KR20220120474A

KR20220120474A - 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물

Info

Publication number: KR20220120474A
Application number: KR1020220018612A
Authority: KR
Inventors: 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2021-02-23
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-08-30

Abstract

본 발명은 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다. 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 종래의 흑효모 발효 여과물, 흑효모 배양액 또는 단순 흑효모 추출물에 비해 불순물 함유 가능성이 낮으며, 흑효모 발효 여과물, 흑효모 배양액 또는 단순 흑효모 추출물에 비해 세포 독성이 적은 장점이 있다. 또한, 본 발명의 항염 조성물은 항염 효과가 종래의 흑효모 배양액 보다 우수하다.

Description

흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물 {Composition for anti-inflammation comprising an exosome derived from Aureobasidium pullulans as an active ingredient}

본 발명은 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항염 조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

염증은 물리적 또는 화학적 외상, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스에 의한 감염, 각종 알레르기 유발 물질 등에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 생체의 방어 반응이다. 염증반응은 선천성 면역 반응의 일환으로 나타난다. 염증반응에는 다양한 물질 및 생리·화학적 현상이 관여하는데, 최근의 연구에 따르면 다양한 염증성 사이토카인이 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 염증반응에 관여하는 주요 사이토카인으로는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-β 등이 있으며, 이들의 발현량 및 분비량 증가와 활성화는 염증매개물질 분비, 면역세포 침윤, 세포 이동 및 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열 및 통증 등의 증상과 관련이 있다.

일반적으로, 염증반응은 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하면 큰 문제가 되지 않고 질환 부위가 정상으로 회복되지만, 감염원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 급·만성 염증성 질환을 유발하게 된다. 염증반응이나 이로 인한 염증성 질환의 완화 내지는 치료를 위해 비스테로이드계 항염제, 스테로이드계 항염제, 신경 펩타이드 길항제, COX 억제제, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제를 사용하지만, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 과민 반응, 내성, 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한, 이들 약제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 한계도 있다.

최근에는 천연물을 이용한 염증성 질환 치료제나 기능성 화장품 개발에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 염증성 질환 치료제나 기능성 화장품의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 항염 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 실질적인 항염 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 암세포, 면역세포, 중간엽 줄기세포 등의 배양액 외에도 세균 또는 균규 배양액으로부터도 분리될 수 있다.

흑효모는 식품 및 화장품 산업에서 다당류 필름 및 점증제 원료로 사용되는 고분자 다당류인 풀루란(pullulan)을 생산하는 균주이다. 또한, 흑효모가 생산하는 베타글루칸은 항암, 인슐린 분비억제 등의 생리 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 흑효모는 식품, 화장품 분야 등에서 널리 활용되고 있다. 그러나 흑효모로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대한 연구는 아직 미진한 상태이다. 따라서 흑효모로부터 유래된 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요하다.

본 발명자는 흑효모로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 흑효모로부터 유래된 엑소좀이 피부 독성을 줄이면서도 항염 효능이 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1788530호 (2017.10.24) 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0028201호 (2015.03.13)

본 발명의 목적은 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항염 조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "흑효모(Aureobasidium pullulans)"는 Aureobasidium 속에 속하는 검은 곰팡이로서, 균사가 없고 운동성 및 광합성능을 가지지 않는 단세포 생물이다. 흑효모는 자연계에 널리 존재하는 불완전 균류이며, 멜라닌색소를 생성하고 배양조건에 따라 베타글루칸을 생산한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 흑효모로부터 세포외 공간으로 분비 또는 방출된 막 구조를 갖는 나노 사이즈의 소낭을 의미하며, 엑소좀-유사 베지클 또는 엑소좀-유사 파티클로도 정의된다.

본 발명의 명세서에서 사용된 "흑효모 유래의 엑소좀"이란 용어는 예를 들어, 흑효모 배양액 또는 흑효모 발효물, 또는 이들과 동등한 흑효모의 생물학적 용액으로부터 분리되거나 흑효모 자체로부터 분비 및/또는 방출된 엑소좀을 모두 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "항염"이란 염증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 일 구체예의 항염 조성물에 있어서, 상기 흑효모 유래의 엑소좀은 흑효모 배양액 또는 흑효모 발효물, 또는 이들과 동등한 흑효모의 생물학적 용액으로부터 분리하여 얻은 것일 수 있다.

