TWI577383B - 台灣冬蟲夏草分離株及其用途 - Google Patents
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Description
本發明關於一種新穎的台灣冬蟲夏草分離株，其能展現出優越的抗氧化和癌細胞抑制性質。本發明也關於台灣冬蟲夏草在用於製造在一個體中治療活性氧相關性疾病的醫藥組成物上的用途。
昆蟲病原性(entomopathogenic)真菌中的廣義蟲草屬(Cordyceps s.l.(sensu lato))包括有西藏冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)和蛹冬蟲夏草(Cordyceps militaris)等物種，其乃是一種極負盛名的傳統漢藥，長年以來被使用做為補品和民間藥方，與人參、鹿茸並稱「中藥三大寶」。除了使用上的安全性以外，冬蟲夏草在治療呼吸和腦血管疾病(Wang,et al.,Metab.Brain Dis.27,p.159-165(2012))、促進免疫調節功能(Shi,et al.,Int.Immunopharmacol.9,p.582-586(2009))、調整肝臟代謝(Manabe,et al.,Br.J.Nutr.83,p.197-204(2000))和治療癌症(Jayakumar,et al.,J.Cancer Res.Ther.10,p.43-49(2014))上的高度藥學和治療價值也受到注意。對此，近年來研究者也傾注了大量心力在發掘廣義蟲草屬各物種中的生物活性組份、藥學有效
性和第二代謝產物的機轉。此外，活性氧(ROS)會促使細胞壞死，並促成癌症(Faisal,et al.,Urology 84,p.1434-1441(2004))、神經退化疾病(Tiurenkov,et al.,Eksp.Klin.Farmakol.77,p.16-19(2014))、肝病(Matsui,et al.,JPEN.J.Parenter.Enteral.Nutr.31,p.373-380(2007))、動脈粥狀硬化(Park,et al.,Cardiovasc.Toxicol.14,p.1-9(2014))等各種病理狀況，甚至引發老化(Ji,et al.,Phytother.Res.23,p.116-122(2009)；Lee,et al.,Arch.Biochem.Biophys.490,p.103-109(2009))。經報導，冬蟲夏草可以清除自由基，能夠做為一種抗氧化劑(Yu,et al.,J.Agric.Food Chem.54,p.3132-3138(2006)；Li,et al.,Life Sci.73,p.2503-2513(2003))。
就分類學而言，廣義蟲草屬是廣義麥角菌科(Claviciptaceae s.l.)的一個龐大側系群(paraphyletic group)，其包含許多物種，具有昆蟲、蜘蛛乃至於松露類真菌的廣泛寄主範圍。近來，ITS(內轉錄間隔區)、RPB(RNA聚合酶II)、EF(延長因子)等分子標記已被普遍地應用於物種鑑別和系統發生的研究上(Gardes,M.and Bruns,T.D.,Mol.Ecol.2,113-118(1993)；Schoch,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.109,p.6241-6246(2012)；Tanabe,et al.,Mol.Phylogenet.Evol.30,p.438-449(2004))。基於多基因系統發生分析法(multiple genes phylogenetic analysis)的研究結果，目前廣義蟲草屬已被劃分成幾個屬，包括狹義蟲草屬(Cordyceps s.s.)、大團囊蟲草屬(Elaphocordyceps)、綠僵蟲草屬(Metacordyceps)和線蟲草屬(Ophiocordyceps)。
台灣冬蟲夏草(Ophiocordyceps formosana)是在西元1981年由日人小林氏和清水氏在台灣南投縣溪頭地區發現並率先提出報告(Kobayasi,Y.,Bull.Natn.Sci.Mus.,Tokyo.Ser.B 7,p.113-122(1981))，其原本被認定為台灣的原生菌種。西元2001年，安徽大學李春如教授在安徽省黃山地區也採集到台灣冬蟲夏草，意味著台灣冬蟲夏草的分佈範圍並不限於台灣(Li,et al.,Mycosystema 24,p.349-355(2005))。然而，在本案提出申請前，台灣冬蟲夏草的鑑定僅侷限於形態學上的描述。對於台灣冬蟲夏草的生理學和生化學分析，乃至於醫藥上的應用，皆付之闕如。台灣冬蟲夏草的生長習性和形態特徵與廣義蟲草屬中其他物種類似，使得它的藥用潛力引人注意。但在本案提出申請前，台灣冬蟲夏草少有文獻報告，也沒有足夠的材料進行進一步的鑑定和探討。
由於廣義蟲草屬各菌種及其相關產品的安全性和有效性，使其發展出各式各樣的輔助性藥品和傳統性藥品。但是，因為其供應來源有限、價格高昂、過度採集以及人工培植不易等原因，導致蟲草屬各菌種瀕臨絕跡。因此，相關技術領域中亟需以蟲草屬各物種間的系統發生關係為基礎，建立一個台灣冬蟲夏草的典型菌株。此外，相關技術領域中也需要就台灣冬蟲夏草的癌細胞抑制潛力、抗氧化活性以及其給予個體時的安全性進行進一步的研究。
依據本發明，本案發明人已鑑定出一種新穎的台灣冬蟲夏草分離株，其在形態(morphologically)和系統發生上(phylogenetically)與台灣冬蟲夏草的已知特徵相同，但不同於廣義蟲草屬中的其他物種。尤其是，藉由鑑定和分析本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株，本案發明人意外地發現到，台灣冬蟲夏草在抗氧化活性和癌細胞抑制活性上較廣義蟲草屬中的其他物種更為優越，而且對於正常細胞具有更低的毒性。這意味著相較於廣義蟲草屬中的其他物種，台灣冬蟲夏草在治療癌症上能夠展現出更高的有效性以及更高的安全性。本案揭露內容顯示出，台灣冬蟲夏草，特別是本案所揭露的新穎台灣冬蟲夏草分離株，在醫藥用途上具有極高的應用價值。
