KR101760184B1 - 곰팡이 균사체 접종에 의해 글리세올린 함량이 증가된 콩의 제조 방법 - Google Patents

곰팡이 균사체 접종에 의해 글리세올린 함량이 증가된 콩의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세올린 함량이 증가된 콩 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 식용 곰팡이 균주 균사체를 접종한 콩의 글리세올린 함량 증진 방법 및 이의 방법으로 제조된 콩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 균사체 접종 콩은 곰팡이 포자를 접종한 콩과 비교하여 글리세올린 함량이 보다 증가되었으며, 곰팡이 포자 접종시 유래되는 이미 및 이취의 문제를 효과적으로 개선하여 다양한 종류의 식품으로 가공할 수 있는 이점을 가진다.

Description

곰팡이 균사체 접종에 의해 글리세올린 함량이 증가된 콩의 제조 방법{Method for producing Soybean with increased glyceollins content by infecting mycelium of Aspergillus sojae}
본 발명은 글리세올린 함량이 증가된 콩 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 식용 곰팡이 균주 균사체를 접종한 콩의 글리세올린 함량 증진 방법 및 이의 방법으로 제조된 콩에 관한 것이다.
일반적으로 식물이 각종 해충이나 균류가 침입했을 때 균류를 퇴치하고자 스스로 만들어내는 저분자 항균성 물질을 피토알렉신(phytonalexin)이라 하는데, 이들 물질은 감염 이전에는 식물체 내에서 발견되지 않으나, 감염 후 수시간 이내에 매우 빠른 속도로 합성되어 감염 부위에서 작용하며 여러 종류의 박테리아나 균류에 대하여 독성을 나타내는 특징을 가지고 있다. 이러한 피토알렉신은 식물을 보호하는 역할로 자체 생산이 되는 것이지만, 최근 이 물질의 항균력 등의 기능들이 밝혀져 이를 대량배양하여 안정되고 저렴한 의약품, 염료, 향미 및 방향 등의 용도로 이용하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있는 추세이다.
콩에는 다양한 기능성 성분이 존재하며, 이들에 대한 많은 연구가 진행되어 왔다. 콩의 발아중 식용곰팡이를 처리하게 되면 콩 자체에는 존재하지 않는 특수한 기능성 물질들이 생성되는 것이 알려져 있으며, 이들 가운데 콩에서 생산되는 피토알렉신의 일종인 글리세올린(glyceollins) 연구가 가장 활발하게 진행되고 있다.
콩에 곰팡이를 접종하여 발아를 하는 경우, 이후 콩을 다른 식품가공에 활용하기 위해서는 곰팡이를 제거해야 하고, 완전제거가 어려우므로 다른 식품원료로 활용시 곰팡이취 및 제품색깔 등에 영향을 미칠 수 있는 단점이 있다.
이에 곰팡이 포자를 접종한 콩의 이미 및 이취를 해결하기 위한 새로운 글리세올린 합성 유도 방법이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1126297호 한국공개특허 제10-2010-0035843호
따라서 본 발명의 목적은 균사체를 이용하여 글리세올린 함량이 증진된 콩 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 콩에 곰팡이 균사체를 접종시키는 단계; 및 균사체 접종 콩을 20~30℃에서 1~7일 배양하는 단계;를 포함하는 글리세올린 함량이 증가된 콩 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균사체는 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 또는 리조푸스 올리고스포러스(rhizopus oligosporous) 균주의 포자를 이용한 균사체 부유물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균사체 접종은 균사체 부유물을 콩 분할면에 접종하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균사체 부유물은 포자를 액체배지에 2×108 spores/200ml의 양으로 접종한 뒤, 교반 배양기에 14~18 시간 배양한 후 걸러진 균사체인 것일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 글리세올린 함량이 증가된 콩을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 균사체 접종 콩은 곰팡이 포자를 접종한 콩과 비교하여 글리세올린 함량이 보다 증가되었으며, 곰팡이 포자 접종시 유래되는 이미 및 이취의 문제를 효과적으로 개선하여 다양한 종류의 식품으로 가공할 수 있는 이점을 가진다.
도 1은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae)의 형태에 따른 글리세올린 생성 비교를 위한 포자 또는 균사체의 접종 방법에 관한 모식도이다.
도 2은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자 또는 균사체를 접종한 아가콩의 일자별 관찰 사진이다.
도 3은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자 또는 균사체를 접종한 아가콩의 일자별 1.5×12.5 배율의 현미경 관찰 사진이다.
도 4은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자 또는 균사체를 접종한 아가콩의 일자별 1.5×20 배율의 현미경 관찰 사진이다.
도 5은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자 또는 균사체를 접종한 아가콩의 일자별 1.5×50 배율의 현미경 관찰 사진이다.
도 6은 본 발명의 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균사체를 접종한 아가콩의 글리세올린 I HLPC standard 분석 결과이다.
도 7은 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균사체를 접종한 아가콩의 글리세올린 I 함량 측정을 위한 HLPC 분석 결과이다.
