KR20070121073A - 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법 - Google Patents

베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명의 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법은, 뽕잎을 건조한 후, 분쇄하여 뽕잎분말을 제조하는 제1공정, 제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음, 배양하여 배양물을 제조하는 제2공정, 제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 제2공정의 배양물을 접종한 다음, 배양하여 배양액을 제조하는 제3공정, 곡류를 준비한 후 제1공정에서 제조한 뽕잎분말과 곡류를 1 ~ 3 : 100 중량비로 혼합하여 곡류배지를 제조하는 제4공정, 곡류배지 100 g 당 제3공정의 배양액 3 ~ 10 ㎖를 상기 곡류배지에 접종한 다음, 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하는 제5공정으로 구성된다.
본 발명에 의해, 뽕잎을 이용하여 목질진흙버섯균사체를 단시간에 대량 생산할 수 있는 배양방법을 제공되며, 최적의 배양조건을 통해 베타-글루칸의 함량이 높은 목질진흙버섯균사체가 제공된다.
뽕잎, 목질진흙버섯균사체, 곡류배지,베타-글루칸

Description

베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법{THE CULTIVATION METHOD OF PHELLINUS LINTEUS MYCELLIA HAVING HIGH BETA-GLUCAN CONTENT}
도 1은 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법도.
본 발명은 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법에 관한 것이다.
베타-글루칸은 포도당이 베타(β)-1,3 화학결합을 중심으로 중합된 다당류를 일컫는 용어로써, 곡류의 표피, 버섯의 균사체와 자실체, 효모의 세포벽, 박테리아의 세포외 다당체에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 면역세포의 활성화, 항암작용, 체지방 감소 및 콜레스테롤 저하효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 베타-글루칸을 함유하고 있는 버섯으로는 목질진흙버섯이 있는데, 이는 원래 뽕나무의 고목에 자생하므로, 목질진흙버섯균주를 손쉽게 구하기 어려울 뿐만 아니라, 구한 목질진흙버섯균주가 목질진흙버섯균주인지 구별하기가 어렵기 때문에 일반인들이 생산하기에는 더욱 어려운 문제점이 있다.
또한, 목질진흙버섯을 배양할 시, 배양배지로 톱밥배지, 맥아추출물배지, 펩톤배지 등이 흔히 사용되고 있으나, 이러한 배지에서는 잘 배양되지 않아 대량생산이 어려운 실정이다.
따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 아래와 같은 다양한 연구가 시행되고 있다.
한국공개특허공보 제10-206-0008341호(코팅 녹차잎을 함유한 곡류 배지에서의 상황버섯 균사체속성 배양법)에는, 현미, 보리쌀, 밀쌀과 같은 전분질로 이루어진 곡류에 일정량의 yeast extract 코팅처리된 녹차잎을 첨가함으로써 섬유질과 공극률을 높여주며, 이를 통해 상황버섯 균사체의 배양기간을 단축시키고, 상황버섯 특유의 색상인 황색 ~ 노란색의 색이 더욱 진하게 나타날 뿐만 아니라, 상황버섯 특유의 면역증가물질인 베타글루칸 함량을 증가시키는 영양학적으로 우수한 품질의 차별성을 부각한 기능성 상황버섯 균사체의 생산방법에 관한 것이 공개되어 있다.
그러나, 상기와 같은 발명은 녹차잎을 코팅시키는 번거로움이 발생되며, 베타글루칸 함량을 증가시켰다고는 하나, 정확한 함유량이 기재되어 있지 않으며, 단지 고유 상황버섯보다 1.5 배 증가되었다고 기재되어 있어, 그다지 많은 양이 증진되었다고 볼 수 없다.
한국공개특허공보 제10-2004-0024757호(곡물을 이용한 상황버섯 균사체의 속성배양 방법)에는, 곡물류에서 상황버섯 균사체가 원활하게 생육할 수 있도록 곡물에 포도당 등의 촉진제를 혼합하여 배지조성을 조절하여 속성으로 배양시킬 수 있 도록 하는 상황버섯 균사체 속성배양방법에 관한 것이 공개되어 있다.
