KR100597950B1 - 버섯균사체를 이용한 항산화제 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 버섯균사체를 이용한 항산화제 생산방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 뽕나무 분말 및 대두박을 유효성분으로 포함하는 버섯액체배지에 버섯균사체를 배양하고, 버섯균사체 배양액을 여과하여 여액을 수득하는 것을 포함하는 항산화제 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 항산화제는 활성산소에 의하여 유발되는 산화를 억제할 수 있는 제제로 사용할 수 있다.

버섯균사체, 항산화제

Description

버섯균사체를 이용한 항산화제 생산방법{METHOD OF PREPAREING ANTIOXIDANT BY USING MUSHROOM MYCELIUM}

도 1은 뽕나무 및 소나무가루가 첨가된 배지에서 배양한 신령버섯균사체 배양물의 항산화력을 나타낸 그래프이고,

도 2는 뽕나무 및 소나무가루가 첨가된 배지에서 배양한 상황버섯균사체 배양물의 항산화력을 나타낸 그래프이고,

도 3은 5종의 버섯균사체(신령버섯, 느타리버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯, 눈꽃동충하초버섯)를 배양배지에서 배양한 배양물의 항산화력을 배양배지에 따라 비교한 그래프이고,

도 4는 각 버섯균사체 배양물 중에서 뽕나무 분말이 함유된 배지-1에서 배양하여 수득한 시료간의 항산화력을 비교한 것이고,

도 5는 5종의 버섯균사체를 배양배지에 따라 배양한 배양물의 말론알데하이드 (MA) 생성 억제능을 배지별로 비교한 것이고,

도 6은 뽕나무 분말이 함유된 배지-1에서 배양하여 수득한 5종의 버섯균사체 배양물의 MA 생성 억제능을 비교한 것이고,

도 7은 느타리버섯균사체 배양물을 용매로 분획하는 과정을 간략하게 나타낸 것이고,

도 8은 버섯균사체 배양물의 각 분획물을 1일간 반응시켜 측정한 MA 생성량을 나타낸 것이고,

도 9는 느타리버섯균사체 배양물의 TLC 패턴을 나타낸 것이고,

도 10은 느타리버섯균사체 배양물의 TLC에서 Rf 0.43 밴드의 UV 흡광도 패턴을 나타낸 것이고,

도 11은 느타리버섯균사체 배양물의 TLC에서 Rf 0.43 밴드의 IR 스펙트럼 패턴을 나타낸 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 버섯균사체를 이용한 항산화제 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화력이 우수한 항산화제를 제조하여 이를 자동산화 및 활성산소에 의하여 유발되는 산화를 억제하는 제제로 이용하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

버섯균사체는 고사된 나무에 기생하여 생육하면서 매우 다양한 세포외 효소를 분비하여 자체 생장을 위한 영양분을 조달하는 고등균류로서, 자연에는 식용 가능한 버섯균이 많이 생육하고 있다.

식품으로서의 버섯은 독특한 향기와 맛, 영양가치 때문에 널리 상용되고 있다. 식용버섯의 대표적인 종류는 목이버섯, 흰목이버섯, 싸리버섯, 꾀꼬리버섯, 능이버섯, 갓버섯, 송이버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 팽나무버섯, 맛버섯, 비늘버섯, 배젖버섯 및 기와버섯 등이다. 식용버섯의 조성분은 수분이 70∼95 %이며 5∼30 %가 유기 및 무기성분으로 되어 있다. 건물(乾物) 중에는 15∼30 %의 단백질, 2∼10 %의 지방과 50 % 내외의 가용성 무질소물이 들어 있고, 5∼10 %의 조섬유와 칼륨, 인산, 석회 등의 무기질이 함유되어 있다.

최근에는 버섯이 항암, 콜레스테롤억제, 미백 등의 약리학적 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀지면서, 약용가치 또한 매우 높게 판단되고 있다. 버섯균사체를 배양하여 이러한 활성성분을 생성할 수 있다. 버섯을 인공 재배하고자 하는 시도가 각 버섯의 생육조건에 따라 다양한 방법으로 시도되어 확립되어가고 있다. 인공재배 방법들 중 버섯균사체를 액체배양하는 경우, 계절에 영향을 받지 않을 수 있으며 값싸게 대량생산이 가능할 뿐만 아니라 원료공급이 용이하여 산업화가 쉬운 장점이 있다.

한편, 산소는 안정한 분자상태인 기저삼중합산소(ground state triplet oxygen)가 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼 (superoxide radical), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, HO·), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중합산소(singlet oxygen)와 같은 반응성이 매우 큰 활성산소(active oxygen)로 전환되면 식품의 산화 또는 생체에 치명적인 산소독성을 일으킨다. 이들 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대 하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 노화 등의 생리적 변화나 암, 관절염, 당뇨 등의 광범위한 생체 현상에 관여하여 직접 또는 간접적으로 생체의 장애를 일으키는 원인으로 알려져 있다.