본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 항염증용 약학 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 항염증용 기능성 화장품, 피부외용제 또는 의약외품으로도 사용될 수 있다.

본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 항염 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 항염 조성물은, 예를 들어, 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있다

본 발명의 일 구체예의 항염 조성물은, 예를 들면, 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 항염 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 항염 조성물은 흑효모 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(예를 들어, 항염 효능 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 항염제, 소염제, 창상 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항염 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 항염 조성물을 피부 또는 염증 부위에 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 항염 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 포유동물에 투여 또는 처리될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 방법은, 상기 항염 조성물이 처리된 포유동물의 피부 또는 염증 부위에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스를 수행하는 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부 또는 염증 부위에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.

본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 종래의 흑효모 발효 여과물, 흑효모 배양액 또는 단순 흑효모 추출물에 비해 불순물 함유 가능성이 낮으며, 흑효모 발효 여과물, 흑효모 배양액 또는 단순 흑효모 추출물에 비해 세포 독성이 적은 장점이 있다. 또한, 본 발명의 항염 조성물은 항염 효과가 종래의 흑효모 배양액 보다 우수하다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 흑효모 유래의 엑소좀에 대해 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 형광 염색된 흑효모 유래의 엑소좀이 RAW 264.7 세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵).
도 3은 흑효모 유래의 엑소좀이 흑효모 배양액에 비해 세포 독성이 적은 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 흑효모 유래의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-6이 감소하고, 흑효모 배양액 보다 IL-6 감소 효과, 즉 항염 효과가 우수한 것을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 흑효모 유래의 엑소좀의 제조

상업적으로 입수 가능한 흑효모 균주인 Aureobasidium pullulans를 YMBroth 배지에 48시간 내지 72시간 동안 진탕 배양한 후, 배양 배지를 원심분리하여 펠릿화하고 흑효모 세포를 제거하였다.

상기와 같은 과정에서 얻은 흑효모 배양액(Conditioned Media; CM)을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 흑효모 유래의 엑소좀을 분리하였다.

분리된 흑효모 유래의 엑소좀의 크기와 농도는 NS300(Malvern Panalytical에서 구입)을 이용한 나노입자트래킹분석(Nanoparticle Tracking Analysis; NTA)으로 확인하였다(도 1).

실시예 2: 흑효모 유래의 엑소좀의 대식세포 전달능의 확인

흑효모 유래의 엑소좀이 마우스 대식세포(RAW 264.7; ATCC에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 1에서 준비된 흑효모 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(Sigma-Aldrich에서 구입) 형광 염료와 반응시켰다. 반응 후 반응액을 MiniTrap-25(Cytiva에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67) 형광 염료를 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MiniTrap-25 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 마우스 대식세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트(Hoechst) 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였고, 세포질을 염색하기 위하여 CellMask Orange 형광 염료(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다(도 2).

실시예 3: 흑효모 유래의 엑소좀의 대식세포 생존율에 대한 평가

본 실시예에서는 흑효모 유래의 엑소좀의 독성을 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 평가하기 위해, 실시예 1에서 준비된 흑효모 배양액 혹은 흑효모 유래의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 처리하고 세포의 생존율을 확인하였다.

RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시킨 후 이를 48-웰 플레이트(48-well plate)내 각 웰 당 30,000개의 세포를 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고, 흑효모 배양액 또는 흑효모 유래의 엑소좀을 새로운 배지와 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리하고 RAW 264.7 세포를 48시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 평가하기 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:

(1) 대조군(Control): 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;

(2) 흑효모 배양액 처리군(도 3에서 "A.P CM"으로 표시): 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 실시예 1에서 준비된 흑효모 배양액(세포에 처리하는 배지 부피의 10% 및 3%)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;

(3) 흑효모 유래의 엑소좀 처리군(도 3에서 "A.P Exosome"으로 표시): 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 실시예 1에서 준비된 흑효모 유래의 엑소좀(세포에 처리하는 배지 부피의 10% 및 3%)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군(10% 엑소좀은 5×10⁹ 입자/mL에 해당하고, 3% 엑소좀은 1.5×10⁹ 입자/mL에 해당).