한국등록특허공보 제10-0393254호(상황버섯 속성 배양배지 및 이를 이용한 상황버섯 균사체속성 배양방법)에는, 상황버섯의 배양배지 성분으로서 참나무로부터 추출한 참나무즙액을 첨가함으로써 상황버섯 균사체의 배양 기간을 단축시킴과 동시에 단시간 내 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.
그러나, 상기와 같은 발명은 상황버섯 균사체의 배양기간을 단축화하고 단시간내 대량생산을 목적으로 발명한 것으로써, 상황버섯이 함유하는 베타-글루칸의 함량이 얼마나 증진되어 있는지는 언급되어 있지 않아, 그 효과가 다름을 알 수 있다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 뽕잎을 이용하여 목질진흙버섯균사체를 단시간에 대량 생산할 수 있는 배양방법을 제공하려는 목적이 있다.
또한, 최적의 배양조건을 통해 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체를 제공하려는 목적도 있다.
본 발명은 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명의 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법은, 뽕잎 을 건조한 후, 분쇄하여 뽕잎분말을 제조하는 제1공정, 제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음, 배양하여 배양물을 제조하는 제2공정, 제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 제2공정의 배양물을 접종한 다음, 배양하여 배양액을 제조하는 제3공정, 곡류를 준비한 후 제1공정에서 제조한 뽕잎분말과 곡류를 1 ~ 3 : 100 중량비로 혼합하여 곡류배지를 제조하는 제4공정, 곡류배지 100 g 당 제3공정의 배양액 3 ~ 10 ㎖를 상기 곡류배지에 접종한 다음, 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하는 제5공정으로 구성된다.
본 발명의 주재료인 목질진흙버섯(Phellinus linteus)은 담자균류 민주름버섯목 진흙버섯과로써, 상황버섯의 일종이다
상황버섯은 항암효과가 뛰어나며, 면역력 증강에 뛰어난 효능이 있다고 알려져 있다.
상황버섯은 뽕나무, 상수리나무, 참나무, 소나무 줄기에서 자라나며, 그 중 유전자 분석에 의하여 산뽕나무에서 자라는 버섯은 유일하게 목질진흙버섯이라고 한다.
또 다른 주재료인 뽕잎은 뽕나무(Morus)의 잎으로써, 난상 원형 또는 긴 타원상 원형이며, 3 ~ 5 개로 갈라지고, 길이가 10 cm로서, 가장자리에 둔한 톱니가 있으며, 통상적으로 누에를 기르는데 이용되고 있다.
본 발명은 상기와 같이 뽕나무에서 자라는 목질진흙버섯의 특징을 이용하여 뽕잎을 분말상태로 제조하여 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 이 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종하여 순수 목질진흙버섯균사체를 획득하였으며, 그렇게 자란 목질진흙버섯균사체를 또다시 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지에 접종하여 배양할 시, 단기간에 쉽게 목질진흙버섯균사체를 배양할 수 있었다.
이때, 베타-글루칸의 함유량을 최대로 획득할 수 있는 최적의 배양조건을 알아내기 위해 수차례 연구해오던 결과, 고체 상태의 배지 100 ㎖ 당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 5 ~ 10 일간 배양하여 배양물을 제조하며, 액체 상태의 배지 100 ㎖ 당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 상기 배양물을 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 3 ~ 5 일간 배양하여 배양액을 제조한 후, 뽕잎분말과 곡류를 1 ~ 3 : 100의 중량비로 혼합하여 곡류배지를 제조한 다음, 곡류배지 100 g 당 상기 목질진흙버섯균사체배양액 3 ~ 10 ㎖를 곡류배지에 접종한 다음, 100 ~ 1000 Lux, 20 ~ 32 ℃에서 10 ~ 25 일간 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하면 뽕잎분말에 의해 곡류가 가지고 있는 공극률이 높아지므로써, 목질진흙버섯균사체가 곡류에 쉽게 침투할 수 있어서, 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체가 배양될 수 있었다.