콩의 발아중 식용 곰팡이를 접종하면 콩에서 피토알렉신의 일종인 글리세올린이 합성되는데, 콩에 곰팡이를 접종하여 발아를 하는 경우, 이후 콩을 다른 식품가공에 활용하기 위해서는 곰팡이를 제거해야 하고, 완전제거가 어려우므로 다른 식품원료로 활용시 곰팡이취 및 제품 색깔 등에 영향을 미칠 수 있고, 글리세올린을 함유한 콩 자체를 식품소재로 활용하기 위해서는 곰팡이를 접종하기 보다는 콩의 맛이나 향기에 영향을 주지 않는 유도체(elicitor)의 발굴이 필요하다.
따라서 본 발명에서는 글리세올린 함량이 증진된 콩을 제조하였으며, 본 발명에 따른 콩의 제조방법은 콩에 곰팡이 균사체를 접종시키는 단계; 및 균사체 접종 콩을 20~30℃에서 1~7일 배양하는 단계;를 포함하는 글리세올린 함량이 증가된 콩 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 콩과 곰팡이 포자 접종 콩의 글리세올린 함량 비교를 위해 먼저 식용 곰팡이 균주 포자를 제조하였고, 식용 곰팡이 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae)를 완전배지(compleate media, CM)에 배양시키고, 1 플레이트당 0.1% tween buffer를 10ml정도 넣고 스프레더(spreader)를 이용하여 튜브에 모은 후, 원심분리하여 남은 펠렛에 증류수를 첨가하여 세포계수기로 포자를 계측하였다(준비예 1 참조).
본 발명의 일실시예에 따르면, 균사체는 계측한 포자를 액체배지에 2×108 spores/200ml의 양으로 접종한 뒤, 교반 배양기에 배양시킨 후 걸러진 것으로, 상기 균사체 2×105/10ul mycelia의 양을 반으로 절단한 콩에 처리하여 배양한 콩을 대상으로 HPLC 분석한 결과, 포자를 접종한 발아 아가콩에서보다 균사체를 접종한 발아 아가콩에서 더 많은 양의 글리세올린 I이 존재하는 것으로 나타났고, 특히 3일째와 5일때에는 2배 이상 많은 양의 글리세올린 I이 측정되었다(실시예 3, 표 2 및 도 7 참조).
본 발명의 “글리세올린”은 콩에서 과민성 반응 또는 진균 스트레스(fungal stress) 동안에 생성되는 일종의 피토알렉신(phytoalexin) 물질이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 상기 글리세올린 화합물은 수침된 콩에 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균주를 처리하여 배양한 콩의 추출물로부터 통상적인 정제 방법 예를 들어 크로마토그래피(chromatography) 분리방법에 의해 분리 및 정제하여 얻는다.
상기 글리세올린은 자연계에서 글리세올린 I이 가장 주요한 형태이고, 이의 2가지 이성질체(isomer)인 글리세올린 Ⅱ 및 Ⅲ은 미량으로 존재한다(Clinical Cancer Research 2006;12(23) December 1, 2006, 7159-7164, Antiestrogenic Glyceollins Suppress Human Breast and Ovarian Carcinoma Tumorigenesis).
본 발명에서 활성성분 "글리세올린" 은 글리세올린 I, 글리세올린 Ⅱ, 글리세올린 Ⅲ, 또는 이들의 혼합물을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 글리세올린은 글리세올린 I, 글리세올린 Ⅱ, 글리세올린 Ⅲ, 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 상기 글리세올린은 글리세올린 I 이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<준비예 1>
아스퍼질러스 소제( Aspergillus sojae ) 준비 및 포자 counting
아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae)는 경상대학교에서 구입하였고, 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae)는 완전배지(CM, Complete media)에 2일, 30℃에 배양시킨다. 1 plate 당 0.1% tween buffer를 10ml 정도 넣고 스프레더(spreader)를 이용하여 50ml 튜브에 모은 후 5000 RPM, 10분 원심분리(centrifuge) 한다. 상등액은 버리고 남은 세포 펠렛(cell pellet)에 오토클레이브(autoclave) 한 증류수를 10ml 넣는다. vortex 후, cell을 100배 희석 (10 μl cell + 990 μl autoclave dw) 하여 세포계수기(hemocytometer)를 이용하여 포자의 수를 계측한다(도 1 참조).
<준비예 2>
아가콩 준비
50ml 튜브에 이소플라본 함량이 높은 품종인 아가3호(충남 홍성군 서부면에서 계약하여 재배한 콩을 구입)을 약 2g 정도를 넣고 70% 에탄올을 이용하여 1~2분 살균한 뒤 오토클레이브(autoclave)한 증류수로 3회 정도 헹궈낸다. 그 이후 오토클레이브한 증류수를 45ml 까지 채우고 5시간 정도 암실, 상온에서 불린다. 불린 콩은 껍질은 벗긴 후 반을 가른다. 잘린 면이 위쪽으로 오도록하여 오토클레이브 한 whatman 110mm filter paper와 1ml의 오토클레이브 한 증류수가 들어간 페트리디쉬에 올려둔다.
