우스(6주령 암컷, SLC.)를 8일간 순화시킨 후, 체중 (20.78±1.08g, 18.0-22.4 g/head)을 기준으로 군당 8마리씩 6군(총 48마리)으로 구분하여 실험에 사용하였으며, 모든 실험동물은 대구한의대학교 실험동물윤리위원회의 동물윤리 기준에 따라 취급하였으며, 사전승인하에 실험을 실시하였다.

4. 실험방법

<군 분리(총 6개군; 군 당 8마리)>

정상 매체 대조군: UVB 조사를 실시하지 않은 정상 대조군; 멸균증류수 처리군

UVB 대조군: UVB 조사 매체 대조군; 멸균증류수 처리군

SK-II: UVB 조사 및 SK-II Facial Treatment Mask 처리군

Mask A: UVB 조사 및 Miskin Algae Hydrogel Patch 처리군

Mask B: UVB 조사 및 흑효모 배양액 함유 마스크 팩 처리군

Mask C: UVB 조사 및 Miskin General Hydrogel Patch 처리군

<샘플 패치(patch) 처리>

1×1 cm의 SK-II, Mask A, B 또는 C를 각각 둔부 근처 부위의 일정한 등쪽 피부에 매일 1회씩 10분간, 15주 동안 부착시켰으며, UVB 조사일에는 patch의 부착을 UVB 조사 1시간 후 실시하였다. 정상 매체 및 UVB 대조군에서는 patch 대신 200 μl의 멸균 증류수만 동일한 부위에 동일한 방법으로 도포하였다.

<피부 광 노화의 유발>

254 nm, 312 nm 및 365 nm의 파장(312 nm 주파장)을 방출하는 UV Crosslinker system(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA)을 이용하여, hairless 마우스에 0.18J/cm²의 UVB를 주 3회씩 15주간 조사하여 피부 광 노화를 유발하였다. 정상 매체 대조군에서는 동일한 시간 동안 UV Crosslinker system에 UVB를 조사하지 않고, 방치하였다.

<관찰항목>

UVB 조사 1일 전부터 1주일 간격으로 체중을 측정하였으며, 최종 희생일에 등쪽 피부의 replica를 취하여 형성된 주름의 평균 길이 및 깊이를 측정하였고, 단위 면적(직경 6 mm) 당 피부 중량을 측정하여, 피부 부종성을 평가하였고, 피부 내 MPO 활성, 염증성 사이토카인(IL-1β 및 IL-10) 함량의 변화를, patch 적용 피부 부위의 조직병리학적 변화와 함께 측정하여, 항염 효과를 평가하였고, GSH 함량, 지질과산화, superoxide anion 생산량, Nox2(gp91phox) 및 GSH 환원효소 mRNA 발현, NT 및 4-HNE 면역반응성의 변화를 관찰하여, 항산화 방어 시스템의 변화를 평가하였다. 또한, MMP-1, MMP-9 및 MMP-13 mRNA 발현, 진피 내 MMP-9 면역반응성, 표피 각질세포에서 아폽토시스 마커- caspase-3 및 PARP 면역반응성의 변화 역시 관찰하였다.

본 실험에서 피부 조직 표면에 형성된 미세주름(microfold)의 수, 평균 상피 두께, 진피 내 침윤 염증세포의 수 및 진피 내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율 collagen fiber occupied region percentages; %/mm2 of dermis), 100개의 표피 각질세포 중 NT, 4-HNE, caspase-3, PARP 면역반응세포의 수(immunoreactive cells/100 epithelial cells), 진피 내 단위 면적당 MMP-9 면역반응섬유가 차지하는 비율(%/mm² of dermis)의 변화를 각각 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Quebec, Canada)를 이용하여, 조직 형태계측(histomorphometry) 적으로 측정하였다.

5. 시험 결과

<5-1. 체중의 변화>

모든 UVB 조사군에서 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전 기간 동안 인정되지 않았으며, UVB 대조군에 비해서 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화 역시 모든 SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서 인정되지 않았다(표 34, 도 37).

투여기간인 15주(105일) 동안의 증체량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 -8.23%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 7.00, 15.32, 5.03 및 -3.06%의 변화를 나타내었다.

<5-2. 피부 replica에서 형성된 주름의 평균 길이 및 깊이의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 replica에 형성된 주름의 평균 길이 및 깊이의 증가가 인정되었으나, SK-II를 포함한 모든 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) replica 주름의 평균 길이 및 깊이의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 형성 주름의 길이 및 깊이의 감소가 인정되었으며, SK-II 도포군에 비해소 유의성 있는 (p<0.05) 평균 길이의 감소가 유의성은 인정되지 않았으나, 현저한 평균 주름 깊이의 감소가 인정되었다(도 38-40).