항산화제에 대한 연구는 1969년 맥코드와 프리도비가 수퍼옥사이드 라디칼을 소거하는 효소인 SOD(superoxide dismutase)를 발견한 것을 계기로 본격적으로 진행되었다. 이후 항산화제 연구는 식품 첨가물로서의 항산화제 개발을 위한 연구에서 노화억제 및 질병치료제로서의 항산화제를 찾는 연구로 전환되고 있는 실정이다.

지금까지 개발되어 사용되고 있는 항산화제로는 BHT(tert-butyl- hydroxy toluene), BHA(tert-butylhydroxyanisol) 등과 같은 합성 항산화제, 토코페롤, 아스코르빈산, 카로테노이드, 플라보노이드, 탄닌 등과 같은 천연 항산화제 및 SOD, 카탈라아제, 글루타티온 등과 같은 항산화 효소가 있다. 하지만 이들 항산화제는 독성, 저활성 및 용도의 한계성 등의 여러 가지 문제로 인하여 사용에 제한을 받고 있다. 따라서 보다 안전하면서도 강한 항산화제를 천연물 또는 미생물 대사산물로부터 개발하고자 하는 노력이 절실히 요구된다.

본 발명은 버섯균사체를 이용하여 항산화제 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 버섯균사체 액체배양시 사용될 수 있는 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 이용하여 천연 항산화제를 수득하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 뽕나무 분말 및 대두박을 유효성분으로 포함하는 버섯액체배지에 버섯균사체를 배양하고, 버섯균사체 배양액을 여과하여 여액을 수득하는 것을 포함하는 항산화제 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 생산방법으로 제조된 항산화제를 제공한다.

또한 본 발명은 뽕나무 분말 및 대두박을 유효성분으로 포함하는 항산화력 증강용 버섯액체배지를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 항산화성 화합물 또는 이를 포함하는 물질을 버섯액체배지에 첨가하여 항산화력 증강용 버섯액체배지를 제조하는 단계, (b) 상기 항산화력 증강용 버섯액체배지에 버섯균사체를 배양하여 배양액을 수득하는 단계 및 (c) 상기 배양액을 여과하여 여액을 수득하는 단계를 포함하는 버섯대사를 이용한 항산화력이 강화된 항산화제 생산방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항산화력 증강용 배지에 버섯균을 배양하여 저독성 천연항산화제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

항산화력 증강용 배지는 통상적인 버섯배양용 액체배지에 뽕나무 분말 및 대두박이 포함된 것이다. 상기 액체배지는 버섯균의 종류에 따라 적절히 사용할 수 있으며, 액체배지의 일예로는 0.005 내지 0.5 (w/v)%의 MgSO₄, 0.005 내지 0.05 (w/v)%의 KH₂PO₄, 0.1 내지 3 (w/v)%의 설탕 및 잔량의 물을 포함하는 것이다. 가장 바람직한 액체배지는 0.05 (w/v)%의 MgSO₄, 0.05 (w/v)%의 KH₂PO₄, 2 (w/v)%의 설탕 및 잔량의 물이다.

대두박은 0.01 내지 1 (w/v)%로 액체배지에 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 4 (w/v)%이다. 상기 대두박은 효소처리된 것이 더욱 바람직하다.

뽕나무 분말은 뽕나무로부터 유래한 건조물로, 바람직하기로는 뽕나무, 뽕나무 잎 또는 열매를 건조/분쇄한 분말 또는 상기 분말을 용매로 추출한 것이다. 더욱 바람직하기로는 뽕나무를 건조/분쇄한 분말이다. 뽕나무 분말은 액체배지에 0.01 내지 20(w/v)%로 포함될 수 있다. 뽕나무 분말의 함량이 0.01 (w/v)% 미만인 경우 버섯균사체 배양물로부터 수득할 수 있는 천연항산화제의 수율이 매우 낮을 수 있으며, 20(w/v)% 초과하는 경우 버섯균사체의 생육을 저해할 수도 있다. 바람직한 뽕나무 분말의 함량은 0.5 내지 5 (w/v)%이다.

본 발명의 버섯균은 식용가능한 버섯의 종균이다. 버섯의 일예로는 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 느타리버섯, 상황버섯 및 눈꽃동충하초버섯이 있다.

버섯을 이용한 저독성 천연항산화제 생산방법은 버섯균사체를 액체배양한 다음 균사체 및 잔사가 제거된 버섯균사체 배양물을 수득하는 것이다. 상기 버섯균사체 배양물은 이후 동결건조나 통상의 건조방법으로 건조형태로 더욱 제조할 수 있으며, 이후 용매 추출을 더욱 실시하여 활성분획으로분리 할 수도 있다.

더욱 구체적인 천연항산화제 생산방법은

(a) 버섯균을 멸균한 항산화력 증강용 배지에 접종하여 1일 내지 14일간 배양하여 버섯균사체 배양액을 수득하는 단계;

(b) 상기 버섯균사체 배양액을 멸균하고 여과하여 여액을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 여액을 건조하여 건조된 버섯균사체 배양물을 수득하는 단계를 포함한다.

상기 (a)단계에서, 배양조건은 버섯마다 바람직한 조건을 채택하는 것이 좋으며, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 느타리버섯, 상황버섯 및 눈꽃동충하초버섯은 발효조(20-27 ℃)에서 1일 내지 14일간 호기 배양할 수 있다. 바람직한 배양기간은 1일 내지 3일이다.