본 발명은 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법에 대하여 설명하면 다음과 같다.
1. 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체의 배양방법
1) 뽕잎분말 제조
뽕잎을 건조한 후, 분쇄하여 뽕잎분말을 제조한다.
뽕잎을 분쇄할 시, 뽕잎분말의 입자크기가 0.1 ~ 10 mm의 크기가 되도록 분쇄하는 것이 바람직하다.
2) 배양물 제조
상기 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음 배양하여 배양물을 제조한다.
이때, 뽕잎분말이 고체 상태의 배지 100 ㎖당 4 g 이상 첨가될 시, 배양되는 목질진흙버섯균사체의 직경이 뽕잎분말 3 g 첨가될 때와 큰 차이점을 나타내지 않으므로, 비용적인 면을 고려할 때, 고체 상태의 배지 100 ㎖당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 목질진흙버섯균사체 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 5 ~ 10 일간 배양하여 배양물을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 입자크기가 0.1 ~ 1.0 mm인 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비하는 것이 바람직하다.
3) 배양액 제조
상기 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 배양물을 접종한 다음 배양하여 배양액을 제조한다.
이때, 뽕잎분말이 액체 상태의 배지 100 ㎖당 4 g 이상 첨가될 시, 배양되는 목질진흙버섯균사체의 수율이 뽕잎분말 3 g 첨가될 때와 큰 차이점을 나타내지 않아, 비용적인 면을 고려할 때, 액체 상태의 배지 100 ㎖당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 제2공정의 배양물을 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 3 ~ 5 일간 배양하여 배양액을 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 입자크기가 0.1 ~ 1.0 mm인 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지를 준비하는 것이 바람직하다.
4) 곡류배지 제조
곡류를 준비한 후, 뽕잎분말과 곡류를 1 ~ 3 : 100의 중량비로 혼합하여 곡류배지를 제조한다.
이때, 곡류로는 현미, 쌀, 옥수수, 보리, 밀, 율무, 수수, 콩 중 선택된 1 종을 사용한다.
또한, 입자크기가 1.0 ~ 10 mm인 뽕잎분말을 사용하여 곡류배지를 제조하는 것이 바람직하다.
이는, 곡류배지의 공극률을 높여줌으로써 산소공급이 원활히 이루어져 배양기간이 단축되는 효과를 갖게 한다.
5) 목질진흙버섯균사체 배양
곡류배지 100 g 당 배양액 3 ~ 10 ㎖를 상기 곡류배지에 접종한 다음, 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양한다.
이때, 100 ~ 1000 Lux, 20 ~ 32 ℃에서 10 ~ 25 일간 배양하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양 1
뽕잎을 준비한 후, 건조시킨 다음, 분쇄기로 건조된 뽕잎을 분쇄하여 뽕잎분말을 제조하였다.
YMA 배지(yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g, Agar 1.8 g, distill water 96.1 ㎖, pH 5.0)에, 입자크기가 0.2 mm인 뽕잎분말이 3 g 첨가된 배지를 121 ℃, 20 분간 멸균한 후 고체 상태의 배지를 준비하였다.
자연산 상황버섯에서 직접 분리하여 목질진흙버섯균사체(한국미생물보존센터에 의뢰하여 분류번호 BPL의 ITS-5.8S rDNA sequence를 분석한 결과, Phellinus linteus와 100 %의 유사성을 나타냄)를 준비한 후, 상기 고체 상태의 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종하여 26 ℃에서 10 일간 배양하여 배양물을 제조하였다.
YMB 배지(yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g, distill water 97.9 ㎖, pH 5.0)에, 입자크기가 0.2 mm인 뽕잎분말이 3 g 첨가된 액체 상태의 배지 100 ㎖를 121 ℃, 20 분간 멸균 한 후 준비하였다.