據此，在本案所揭露的第一態樣中是提供一種台灣冬蟲夏草分離株，它是以BCRC 930172的寄存編號於2015年01月16日被寄存在中華民國食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)，並且基於布達佩斯條約在國際承認用於專利程序的微生物寄存上的效力，以DSM 32000的寄存編號於2015年01月28日被寄存在德國國家微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen；DSMZ)。
在本案所揭露的第二態樣中是提供一種冬蟲夏草組成物，其包含前述台灣冬蟲夏草分離株的乾燥粉碎顆粒或是前述台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物，且任擇地包含有一可接受之
賦形劑。
在本案所揭露的第三態樣中是提供一種保健食品，其包含前述台灣冬蟲夏草組成物。
在本案所揭露的第四態樣中是提供一種台灣冬蟲夏草的用途，其供用於製造一用來在一個體中治療活性氧相關性疾病的醫藥品，較佳為供用於製造一用來治療癌症的醫藥品，例如用來治療肺癌、乳癌、肝癌和白血病的醫藥品。
第1A-1G圖顯示實例1中採集到的台灣冬蟲夏草的形態特徵，其中第1A圖顯示所述台灣冬蟲夏草的子座由寄主長出，且具有長柱狀的柄，第1B圖顯示子座頭部呈長橢圓形，第1C圖顯示卵形子囊殼埋生於子座內，第1D圖顯示子囊殼孔口處具有被子囊殼厚壁所包圍的縊縮頸部，第1E圖顯示由子囊孢子斷裂而生成的桿狀次生孢子，第1F圖顯示本案所揭分離株在馬鈴薯右旋糖瓊脂培養基上的菌落呈橘色至白色，外表具絨毛且帶有小水珠，而第1G圖顯示台灣冬蟲夏草的無性世代中華被毛孢(Hirsutella)；第2圖顯示廣義蟲草屬的系統發生樹，其利用三組基因(RPB1,RPB2,EF1-α)加以連鎖並藉由最大近似法則進行推衍，而得出其歸屬於三個新創科別：線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)、蟲草科(Cordycipitaceae)和狹義麥角菌科(Clavicipitaceae s.s.)，圖中的比例尺代表50個變異；第3A-3F圖為各種蟲草的水性萃出物的HPLC圖譜，
其中第3A圖顯示D-甘露醇(標註為D)、腺苷(標註為A)和蟲草素(標註為C)在HPLC管柱內的滯留時間，而第3B至3F圖分別為台灣冬蟲夏草菌絲體(OFMY)、西藏冬蟲夏草菌絲體(OSMY)、西藏冬蟲夏草子實體(OSFB)、蛹冬蟲夏草菌絲體(CMMY)和蛹冬蟲夏草子實體(CMFB)的水性萃出物的HPLC沖提圖譜；第4A圖顯示各種癌細胞株暴露於台灣冬蟲夏草菌絲體(OFMY)、西藏冬蟲夏草菌絲體(OSMY)、西藏冬蟲夏草子實體(OSFB)、蛹冬蟲夏草菌絲體(CMMY)和蛹冬蟲夏草子實體(CMFB)的熱水萃出物下的存活率；第4B圖顯示正常細胞株暴露於各蟲草萃出物下的存活率；第5A-5D圖顯示各蟲草萃出物於活體外和於活體內的抗氧化活性，其中第5A圖顯示台灣冬蟲夏草菌絲體(OFMY)、西藏冬蟲夏草菌絲體(OSMY)和蛹冬蟲夏草菌絲體(CMMY)的熱水萃出物於活體外的DPPH抗氧化活性，第5B圖顯示台灣冬蟲夏草菌絲體(OFMY)、西藏冬蟲夏草子實體(OSFB)和蛹冬蟲夏草子實體(CMFB)的熱水萃出物於活體外的DPPH抗氧化活性，第5C-D圖分別顯示藉由流式細胞儀來測量各種蟲草萃出物於活體內的ROS清除功效及其定量結果(p<0.05)；以及第6A和6B圖顯示台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815在接種有MDA-MB-231人類乳癌細胞的異種移植裸鼠模型中所展現的抗腫瘤生成活性，其中第6A圖為柱狀圖，顯示1
倍量和5倍量的台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的熱水萃出物(分別以1×OFMY和5×OFMY標示組別)以劑量相依方式抑制裸鼠模型中腫瘤的發展，數據以平均值±標準差表示，而第6B圖顯示各組裸鼠在接受處理20天時的腫瘤尺寸照片。
除非另行說明，否則本案專利說明書和各請求項中所使用的下列用語具有下文給予的定義。請注意，本案說明書和各請求項中所使用的單數形用語「一」意欲涵蓋在一個以及一個以上的所載事項，例如至少一個、至少二個或至少三個，而非意味著僅僅具有單一個所載事項。此外，本案各請求項中使用的「包含」、「包括」等開放式連接詞是表示請求項中所記載的元件或成分之組合中，不排除請求項未載明的其他元件或成分。
本說明書中所使用的術語「台灣冬蟲夏草」意欲涵蓋被分類於Cordyceps formonsana此物種以及被分類於Ophiocordyceps formosana此物種中的所有分離株，特別是依據RPB1、RPB2和EF1-α基因的核苷酸序列相同性，而被分類於Ophiocordyceps formosana此物種中的所有分離株。這些台灣冬蟲夏草菌株包括本項技術中具有通常知識者可易於獲得的台灣冬蟲夏草菌株，例如可由國內或國外寄存機構購買或是透過申請分讓而獲得的分離株，或者是利用本技術領域中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中單離出來的台灣冬蟲夏草菌株。在一較佳具體例中，所述台灣冬蟲夏草為本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離
株，其是以BCRC 930172的寄存編號被寄存在中華民國食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)，以及以DSM 32000的寄存編號被寄存在德國國家微生物菌種保藏中心(DSMZ)。
