KR101040236B1 - 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물 및 이것의제조방법 - Google Patents

항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물 및 이것의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물 및 이것의 제조방법에 대한 것으로, 특히 베타-카로틴(β-carotein)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 접종하여 배양시키고, 상기 배양시킨 배양물을 증류하여 저분자 물질을 추출함으로써, 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물을 제조하는 것이다. 이렇게 얻어진 버섯균사체배양 추출물은 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하여 폐암세포의 성장을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라, 동일한 양의 베타-이오논(β-Ionone) 자체보다 더욱 우수한 항암 효과를 가진다.
버섯균사체배양 추출물, 베타-이오논, 항암 효과

Description

항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물 및 이것의 제조방법{Extracts of Mushroom Mycelial Liquid Culture Having Anticancer Effect and Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 버섯균사체배양 추출물 추출물에 대한 것으로, 특히 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물 및 이것의 제조방법에 대한 것이며, 더욱 상세하게는 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하여 폐암세포의 성장을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라, 동일한 양의 베타-이오논(β-Ionone) 자체보다 더욱 우수한 항암 효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물에 대한 것이다.
암의 치료는 수술요법, 화학요법 및 방사선 요법이 시행되고 있는데, 수술요법이 가장 좋은 완치법이라고 할 수 있으나, 암의 시기와 종류 및 발생위치에 따라서 치료법의 적용에 한계가 있기 때문에 화학요법이나 방사선 요법과 같은 보조요법이 동원된다. 1940년대부터 암치료에 도입된 화학요법은 암의 시기나 종류에 관계없이, 비교적 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있어서 현재 많은 관심이 집중되고 있으며, 여러 가지 항암화학요법제가 개발되어 있다. 그러나 현재까지 개발된 많은 화학요법제들은 암세포의 저항성과 부작용 때문에 투여에 있어서 제한을 받고 있다.
최근 화학요법제의 이러한 문제점을 해결하기 위하여 항암제 병행요법, 고단위 화학요법 및 방사선요법과 병행하는 방법이 시행되고 있다. 그러나 이러한 방법은 화학요법제의 효과는 증가시킬 수 있으나 부작용이 증가하기 때문에 시행에 있어서 어려운 점이 있다.
시스플라틴은 현재 사용되고 있는 광범위한 항암제 중에서 가장 우선순위로 사용되는 항암제이나, 여러 가지 암의 치료에 이용되고 있는 여러 종류의 암세포에서 시스플라틴에 대한 내성이 나타나서 이의 사용은 그 용량을 증가시켜야 하는 문제점이 있다. 따라서 천연 화학요법제의 항암작용을 증가시키는 제제의 개발은 항암제의 개발과 함께 매우 중요한 연구과제이다.
한편, 버섯은 항균작용, 항암작용 및 면역계 조절작용 등 생리적으로 중요한 여러 가지 작용을 한다고 알려져 있다. 버섯류에서 항암작용을 나타내는 물질이 여러 가지가 알려져 있는데, 이들은 대부분 베타글루칸(β-glucan)이나 렌티난(lentinan) 등의 다당체류이다. 또한, 구름버섯(Coriolus versicolor), 표고버섯(Lentinus edodes), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 영지버섯 등의 자실체의 열수 추출물 이 암세포에 대한 독성작용을 한다는 것이 이미 보고되어 있으나, 이들 버섯류로부터 우수한 항암효과를 가지는 화합물을 대량으로 추출해 내는 기술은 아직 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인체의 폐암세포를 사멸하는 효과를 가지는 다양한 저분자 물질을 스크리닝하여, 항암효과가 현저히 우수한 방향성 저분자 물질을 찾게 되었고, 이를 버섯균사체배양 추출물로부터 간단하고 용이하게 대량으로 추출할 수 있는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하여 폐암세포의 성장을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라, 동일한 양의 베타-이오논(β-Ionone) 자체보다 더욱 우수한 항암 효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물을 제조하는 것이 목적이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법은, 베타-카로틴(β-carotein)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 접종하여 배양시키는 단계; 및, 상기 배양시킨 배양물을 증류하여 저분자 물질(베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 물질)을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 배지는 대두박분해물, 황백당, MgSO47H2O 및 KH2PO4 가 포함된 액체배지인 것이 바람직하고, 상기 버섯균주는 잣버섯 (LL, Lentinus lepideus) 균사체가 포함된 액체 배양물인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 저분자 물질을 추출하는 단계는, 상기 배양물을 고체부분과 액체부분으로 분리하는 단계; 및, 상기 분리한 고체부분과 액체부분 각각을 증류하여 저분자 물질을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 가능하다.