상기 액체 상태의 배지에 배양물을 접종하여 200 rpm, 1.0 vvm, 26 ℃에서 5 일간 배양하여 배양액을 제조하였다.
현미를 준비한 후, 증류수에 현미 300 g을 넣어 35 ℃에서 24 시간동안 침지시킨 후, 건져내어 물기를 제거한 후, 입자크기가 10 mm인 뽕잎분말 3 g과 혼합하 여 곡류배지를 제조하였다.
제조된 곡류배지 300 g에 배양액 20 ㎖를 넣고 접종한 다음, 800 Lux, 26 ℃에서 25일간 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하였다.
<실시예 2> 본 발명의 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양 2
실시예 1과 같은 방법으로 배양하되, 곡류배지 제조시 뽕잎분말 6 g을 넣고 혼합하여 목질진흙버섯균사체를 배양하였다.
<실시예 3> 본 발명의 베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양 3
실시예 1과 같은 방법으로 배양하되, 곡류배지 제조시 뽕잎분말 9 g을 넣고 혼합하여 목질진흙버섯균사체를 배양하였다.
<비교예 1> 목질진흙버섯균사체 배양 1
YMA 배지(yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g, Agar 1.8 g, distill water 96.1 ㎖, pH 5.0)를 121 ℃, 20 분간 멸균한 후 고체 상태의 배지를 준비하였다.
자연산 상황버섯에서 직접 분리하여 목질진흙버섯균사체를 준비한 후, 상기 고체 상태의 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종하여 26 ℃에서 10 일간 배양하여 배양물을 제조하였다.
YMB 액체 상태의 배지(yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g, distill water 97.9 ㎖, pH 5.0) 100 ㎖를 121 ℃, 20 분간 멸균한 후 준비하였다.
상기 액체 상태의 배지에 배양물을 접종하여 200 rpm, 1.0 vvm, 26 ℃에서 5 일간 배양하여 배양액을 제조하였다.
현미를 준비한 후, 증류수에 준비한 현미를 넣어 35 ℃에서 24 시간동안 침지시킨 후, 건져내어 물기를 제거하였다.
상기 침지시켰던 현미 300g에 배양액 20 ㎖를 넣고 접종한 다음, 800 Lux, 26 ℃에서 25일간 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하였다.
<실험예 1> 배양물제조시 뽕잎의 함유량에 따른 균사체 직경 측정
1. 재료준비
완전히 건조된 뽕잎을 0.2 mm 크기로 분쇄하여 뽕잎분말을 준비하였다.
YMA 고체배지를 제조하기 위해, yeast extract, malt extract, glucose, peptone, Agar를 준비하였다.
자연산 상황버섯에서 직접 분리하여 목질진흙버섯균사체를 준비하였다.
2. 실험방법
준비된 배지 조성물 yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g, Agar 1.8 g을 300 ㎖짜리 삼각플라스크에 넣은 후, 총 100 ㎖가 되도록 삼각플라스크에 증류수를 넣은 다음 뽕잎분말을 0 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 씩 각각 넣어 고체배지를 제조하였다.
이렇게 제조된 각각의 고체배지에 목질진흙버섯균사체를 접종한 후, 26 ℃에서 10 일간 배양하였다.
3. 실험결과
10 일이 지난 후, 배양된 고체배지를 꺼내어 균사체의 직경을 측정하였다.
그 결과, 아래의 표 1에 나타내었다.
<표 1> 뽕잎의 첨가량에 따른 균사체 직경측정
뽕잎의 첨가량(g) 균사체의 직경(mm)
0 38.0
1 45.0
2 51.2
3 52.3
4 52.5
상기 표 1에 나타나 있듯이, 뽕잎이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 배지를 비교한 결과, 목질진흙버섯균사체가 생육할 시, 뽕잎이 첨가된 배지에서 더 잘 자람을 알 수 있었다.