本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株可以參照習用的蟲草菌絲體培養方法進行菌絲體的培養和增殖。一般來說，適合於蟲草菌絲體的培養條件為使用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米澱粉、麥芽萃出物或是彼等的組合做為碳源，且使用硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、酵母菌萃出物、蛋白腖(peptone)及胰化腖(tryptone)或是彼等的組合做為氮源，另將培養基的酸鹼值調整到中性至微酸性，較佳為pH 5.0-7.0，例如pH 5.5-6.0。在一較佳的具體例中，所述培養基是適合搖瓶發酵培養以獲取蟲草菌絲體的液態培養基，例如馬鈴薯右旋糖液態培養基(potato dextrose broth)。在另一較佳具體例中，所述培養基是固態培養基，例如馬鈴薯右旋糖瓊脂(PDA)或沙氏右旋糖瓊脂酵母菌萃出物(S-DAY)。培養溫度較佳為被控制在室溫或略低於室溫，例如15℃-25℃。
經由後文所述的MTT分析發現，台灣冬蟲夏草這個物種，特別是本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株，能夠展現出顯著的癌細胞抑制活性。而且，相較於西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的菌絲體所得到的活性，台灣冬蟲夏草能夠展現出更強的癌細胞
抑制效果，而其抑制癌細胞的能力甚至與西藏冬蟲夏草的子實體相當(參見實例7)。
大體來說，冬蟲夏草不容易以人工培養方式生產子實體，通常只能利用發酵技術大量生產菌絲體。雖然目前已經成功地使用人工培養方式培養出蛹冬蟲夏草的子實體，但子實體長成所需要的時間長，且子實體的出菇率低且變異率高，故仍以菌絲體的生產較具經濟效益。如本項技術領域具有通常知識者所知悉，蟲草子實體中的腺苷和蟲草素(cordycepin)等活性成份的含量遠較菌絲體為高，故一般認定蟲草子實體相較於菌絲體具有更高的藥用價值。然而，依據本案說明書的揭露內容，台灣冬蟲夏草，特別是本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株，其菌絲體萃出物所展現的癌細胞抑制活性竟然與西藏冬蟲夏草的子實體萃出物相當，更遠高於西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的菌絲體萃出物所展現的抑癌活性。
另一方面，氧化壓力對於人體健康的不利影響也廣為受注意。事實上，生物體或細胞暴露於過量活性氧(ROS)會明顯導致體內平衡失調。最後，大量的ROS會促使細胞和DNA損壞、引發細胞淍亡，並且促成有害併發症的發生，例如老化、高血壓、發炎反應等，甚至癌症。一般相信，蟲草的抗氧化活性與其醫藥上的療效息息相關。在本案說明書中，DPPH抗氧化分析(參見實例8)和活性氧(ROS)清除分析(參見實例9)的結果顯示，台灣冬蟲夏草的菌絲體相較於等量的其他蟲草物種的菌絲體具有
更為優越的抗氧化能力，其抗氧化能力甚至與西藏冬蟲夏草的子實體相當，而且對於細胞或個體的毒性最低，因而適用於治療、預防或改善與活性氧相關性疾病。
綜合上述分析所獲得的結果，本發明的一個態樣為台灣冬蟲夏草在製造用於在一個體中治療活性氧相關性疾病(diseases associated with ROS)的藥品上的用途。本說明書所稱「活性氧」的定義如WO 94/13300 A1中所述，且意欲涵蓋以氧為中心的自由基，例如氫氧自由基(‧OH)、超氧陰離子(O2‧-)等，以及非自由基型含氧氧化劑，例如過氧化氫。本說明書所稱「活性氧相關性疾病」意指至少部分地由於活性氧的產生或是至少部分地由於暴露在活性氧環境中所導致的個體病況，其包括但不限於白內障、糖尿病、阿茲海默症、心臟病、發炎、癌症、雄性不孕性、肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、帕金森氏症和老化。
在一較佳具體例中，前述活性氧相關性疾病為癌症，其包括但不限於固體腫瘤，例如肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC))、肺部、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宮頸癌、食道癌、膀胱癌、胰臟癌、腦癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、皮膚癌、遺傳性和散發性乳突腎細胞癌、黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、神經纖維瘤、間皮細胞瘤和骨肉瘤；以及液體腫瘤，例如淋巴癌、白血
病，例如急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、B-細胞慢性淋巴性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)和慢性粒細胞性白血病(chronic granulocytic leukemia)，以及多發性骨髓瘤。在一更佳具體例中，所述癌症是選自於由肺癌、乳癌、肝癌和白血病所組成的群組。
本說明書所稱「治療」等用語意指將本案說明書所述疾病或是它們的一或多種症狀的進展予以逆轉、緩和、延遲發作或抑制。在一些具體例中，治療可在發展出一或多種症狀後再施行。在其他具體例中，治療可在無症狀下施行。例如，治療可在症狀發作前施行至易染病個體(例如根據症狀歷史及/或根據遺傳或其他感病性因素)。治療亦可於症狀解除後持續施行，以進行預防或延遲其復發。
依據本案揭露內容，可以將能夠有效治療活性氧相關性疾病或是將能夠有效減緩這些疾病的嚴重性的任何用量的台灣冬蟲夏草，透過任何投藥途徑給予需要的個體。所需要的精確用量隨個體不同而有別，依據個體的物種、年齡和健康情況、性別和飲食、患病的嚴重性、特定藥劑形式、投藥模式、治療持續時間以及合併使用或同時使用的藥劑等因素而定。相關技術中具有通常知識者應能明暸，台灣冬蟲夏草的每日總和用量將在合理醫學判斷的範疇內由醫師來決定。當給予人類個體時，台灣冬蟲夏草萃出物通常是以每日一至三次、每週一至三次或是每雙週一
次的頻率，以每次約0.01-1000毫克/公斤體重的用量進行給予，較佳為以每次約0.1-100毫克/公斤體重的用量給予，更佳為以每次約1-50毫克/公斤體重的用量給予。