이와 함께, 본 발명의 다른 실시형태로써 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물은, 베타-카로틴(β-carotein)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 배양한 후 증류하여 얻은 저분자 물질로써, 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
상기한 본 발명에 의하는 경우, 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하여 폐암세포의 성장을 억제하는 효과를 가질 뿐만 아니라, 동일한 양의 베타-이오논(β-Ionone) 자체보다 더욱 우수한 항암 효과를 가지는 버섯균주 추출물을 제조할 수 있는 효과가 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법은, 먼저 베 타-카로틴(β-carotene)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 접종하여 배양시키고, 이어서 상기 배양시킨 배양물을 증류하여 저분자 물질을 추출하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명자들은 후술하는 실험예에 기재한 바와 같이 인체의 폐암세포를 사멸하는 효과를 가지는 다양한 저분자 물질을 탐색하였고, 그 중에서도 베타-이오논(β-ionone)의 항암효과가 현저히 우수하다는 것을 확인하였다. 이에 따라 상기 β-ionone을 대량으로 생산하기 위하여 버섯균주를 이용하였고, 상기 버섯균주로부터 β-ionone을 만들어내고자 β-carotene 과 lutein이 포함된 배지를 이용하여 버섯균주를 배양한 것이다.
그런 다음, 이와 같이 배양된 배양물을 증류하여 저분자 물질을 추출하였고, 추출된 저분자 물질이 우수한 항암효과를 가진다는 것을 확인하였다. 상기 배양물로부터 저분자 물질의 추출은 상기 배양물 자체를 증류하여 추출하는 것도 가능하고, 상기 배양물을 고체부분과 액체부분으로 분리한 다음 상기 분리한 고체부분과 액체부분 각각을 증류하여 저분자 물질을 추출하는 것도 가능하다.
이러한 버섯균사체배양추출물의 제조방법에 따라 제조된 추출물은 폐암세포의 성장을 억제하는 우수한 효과를 가지고, 본 발명의 다른 실시형태는 이러한 제조방법에 따라 제조되어 β-ionone을 포함하는 것을 특징으로 하는 버섯균사체배양추출물일 수 있으며, 본 발명의 또 다른 실시형태로써 항암효과를 가지는 버섯균사체배양추출물은, 베타-카로틴(β-carotene)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 배양한 후 증류하여 얻은 저분자 물질로써, 베타-이오논(β-ionone)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실험예 1 : A549 인체폐암 세포 사멸효과가 있는 저분자 방향성 물질의 탐색
실험예 1-1 : 실험방법
A-549 인체폐암 세포 사멸효과가 있는 저분자 방향성 물질을 탐색하기위해 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 DMEM/F-12 배지(Gibco BRL)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 A-549 인체폐암세포를 배양하였다. 탐색에 사용된 저분자 방향성물질은 Aldrich, Inoe, Genyin사로부터 구입한 순도 99%이상의 화합물 117종을 사용하였으며 이를 순수 DMSO에 녹여 1 mg/ml 의 stock 용액으로 제조한 뒤 4℃에 보관하여 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다.
A-549 인체 폐암세포를 culture dish에서 48시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS를 첨가하여 세척하였다. 여기에 0.25% trypsin-EDTA를 첨가하여 37℃에서 3분간 배양하여 세포를 가 culture dish로부터 분리하였다. 분리한 A549 인체 폐암세포를 배지를 사용하여 적정 세포수가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다. 배양한 A549 인체 폐암세포를 24-well plate에 1×04 cells/well로 분주한 후 24시간 배양하고 여기에 방향성 화합물 시료를 10㎍ 씩 각 well에 첨가한 후 37℃, 5% CO2하에서 48시간 다시 배양하였다. 시료처리에 따라 살아있는 세포수는 MTT 방법으로 microplate reader (Anthos Labtech Instruments)로 570nm 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
방향성 화합물을 농도별로 처리하여 세포성장억제 효과를 조사하기 위하여 상기 A549 인체 폐암세포 실험과 같이 화합물을 0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍씩 well에 첨가하여 실험을 수행하였다. 살아 있는 세포는 MTT 방법으로 측정하였다.