상기 (b)단계에서, 버섯균사체 배양액은 고온 멸균한 다음 여과하여 수득한다.

상기 (c)단계에서, 버섯균사체 배양액의 여액은 동결건조하여 건조시킨다.

상기의 방법으로 제조된 버섯균사체 배양물은 저독성의 항산화력을 나타낸다.

본 발명은 일실시예에서 신령버섯균사체 배양물의 항산화력(도 1), 상황버섯균사체 배양물의 항산화력(도 2), 5종의 버섯균사체 배양물의 항산화력(도 3)을 확인하였다. 과산화물 생성을 측정하여 산출한 항산화력은 버섯에 따라 조금씩 차이가 있었으며, 신령버섯균사체 배양물, 느타리버섯균사체 배양물, 노루궁뎅이버섯균사체 배양물이 상황버섯과 눈꽃동충하초버섯에 비하여 우수한 항산화력을 나타내었 다(도 4). 또한 5종의 버섯균사체로부터 수득한 배양물은 2차적인 산화 역시 억제하였다(도 5-6).

본 발명의 버섯균사체 배양물은 용매로 더욱 추출하여 항산화성 분획으로 분리된다. 상기 용매는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로, 층분리방법으로 분획을 실시할 수 있다. 간략한 층분리방법은 도 7에 나타낸다. 또한 항산화성 분획은 이후 크로마토그래피 등의 통상의 물질분리방법으로 더욱 실시하여 활성 화합물로 수득 가능하다.

일실시 예로, 느타리버섯균사체 배양물, 상기 배양물의 물분획 및 상기 배양물의 부탄올분획을 각각 TLC, UV 흡광도 측정 및 IR 스펙트럼을 실시하였다. 상기 결과로부터 동정한 화합물은 글루코시드 길이가 다른 이소플로본의 당화된 형태이거나 이소플로본의 생물학적으로 전환된 화합물인 것으로 추정되며, 다양한 방법을 통하여 동정 가능하다.

본 발명의 버섯균사체 배양물 또는 상기 배양물의 용매분획물은 약제 또는 식품으로 사용하여 활성산소의 산화력으로 인하여 야기되는 질병을 예방 및 치료하는 목적으로 활용할 수 있다.

이에, 버섯균사체 배양물 또는 상기 배양물의 용매분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화성 조성물을 제공한다. 상기 항산화성 조성물은 버섯균사체 배양물 또는 상기 배양물의 용매분획물을 단독으로 포함할 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다. 항산화성 조성물은 경구 또는 비 경구용으로 사용할 수 있으며, 제형은 사용목적에 맞게 적절히 조절할 수 있다. 제형의 일예로는 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유제, 현탁제, 정제, 주사제, 캅셀제 및 환제가 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 배지 제조

1-1. 실험방법

가. 버섯균주

본 실험에 사용된 버섯균주는 표 1과 같다.

No	한국명	생물명
1	신령버섯	Agaricus blazei (AB)
2	노루궁뎅이버섯	Hericicum erinacium (HE)
3	잣버섯	Lentinus lepideus (LL)
4	눈꽃동충하초버섯	Paecilomyces Japonicus (PJ)
5	상황버섯	Phellinus linteus(PL)
6	느타리버섯	Pleurotus ostreatus (PO)

나. 배지

- PDA 배지: 감자 200 g을 잘게 썰어 100 ℃에서 15분간 삶은 후 실온에서 균질화 하였다. 여기에 황백당 30 g 및 박토-아가 15 g을 각각 첨가하고, 증류수로 최종부피 1 ℓ로 보정한 다음 121 ℃에서 15분간 살균하여 지름 8.9 ㎝의 페트리디쉬에 분주하여 배지로 사용하였다.

- 기본액체배지 : 배지 1 ℓ에는 효소분해 한 대두박 4 g 과 황백당 20 g, MgSO₄ 0.5g, KH₂PO₄ 0.5 g으로 조성되어 있다.

-실험군:

배지 1 - 기본액체배지 3 ℓ에 뽕나무 분말 1% (w/v)을 첨가하였다.

배지 2 - 기본액체배지 3 ℓ에 소나무 분말 1% (w/v)을 첨가하였다.

배지 3 - 기본액체배지 3 ℓ에 뽕나무 분말 0.5% (w/v)와 소나무 분말 0.5% (w/v)를 첨가하였다.

다. 배양조건

각 배지들은 121 ℃에서 20분간 고압 멸균한 후 표 1에 기재한 5종의 버섯균을 각각 접종하고, 5 ℓ 용량의 발효조(코바이오텍, 인천)에서 일정기간 배양하였다.

1-2. 실험결과

가. 균주의 생육조사

버섯균을 PDA를 깐 페트리디쉬에 접종하고 3, 7, 10, 14일 간 배양 (25 ℃ 배양기) 하면서 생육정도를 관찰하였다.

표 2는 버섯 균주의 PDA 배지에서의 생육정도를 확인하여 그 결과를 나타낸 것이다.

