KR20100035843A

KR20100035843A - 글리세올린을 함유한 항염증 효과를 가지는 조성물

Info

Publication number: KR20100035843A
Application number: KR1020080095204A
Authority: KR
Inventors: 김용훈; 윤은경; 정명애; 김현경
Original assignee: (주)엔앤비
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2010-04-07

Abstract

본 발명은 병원균에 대항하는 대두의 이차대사산물인 글리세올린에 대한 것으로, 글리세올린에 대한 쥐의 대식세포인 RAW264.7세포에 대한 iNOS, COX-2, 및 이들의 억제 메카니즘 규명을 통하여, 염증반응과 관련된 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 동맥경화, 암 및 퇴행성질환 등 염증반응과 관련된 질환의 대한 예방 및 치료목적의 제품에 글리세올린을 이용하고자 한다.

글리세올린, 항염증, iNOS, COX-2

Description

글리세올린을 함유한 항염증 효과를 가지는 조성물 { The coposition, containing glyceollins, showing eminent anti-inflammation effects. }

본 발명은 글리세올린을 이용한 항염증 억제효과 및 면역조절 활성에 관한 것으로, 보다 상세히는 글리세올린을 포함하는 조성물을 이용하여 항염증과 관련된 질환의 예방 및 치료 목적의 제품생산에 이용하고자 하는 것이다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 생물학적 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소 혈관과 체액 중의 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴등 일련의 복합적인 생리적인 반응과 홍반, 부종, 발열 등 외적 증상을 나타낸다. 또한 그 결과에 따라 급성 염증, 류마티스 관절염, 골 관절염 등의 만성염증의 증상으로 나타난다. 이런 염증 반응에 관여하는 물질에는 NO(nitric oxide), prostaglandin 등이 있다. prostaglandin은 cyclooxygenase (COX)에 의해 합성되며 외부자극에 의해 그 발현이 유도되는 COX2는 염증반응과 암을 비롯한 퇴행성질환의 발병과 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 산화질소(NO)는 인체의 대 식세포(macrophage)에서 산화질소 합성효소(nitric oxide synthetase, 이하 NOS라 칭한다)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된다 (Kerwin, J.F. et al., J. Med. Chem., 38:4343, 1995). 인체의 NOS 에는 내피세포 구성형 NOS(endothelial constitutive NOS, 이하 eNOS라 칭한다), 신경세포 구성형 NOS(neuronal constitutive NOS, 이하 ncNOS라 칭한다) 및 유도성 NOS(inducible NOS, 이하 iNOS라 칭한다)의 3가지 이성체가 존재한다. 이중 eNOS와 nNOS는 각각 내피세포와 신경외피세포에서 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린(calmodulin)에 의존적인 반면, iNOS는 병원균의 세포막 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, 이하 LPS라 칭한다), IL-1, TNF-a와 같은 사이토카인 (cytokine), 방사선 등의 면역 자극제에 의해 세포가 활성화될 때에만 여러 세포에서 많은 양이 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린에 비 의존적이다. 또 다른 염증유발 물질인 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 프로스타글란딘 생산효소인 COX 에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린, 인도메타신과 같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 비스테로이드성 소염제의 COX 억제 작용은 발암물질 활성화의 억제 및 세포증식의 억제와 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며, COX는 두 개의 유전자 (COX-1, COX-2)가 알려져 있다. COX-1은 대부분의 조직에 존재하며 인체의 항상성을 유지하고, COX-2는 염증 부위에서의 프로스타글란딘의 생성에 관여한다. 이러한 COX 유전자의 억제는 면역관련 세포나 암세포의 과적인 조절 및 제어에 이용되고 있다. 이러한 분자물질 들의 발현은 전사유도인자인 NF-kB (nuclear factor-B)의 신호전달에 의해 조절된다. NF-kB는 Rel 유전자과 (Rel gene family)의 핵단백질이며 세포질에서는 IB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나 활성산소(reactive oxygen), TNF-a, IL-1과 같은 cytokine 및 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 다양한 자극에 의해 활성화된 후 핵으로 이동하여 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 대두의 elicitation으로 확보된 글리세올린을 이용하여 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 염증반응과 관련된 iNOS, COX-2, 및 이들의 생성과 관련된 효소의 차단 경로를 밝힘으로서, 글리세올린이 항염증에 탁월한 효능이 있음을 밝히는 본 발명에 이르게 되었다.

상기한 면역관련 기술을 바탕으로, 본 발명은 글리세올린을 이용한 세포면역 억제활성을 검정하여, 이들을 포함하는 염증반응 및 면역조절기능의 예방 및 치료목적의 제품으로 제공하고자 한다.

상기의 글리세올린은 항염증효과가 뛰어남이 검증된 바, 본 발명의 글리세올린 함유제품은 염증반응과 관련된 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 동맥경화, 암 및 퇴행성질환 등 염증반응과 관련된 질환의 대한 예방 및 치료목적의 제품에 효과적으로 이용할 수 있다.