실험예 1-2 : 실험 결과
1차 탐색결과 117종 test 화합물중 caryophyllene oxide, β-ionone, t,t-2,4-nonadienal, phenethyl alcohol, -valerolactone, 1-octen-3-ol, 2-octen-1-ol, methyl cinnamate가 높은 세포 성장억제율을 보였다(표 1 참조).
[표 1: A549 인체폐암 세포에 대한 저분자 방향성 물질의 생육억제 효과]
번호 방향성 물질 성장율 (%)
1차 2차 3차
1 Control 100 100 100
2 Caryophyllene oxide 23 23 27,
3 1-Octen-3-one 31
4 2-Octen-1-al 31
5 β-Ionone 20 20 19
6 t,t-2,4- Nonadienal 22 22 23
7 5-Methylfurfural 34
8 Benzaldehyde 34
9 cis-3-Hexen-1-ol 38
10 Phenethyl alcohol 25 35 45
11 2,3,5,6-Tetramethylpyrazine 45
12 d-Dodecalactone 33
13 2-Pentylfuran 34
14 Ethyl myristate 37
15 Ethyl benzoate 33
16 Methional 51
17 2-Pentanone 53
18 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone 51
19 γ- Valerolactone 25 31 26
20 1- octen -3- ol 29 31 29
21 2,3-Pentadione 53
22 2- Octen -1- ol 27 20 26
23 4-cis-Heptenal 55
24 4-Hydroxy-2 54
25 5-dimethyl-3 (2H)-furanone 55
26 1-Octanol, 55
27 Nonanal 54
28 2-Ethyl butyric acid 56
29 Pentanoic acid 58
30 t,t-2,4-Nonadienal 53
31 Methyl cinnanate 30 25 30
32 Phenethyl hexaneate 76
33 Ethyl-3-hydroxyhexanoate 75
34 γ-Octalactone 79
35 Nerol 73
36 Methyl hexanoate 75
37 Ethyl butyrate 72
38 Methyl 2-methyl butyrate 80
39 2,6-dimethyl-5-heptenol 79
40 Nerolidol 49
번호 방향성 물질 성장율 (%)
41 4-(4-hydroxy(phenyl)-2-butane 75
42 cis-3-hexanl 79
43 geranyl acetate 81
44 Allyl hexanoate 74
45 ethyl naltol 76
46 coumarin 69
47 borneol 68
48 4-hydroxy 2,5-dimethyl 3-(2H)-furanone 70
49 Decyl acetate 60
50 Ethyl anthranilate 80
51 allyl cyclo hexane propionte 55
52 allyl octan oate 70
53 Trans-2-hexenal 33
54 gamma-Octalactone 70
55 2-methyl butyl isovalerate 65
56 Delta-Decalactone 68
57 Ethyl cylo Hexane propionate 59
58 piperenyl acetate 60
59 c-3-hexenol 72
60 Ethyl 3-phenyl glycldate 51
61 Gamma-Decalactone 69
62 Butyl valerate 65
63 Allyl cinnamate 65
64 Benzophenone 50
65 phenethyl butyrate 50
66 methyl propionate 52
67 ethyl acetate 40
68 Benzyl isovalerate 50
69 phenethyl acetate 52
70 butyl isovalerate 40
71 benzyl cinnamate 42
72 β-pinene 45
73 (ir)-(+)-α-pinene 40
74 phenethyl acetate 60
75 butyl isovalerate 70
76 benzyl cinnamate 72
77 α-Terpineol 70
78 T-undecalactone 69
79 isobutyl isobutyrate 70
번호 방향성 물질 성장율 (%)
80 Allyl heptanoate 40
81 Citronellal 50
82 Ethyl valerate 54
83 hexyl isobutyrate 52
84 4-(p-rlydroxy phenyl)-2butanone 49
85 isoamyl hexnoate 47
86 ethyl octanoate 50
87 Linalyl acetate 30
88 benzyl benzcate 30
89 ethyl levulinate 50
90 isobutyl hexanoate 51
91 isoamyl acetate 40
92 isoamyl butyrate 30
93 isoamyl propionate 50
94 hexyl acetate 50
95 ethyl isovalerate 50
96 methyl hexanoate 60