버섯균주	배양기간(일)
	3	7	10	14
AB (신령)	10.3±1.5*	32.0±1.5	51.2±0.3	78.3±0.4
HE (노루궁뎅이)	15.4±1.2	32.3±1.0	56.5±0.1	82.3±1.2
LL (잣)	12.0±0.1	15.0±0.1	61.0±0.4	85.2±0.1
PJ (눈꽃동충하초)	18.3±1.5	34.5±2.0	85.7±0.1	89.0**
PL (상황)	13.0±1.0	20.0±0.1	43.3±0.3	81.0±0.2
PO (느타리)	17.5±1.2	48.3±1.5	87.0±0.4	89.0
*: 균사생장길이 (mm), **: 균사가 완전히 페트리디쉬를 덮음

표 2에서, 버섯균 중 PDA 배지에서 가장 생육이 빠른 균주는 눈꽃동충하초, 느타리버섯으로, 배양 7일 후 균사생장의 직경이 각각 34.5, 48.3 ㎜이었으며, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 잣버섯, 상황버섯은 32.3 내지 15.0 ㎜이었다. 배양 10일째 눈꽃동충하초와 느타리버섯은 배지의 대부분에 걸쳐 생육하였고, 나머지 균사체들은 43.3 내지 61.0 ㎜까지 생장하다가 배양 14일 경에는 대부분의 균주가 완전히 생육하여 PDA 배지 전체를 덮었다.

나. 버섯균사체의 액체배양

버섯균을 액체배지(기본배지 및 배지 1 내지 3)에서 7일간 배양하고 원심분리(10,000 rpm, 10 min) 한 후 균사체 배양액과 버섯균사체를 분리하여 균사체 무게를 측정하였다(표 3).

버섯	균사체 무게 (g/100 ㎖)
	기본배지	배지 1	배지 2	배지 3
AB (신령)	2.73	7.24 (4.51)*	3.96 (1.23)	4.95 (2.22)
HE (노루궁뎅이)	1.24	5.94 (4.70)	2.57 (1.33)	4.45 (3.21)
LL (잣)	1.60	7.06 (5.46)	2.41 (0.81)	5.32 (3.72)
PJ (눈꽃동충하초)	3.99	6.37 (2.38)	3.23 (-0.76)	4.69 (0.70)
PL (상황)	3.35	8.09 (4.74)	3.38 (0.03)	6.27 (2.92)
PO (느타리)	2.47	6.20 (3.73)	2.78 (0.31)	6.48 (4.01)
*: ( )에 나타낸 숫자는 각 배지에서 수득한 균사체 무게와 기본배지에서 수득한 균사체의 무게의 차이를 나타냄

-기본배지: 버섯균사의 성장은 눈꽃동충하초, 상황버섯, 신령버섯, 느타리버섯, 잣버섯, 노루궁뎅이버섯 순으로 우수하였고, 균사체의 무게는 각각 3.99, 3.35, 2.73, 2.47, 1.60, 1.24 g/100 ㎖ 였다.

-배지 1: 상황버섯균사체의 무게가 8.09 g/100 ㎖으로 측정되어, 균사체의 생장이 가장 우수하였고, 다른 균사체의 성장도 양호하였다.

-배지 2: 균사체의 생장이 기본배지보다는 다소 우수하였지만 배지 1에 비해 선 다소 저조하였다.

-배지 3: 버섯 성장은 버섯균에 따라 약간의 차이는 있었지만 대체적으로 배지 1과 비슷한 경향을 나타내었다.

상기 실험으로부터 배지 2에 첨가한 뽕나무 분말이 버섯 균사의 생장을 현저히 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 버섯균사체 배양물의 항산화력 검증

2-1. 시료 준비

5종의 버섯 균사체를 실시예 1의 방법으로 배양한 다음 121 ℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균물을 여과하여 균사체와 잔사를 제거하고, 여액을 동결건조한 건조물을 시료로 준비하였다.

2-2. 항산화력 검증

상기 (1)에서 생산한 각각 배양물을 실험관 (in vitro) 실험 (리놀렌산 산화억제)을 통하여 자동산화 억제능을 검증하였다.

가. 과산화물 수치(Peroxide value; POV) 측정에 의한 항산화력 검증

티오시아네이트를 이용한 방법(Osawa, T., Namiki, M. A novel type of antioxidant isolated from leaf wax of eucalyptus leaves. Agric. Bilo. Chem. 45: 735-739, 1981)을 기준으로 하고, 하 등(Ha, Y. L., Storkson, J. M., Pariza, M. W. Inhibition of benzo[a]pyrene induced mouse forestomach neoplasia by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid. Cancer Res. 50: 1097-1101, 1990))의 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.

리놀렌산(LA, 275 μmol), LA + 375 nmol BHT, LA + 375 nmol α-토코페롤, LA + 375 nmol 아스코르브산 및 LA + 10 ㎎ 시료(균사체 배양액 동결건조물) 각각을 10 ml의 0.2M 소듐 포스페이트 완충액(pH 8.0), 4.5 ml의 증류수 및 10.5 ml의 HPLC용 에탄올 혼합용액에 녹인 다음 교반 배양기에서 200 rpm으로 40 ℃로 13일간 반응시켰다. 리놀렌산 산화(과산화물 수치)는 암모늄설페이트 제 1철과 암모늄티아시아네이트를 첨가하여 480 nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였으며, 이때 표준물질로 벤조일 페록사이드를 사용하였다.