상술한 목적을 이루기 위한 본 발명의 특징으로, 본 발명자들이 생산조건을 확립한 글리세올린 생합성 증대기술을 바탕으로 순수 분리한 글리세올린을 DMSO에 녹여서 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 글리세올린의 항염증 효과를 검정하였다.

상기에서 수득된 글리세올린의 항염증제로서의 효능을 조사하기 위하여, LPS(lipopolysaccharide)로 자극시킨 RAW 264.7 동물 대식세포에 콩 추출물을 다양한 농도로 첨가하고 염증반응인자에 미치는 영향을 생화학적 분석과 더불어 분자생물학적인 실험을 통하여 실시한 결과, 본 발명에 따른 클로렐라 추출물이 대식세포에서의 산화질소(NO)와 COX-2의 저해 활성 및 염증성 전사인자인 NF-kB의 활성을 뛰어나게 억제시킴을 확인하였다.

본 발명의 콩 추출물을 함유하는 항염증용 및 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함하며, 이들을 함유하는 제품으로 분말, 환, 및 연고형 제제 등 다양한 형태의 제형화를 하였다.

이하 본 발명과 관련된 실시예를 보다 자세하게 기술한다.

본 발명은 다음의 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실험예1. 글리세올린이 RAW264.7 세포의 세포독성에 미치는 영향

글리세올린의 항염증 효과를 알아보기에 앞서, 실험에 사용하는 농도의 글리세올린 첨가가 대식세포에 세포독성을 나타내는지 관찰해 보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, RAW 264.7 세포를 10 % FBS(fetal bovine serum)와 2 mM L-글루타민 (L-glutamine)을 첨가한 RPMI 1640 배지에 넣고 37 , 5 % CO2를 함유한 항온기에서 배양하였다.

세포 생존률은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]법을 이용하여 측정하였다. 즉, 96 웰(well)에 세포 (5 x 10 4 cells/well)를 주입한 후 부착시키고 여기에 글리세올린을 농도별로 처리하여 24시 간 배양하고 MTT 시약 (1mg/ml)을 넣고 반응시킨 후 formazan이 형성된 것을 확인 한 후, 동량의 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 넣어 녹여서 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, 글리세올린을 농도별로 처리하였을 때 도1에서 보는바와 같이 세포의 생존률에는 변화가 없음을 확인할 수 있었다.

실험예2. 글리세올린이 RAW264.7 세포의 NO 생성능에 미치는 영향

NO는 대식세포에서 만들어지는 수퍼옥사이드 음이온과 결합하여 강력한 페록시니트리트와 히드록시페록사이드를 생성하여 조직을 손상시켜 염증반응에 관여하므로, 콩 추출물이 염증반응인자인 NO 생성능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

NO (Nitric oixde) 생성 정도는 그린 등의 방법(Green LC. et al ., Anal Biochem. , 126 , pp131-138, 1982)으로 아질산염(nitrite)의 생성량을 측정하였다. 즉 24 웰에 8*10^5 개의 RAW 264.7 세포를 부착시킨 후, 콩 추출물을 각각 0.1, 1, 10, 50 ug /ml 농도별로 처리하여 37 , 5 % CO₂ 에서 2시간 배양한 후 웰 당 1mg/ml 의 LPS 주입하여 18시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100와 그리스 시약(Griess reagent, 5% phosphoric acid에 1 % 함유되어 있는 sulfanilamide와 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride 혼합액) 100 를 실온에서 10분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 NaNO₂ 를 농도별로 조제 하여 사용하였다.

실험 결과, LPS로 자극시킨 RAW264.7 세포에서 글리세올린은 도2에서 보는바와 같이 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났다

실험예3. 글리세올린이 RAW 264.7 세포의 iNOS와 COX-2활성에 미치는 영향

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다. 그리고, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

RAW264.7 세포에 LPS (1mg/ml)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 콩 추출물 인 Glyceollins를 처리하여 iNOS 와 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 웨스턴 블랏(Western blot)과 RT-PCR 통해 알아보았다.

배양이 끝난 세포를 수집하여 2 ~3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후 1ml 의 용해 완충용액(lysis buffer)을 첨가하여 30 분간 용해(lysis) 시킨 후 12,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 단백질 정량키트(Protein Assay Kit, Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다. 30~50의 용해액(lysate)을 8 % mini gel SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 Nitrocellulose membrane (BIO-RAD)에 360 mA로 2 시간 동안 transfer하였다.

그리고 Membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 30여분 동안 실시하였다.

iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz) 을 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 4℃에서 18시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다.

2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1 ~ 3 분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

RAW 264.7 세포로부터 iNOS 와 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다. 세포로부터의 Total RNA 추출은 TRI-reagent (MRC)를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 1 의 Total RNA를 oligo(dT) primer, dNTP(0.5 mol), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2U로 70 5 min, 37 5 min, 37 60 min, 그리고 70 에서 10 min 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다.