97 isobutyl acetate 50
98 hexyl butyrate 52
99 Amyl butyrate 39
100 benzyl acetate 45
101 benzyl butyrate 60
102 butyl butyrate 70
103 butyl heptanoate 59
104 butyisobutyrate 50
105 α-methyl benzyl acetate 48
106 ethyl hexanoate 52
107 citral 48
108 ethyl decanoate 56
109 ethyl isoloutyrate 69
110 cyclohexyl butyrate 46
111 ethyl heptanoate 65
112 Vanila ethyl vinila 68
113 Geraniol 42
114 Ethyl 2-Methylbutyrate 40
115 Hexyl propionate 60
116 Ethyl propionate 50
117 Nerolidol 42
118 Linalool 40
그리고, 1차 screening 시험에서 A549 인체폐암세포에 대하여 세포사멸효과가 있는 β-Ionone을 비롯한 8종 (caryophyllene oxide, β-inone, t,t-2,4-nonadienal, phenethyl alcohol, γ- valerolactone, 1-octen-3-ol, 2-octen-1-ol, methyl cinnamate)의 저분자방향성물질의 세포사멸효과 확인을 위하여 2차 screening 시험 을 실시하였다. 2차 시험에서 1차 탐색시험에서와 동일한 효과를 나타내었으며 각각 23, 20, 22, 35, 31, 31, 20, 25%의 암세포성장율을 나타내었다. 3차 비교 확인시험에서는 각각 27, 19, 23, 45, 26, 29, 26, 30%의 암세포 성장율을 나타냄으로써 반복 시험에서도 동일하거나 높은 암세포성장억제효과를 나타내었다(도 1, 2). 특히, A549 세포성장을 가장 많이 억제시킨 화합물은 β-ionone으로 2차와 3차 시험에서 각각 20%와 19%의 세포성장율을 보임으로써 세포성장억제 효과가 높은 것으로 나타났다. 1-Octen-2-ol과 methyl cinnamate의 경우도 각각 29%, 30%의 세포성장율로 높은 암세포성장억제효과를 나타내었다.
또한, β-Ionone, 1-octen-3-ol, phenethyl alcohol, methyl cinnanate, delta dodecalactone, t,t-2,4-nonadienal, 2-pentyfuran를 농도별 (0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍)로 처리하였을 경우의 세포성장율을 조사한 결과는 도 3 내지 도 9에 나타난 바와 같다. A549 인체폐암세포의 사멸효과가 가장 높은 화합물은 β-Ionone을 농도별(0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍)로 세포성장율이 대조군(100%)에 비하여 93, 83, 73, 19, 9, 7% (도 3)였다. 또한, 1-octen-3-ol은 76, 77, 63, 49, 25, 27% (도 4), phenethyl alcohol은 76, 77, 63, 49, 25, 27% (도 5), methyl cinnamate는 93, 73, 62, 36, 18, 19% (도 6), delta dodecalactone은 92, 85, 78 37 34, 20% (도 7), t,t-2,4-nonadienal은 83, 73, 27, 20, 18% (도 8), 2-pentyfuran은 93, 63, 53, 33, 25% (도 9)의 세포성장율을 나타냄으로써 동일 농도에서 가장 강한 세포성장억제효과를 나타낸 화합물은 β-Ionone이었다.
실험예 2 : 사멸된 폐암세포의 효소활성 및 조직학적 변화 조사
실험예 2-1 : β- Ionone 처리농도에 따른 cell cycle analysis
β-Ionone 처리(0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍)에 의해 자극된 A549 세포 (1×106cells/90mm dish)는 PBS로 세척한 다음 trypsinization시켜 바닥에서 떨어뜨린 후 원심분리 (1,000rpm, 10 min, 4℃)하여 수거하였다. 수거한 세포에 ice-cold 70% EtOH 2 ㎖을 한 방울씩 첨가하여 고정시킨 후 천천히 vortexing하여 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 저장하였다. 고정된 세포는 PBS로 세척한 후 500 ㎖ propidium iodide solution (10 mM Tris pH 8, 1 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 0.7 ㎎/㎖ RNase A, 0.05 ㎎/㎖, PI)을 첨가하여 37℃에서 15분간 배양하였다. Cell apoptosis와 cell cycle analysis는 EPICS Altra flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA)를 이용하여 488 nm에서 측정하였다. 시험결과로부터 β-Ionone 처리농도에 따른 cell cycle analysis를 하였다.