도 1은 신령버섯균사체 배양물의 항산화력을 나타낸 그래프로, 기본배지(BM), 배지-1(BMM), 배지-2(BPM) 및 배지-3(BMPM)에서 배양하여 수득한 배양물과 그 외 대조군(리노렌산), BHT, 아스코르브산, α-토코페롤의 항산화력을 비교한 것이다.

도 2는 상황버섯균사체 배양물의 항산화력을 나타낸 그래프이다.

신령버섯의 경우, 기본배지보다는 배지-1에서 배양한 동결건조물의 항산화력이 보다 우수하였고, 상황버섯 역시 배지-1에서 배양하여 수득한 동결건조물이 기본배지에서 배양하여 수득한 것에 비하여 현저히 우수한 항산화력을 나타내었다.

도 3은 5종의 버섯균사체(신령버섯, 느타리버섯, 노루궁뎅이버섯, 상황버섯, 눈꽃동충하초버섯) 배양물에서의 항산화력을 배양배지에 따라 비교한 그래프이다. 항산화력은 전반적으로 신령버섯균사체 배양물이 과산화물의 생성을 억제하는데 가장 효과적이었으며, 상황버섯균사체 배양물이 그 효과가 가장 낮았다. 배지조성간에는 뽕나무 분말을 첨가한 배지-1에서 배양한 실험구(BMM)가 대체적으로 우수한 항산화력을 나타내었다.

또한, 각 버섯균사체 배양물 중에서 배지-1에서 배양하여 수득한 시료간의 항산화력을 비교하여 도 4로 나타내었다. 배지-1에서 버섯균사체를 배양한 경우 항산화력은 신령버섯균사체 배양물, 느타리버섯균사체 배양물, 노루궁뎅이버섯균사체 배양물이 다른 상황 및 눈꽃동충하초 버섯균사체 배양물에 비하여 우수하였다.

나. MA 측정에 의한 항산화력 검증

시료를 시간에 따라 반응시킨 다음, MA의 함량을 측정하였다 (Writte, V. C., Krausw, G. F., Bailey, M. E. J. Food Sci. 35: 582, 1970). MA는 산화과정에서 2차적으로 생성되는 산화물질로 산화정도를 파악할 수 있은 중요한 지표이다.

0.5 ㎖의 시료를 함유한 시험관에 1 % 인산 3 ㎖과 0.6 % 티오바르비튜릭산(thiobarbituric acid; TBA) 용액 1 ㎖을 첨가하고, 볼텍스에서 10초간 2회 현탁시킨 후 끓는점의 수조(boiling water bath)에서 45분간 반응시키고 실온으로 냉각시켰다. 여기에 부탄올 4 ㎖을 첨가하여 10초간 강하게 흔들어 추출한 후 원심분리(2,000 rpm, 3분)하였다. 부탄올 층을 535 ㎚의 흡광도에서 측정하여 표준곡선으로부터 MA값을 측정하였다. 표준곡선은 1,1,3,3,-테트라-메톡시프로판{말론알데하이드 비스[디메틸 아세탈], MA}를 2, 4, 6, 8, 10 nmol 농도로 조제하여 시험관에 취하고 시료와 동일한 조건으로 수행하여 표준곡선을 수득한 후 이를 토대로 항산화력을 계산하였다.

도 5는 5종의 버섯균사체 배양물의 MA 생성 억제능 측정에 사용한 배지 종류에 따라 나타낸 그래프이고, 도 6은 배지-1에서 배양하여 수득한 5종의 버섯균사체 배양물의 MA 생성 억제능을 나타낸 그래프이다. 도 5에서 볼 때, 배지의 종류에 따라 MA 생성 억제능은 차이가 있었으며, 신령버섯균사체 배양물과 노루궁뎅이버섯균사체 배양물이 그 외 버섯균사체 배양물보다 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 그리고 배지 종류별로는 뽕나무 분말이 첨가된 배지-1(BMM)가 버섯균사체의 항산화력을 증진시키는 효과가 있었다. 또한, 도 6에서는 배지-1에서 배양하여 수득한 버섯균사체 배양물들간의 항산화력을 비교한 것으로, 신령버섯과 노루궁뎅이버섯이 보다 우수한 항산화력을 나타내었다.

실시예 3: 버섯균사체 배양물로부터 항산화성 분획 분리

가. 버섯 균사체 배양물의 용매별 분획물 제조

도 7에 나타낸 버섯균사체 배양물을 분획하였다. 버섯균사체 배양물은 배지-1에서 3일간 배양한 것을 사용하였다.

수득한 각 분획물(헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물분획)은 각 용매를 제거하고 건조물 형태로 준비하였다. 각 분획의 중량은 하기 표 4에 나타낸다.