本案說明書中所使用的術語「個體」意欲涵蓋人類或非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括畜產動物、伴侶動物、實驗動物和非人類靈長類動物。非人類哺乳動物亦非限制性地包括有馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、貂等。較佳為人類，且更佳為罹患活性氧相關性疾病的個體，例如罹患癌症的個體。
為了供研究之用，本案說明書中所使用的術語「個體」也意欲涵蓋細胞、組織和器官。本案所揭露的發明也因而不僅適用於活體內，也適用於活體外。
台灣冬蟲夏草可以子實體和菌絲體的形式給予個體。由於子實體不易培養，所以較佳為呈菌絲體的形式給予個體，更佳為呈菌絲體的乾燥粉碎顆粒、水性萃出物或是水性萃出物的製劑的形式給予個體。
可以使用研磨機將乾燥後的冬蟲夏草子實體或菌絲體直接予以研磨，而製成前述乾燥粉碎顆粒。乾燥粉碎顆粒的粒徑並無特別限制，只要適合於直接給予個體且有利於個體的攝取和吸收，或是有利於進一步加工製成其他適合給予個體的形式即可。
可以選用任何習用製程來製備出蟲草的水性萃出
物，只要所述萃取製程可以有效地將蟲草的水溶性以及水可混溶性組份由蟲草的固體部分轉移至水性溶劑中即可。一般來說，所述萃取製程包括將台灣冬蟲夏草的子實體或菌絲體加以粉碎，再以水、具有1至4個碳原子的低級醇類(例如甲醇、乙醇)或彼等的組合等水性溶劑進行萃取作業，且較佳為在萃取作業進行同時施加熱能、超音波振盪或機械性攪拌等手段來促進萃取的效率，最後再以過濾、離心等手段去除固體部分，從而獲得蟲草的水性萃出物。較佳為所述萃取製程是選自於由浸提法、熱水迴流法、熱醇迴流法、超音波水提法，超音波醇提法所組成的群組。在一較佳具體例中，是以熱水迴流法來製備台灣冬蟲夏草的水性萃出物，也就是使定量熱水持續地流過蟲草材料以提取水性萃出物，較佳為熱水溫度為30-100℃，更佳為40-60℃，最佳為45-55℃，例如50℃，而且萃取作業歷時30分鐘至12小時，較佳為1-6小時，例如2小時。在一較佳具體例中，萃取作業的效率可以藉由D-甘露醇、腺苷及/或蟲草素等蟲草活性成份的萃出量來進行評估。
前述台灣冬蟲夏草的水性萃出物可經調製成適當濃度後，再配製成口服形式或非經腸形式而給予個體。調製這些給予形式時，可加入例如填充劑、膨化劑、黏合劑、溼潤劑、崩解劑、界面活性劑等稀釋劑，或是加入其他類型的賦形劑。
口服用液態製劑的形式包括懸浮液、溶液(糖漿、飲料等)、乳劑等。除了可以添加水或液態石蠟等最常用的稀釋劑以外，也可額外添加溼潤劑、增甜劑、調味劑以及防腐劑。口服
用固態製劑的形式包括錠劑、藥丸、粉末、顆粒、膠囊、糖錠等。
非經腸給予用製劑的形式包括無菌溶液、非水性溶液、懸浮液、乳劑、冷凍乾燥劑等。非水性溶液用溶劑、懸浮液或乳劑所使用的溶劑包括但不限於蔬菜油、丙二醇、聚乙二醇、橄欖油及油酸乙酯。
一般而言，這些製劑是藉由將至少一種賦形劑加入前述粉碎顆粒或水性萃出物中，必要時加以乾燥，然後再進行造粒、打錠或囊封而製備出來。所述賦形劑包括但不限於水、具有1至4個碳原子的低級醇類、天然油或合成油、膠凝劑、助懸劑、乳化劑、增稠劑、惰性粉末、天然和合成的聚合物、溼潤劑、增甜劑、調味劑、芳香劑、香料、著色劑，防腐劑、潤滑劑、介面活性劑。較佳的賦形劑包括但不限於水、乙醇、澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠、樹膠類、糊精、環糊精、微晶性纖維素、羧甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉等。此外，除了單純地添加賦形劑以外，還可加入例如硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑。
因此，本案所揭露的一態樣為一種冬蟲夏草組成物，其包含如前所述的台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物或是乾燥粉碎顆粒，且任擇地包含有一可接受之賦形劑。本案所稱「可接受之賦形劑」意指被使用做為本案冬蟲夏草組成物之載體的惰性物質，其對於給予的個體不具有毒性、刺激性、熱原性、抗原性及溶血性，而且無實質的藥理活性，也不會妨礙本案冬蟲夏草組成物之有益效果的發揮。本案所揭露的另一態樣為一種保健食
品，其包含前述的冬蟲夏草組成物，以供直接食用、入菜，或是摻混於飲料、零食、動物飼料、膳食補充品、其他中草藥材等各種可食性材料中，或是包裝成其他適合服用的形式，例如將前述乾燥粉碎顆粒以茶袋包裝成茶包形式以供沖泡飲用。在一較佳具體例中，本案所揭露的冬蟲夏草組成物可以搭配來自於其他蟲草物種的組成物，例如搭配來自於西藏冬蟲夏草及/或蛹冬蟲夏草的子實體或菌絲體組成物，從而調配成適合個體攝取且能兼顧安全性及有效性的健康食品和醫藥品。
在另一較佳具體例中，本案冬蟲夏草組成物基本上由如前所述的台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物或是乾燥粉碎顆粒及前述可接受之賦形劑所組成。此處所稱「基本上由...所組成」意指所記載的成分組合中不排除另外含有實質上不會影響水性萃出物或是乾燥粉碎顆粒的性質的其他未記載成分。在另一較佳具體例中，本案冬蟲夏草組成物僅由前述台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物或是乾燥粉碎顆粒及前述可接受之賦形劑所組成。
下列實例僅供用於例示，而非意欲限制本發明的範圍。實例中所顯示的所有數據是以平均值±標準差表示。統計學分析是利用單因子變異數分析(ANOVA)再進行杜凱氏測驗(Tukey’s test)或司徒登氏測驗(Student’s test)來完成，其中p值小於0.05時表示在統計學上具有顯著性。
實例1：分離株的收集和微形態鏡檢維持
本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株是在西元2013年8月在台
灣桃園縣拉拉山區，於倒伏腐爛樹幹中的擬步行蟲幼蟲(Tenebrionoidea)採集而得，因此命名為台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815。立即拍攝所收集到的樣品的影像，如第1A和1B圖所示。將樣品帶回位於台北市的台灣大學應用真菌實驗室，在標準去污染程序下將孢子和菌絲體(mycelium)分離出來。