β-Ionone 처리에 의한 폐암세포의 (A-549) apoptosis 유발 정도를 정량적으로 조사하기 위하여 PI염색액을 이용하여 핵을 염색한 후 유세포 분석기를 이용하여 핵 내 DNA 함량을 비교 분석하였고, 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, β-Ionone의 농도가 증가할 수록 apoptosis가 일어난 세포의 빈도에 해당하는 세포주기의 sub- G1기에 속하는 세포의 빈도가 증가됨을 알 수 있었다. 즉 β-Ionone의 처리 농도 의존적으로 sub-G1기가 증가됨을 확인할 수 있다.
실험예 2-2 : β- Ionone 처리농도에 따른 Caspase -3 활성 및 발현 조사
β-Ionone을 처리(0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍)하여 4일 동안 배양한 세포들을 회수하여 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC의 지시에 따라 caspase-3 assay를 실시하였다. Caspase-3의 발현은 Anti-caspase-3를 blotting하여 ECL로 detection하였다.
죽음신호에 의한 단백질의 절단을 통해서 활성화 되는 Caspase의 활성과 발현에 대한 시험결과는 도 11에 나타난 바와 같다. β-Ionone처리에 의한 caspase-3활성이 증가하였다. 인체 폐암세포인 A-549cells에서 β-Ionone은 암세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도하는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실험예 2-3 : β- Ionone 처리농도에 따른 western-blot analysis
β-Ionone을 처리(0.1, 1, 5, 10, 15, 20 ㎍)하여 배양한 세포들을 회수하여 세포를 PBS로 세척을 한 후 모아서 50 mM Tris buffer (pH 7.4) 용액에 protease inhibitor [1.0 mM EDTA, 0.1 uM (2.0 ug/ml) aprotinin, 1uM (0.5 ㎍/㎖) leupeptin, 1 uM (0.7 ㎍/㎖) pepstatin A, 1.0 mM (174 ㎍/㎖) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]를 200 ul을 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이것을 4℃, 10,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 얻어 Bradford법으로 정량하여 protein을 확인하였고 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 전기영동이 끝난 후 gel로부터 단백질을 PVDF membrane으로 옮겨서 transfer하였다. PVDF membrane TTBS로 3회 10분씩 washing 한 후 8% nonfat skim milk에 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. Blocking 후 PVDF membrane을 washing 하고 primary antibody를 처리하여 4℃에서 overnight하였고 secondary antibody (HRP-conjugated)를 상온에서 1시간 동안 처리하고 ECL detection reagents (Amersham, Berkshire, UK)로 감광하여 발현을 확인하였다.
β-Ionone의 농도가 증가할수록 apoptosis유발에 관여하는 Bax protein의 발현은 증가되는 반면 apoptosis억제에 관여하는 Bcl-2 protein의 발현은 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 12). 즉 β-Ionone처리가 Bax 단백질의 발현을 증가시켜서 apoptosis를 유도하는 것을 알 수 있다.
또한, β-Ionone의 처리가 증가할수록 종양억제유전자인 p53의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었는데(도 13), 이는 β-Ionone처리농도가 증가할수록 pro-apoptotic유전자인 p53은 apoptosis에 있어서 apoptotic프로그램을 촉진시키는데 핵심적인 역할을 한 것으로 보여진다.
실시예 1 : 버섯균사체배양 추출물의 제조
상기한 실험예 1, 2에 따라 여러가지 저분자 물질 중에서, β-Ionone의 폐암 세포 사멸효과가 가장 우수하다는 것을 알았고, 이에 따라 본 발명자들은 버섯균주를 이용하여 β-Ionone을 대량으로 추출하고자 하였으며, 결과적으로 β-Ionone 자체보다 더욱 우수한 항암효과를 가지는 저분자 추출물을 제조할 수 있었다.
실시예 1-1 : 버섯균주의 선발
특정 방향성 저분자 화합물 생산을 위해 균사생장속도가 빠르고 목표화합물의 합성이 용이하며 효소분비가 왕성한 균주를 선택하고자 하였고, 신령버섯(Agaricus blazei ), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 동충하초(Paecilomyces japonicus ), 잎새버섯(Grifola frondosa ), 잣버섯(LL, Lentinus lepideus) 등의 여러가지 버섯균사체 중, 잣버섯이 특정 방향성 저분자화합물 생산에 용이하며 균사생장속도가 빠르고 목표화합물의 생성이 용이하며 효소분비가 왕성하다는 것을 확인하였으며, 이에 따라 상기 잣버섯을 선택하여 버섯균주로 사용하였다.