또한, 뽕잎의 첨가량이 3 g 일때와 4 g일때를 비교한 결과, 목질진흙버섯균사체의 생육정도가 비슷함을 확인하여, 본 발명에서 사용되는 뽕잎의 첨가량이 1 ~ 3 g이 가장 적합함을 알 수 있었다.
<실험예 2> 배양액제조시 뽕잎의 함유량에 따른 균사체 수율 측정
1. 재료준비
완전히 건조된 뽕잎을 0.2 mm 크기로 분쇄하여 뽕잎분말을 준비하였다.
YMA 액체배지를 제조하기 위해, yeast extract, malt extract, glucose, peptone을 준비하였다.
자연산 상황버섯에서 직접 분리하여 목질진흙버섯균사체를 준비하였다.
2. 실험방법
준비된 배지 조성물 yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, glucose 1 g, peptone 0.5 g을 300 ㎖짜리 삼각플라스크에 넣은 후, 총 100 ㎖가 되도록 삼각플라스크에 증류수를 넣은 다음 뽕잎분말을 0 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 씩 각각 넣어 액체배지를 제조하였다.
이렇게 제조된 각각의 고체배지에 상기 실험예 1에서 뽕잎분말이 3 g첨가된 고체배지에서 배양된 목질버섯균사체를 접종한 후, 200 rpm, 26 ℃에서 5 일간 배양하였다.
3. 실험결과
5 일이 지난 후, 배양된 액체배지를 꺼내어 균사체의 수율을 측정하였다.
이때, 전체 균사체 함량(dry cell weight)으로 수율을 측정하기 위해 배양된 배양액을 원심 분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
상등액은 제거하고 남은 침전물로 균사체 수율을 측정하였다.
그 결과, 아래의 표 2에 나타내었다.
<표 2> 뽕잎의 첨가량에 따른 균사체 수율측정
뽕잎의 첨가량(g) 균사체 수율(g/ℓ)
0 5.7
1 8.1
2 12.8
3 13.3
4 13.5
상기 표 2에 나타나 있듯이, 액체배양에서도 고체배지와 마찬가지로 뽕잎이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 배지를 비교한 결과, 목질진흙버섯균사체가 생육할 시, 뽕잎이 첨가된 배지에서 더 잘 자람을 알 수 있었다.
또한, 뽕잎의 첨가량이 3 g 일때와 4 g일때를 비교한 결과, 목질진흙버섯균사체의 수율이 비슷함을 확인하여, 본 발명에서 사용되는 뽕잎의 첨가량이 1 ~ 3 g이 가장 적합함을 알 수 있었다.
<실험예 3> 본 발명에 의해 배양된 목질진흙버섯균사체가 함유하고 있는 베타-글루칸 함량 측정
1. 재료준비
실시예1, 2, 3에서 배양된 목질진흙버섯균사체를 준비하였다.
비교예 1에서 배양된 목질진흙버섯균사체를 준비하였다.
총 30일간 배양을 하였으며, 균사체가 곡류배지에 활착하는 시점인 10 일째부터 5일 간격으로 각각의 목질진흙버섯균사체를 채취하여 베타-글루칸 함량을 측정하였다.
이때, 뭉쳐있는 균사체를 각각 70 ℃에서 48 시간동안 건조시켜 수분함량이 10 % 이하가 되도록 만들었다.
건조된 균사체는 뭉쳐져 있으므로, 파쇄기로 파쇄한 후, 후드믹서에 넣고 1 분동안 회전시켜 균사체 분말을 얻었다.
상기 얻어낸 각각의 균사체 분말들을 각각 증류수에 넣고 100 ℃에서 2 시간 씩 2 회 열수추출한 후, 상등액은 제거하고 열수추출물만을 회수하였다.
이 열수추출물은 진공농축한 후, 농축된 양의 3 배의 95 % 에탄올을 넣고 24 시간동안 방치한 후, 3000 rpm에서 30 분간 원심 분리하였다.