시료	분획 (g/100 solid)
	헥산	클로로포름	에틸아세테이트	부탄올	물
신령버섯균사체 배양물	1.75	1.35	0.52	7.54	88.84
느타리버섯버섯균사체 배양물	0.61	1.38	0.90	4.24	92.87
노루궁뎅이버섯버섯균사체 배양물	0.80	0.83	1.18	7.38	89.81
눈꽃동충하초버섯버섯균사체 배양물	1.67	0.35	0.62	4.64	92.72
상황버섯버섯균사체 배양물	0.51	0.61	0.80	9.92	88.16

버섯균사체 액체배양으로부터 얻은 고형물에 함유된 화합물은 대부분 물분획에 포함된 수용성 물질이었고, 다음으로 부탄올 가용성 물질이었다.

나. 각 분획별 항산화력 검증

버섯균사체 배양물의 조추출물 및 분획물을 in vitro 실험 (Fenton-type reaction)을 통하여 자유 라디컬 소거효과를 확인하였다.

펜톤 방법(Kim, B. J., Kim, J. H., Kim, H. P., Heo, M. Y. International J. Cosmetic Sci. 19: 299-307, 1997)으로 시료별 MA 함량을 측정을 하였다. 배양배지(2 % SDS, 1 μM 염화제1철, 0.5 mM 과산화수소) 4.90 ㎖에 각 시료를 30 ㎎/100 ㎕로 첨가하고, 여기에 25 μM의 리놀렌산을 첨가하여 55 ℃에서 일정시간 반응시켰다. 이후 각 시료별 MA를 측정하여 하기 표 5에 나타낸다.

시료		MA(nmol/25 μM LA, 평균±오차)
		1일 배양	3일 배양	6일 배양
대조군		43.11 ± 13.44	35.95 ± 4.03	38.02 ± 0.537
비교군	아스코르빈산	5.82 ± 4.36	10.08 ± 0.655	18.58 ± 1.327
	α-토코페롤	4.99 ± 0.62	9.953 ± 0.558	16.42 ± 0.619
	BHT	2.47 ± 1.94	1.156 ± 0.559	3.381 ± 0.457
신령버섯	조추출물(배양물)	29.39 ± 6.91	36.34 ± 1.033	30.15 ± 2.1
	물분획	25.52 ± 7.15	36.18 ± 3.608	31.48 ± 3.94
	부탄올분획	28.78 ± 0.6	30.82 ± 5.644	33.5 ± 2.587
느타리버섯	조추출물	10.39 ± 6.91	39.4 ± 5.777	33.23 ± 2.771
	물분획	12.56 ± 7.15	38.69 ± 1.439	33.44 ± 1.126
	부탄올분획	22.43 ± 0.6	24.6 ± 2.727	30.11 ± 1.986
노루궁뎅이버섯	조추출물	14.74 ± 6.91	36.33 ± 3.437	29.94 ± 2.759
	물분획	23.7 ± 7.15	36.05 ± 2.454	28.24 ± 1.956
	부탄올분획	27.58 ± 0.6	36.23 ± 3.917	35.57 ± 4.367
상황버섯	조추출물	12.65 ± 6.91	34.22 ± 0.664	32.76 ± 1.809
	물분획	20.38 ± 7.15	39.04 ± 3.269	31.41 ± 2.278
눈꽃동충하초	조추출물	12.85 ± 6.91	32.7 ± 1.574	31.59 ± 3.446
	물분획	16.31 ± 7.15	32.04 ± 3.811	24.27 ± 2.76

표 5에서, 신령버섯균사체 배양물의 경우 BHT, α-토코페롤, 아스코르빈산에 비하여 다소 낮았으나, MA 생성을 억제하였다. 또한 대조구에서는 1일 배양시에 MA의 생성이 최대에 도달하였고, 아스코르빈산과 α-토코페롤은 6일간 계속 산화가 진행되고 있었으며, 산화 정도는 서로 비슷하였다. 그러나 신령버섯배양물의 각 분획은 산화를 1일부터 3일까지는 증가시켰고, 6일에는 감소시켰다. 따라서 버섯균사체 배양물로 항산화 연구를 할 경우 1일간 반응시켜 MA를 측정하는 것이 가장 적당하였다. 그 이유는 대조구의 MA생성이 1일에 최대가 되고 그 이후에는 감소가 되기 때문에 시료의 항산화력 측정을 위해서는 1일 동안 반응시키는 것이 가장 타당하다고 할 수 있다. 그 외 느타리버섯균차체 배양물, 노루궁뎅이버섯균사체 배양물, 상황버섯균사체 배양물 및 눈꽃동충하초버섯균사체 배양물에서도 유사한 결과가 확인되었다.