실시예 1-2 : β- Ionone 의 생성을 위한 배양
상기 실시예 1-1에 따라 준비된 잣버섯 균주를 이용하여 β-Ionone을 생성하기 위하여, 먼저 고체배지로 seed 배양을 하였다. 즉, Potato dextrose agar (PDA, Difco사) 39g을 증류수 1L에 녹이고 고압살균 (121℃, 15분)한 다음 8.9 ㎝의 petri dish에 분주하였으며, 상기 실시예 1-1에 따라 준비된 잣버섯 균주를 PDA배지 중앙에 접종하여 low temperature incubator (25℃, 7~14일)에서 배양시킨 후, 균사체가 8.0 ㎝이상 성장한 것을 액체 배양균주로 사용하였다.
한편, 상기 액체 배양균주를 배양하기 위한 배지를 별도로 준비하였다. 이러한 배지는 대두박분해물 0.2%, 황백당 1.2%, MgSO47H2O 0.0375%, KH2PO4 0.0375%가 첨가된 액체배지를 기본으로하고, 여기에 β-Ionone 생성을 위한 전구물질인 β-carotein (0.2%, w/v)과 lutein (0.2%, w/v)을 각각 첨가하여, 본 발명에 따른 잣버섯 균주가 생육하면서 β-Ionone을 생산할 수 있도록 하였다.
즉, 상기 β-carotein과 lutein이 첨가된 배지 300 ㎖을 500 ㎖ 용량의 삼각플라스크에 첨가하고 고압멸균 (121℃, 20분)한 다음 실온에서 충분히 식힌 후, 상기 잣버섯 균사체가 성장된 액체 배양균주(1/4 petri dish)를 지름 5 ㎜이하로 잘게 잘라 접종하고 진탕배양기(120 rpm, 25℃, 5일)에서 배양하였다.
실시예 1-3 : 저분자 물질의 추출과 폐암세포 사멸효과
상기 실시예 1-2에 따라 배양된 배양물을 균사체로 이루어진 고체부분과 배양액으로 이루어진 액체부분으로 분리한 다음, 상기 고체부분과 액체부분 각각으로부터 저분자 물질을 추출하였다.
즉, 상기 실시예 1-2에 따라 배양된 배양물을 여과하여 액체부분과 고체부분으로 분리한 다음, 액체부분의 경우 여과액 300ml를 증류하여 저분자 물질 100mg을 추출 하였고, 고체부분의 경우 균사체 100g(wet weight)에 증류수 200ml을 넣고 증류하여 저분자 물질 100mg을 추출하였다.
그런 다음, 이와 같이 액체부분과 고체부분으로부터 각각 추출한 100mg의 저분자 물질 중 10ug을 test용 시료로 사용하여, 앞선 실험예 1, 2와 같은 방법으로 A549 인체 폐암 세포에 대한 사멸효과를 측정하였다. 그 결과는 도 14에 나타난 바와 같이, 상기 배양물의 고체부분(LL(solid))과 액체부분(LL(liquid))으로부터 각각 추출된 저분자 물질에 따른 암세포의 성장률은 각각 35, 38%로, 폐암세포 성장억제효과가 현저히 우수한 것으로 나타났다.
나아가, 상기한 10ug의 test용 시료 중에 함유된 B-ionone의 함량은 액체부분의 경우 1.20㎍ 였고, 고체부분의 경우 2.93㎍ 였다. 이를 B-ionone 자체의 A549 인체 폐암 세포에 대한 사멸효과와 비교해보면, 상술한 실험예 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, B-ionone 자체만의 농도가 1㎍ 인 경우 폐암 세포의 성장율은 80%에 달하여, 본 발명에 따라 버섯균주에서 추출된 저분자 화합물이 동일한 양의 β-Ionone 자체보다 현저히 우수한 항암 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.