運用冷凍切片技術(cryosection)和複式光學顯微鏡技術(compound microscopy)來進行鏡檢。運用配於磷酸鹽緩衝化生理食鹽水(PBS)中的4%甲醛溶液，將樣品予以固定，歷時1天，期間更換溶液一次。將樣品置入最佳切割溫度複合物(optimal cutting temperature compound；OCT)內之後，在一具倈卡CM3050-S型恆冷箱切片機中進行冷凍切片，以獲得5微米(μm)至10微米厚的切片。檢視各切片，並在一具有配備有佳能-ds126型攝像機(Canon-ds126 camera)的奧林巴斯BH2型顯微鏡(Olympus BH2 microscope)下取像，如第1C-1E圖所示。
第1A-1E圖顯示，實例1所採集到的台灣冬蟲夏草分離株，其子座由寄主的頭部或腹部長出。柄呈長柱狀，呈橘色，尺寸為10-30毫米×0.5-2毫米，具短毛，無被膜鞘。子座頭部呈長橢圓形，尺寸為4-6毫米×1-4毫米。菌絲組織擬薄壁組織狀，子囊殼埋生，卵形，呈棕橘色，尺寸為360-480微米×240-320微米。子囊殼孔寬60微米，子囊殼壁厚20微米，埋於40微米厚的菌絲組織下。子囊呈長筒狀，基部縊縮，寬6.5-7.9微米，長160-240微米。子囊頂寬3.9-5.3微米，長3.2-4.6微米，鐵鐘罩狀，具狹溝。子囊孢
子8個，透明無色，成熟時斷裂成次生孢子，次生孢子呈桿狀，兩端呈截頭狀，尺寸為2.6-3.0微米×6.5-7.3微米。
實例2：分離株的維持
接著，將分離出來的孢子和菌絲體轉移至含有馬鈴薯右旋糖瓊脂(PDA；購自於位在美國密西根州底特律市的Difco公司)或沙氏右旋糖瓊脂酵母菌萃出物(S-DAY；購自於位在美國密西根州底特律市的Difco公司)的培養皿中，並在25℃下予以培植。每隔3-4週採收菌落一次。先在55℃下將所採收到的菌落加以乾燥至隔日，再將其儲存在乾燥器(desiccator)中，供後續分析或製作萃出物之用。將含有菌絲體的小塊瓊脂經常性地轉移至新的PDA或S-DAY培養基中，以維持這個台灣冬蟲夏草分離株的培養。
如第1F至1G圖所示，本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株在馬鈴薯右旋糖瓊脂培養基上的菌落呈橘色至白色，呈褥墊狀至鈕扣狀，白色菌絲，且外表帶有小水珠。其無性型似中華被毛孢(Hirsutella)，生成分生孢子的細胞為單生、透明，呈安瓿形(尺寸為1.5-2.3×8.6-17.0微米)。分生孢子透明呈圓柱形(尺寸為1.6-2.3×3.6-6.9微米)。
綜合實例1、2所示觀察結果，本案所揭露的蟲草分離株在巨觀和微觀形態上皆與先前所發現的其他台灣冬蟲夏草菌株相同，顯示其確為台灣冬蟲夏草分離株。
實例3：蟲草基因體DNA的萃取
蟲草基因體DNA的萃取方法是參照杜爾等人所發表的文獻
再進行修改((Doyle and Doyle 1990))。簡單來說，真菌樣品來自於直接切下蟲草的子座(stroma)和菌柄(stalks)，或是來自於在培養皿中採取菌絲體。將收集到的樣品加以冷凍乾燥，再加入500微升熱的溴化十六烷基三甲銨(Cetyltrimethyl ammonium bromide；CTAB)緩衝液(2% CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA、酸鹼值為8.0的100mM Tris、2% PVP-40)和新鮮的3微升2-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，以磨杵加以磨碎。在60℃下培育20分鐘後，添加500微升CI(氯仿：異戊醇=24：1)，並溫和地混合10分鐘，再於13,200×g下予以離心2分鐘。將上清液(supernatant)小心地轉移至一個新的離心小管(eppendorf)中，再添加0.6倍體積的異丙醇。接著，在-20℃下將混合物予以培育30分鐘，使DNA沈澱析出。藉由在13,200g下離心30分鐘來收集DNA，並以75%冰冷乙醇洗滌一次，加以真空乾燥，並使其再懸浮於50微升的二次去離子水中。
實例4：DNA的擴增和定序
運用聚合酶鏈鎖反應(PCR)來進行特定片段的擴增，如下文所述。大致來說，PCR反應混合物在25微升的總體積中，含有2.5微升10X反應緩衝液、1微升的10μM各個特定引子(primer)、0.5微升的10mM dNTPs、2微升模版DNA，和0.3微升1U Taq聚合酶(購自於位在美國印地安納州的Boehringer-Mannheim公司)。運用正向引子cRPB1(序列識別號：第1號)和反向引子RPB1c-r(序列識別號：第2號)(Castlebury,et al.,Mycol.Res.108,p.864-872(2004))，
且遵循下列步驟來擴增rpb1序列：在95℃下進行變性(denaturation)5分鐘，再進行由95℃歷時1分鐘、55℃歷時1分鐘和72℃歷時1分鐘所組成的40個循環，隨後在72℃下進行額外的延長步驟，歷時10分鐘。運用正向引子fRPB2-5f(序列識別號：第3號)和反向引子fRPB2-7cr(序列識別號：第4號)(Liu,et al.,Mol.Biol.Evol.16,p.1799-1808(1999))，且遵循下列步驟來擴增rpb2序列：在95℃下進行變性5分鐘，再進行由95℃歷時50秒、55℃歷時1分鐘和72℃歷時90秒所組成的40個循環，隨後在72℃下進行10分鐘的額外延長步驟。運用正向引子EF1-2218R(序列識別號：第5號)和反向引子EF1-983F(序列識別號：第6號)(Rehner,S.A.,Buckley,E.,Mycologia 97,84-98(2005))，且遵循下列步驟來擴增EF1-α序列：在94℃下進行變性5分鐘，再進行由94℃歷時1分鐘、46℃歷時30秒和72℃歷時2分鐘所組成的40個循環，並在72℃下進行7分鐘的額外延長步驟。使PCR產物接受電泳分析並將其洗提出來，以供利用ABI 3730XL系統(美國加州應用生物系統公司)進行定序。接著，利用ContigExpress of Vector NTI®軟體(美國加州Invitrogen公司)來拼接和修整所得到的序列。