이와 같이 얻어진 추출물을 다시 증류수에 녹여서 분자량 8000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 4 일간 투석한 후 -70 ℃에서 동결건조하여 준비하였다.
2. 실험방법
베타-글루칸의 측정은 Megazyme β-glucan assay kit(Megazyme International Ireland Ltd., Ireland)를 이용하여 Total glucan을 구한 후, α-glucan 값을 빼서 구하였다.
각각의 0.5 ㎜ 크기 이하의 균사체 분말 100 ㎎에 1.5㎖ hydrochloric acid (37% v/v)을 첨가 후, 내용물을 잘 섞어준 다음, 30 ℃에서 60분 동안 15분 간격으로 베타-글루칸이 녹아 나올 수 있도록 잘 섞어주었다.
전분 및 단백질 성분이 효과적으로 변성, 제거시키기 위해 증류스 10 ㎖씩을 첨가한 후 2 시간 동안 끓는 물(100℃)에 방치하였다.
그 후, 실온에서 내용물을 식힌 후, 2N KOH를 첨가하여 pH를 맞추고, 200 mM sodium acetate buf(pH 5.0)로 희석하였다.
희석된 내용물은 원심분리를 통해 상층액을 얻은 후, 각각의 상층액 100 ㎕에 exo-1,3-β-Glucanase (100 U/mL) + β-Glucosidase(20 U/mL) 용액을 100 ㎕씩첨가하여 1 시간 동안 40 ℃에서 방치하고, glucose determination reagent 3㎖을 첨가한 후 40 ℃에서 20 분 동안 방치하였다.
그 다음, 510 nm에서 흡광도를 측정하여 총 글루칸(total glucan) 값을 얻었다.
또한, 알파-글루칸(α-glucan)값은 각각의 현미분말 100 ㎎에 2M KOH 2 ㎖를 넣고, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 ice/water bath에서 20 분 동안 섞어준 후, 1.2M sodium acetate buf(pH3.8) 8 ㎖를 첨가하였다.
또한 Amyloglucosidase (1630 U/mL) plus invertase(500 U/mL)용액을 200 ㎕ 첨가한 후, 40 ℃에서 30분 동안 방치하고, 200mM sodium acetate buf(pH 5.0)을 이용하여 희석하였다.
그 다음, glucose determination reagent 3 ㎖를 첨가한 후 20 분 동안 40 ℃에서 방치하였다.
그 후, 510nm에서 흡광도를 측정하여 알파-글루칸(α-glucan) 값을 얻었다.
베타-글루칸의 값은 아래의 식을 통해 얻어내었다.
베타-글루칸(β-glucan) = Total glucan - α-glucan
3. 실험결과
각각의 균사체 분말이 함유하고 있는 베타-글루칸의 수율을 배양기간 10일째부터 5일간격으로 측정하여 아래의 표 3에 나타내었다.
<표 3> 베타-글루칸 수율측정(%)
배양일수
10 일 15 일 20 일 25 일 30 일
비교예 1 1.0 1.6 2.0 2.2 2.3
실시예 1 2.9 5.9 9.1 9.4 9.6
실시예 2 3.1 10.1 16.1 16.4 16.6
실시예 3 3.3 10.5 16.5 16.7 16.9
상기 표 3에 나타나 있듯이, 배양일수가 20 일째, 뽕잎분말이 첨가하지 않은 비교예 1보다 뽕잎분말이 6 g 첨가된 실시예 2에서 약 8배 높은 베타-글루칸 함량이 측정됨을 알 수 있었다
또한, 뽕잎분말의 양을 달리하여 첨가한 실시예1, 2, 3을 비교해 보면, 뽕잎분말의 양이 증가됨에 따라 베타-글루칸의 함량이 월등히 높아짐을 알 수 있었다.