중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 합성된 cDNA로부터 유전자를 증폭시키기 위하여 1 cDNA, 2ul의 5'과 3' primer, 10X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 ul dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase (Promega)를 섞고 증류수로 전체를 10ul 로 맞춘 다음 Perkin-Elmer 사의 온도순환기(Thermal Cycler)를 이용하여 PCR을 실시하였다.

이때, PCR cycle은 94/30초, 55 ~ 60/30초, 72/30초, 25회 이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5 % 아가로스겔(agarose gel)에서 전기영동을 실시하고 이티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다. 위 결과는 도3에서 나타내었다.

실험예4. 글리세올린이 RAW 264.7 세포의 NF-kB 활성에 미치는 영향

4-1. 핵단백 추출

10mm 세포배양 디쉬(culture dish)에 배양 된 RAW264.7 세포에 글리세올린을 각각 25, 50, 100, 150 /의 농도별로 처리하여 2시간 배양 시킨 후 2 LPS를 주입하고 다시 20시간 배양하였다. 차가운 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4)로 3회 세척한 후 수확된 대식세포는 0.6 % NP-40), 0.15 M 염화나트륨, 10 mM 트리스(pH7.9), 1 mM EDTA 완충용액에 1000: 1의 비율로 단백질 분해효소 저해제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail, Sigma사, 미국)을 혼합한 RNA 용해액으로 균질화하였다. 이것을 얼음에서 5분간 배양하고 4 , 10분간 12,300 rpm에서 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하고 위의 과정을 한번 더 반복하여 상등액을 완전히 제거하였다. 여기에 10 mM HEPES (pH7.9), 0.1 mM EDTA, 1.5 mM 염화마그네슘, 420 mM 염화나트륨, 25 % 글리세롤을 혼합한 완충용액에 1: 0.03의 비율로 단백질 분해효소 저해제 칵테일, 50 mM DTT(Dithiotreitol, Sigma사)를 혼합하여 만든 추출 완충액 60 을 넣어 혼합하고 얼음에서 20분간 배양시키고 4 , 10분간 12,300 rpm에서 원심분리하였다. 상등액 중 일부는 단백질 농도 결정을 위해 BCA 시약을 이용하여 실행하며, 나머지는 EMSA에 이용하기 위해 -70 에 보관하였다.

4-2. EMSA(Electrophoresis mobility shift assay)

염증반응인자인 NO, 수퍼옥사이드 음이온과 같은 분자물질들의 발현은 전사유도인자인 NF-kB의 신호전달에 의해 조절된다. 따라서 콩 추출물 Glyceollins가 NF-kB 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, gel shift를 확인하기 위하여 NF-kB DNA binding motif (sc-2505, Santa Cruz Biotechnology)를 프로브로 사용하였다. NF-kB probe는 우선적으로 Biotin 3

End DNA Labeling kit ( Pierce )를 이용하여 바이오틴으로 labelling하였다. 20ug의 핵 단백질에 프로브 1ug를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤, 여기에 젤 로딩 완충액 1ul를 첨가하였다. 시료는 4 % 아크릴아미드 젤에 로딩한 후, 200 V, 25 mA에서 전기영동을 실시하였으며, 나일론 멤브레인으로 트렌스퍼한뒤 15분간 UV (312nm) 크로스링크 시켜서 고정시켰다. 루미놀 용액과 반응시켜서 x-ray에 감광시켜 도4에서와 같이 확인하였다.

본 발명의 글리세올린을 포함하는 제형으로 제품화 될 수 있으며, 제제 실시예는 예시에 국한되에 이에 의해 본 발명이 제한되지 않는다.

제제예1. 고형제제의 제조

글리세올린 ..................... 1g

전분 .................... 20g

수트로스 ..................... 15g

락토오스 .................... 20g

칼슘카보네이트 ............... 5g

증류수 ................. 적량

상기의 물질을 혼합하여 필, 환 등의 고형제제를 제조한다.

이외에도 다양한 제품화 제형인 캡슐, 음료, 및 연고형 등 항염증억제 제품에 이용될 수 있다.

도 1은 글리세올린이 RAW264.7 세포에 대한 MTT를 통한 세포독성에 미치는 영향

도 2는 글리세올린이 RAW264.7 세포의 NO 생성능에 미치는 영향

도 3은 글리세올린의 PCR 및 Western Blot을 통한 iNOS 및 COX-2 생성억제 효과 도 4는 글리세올린이 RAW 264.7 세포의 NF-κB 활성에 미치는 영향

Claims

글리세올린을 함유하는 염증관련 질환개선 조성물.
제 1항에 있어서, 글리세올린은 NF-κB의 생성차단을 통한 iNOS 및 COX-2 저해제
제 1항에 있어서, 염증관련 질환으로는 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 동맥경화, 암 및 퇴행성질환 등 염증반응과 관련된 질환으로, 글리세올린 함유제품은 이들 염증관련질환의 개선 및 치료 목적으로 사용되는 제제.
글리세올린 함유 제품으로 이를 포함하는 고형제제(환, 필, 분말), 음료, 및 연고형제제.