依據上述方法，獲得了本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株的RPB1、RPB2和EF1-α基因的核苷酸序列，它們分別具有790個、1062個和1068個核苷酸。利用所獲得的序列在NCBI資料庫中進行blast搜尋，綜合考量三個序列，與本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株最為相近的前三名是台灣冬蟲夏草分離株TNM
F13893、大團囊蟲草分離株CBS 100239(Elaphocordyceps ophioglossoides CBS 100239)和台灣冬蟲夏草分離株TNM F13893，分別享有99%(676/679)、89%(939/1061)和99%(847/849)的序列相同性。就RPB2來說，雖然最為相近的並不是台灣冬蟲夏草，但本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株的RPB2序列仍然與台灣冬蟲夏草分離株TNM F13893享有100%的相同性，且具有47%的涵蓋度。這些結果顯示，在分子層級上，本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株與習知台灣冬蟲夏草分離株TNM F13893屬於同一物種，如下表1所示。
實例5：系統發生學的分析
各蟲草菌株的RNA聚合酶Ⅱ(RPB1,RPB2)的最大和第二大次單元以及轉譯延長因子1-α(EF1-α)等三個基因的核苷酸序列，是遵循宋等人發表之文獻(Sung,et al.,Mol.Phylogenet.Evol.44,p.1204-1223(2007))中所敘述的要件，或是藉由蛹冬蟲夏草分離株CM01的全基因體直系同源基因(orthologs)BlastN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide)測序工具，而得自於本案所揭台灣冬蟲夏草分離株的PCR定序產物，或是得自於美國國家生物技
術資訊中心(NCBI)的資料庫。總共有51個物種/分離株被囊括在本實例所載研究中。運用分子演化遺傳分析軟體第6.0版(MEGA 6.0；網址：http：//www.megasoftware.net)，將這三組基因的核苷酸序列予以連鎖及比對。運用CIPRES入口網站中所架設的RAxML blackbox網頁(RAxML 7.2.7；網址：http：//embnet.vital-it.ch/raxml-bb)來分析比對完成的序列，以搜尋最近似的系統發生樹。儲存所獲得到系統發生樹，並運用Adobe®Illustrator®CS3圖形設計軟體繪製成圖。
最可能的系統發生樹建構於第2圖，其樹形與宋等人所發表的文獻(Sung,et al.,Mol.Phylogenet.Evol.44,p.1204-1223(2007))非常一致，而且台灣冬蟲夏草這個物種位於線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)此一分支，而非位於蟲草科(Cordycipitaceae)或狹義麥角菌科(Clavicipitaceae s.s.)此二分支。同理，本案所建構的系統發生樹顯示，台灣冬蟲夏草和西藏冬蟲夏草的關係緊密，而蛹冬蟲夏草則位於蟲草科。據此，本案所揭露的台灣冬蟲夏草分離株與習知台灣冬蟲夏草分離株在系統發生上屬同一分支，屬於同一物種。而且，依據本案所建構的系統發生樹，台灣冬蟲夏草的學名應由原先的Cordyceps formonsana修改成為Ophiocordyceps formosana。
實例6：蟲草萃出物的製備和HPLC分析
以下各實例中所使用的蛹冬蟲夏草的菌絲體和子實體是得自於台灣慕求生技股份有限公司。西藏冬蟲夏草的菌絲體和子實體
則購自於北京同仁堂國藥有限公司。台灣冬蟲夏草分離株的菌絲體得自於實例2。
運用一具均質機在1300rpm的運轉速度下將經乾燥的蟲草樣品加以粉碎，並在室溫下儲存於控濕型乾燥器中，以供後續進行高性能液相層析(日立D-2000型HPLC管理系統)，分析這些蟲草樣品中的次生代謝物(de novo secondary metabolites)。蟲草萃出物是依據下文所敘述的標準作業流程進行製備。簡單來說，在一個50毫升Falcon®離心管(購自於美國Becton Dickinson and Company)中，以固體相對於溶劑的比例為1：40的條件，使1克蟲草粉末溶入去離子水中，並施以振盪30秒。接著，使50℃熱水迴流2小時來進行萃取作業(前30分鐘另施加超音波振盪)。經過在4000rpm(約3200×g)下加以離心20分鐘後，收集上清液，並藉由0.22微米孔徑的濾器進行過濾。所得到的萃出物可直接進行HPLC分析，或是儲存在-20℃下供實例7至10的後續實驗之用。
高性能液相層析是在RP-18管柱(150252 Purospher® STAR RP-18 endcapped(5μm)LiChroCART® 250-4；Merck)中進行，流速為每分鐘1毫升。流動相的組成為20%甲醇/H2O。D-甘露醇、腺苷和蟲草素等三種成份是在260nm下運用二極體陣列感測儀(DAD detector)進行檢測。結果顯示於第3A-3F圖。
如第3A-3F圖所示，本案所揭台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的化學總成與西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草極為類似，意味著本案所揭台灣冬蟲夏草分離株的生化特性理應
與習知的廣義蟲草屬物種/分離株相似。此外，將各蟲草萃出物樣品的HPLC圖譜中對應於D-甘露醇、腺苷和蟲草素標準品的波峰面積加以測量，以就D-甘露醇、腺苷和蟲草素等三種蟲草特有代謝物的含量進行比較(r2>0.999)，結果顯示於下表2。表2的數據指出，本案所揭台灣冬蟲夏草分離株也含有與習知的廣義蟲草屬物種/分離株相當甚至略高的代謝物含量。
實例7：細胞培養和MTT分析