도 8은 버섯균사체 배양물의 각 분획물을 1일간 반응시켜 측정한 MA 생성량을 나타낸 그래프이다(AB-C: 신령버섯 배양물의 조추출물, AB-W: 신령버섯 배양물의 물분획, AB-B: 신령버섯 배양물의 부탄올분획, PO-C: 느타리버섯 배양물의 조추출물, PO-W: 느타리버섯 배양물의 물분획, PO-B: 느타리버섯 배양물의 부탄올분획, PL-C: 상황버섯 배양물의 조추출물, PL-W: 상황버섯 배양물의 물분획, PJ-C: 눈꽃동충하초 배양물의 조추출물, PL-W:동총하초 배양물의 물분획, HE-C: 노루궁뎅이버섯 배양물의 조추출물, HE-W: 노루궁뎅이버섯 배양물의 물분획, HE-B: 노루궁뎅이버섯 배양물의 부탄올분획). 펜톤시약을 이용한 반응에서는 느타리버섯균사체 배양물의 분획(조추출물과 물분획)이 가장 우수한 항산화력을 나타내었고, 상황버섯버섯균사체 배양물의 조추출물, 눈꽃동충하초버섯균사체 배양물 조추출물 순으로 감소된 항산화력이 확인되었다.

실시예 4: 동물실험

4-1. 실험재료

암모늄설페이트 제1철(Fe⁺⁺), NADPH, 아스코르베이트-Na(Asc-Na), 2,2'-아조-비스[이소부티로니트릴](ABIN) 및 쿠멘 하이드로페록시드(CuOOH)는 시그마 사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

4-2. 실험방법

ICR 마우스 암컷을 베타-칩이 깔린 폴리카보네이트 케이지(5 mice/cage)에 넣고 마우스용 펠렛사료로 1주일동안 예비 사육하여 체중이 24 ±1 g인 것을 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였고, 조명은 12시간 간격의 명암주기를 유지하여 자연조명에 가깝게 하였으며, 사육실의 온도는 20±1℃, 습도는 60 %로 하였다.

실시예 3의 시료(100 ㎎/0.2 ㎖ PBS), BHT (5 ㎎/0.2 ㎖ PBS)를 매일 0.2 ㎖을 10일 동안 마우스에 경구 투여하고, 대조구는 PBS만을 경구 투여하였다. 시료 처리 2주 후 마우스를 희생하여 간을 적출하고, 마이크로솜을 분리하였다. 마이크로솜에 산화유도물질(NADPH/Fe⁺⁺, Asc-Na/Fe⁺⁺, CuOOH, ABIN)을 표 6(Unit: ㎖)과 같이 처리한 다음 항산화 효과를 측정하여 표 7(unit: MA nmol/min/g protein)에 나타낸다.

처리	마이크로솜	Tris-HCI1)	Asc-Na2)	NADPH3)	Fe++ 4)	ABIN5)	CuOOH6)
대조구	1	0.5
Asc-Na/Fe++	1		0.25		0.25
NADPH/Fe++	1	0.1		0.15	0.25
ABIN	1					0.5
CuOOH	1						0.5
1) Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris-HCI, pH7.4) : 50 mM. 2) Ascorbate sodium salt (Asc-Na) : 0.5 mM. 3) β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) : 0.2 mM. 4) Ferrous ammonium sulfate (Fe+2) : 1 μM. 5) 2,2'-Azobis[isobutyronitrile] (ABIN) : 40 mM. 6) Cumene hydroperoxide (CuOOH) : 0.1 mM.

처리	지질과산화용 시약
	Asc/Fe++	NADPH/Fe++	ABIN	CuOOH
대조구1)	0.16a2)	0.14a	0.70a	0.87a
BHT	0.05d	0.06bc	0.40c	0.54c
MC3)	0.11c	0.05c	0.52bc	0.69b
느타리버섯 조추출물	0.10c	0.05c	0.48c	0.64bc
느타리버섯 물분획	0.12bc	0.08b	0.57b	0.73ab
느타리버섯 부탄올분획	0.13b	0.08b	0.53bc	0.77ab
1)Treatment without sample. 2)Means followed by the different letter in same column are significantly different (P<0.05) by Duncan's multiple test. 3)MC, Crude mulbery; POC, CrudePleurotus ostreatus; POW, Water fraction ofPleurotus ostreatus; POB, Butanol fraction ofPleurotus ostreatus.

표 7에서, 시료 처리구는 산화유도물질에 따라 다소 차이는 있었으나 대조구에 비하여 우수한 산화억제효과를 나타내었다. 느타리버섯균사체 조추출물의 항산화력은 물분획과 부탄올분획보다 약간 높았다. 이와 같은 결과는 펜톤스 시약 방법에 의한 in vitro의 결과와 유사하였다.

실시예 5: 항산화성 물질의 분리

배지-1에서 배양한 느타리버섯균사체 배양물로부터 항산화성 물질을 분리하고자 하였다. 느타리버섯균사체 배양물에 함유된 물질 중 항산화력과 관련이 있을 것으로 생각되는 물질의 함량을 분석한 결과 표 8과 같다. 배양물에 함유된 주된 물질과 이소플라본의 함량을 분석하였다.

화합물 구성	함량 (g/ℓ)
총 고형물	21.86±3.25
β-D-글루칸	0.87±0.12
총 단백질	2.11±0.42
Crude 지질	0.12±0.08
당단백질	0.77±0.03
당지질	0.15±0.08
이소플라본	Tr1)
1)1.0 mg/ℓ이하

5-1. TLC에 의한 분리

배지-1에서 배양한 느타리버섯균사체 배양물의 건조물을 실리카겔 TLC를 이용하여 분리하였다.