실시예 1-4 : 저분자 물질에 포함된 β- Ionone 확인
참고로, 본 발명에 따른 버섯균주로부터 얻어진 배양물에 β-ionone이 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에 따라 배양된 배양물(고체 부분+ 액체부분) 원액(5 ㎖)과 ether (5 ㎖)를 20 ㎖ screw capped test tube에 넣고 2분간 추출한 다음, 실온에 방치하여 ether층과 물층을 분리시켰다. Pasteur pipette으로 물층을 제거하고 남은 ether층에 sodium sulfate를 뭉치지 않고 서로 분리되는 입자가 있을 때까지 첨가하였다. Ether층으로 추출된 화합물을 GC-MS 분석용 시료로 사용하였다.
Ether로 추출한 화합물을 GC-MS로 분석한 결과, 도 15a 및 15b에 나타난 바와 같이, RT 59.084에서 β-Ionone이 생성되었음을 확인하였다.
GC -MS 분석조건
- GC-MS : Agilnet 6890 series GC system
Agilnet Network Mass selective Detector
- Column : SupelcowaxTM - 10 (60m x 0.32㎜ i.d.)
- The mass spectra were recorded ant an electron energy of 70eV and the ion source temperature was 260℃
- The column was operate with temperature program from 50℃ (hold for 5 min) to 250℃ (hold for 10 min) at 2℃/min
- Helium was used at carrier gas (1㎖/min)
- Injection volume : 1ul (Split ratio: 1:20)
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
상술한 본 발명은 폐암세포의 성장 억제 효과가 종래보다 현저히 우수한 버섯균주 추출물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 caryophyllene oxide, β-inone, t,t-2,4-nonadienal, phenethyl alcohol 저분자 물질의 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 2는 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 γ- valerolactone, 1-octen-3-ol, 2-octen-1-ol, methyl cinnamate 저분자 물질의 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 3은 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 β-inone 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 4는 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 1-octen-3-ol 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 5는 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 phenethyl alcohol 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 6은 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 methyl cinnamate 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 7은 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 delta dodecalactone 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 8은 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 t,t-2,4-nonadienal 의 농도별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 9는 본 발명에 따른 A549 인체 폐암세포에 대하여 2-pentyfuran 의 농도 별 세포사멸효과 결과를 나타내는 그래프이고,
도 10은 본 발명의 실험예 2-1에 따라 β-Ionone 처리에 의한 폐암세포의 (A-549) apoptosis 유발 정도를 정량적으로 조사하기 위하여, PI염색액으로 핵을 염색한 후 유세포 분석기를 이용하여 핵 내 DNA 함량을 비교 분석한 그래프이고,
도 11은 본 발명의 실험예 2-2에 따라 β-Ionone 처리농도에 따른 Caspase-3 활성 및 발현 조사 결과를 나타내는 그래프이고,
도 12는 본 발명의 실험예 2-3에 따라 β-Ionone 처리농도에 따른 western-blot analysis 결과를 나타내는 그래프이고,
도 13은 본 발명에 따라 A-549 세포에 β-ionone 처리를 한 경우 p53 단백질의 발현을 나타내는 그래프이고,
도 14는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 저분자 추출물의 A549 인체 폐암 세포에 대한 사멸효과를 나타내는 그래프이고,
도 15a 및 15b는 각각 본 발명에 따라 버섯균사체배양 추출물로부터 얻어진 배양물의 GC-MS 크로마토그래피 및 β-ionone의 질량분석(Mass fragmentation) 그래프이다.

Claims (5)

  1. 베타-카로틴(β-carotein)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 접종하여 배양시키는 단계; 및,
    상기 배양시킨 배양물을 증류하여 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 물질을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 대두박분해물, 황백당, MgSO47H2O 및 KH2PO4 가 포함된 액체배지인 것을 특징으로 하는 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 버섯균주는 잣버섯 (LL, Lentinus lepideus) 균사체가 포함된 액체 배양물인 것을 특징으로 하는 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 물질을 추출하는 단계는,
    상기 배양물을 고체부분과 액체부분으로 분리하는 단계; 및,
    상기 분리한 고체부분과 액체부분 각각을 증류하여 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 물질을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물의 제조방법.
  5. 베타-카로틴(β-carotein)과 루테인(lutein)이 포함된 배지에 버섯균주를 배양한 후 증류하여 얻은 저분자 물질로써, 베타-이오논(β-Ionone)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암효과를 가지는 버섯균사체배양 추출물.
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