MTT分析是用於測量蟲草萃出物在抑制人類癌細胞增殖上的能力。在每個井孔含有200微升培養基的96井孔培養皿中，每一井孔中接種約5×103個細胞，經過24小時後再進行處理。經暴露於
各種濃度的指定蟲草萃出物歷時96小時後，加入20微升噻唑藍溴化四唑(MTT；購自於美國密蘇里州Sigma-Aldrich Corp.，型錄編號：M2128)溶液，並將細胞加以培育4小時。運用一具光譜儀(SpectraMax® 190 UV-Vis Microplate,Molecular Devices,USA)測量570nm下的吸光值來測定細胞增殖情形。此測量重覆三次。細胞存活百分率是以下式計算而得：(樣品OD570nm/空白試樣OD570nm)×100(%)。
在本實例中，使用參照實例6所載流程所製得的台灣冬蟲夏草分離株的菌絲體、西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的熱水萃出物，以不同濃度來處理各式各樣的人類癌細胞株，例如A549肺癌細胞株、MDA-MB-231乳癌細胞株、Huh7肝癌細胞株和HL-60白血病細胞株。如第5A圖所示，台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的萃出物(標註為OFMY)成功地展現出顯著的癌細胞抑制能力，且對於A549細胞具有1.0毫克/毫升的半抑制濃度(IC50)、對於MDA-MB-231細胞具有0.53毫克/毫升的IC50、對於Huh7細胞具有0.44毫克/毫升的IC50，以及對於HL-60細胞具有0.19毫克/毫升的IC50。相較於西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的菌絲體萃出物(OSMY和CMMY)所得到的抑癌活性，台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的萃出物(OFMY)展現出更強的癌細胞抑制效果。而且，其抑制所有受測癌細胞株的能力甚至與西藏冬蟲夏草的子實體萃出物(OSMY)相當。各蟲草萃出物在抗癌活性上的IC50值如下表3所示。
本案發明人又意外地發現，相較於其他蟲草萃出物，台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的萃出物對於正常細胞，包括HCEC正常人類角膜上皮細胞和MCF10A正常人類乳腺上皮細胞(購自於美國典型培養物保藏中心(ATCC))，展現出最低的毒性(細胞存活率超過90%)，如第5B圖所示。特別值得注意的是，人類角膜上皮細胞對於毒性物質和刺激性物質極為敏感，經常被使用來檢驗物質的毒性，而本實例顯示，台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的萃出物對於人類角膜上皮細胞完全不具毒性。此外，小鼠以每公斤體重5克的用量餵食以台灣冬蟲夏草菌絲體14天後，犧牲小鼠並觀察其組織/器官切片，並沒有發現任何明顯損傷或生化變化(數據未揭示)。本實例的結果指出，本案所揭台灣冬蟲夏草分離株可以在不對正常細胞造成傷害的情況下，選擇性地抑制癌細胞的增殖，故相較於習知蟲草具有更高的藥用潛力。
實例8：DPPH抗氧化分析
藉由以激烈手段混合等量的蟲草萃出物和2,2-二苯基苦基肼水合物(2,2-diphenyl-picrylhydrazyl hydrate；DPPH)溶液(0.1mM，配於甲醇中)，將DPPH自由基加以清除。接著在室溫下培育
50分鐘，再於517nm下運用一具光譜儀(SpectraMax® 190 UV-Vis Microplate,Molecular Devices,USA)進行檢測。清除活性是藉由比較僅含有DPPH和溶劑的空白試樣(設定為100%)來進行測定。清除活性百分率是以下式計算：(樣品OD517nm/空白試樣OD517nm)×100(%)。
如第5A圖所示，相較於西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的菌絲體萃出物(分別標註為OSMY和CMMY)，本案所揭台灣冬蟲夏草分離株的菌絲體的熱水萃出物(OFMY)明顯展現出更為優越的抗氧化能力。而且，如第5B圖所示，其抗氧化能力甚至與西藏冬蟲夏草的子實體萃出物(OSFB)相當。
實例9：活性氧(ROS)清除分析
在一個12井孔培養皿中，每一井孔中接種約5×104個CHO-K1細胞(購自於美國典型培養物保藏中心(ATCC))，並在16小時血清飢餓處理後，再暴露於指定蟲草萃出物，歷時1小時。在本實例中，以10mM N-乙醯半胱胺酸處理做為正對照組。以H2O2(1800M)處理5分鐘後，在暗室條件下使細胞與螢光探針CM-H2DCFDA(美國加州Invitrogen公司)共同培育於一個37℃培育箱中。最後，以胰蛋白酶處理細胞使細胞脫離培養皿，再運用一具BD FACSCantoTM流式細胞儀(購自於美國B.D.Biosciences)在525nm下檢測二氯螢光素(DCF)的位準，進而推算出活性氧的含量。
如第5C圖所示，相較於西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草
的菌絲體萃出物(分別標註為OSMY和CMMY)，本案所揭台灣冬蟲夏草分離株的菌絲體的熱水萃出物(OFMY)明顯展現出更為優越的抗氧化能力。值得注意的是，其抗氧化能力亦與西藏冬蟲夏草和蛹冬蟲夏草的子實體萃出物(OSFB和CMFB)相當，如第5D圖所示。
實例10：裸鼠腫瘤動物模型
為了進一步研討台灣冬蟲夏草的抗腫瘤生成活性，本實例建立了一個異種移植小鼠模型(xcnograft mouse model)。經由皮下注射，將5×106個MDA-MB-231人類乳癌細胞接種在9隻10週齡裸鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl)的左大腿內。10天後，腫瘤已長大到可藉由以手觸摸而察覺其存在，隨即開始灌食處理。將這些裸鼠分成三組，分別灌食以1倍量台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的熱水萃出物(濃度為25毫克/毫升，每日灌食100微升；以1×OFMY標示組別)、5倍量台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815的熱水萃出物(濃度為125毫克/毫升，每日灌食100微升；以5×OFMY標示組別)，以及對照組(僅灌食100微升PBS)。每隔4日測量並記錄腫瘤尺寸，即腫瘤尺寸=0.4×腫瘤長度×(腫瘤寬度)2，其結果顯示於第6A圖。處理20天以後，將腫瘤的影像照相留存，如第6B圖所示。