피부 replica주름의 평균 길이 및 깊이는 UVB 대조군에서 각각 정상 매체 대조군에 비해 69.75 및 74.02%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -23.02, -15.10, -30.94 및 -7.06%의 주름 평균 길이의 변화를 나타내었으며, -29.11, -24.38, -36.59 및 -15.32%의 깊이의 변화를 각각 나타내었다.

<5-3. 피부 부종성- 단위 면적당 피부 중량의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 단위 면적당(직경 6 mm) 피부조직 중량의 증가, 즉 피부 부종의 증가가 인정되었으나, 실험물질인 Mask B를 포함한 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 중량의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 단위 면적당 피부 중량의 감소가 인정되었다(도 41).

단위 면적당 피부조직의 중량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 167.57%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -45.52, -28.62, -48.65 및 -16.67%의 변화를 나타내었다.

<5-4. 피부 조직 내 MPO 활성의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 MPO 활성의 증가가 인정되었으나, 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) MPO 활성의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) MPO 활성의 감소가 인정되었다(도 42).

피부 조직 내 MPO 활성은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 553.38%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -38.49, -29.34, -71.17 및 -20.16%의 변화를 나타내었다.

<5-5. 피부 조직 내 IL-1β 함량의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 IL-1β 함량의 증가가 인정되었으나, SK-II를 포함한 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) IL-1β 함량의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-1β 함량의 감소가 인정되었다(도 43).

피부 조직 내 IL-1β 함량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 125.72%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -33.27, -23.73, -45.27 및 -14.00%의 변화를 나타내었다.

<5-6. 피부 조직 내 IL-10 함량의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 없는 피부 조직 내 IL-10 함량의 감소가 인정되었으나, SK-II 및 Mask B도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-10 함량의 증가가 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) IL-10 함량의 증가 인정되었다. 한편 Mask A 및 B 도포군에서는 UVB 대조군에 비해 의미 있는 피부 조직 내 IL-10 함량의 변화는 인정되지 않았다(도 44).

피부 조직 내 IL-10 함량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 -16.53%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 31.09, 9.87, 81.69 및 1.49%의 변화를 나타내었다.

<5-7. 피부 조직 내 GSH 함량의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, SK-II를 포함한 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) GSH 함량의 증가가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) GSH 함량의 증가가 인정되었다(표 35).

피부 조직 내 GSH 함량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 -64.97%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 50.27, 30.65, 106.45 및 22.58%의 변화를 나타내었다.

<5-8. 피부 조직 내 지질 과산화(MDA 함량)의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 MDA 함량의 증가, 즉 지질 과산화의 증가가 인정되었으나, 후보물질인 Mask B를 포함한 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) MDA 함량의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 지질 과산화의 감소가 인정되었다(표 35).

피부 조직 내 MDA 함량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 269.35%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -48.91, -33.60, -61.97 및 -21.11%의 변화를 나타내었다.

<5-9. 피부 조직 내 superoxide anion 생산량의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 superoxide anion 생산량의 증가가 인정되었으나, 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) superoxide anion 생산량의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) superoxide anion 생산량의 감소가 인정되었다(표 35).

피부 조직 내 superoxide anion 생산량은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 145.89%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -38.74, -30.63, -49.94 및 -20.54%의 변화를 나타내었다.

<5-10. MMPs mRNA 발현의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 MMP-1, 9 및 13 mRNA의 발현 증가가 각각 인정되었으나, SK-II를 포함한 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) MMPs mRNA 발현의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) MMP-1, 9 및 13 mRNA 발현의 감소가 인정되었다(표 36).

피부 조직 내 MMP-1 mRNA 발현은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 88.20%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -24.95, -16.30, -39.01 및 -11.22%의 변화를 나타내었다.

피부 조직 내 MMP-9 mRNA 발현은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 70.85%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -26.70, -19.35, -35.23 및 -12.14%의 변화를 나타내었다.

피부 조직 내 MMP-13 mRNA 발현은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 112.55%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -30.95, -21.66, -42.23 및 -13.81%의 변화를 나타내었다.

<5-11. GSH 환원효소 mRNA 발현의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 GSH 환원효소 mRNA 발현의 감소가 인정되었으나, 후보물질인 Mask B를 포함한 모든 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) GSH 환원효소 mRNA 발현의 증가가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) GSH 환원효소 mRNA 발현의 증기가 인정되었다(표 36).

피부 조직 내 GSH 환원효소 mRNA 발현은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 -14.65%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 47.50, 29.76, 72.39 및 13.02%의 변화를 나타내었다.

<5-12. Nox2 mRNA 발현의 변화>

UVB 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 피부 조직 내 Nox2 mRNA의 발현 증가가 각각 인정되었으나, 모든 4종류의 patch 도포군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) Nox2 mRNA 발현의 감소가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 인정되었고, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) Nox2 mRNA 발현의 감소가 인정되었다(표 36).