도 9는 느타리버섯균사체 배양물의 TLC 패턴을 나타낸 것으로, 1은 조추출물이고, 2는 물분획, 3은 부탄올분획이다. 각각의 시료에서 Rf 0.62와 0.43의 밴드를 회수하여 UV와 IR 스펙트럼을 분석하였다.

가. Rf 0.43 밴드

도 10은 느타리버섯균사체 배양물을 TLC하였을 때 수득한 Rf 0.43 밴드의 UV 흡광도 패턴을 나타낸 것이다. 최대흡광도는 약 290 nm에서 관찰되었으며, 흡광도의 전 패턴은 이소플라본의 전형적인 흡광도 패턴과 아주 유사하였다.

도 11은 느타리버섯균사체 배양물을 TLC하였을 때 수득한 Rf 0.43 밴드의 IR 스펙트럼 패턴을 나타낸 것이다. 특징적인 흡광도는 648㎝^-1 (medium strong, broad); 956㎝^-1 (weak, sharp); 1043㎝^-1 (weak medium, sharp); 1073 ㎝^-1 (weak medium, sharp); 1380㎝^-1 (weak, broad); 1465.3 ㎝^-1 (weak, broad); 1636.0㎝ ^-1 (strong, sharp); 2091.0㎝^-1 (medium, broad); 2361㎝^-1 (very weak, sharp); 2873.0㎝^-1 (weak, sharp); 2961㎝^-1 (medium, sharp on shoulder of OH absorption ∼3000㎝^-1); 3422 ㎝^-1 (broad OH absorption ∼3000㎝^-1)이었다. 상기 스펙트럼은 디아디젠(diadzein) 또는 게네스테인(genestein)에서 관찰된 스펙트럼과 유사하였다.

따라서 Rf 0.43 밴드는 이소플라본의 아글리콘 형 또는 글루코시드형일 가능성이 높은 것으로 추정되나, 이소플라본이 생물학적으로 전환된 화합물일 가능성도 배제하기 어렵다. 이는 버섯균사체가 다양한 효소를 분비하여 이소플라본의 골격에 작용할 가능성이 있기 때문이다.

나. Rf 0.62 밴드

Rf 0.62 밴드의 IR 스펙트럼과 UV 흡광도 측정 결과 역시 Rf 0.43 밴드의 결과와 비슷하였다.

따라서 이들 두 밴드에 함유되어 있는 UV와 IR 스펙트럼의 분석결과로서는 이소플라본의 글루코시드일 가능성 높은 것으로 추정된다.

다. 환원당 측정

상기 두 밴드의 물질을 가수분해하여 환원당 함량을 측정하였다. 그 결과 두 밴드에서는 상당한 양의 환원당 글루코스가 검출되었다.

따라서, 두 밴드의 물질은 글루코시드를 함유한 이소플로본의 당화된 형태이거나, 즉 디애드진(diadzin) 또는 제네스틴(genestin), 또는 이들 이소플로본이 생물학적으로 전환된 화합물일 것으로 추정된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 저독성 항산화성제 생산방법은 항산화력이 우수한 천연 항산화제를 제조가능하게 하며, 상기 방법으로 제조된 항산화제는 활성산소에 의하여 유발되는 산화를 억제할 수 있는 용도로 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 뽕나무 분말 및 대두박을 유효성분으로 포함하는 버섯액체배지에 버섯균사체를 배양하고, 버섯균사체 배양액을 여과하여 여액을 수득하는 것을 포함하는 것으로서, 상기 버섯액체배지는 0.01 내지 20(w/v)%의 뽕나무 분말, 0.005 내지 0.5(w/v)%의 MgSO₄, 0.005 내지 0.05(w/v)%의 KH₂PO₄, 0.1 내지 3(w/v)%의 설탕, 0.01 내지 1(w/v)%의 대두박 및 잔량의 물을 포함하며, 상기 버섯은 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항산화제 생산방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 생산방법은

   상기 여액을 건조하여 분말화하고;

   상기 분말에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 가하고 층분리하여 항산화성 분획을 수득하는 것을 더욱 포함하는 생산방법.
6. 뽕나무 분말 및 대두박을 포함하는 버섯액체배지에 버섯균사체를 배양하고, 버섯균사체 배양액을 여과하여 여액을 수득하는 것을 포함하는 생산방법으로 제조된 것으로서, 상기 버섯액체배지는 0.01 내지 20(w/v)%의 뽕나무 분말, 0.005 내지 0.5(w/v)%의 MgSO₄, 0.005 내지 0.05(w/v)%의 KH₂PO₄, 0.1 내지 3(w/v)%의 설탕, 0.01 내지 1(w/v)%의 대두박 및 잔량의 물을 포함하며, 상기 버섯은 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항산화제.
7. 0.01 내지 20(w/v)%의 뽕나무 분말 및 0.01 내지 1(w/v)%의 대두박을 유효성분으로 포함하는 버섯액체배지로서, 상기 버섯은 신령버섯, 노루궁뎅이버섯, 및 느타리버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항산화력 증강용 버섯액체배지.
8. 삭제

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