배양이 끝난 후, 세포 생존율(Cell Viability)은 MTT 어세이를 이용하여 측정하였다. MTT 어세이에서는 MTT 시약(Sigma-Aldrich에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 560nm 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율을 측정한 결과, 흑효모 배양액과 흑효모 유래의 엑소좀을 동량 처리하였을 때, 흑효모 배양액에 비해 흑효모 유래의 엑소좀의 세포 독성이 적은 것을 확인하였다(도 3). 특히, 10% 흑효모 유래의 엑소좀은 세포 생존율이 약간 떨어지는 반면에, 10% 흑효모 배양액은 세포 생존율이 매우 낮은 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀은 흑효모 배양액 보다 세포 생존율에 미치는 영향, 즉 세포 독성이 적은 장점이 있다.

실시예 4: 흑효모 유래의 엑소좀의 항염 효능 평가

실시예 1과 같이 준비된 흑효모 유래의 엑소좀이 항염 효능을 나타내는지 확인하기 위해, RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지(1% FBS와 200 nM의 LPS를 포함한 DMEM 배지)에 희석한 흑효모 유래의 엑소좀을 적정 농도로 24시간 동안 RAW 264.7 세포에 처리하여 배양하였다. 항염 효능 평가를 위한 실험군은 다음과 같이 분류하였다:

(1) 음성대조군(Negative Control): LPS 배지만을 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;

(2) 양성대조군(Positive control): LPS 배지에 200 μM 덱사메타손 (dexamethasone)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;

(3) 흑효모 배양액 처리군(도 4에서 "A.P CM"으로 표시): LPS 배지에 실시예 1에서 준비된 흑효모 배양액(세포에 처리하는 배지 부피의 2%)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;

(4) 흑효모 유래의 엑소좀 처리군(도 4에서 "A.P Exosome"으로 표시): LPS 배지에 실시예 1에서 준비된 흑효모 유래의 엑소좀(세포에 처리하는 배지 부피의 0.4% 및 2%)을 혼합하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군(0.4% 엑소좀은 3×10⁸입자/mL에 해당하고 2% 엑소좀은 1×10⁹ 입자/mL에 해당).

배양이 끝난 후 배양 상층액(culture supernatant)을 취하고 배양 상층액 내에 존재하는 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양 상층액 내의 염증성 사이토카인 양은 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트(R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼에 따라, LPS만을 처리한 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량과, 덱사메타손, 흑효모 배양액 및 흑효모 유래의 엑소좀 각각과 함께 LPS가 처리된 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량을 확인하였다(도 4).

도 4에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 처리한 경우, LPS만 RAW 264.7 세포에 처리한 음성대조군에 비해 IL-6(염증성 사이토카인)의 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 0.4% 흑효모 유래의 엑소좀을 처리한 경우, RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 2% 흑효모 배양액을 처리한 A.P CM 군에 비해 IL-6의 생성 억제 효과가 큰 것을 확인하였다.

상기 실험 결과로부터, 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀은 흑효모 배양액 보다 항염 효능이 우수한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 우수한 항염 효능을 나타내어 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물.
제1항에 있어서,
주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리되는, 항염 조성물.
제1항에 있어서,
주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인, 항염 조성물.
제1항에 있어서,
액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제인, 항염 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 흑효모 유래의 엑소좀은 흑효모 배양액 또는 흑효모 발효물, 또는 이들과 동등한 흑효모의 생물학적 용액으로부터 분리된 것인, 항염 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
약학 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 또는 의약외품인, 항염조성물.
제6항에 있어서,
주사제인 것을 특징으로 하는, 항염조성물.
흑효모 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계, 또는 상기 항염 조성물을 피부 또는 염증 부위에 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 항염 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 포유동물의 피부 또는 염증 부위에 투여 또는 처리되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 항염 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 항염 조성물은 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제인, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 항염 조성물이 처리된 포유동물의 피부 또는 염증 부위에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 이온토포레시스를 수행하는 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부 또는 염증 부위에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.