피부 조직 내 Nox2 mRNA 발현은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 61.58%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -21.86, -12.01, -28.66 및 -8.89%의 변화를 나타내었다.

<5-13. 조직병리학적 변화>

일반 조직병리학적 변화: UVB 대조군의 경우, 표피 각질층세포의 증생에 의한 상피두께의 현저한 증가가 진피 내 염증세포 및 콜라겐 섬유 증식과 함께 관찰되었으며, 상피 표면의 미세주름 형성의 현저한 증가 역시 인정되었다. 즉, UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 상피 표면 미세주름의 수, 상피두께, 침윤 염증세포의 수 및 진피내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율의 증가가 각각 인정되었다. 한편 SK-II를 포함한 모든 4종류의 patch 도포에 의해 이러한 조직병리학적 피부 경화 및 염증소견이 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 유의성 있게(p<0.01 또는 p<0.05) 감소되었으며, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 상피 표면 미세주름의 수, 상피두께, 침윤 염증세포의 수 및 진피내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율의 감소가 각각 인정되었다(표 37, 도 45).

상피 표면 미세주름의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 521.98%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -43.99, -34.45, -69.43 및 -20.85%의 변화를 나타내었다.

상피의 평균 두께는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 128.81%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -34.64, -31.57, -50.44 및 -23.25%의 변화를 나타내었다.

피부 조직 내 침윤 염증세포의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 2511.11%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -41.51, -26.95, -69.36 및 -16.88%의 변화를 나타내었다.

진피 내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 70.21%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -27.26, -22.58, -37.37 및 -12.91%의 변화를 나타내었다.

면역조직화학적 변화: UVB 대조군의 경우, NT, 4-HNE, caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 현저한 수적 증가가 표피 각질층세포에서 인정되었으며, 진피 내 MMP-9 면역반응성의 증가 역시 인정되었다. 즉, UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) NT, 4-HNE, caspase-3 및 PARP 면역반응 각질세포의 수의 증가가 유의성 있는(p<0.01) 진피 내 MMP-9 면역반응성의 증가와 함께 인정되었다. 한편 후보물질인 Mask B를 포함한 모든 patch의 도포에 의해 표피 내 산화 스트레스 인자(NT와 4-HNE) 및 아폽토시스 마커(caspase-3 및 PARP)의 증가와 진피 내 MMP-9 활성의 증가가 Mask B, SK-II, Mask A 및 Mask C 순으로 유의성 있게(p<0.01 또는 p<0.05) 감소되었으며, 특히 Mask B 도포군에서는 각각 SK-II, Mask A 및 B 도포군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) 표피 내 NT, 4-HNE, caspase-3 및 PARP 면역반응 각질세포의 수 및 진피 내 MMP-9 면역반응성의 감소가 각각 인정되었다(표 38 및 도 46).

표피 내 NT 면역반응세포의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 608.42%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -57.36, -36.26, -70.43 및 -17.68%의 변화를 나타내었다.

표피 내 4-HNE 면역반응세포의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 475.25%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -42.51, -26.33, -71.77 및 -18.76%의 변화를 나타내었다.

표피내 caspase-3 면역반응세포의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 381.34%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -50.70, -30.54, -73.33 및 -16.12%의 변화를 나타내었다.

표피 내 PARP면역반응세포의 수는 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 430.70%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -55.04, -28.76, -75.54 및 -19.17%의 변화를 나타내었다.

진피 내 MMP-9 면역반응섬유가 차지하는 비율은 UVB 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 144.19%의 변화를 나타내었으며, SK-II, Mask A, B 및 C 처리군에서는 각각 UVB 대조군에 비해 -29.05, -28.10, -51.90 및 -17.62%의 변화를 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하되,
상기 흑효모 배양액은,
효모추출물(Yeast Extract-배지) 0.2 중량%, 설탕 2.5 중량%, 비타민C 0.5 중량%, 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량%를 포함하는 배지에 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001(KCCM 10307)를 접종하고 1차 배양하는 단계와;
1차 배양 후 미강 1.75 중량%, 설탕 2.0 중량%, 비타민C 0.2 중량%, 인산수소칼륨 0.5 중량%, 소금 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.02 중량%, 황산암모늄 0.06 중량%를 포함하는 배지에 1차 배양물을 접종하고 2차 배양하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 흑효모 배양액은 β-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 흑효모 배양액은 무중력 혹은 미세중력(microgravity) 하에서 배양하여 수득된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 미백 개선, 피부 탄력 개선, 안면 처짐 개선, 피부 보습 개선, 피부 윤기 개선, 피부 노화 방지, 다크써클 개선 및 피부 각질 개선으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 세럼, 로션, 에멀전, 크림, 에센스, 화장수, 파운데이션, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 스프레이 및 파우더로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1의 흑효모(Aureobasidium pullulans) 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화 화장료 조성물.