그리고 실시예 2와 실시예 3을 비교하여 보면 그렇게 큰 차이점을 나타내지 않았으므로, 뽕잎의 양을 9 g 이하로 첨가한 배지를 사용하여 목질진흙버섯균사체를 배양하는 것이 경제적으로도 가장 적합하며 베타-글루칸 함량도 가장 높음을 알 수 있었다.
또한, 베타-글루칸 함량을 통하여 목질진흙버섯균사체의 활착이 10 일부터 이루어지기 시작하여 25 일까지 균사체가 생육 됨을 알 수 있었다.
<실험예 4> 본 발명에 의해 배양된 목질버섯균사체가 함유하고 있는 식이섬유 함량 측정
1. 재료준비
실시예1, 2, 3에서 배양된 목질버섯균사체를 준비하였다.
비교예 1에서 배양된 목질버섯균사체를 준비하였다.
총 30일간 배양을 하였으며, 10 일째부터 5일 간격으로 각각의 목질버섯베양체를 채취하여 식이섬유 함량을 측정하였다.
이때, 뭉쳐있는 균사체를 각각 70 ℃에서 48 시간동안 건조시켜 수분함량이 10 % 이하가 되도록 만들었다.
건조된 균사체들은 뭉쳐져 있으므로, 분쇄기로 분쇄한 후, 후드믹서에 넣고 1 분동안 회전시켜 균사체 분말을 제조하였다.
상기 제조된 각각의 균사체 분말들을 각각 증류수에 넣고 100 ℃에서 2 시간씩 2 회 열수추출한 후, 상등액은 제거하고 열수추출물만을 회수하였다.
이 열수추출물은 진공농축한 후, 농축된 양의 3 배의 95 % 에탄올을 넣고 24 시간동안 방치한 후, 3000 rpm에서 30 분간 원심 분리하였다.
이와 같이 얻어진 추출물을 다시 증류수에 녹여서 분자량 8000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 4 일간 투석한 후 -70 ℃에서 동결건조하여 준비하였다.
2. 실험방법
상기 균사체 분말을 각각 1.0 g씩 400㎖의 비커에 넣고, 이에 MES/TRIS용액 40 ㎖씩을 가하여 마그네틱 교반으로 충분히 분산시켰다.
이에 내열성 α-아밀라제용액 50㎕를 가하고, 서서히 저어 혼합하고, 알루미늄으로 뚜껑을 한 후, 100℃에서 15 분간 계속 교반하였다.
25 분간 유지시킨 후, 반응이 끝나면 수욕조에서 꺼내어 60 ℃로 식히고 프로테아제 용액 100 ㎕씩을 첨가하고 뚜껑을 한 후 60 ℃에서 계속 교반하면서 30 분간 항온시켰다.
그 후, 뚜껑을 제거하고 0.561N 염산용액 5 ㎖를 가하고 흔들어 혼합하고 60 ℃에서 pH를 4.5로 조정하였다.
이에 아밀로글루코시다제용액 300 ㎕를 넣고 흔들어 섞은 후 뚜껑을 한 후 60 ℃에서 30 분간 교반을 유지하며 항온시켰다.
총식이섬유의 정량은 상기 용액들 각각에 60 ℃의 95 % 에탄올 225 ㎖를 가하였다.
수욕에서 비커를 꺼내어 실온에 1 시간 방치하여 침전시켰다.
미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78 % 에탄올 15 ㎖를 가하여 분산시킨 후 흡입 여과하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 하였다.
이에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어 넣어주었다.
잔사는 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 15 ㎖씩 2회 씻었다.
아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 빼었다.
또한, 하나의 여과기 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 하고, 또 다른 하나의 여과기 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분량을 구하였다.
검체를 제외한 공시험을 하여 아래의 식에 따라 총식이섬유의 함량을 구하였다.