<실시예 1>
포자 접종
상기 준비예 1에서 계측한 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자를 증류수 10 μl 안에 있는 2×106 spores를 콩 반쪽에 처리하고 25℃에서 0일, 1일, 3일, 5일, 7일간 각각 배양시킨다.
<실시예 2>
균사체 접종
상기 준비예 1에서 한 포자를 200ml 액체배지에 (soybean broth + trace element) 2×108spores/200ml 이 되도록 접종한 후 37℃, 220RPM 교반 배양기(shaking incubator)에 16시간 배양시킨다. 16시간 배양 후에, funnel과 miracloth를 이용하여 균사체를 거른 후 50ml 튜브에 모으고 10ml 멸균한 증류수를 넣고 vortex한다. vortex 한 균사체를 증류수 10 μl 안에 있는 2×105 mycelia를 콩 반쪽에 처리하고 25℃에 0일, 1일, 3일, 5일, 7일간 배양시킨다.
포자를 접종한 콩의 페트리디쉬와 균사체를 접종한 콩의 페트리디쉬를 일차별로 꺼내어 도 2에 나타난 바와 같이 관찰하였고, 또한 현미경을 이용하여 1.5×12.5 배율에서는 전체적인 콩의 변화를 관찰하고자 하였고, 1.5×20 배율에서는 특징적인 부분을 좀 더 가까이 관찰하고자 하였으며, 1.5×50 배율로는 균사체 및 포자의 성장을 확인하고자 각각 관찰하였다(도 3 내지 5 참조).
<실시예 3>
글리세올린 함량 측정을 위한 HPLC 분석 결과
상기 실시예 1 및 2에서 제조한 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 포자 접종 콩 및 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균사체 접종 콩의 글리세올린 함량 측정을 위해, 실시예 1 및 2의 각각의 페트리디쉬에 들어 있는 콩을 50ml 튜브에 옮기고 하루정도 -70℃에 얼린다. 얼린 샘플은 완전히 건조시키기 위해 약 이틀 동안 동결 건조한다. 동결 건조 후, 각 샘플을 막자사발로 파우더가 되도록 갈고 무게를 잰다. 1g / 6ml 80% EtOH이 되도록 넣고 약 20초 정도 vortex 후 water bath 50℃에서 추출한다. 추출 후, 30분 정도 식히고 5000RPM, 10min 원심분리 한다. 원심분리 후 0.22μm 필터를 이용하여 추출물을 여과한다. 여과 후 20℃로 보관하여 다음 HPLC 분석에 이용하였다.
여과한 추출물을 Gemini 5μm C18 150×2.00mm Phenomenex 칼럼을 이용하여 아래와 같은 조건으로 1mM 글리세올린 I (glyceollinⅠ)을 희석하여 standard를 측정한다(도 6 참조). standard 측정 후, 샘플을 희석하여 글리세올린 함량을 측정하였다.
글리세올린 I 함량을 측정하기 위한 HPLC 분석 조건
R.T.(min) 0 40 45 55
% A 90 65 90 90
% B 10 35 10 10
Mobile phase : solvent A (0.1% phosphoric acid), solvent B (acetonitrile)
Column temperature : 25℃
Flow rate: 0.6 ml/min
Injection volume : 10μl
Detection wavelength : 280nm
HPLC 측정 결과, 포자를 접종한 아가콩에서 보다 균사체를 접종한 아가콩에서 더 많은 양의 글리세올린 I (glyceollinⅠ)이 측정 되었고, 특히 3일째와 5일째에는 2배 이상 많은 양의 글리세올린 I (glyceollinⅠ)이 측정됨을 확인하였다(표 2 및 도 7 참조).
(단위 : ug/g)
control 포자(spore) 균사체(mycelia)
0 day 2.1379 397.1767 9.2423
1 day 4.7205 225.9218 324.9719
3 day 4.7016 414.8554 1077.8530
5 day 18.0472 435.7371 1117.7234
7 day 5.1956 736.2531 934.0704
종합적으로, 본 발명에서는 이소플라본 함량이 높은 품종인 아가3호를 이용하여 식용곰팡이 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae)의 포자 또는 균사체를 각각 접종하여 글리세올린 합성 유도를 조사한 결과, 균사체 접종 후 1~5일째 글리세올린 합성 유도가 월등하게 잘 이뤄졌으며, 콩의 외관 및 풍미에도 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 콩 분할면에 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균주의 균사체를 접종시키는 단계; 및
    상기 균사체 접종 콩을 20~30℃에서 3~5일 배양하는 단계;를 포함하는 콩의 글리세올린 I (glyceollin Ⅰ) 함량을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균사체는 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae) 균주의 포자를 액체배지에 2×108 spores/200ml의 양으로 접종한 뒤, 교반 배양기에 14~18 시간 배양한 후 걸러진 균사체 부유물인 것을 특징으로 하는 콩의 글리세올린 I (glyceollin Ⅰ) 함량을 증가시키는 방법.
  5. 삭제
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