從第6A和6B圖可以觀察到，相較於對照組，1×OFMY組和5×OFMY組以劑量相依方式降低了腫瘤的尺寸，這證實了台灣冬蟲夏草分離株O.formosana MUCHO 815能夠於活體內展現出優
越的抗腫瘤生成活性。
雖然本發明已被詳細描述於說明書中，但在本發明精義和範圍內的各種修改和變化對於本領域具有通常知識者而言屬於明顯。基於前述的揭露內容，相關技術中的知識以及在發明背景和發明的詳細敘述中所討論到的參考文獻的揭露內容完全地被納入於此作為參考。
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
中華民國食品工業發展研究所、104年01月16日、BCRC 930172
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
德國國家微生物菌種保藏中心(DSMZ)、104年01月28日、DSM 32000
<110> 慕求生技股份有限公司
<120> 台灣冬蟲夏草分離株及其用途
<160> 序列識別號之數目：6
<210> 序列識別號：第1號
<211> 序列長度：20
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的RPB1基因
<400> 序列：1
<210> 序列識別號：第2號
<211> 序列長度：23
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的RPB1基因
<400> 序列：2
<210> 序列識別號：第3號
<211> 序列長度：20
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的RPB2基因
<400> 序列：3
<210> 序列識別號：第4號
<211> 序列長度：20
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的RPB2基因
<400> 序列：4
<210> 序列識別號：第5號
<211> 序列長度：23
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的EF1-α基因
<400> 序列：5
<210> 序列識別號：第6號
<211> 序列長度：23
<212> 序列類型：DNA
<213> 生物體：人工序列
<220> 特徵：
<223> 用於PCR擴增台灣冬蟲夏草的EF1-α基因
<400> 序列：6
Claims (13)
- 一種台灣冬蟲夏草(Ophiocordyceps formosana)分離株，其是以BCRC 930172的寄存編號被寄存在中華民國食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)，以及以DSM 32000的寄存編號被寄存在德國國家微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen；DSMZ)。
- 一種冬蟲夏草組成物，其包含如申請專利範圍第1項之台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物，任擇地包含有一可接受之賦形劑。
- 如申請專利範圍第2項的冬蟲夏草組成物，其中所述台灣冬蟲夏草分離株的水性萃出物是藉由將台灣冬蟲夏草的菌絲體加以粉碎，以水性溶劑進行萃取，再去除固體部分而製備出來。
- 如申請專利範圍第3項的冬蟲夏草組成物，其中所述水性溶劑是選自於由水、具有1至4個碳原子的低級醇類和彼等之組合所組成的群組。
- 如申請專利範圍第4項的冬蟲夏草組成物，其中所述以水性溶劑進行萃取是以溫度為40-60℃的熱水迴流萃取台灣冬蟲夏草的菌絲體，歷時30分鐘至12小時。
- 一種冬蟲夏草組成物，其包含如申請專利範圍第1項之台灣冬蟲夏草分離株的乾燥粉碎顆粒，任擇地包含有一可接受之賦形 劑。
- 一種台灣冬蟲夏草的用途，其供用於製造一用來在一個體中治療活性氧相關性疾病的醫藥品，其中所述活性氧相關性疾病是選自於由白內障、糖尿病、阿茲海默症、心臟病、發炎、癌症、雄性不孕性、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化症、帕金森氏症和老化所組成的群組；以及其中所述台灣冬蟲夏草為申請專利範圍第1項所載台灣冬蟲夏草分離株。
- 如申請專利範圍第7項的用途，其中所述台灣冬蟲夏草分離株所呈現的形式是申請專利範圍第2-6項中任一項所載之台灣冬蟲夏草組成物。
- 如申請專利範圍第7項的用途，其中所述活性氧相關性疾病是癌症。
- 如申請專利範圍第9項的用途，其中所述癌症是選自於由肺癌、肺部、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宮頸癌、食道癌、膀胱癌、胰臟癌、腦癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、皮膚癌、遺傳性和散發性乳突腎細胞癌、黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、神經纖維瘤、間皮細胞瘤和骨肉瘤、淋巴癌、白血病和多發性骨髓瘤所組成的群組。
- 如申請專利範圍第10項的用途，其中所述癌症是選自於由肺癌、乳癌、肝癌和白血病所組成的群組。
- 一種保健食品，其包含申請專利範圍第2-6項中任一項所載之台灣冬蟲夏草組成物。
- 一種台灣冬蟲夏草的用途，其供用於製造一用來在一個體中清除活性氧的組成物，其中所述台灣冬蟲夏草為申請專利範圍第1項所載台灣冬蟲夏草分離株。
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