* 식이섬유 함량 계산식
공시험값 B(㎎) = 공시험평균잔사무게(㎎)-PB-AB
PB : 공시험 단백질량(㎎)
AB : 공시험 회분량(㎎)
식이섬유함량(%) = (검체의 평균잔사 무게(㎎)-P-A-B)/검체의 평균 무게(㎎)×100
P : 단백질량(㎎)
A : 회분량(㎎)
B : 공시험값(㎎)
3. 실험결과
배양 20 일째 각각의 균사체 분말이 함유하는 식이섬유함량을 측정하여 아래의 표 4에 나타내었다.
배양일수
20 일
비교예 1 3.2
실시예 1 14.6
실시예 2 25.7
실시예 3 26.1
상기 표 4에 나타나있듯이, 뽕잎분말의 첨가량을 달리하여 배양된 실시예 1, 2, 3을 비교하여 보면, 농도가 증가할수록 식이섬유 함량이 월등히 높아지는 것을 알 수 있다.
비교예 1인 뽕잎분말이 첨가되지 않은 비교예 1보다 뽕잎이 첨가된 실시예 2에서 약 8배 높은 식이섬유를 함유하고 있음을 알 수 있고, 베타-글루칸 수율측정에서 나타낸 결과와 유사하게 나타남을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 의해 배양된 목질진흙버섯균사체는 식품, 가곡식품, 식품첨가제로 사용될 뿐만 아니라, 면역세포의 활성화, 항암작용, 체지방 감소 및 콜레스테롤 저하효과가 있는 의약품 개발에 매우 유용하게 쓰일 수 있으며, 대량으로 생산하여 일반인들이 쉽고, 저렴하게 구입가능함을 알 수 있었다.
본 발명에 의해, 뽕잎을 이용하여 목질진흙버섯균사체를 단시간에 대량 생산할 수 있는 배양방법이 제공된다.
또한, 최적의 배양조건을 통해 베타-글루칸의 함량이 높은 목질진흙버섯균사체가 제공된다.

Claims (6)

  1. 목질진흙버섯균사체의 배양방법에 있어서,
    뽕잎을 건조한 후, 분쇄하여 뽕잎분말을 제조하는 제1공정,
    제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음, 배양하여 배양물을 제조하는 제2공정,
    제1공정에서 제조한 뽕잎분말이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 배지에 제2공정의 배양물을 접종한 다음, 배양하여 배양액을 제조하는 제3공정,
    곡류를 준비한 후 제1공정에서 제조한 뽕잎분말과 곡류를 1 ~ 3 : 100 의 중량비로 혼합하여 곡류배지를 제조하는 제4공정,
    곡류배지 100 g 당 제3공정의 배양액 3 ~ 10 ㎖를 상기 곡류배지에 접종한 다음, 배양하여 목질진흙버섯균사체를 배양하는 제5공정으로 구성된,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제2공정의 배양물 제조시, 고체 상태의 배지 100 ㎖ 당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 고체 상태의 배지를 준비한 후, 목질진흙버섯균사체를 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 5 ~ 10 일간 배양하여 배양물을 제조하는 것이 특징인,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양방법.
  3. 제1항에 있어서,
    제3공정의 배양액 제조시, 액체 상태의 배지 100 ㎖ 당 뽕잎분말 0.5 ~ 3 g이 포함된 액체 상태의 배지를 준비한 후, 제2공정의 배양물을 접종한 다음, 20 ~ 32 ℃에서 3 ~ 5 일간 배양하여 배양액을 제조하는 것이 특징인,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양방법.
  4. 제1항에 있어서,
    제5공정의 목질진흙버섯균사체 배양시, 100 ~ 1000 Lux, 20 ~ 32 ℃에서 10 ~ 25 일간 배양하는 것이 특징인,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양방법.
  5. 제1항에 있어서,
    제4공정의 곡류배지 제조시, 곡류로 현미, 쌀, 옥수수, 보리, 밀, 율무, 수수, 콩 중 선택된 1 종을 사용하는 것이 특징인,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체 배양방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 배양된,
    베타-글루칸 함량이 높은 목질진흙버섯균사체.
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