KR20030074265A - 면역조절제의 활성을 갖는 잣버섯 추출물 및 이를포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역조절제로서의 활성을 갖는 잣버섯(Lentinus lepideus) 추출물과 이 추출물을 함유하는 약학조성물 및 건강식품을 제공하는 것으로, 본 발명의 잣버섯 추출물이 인간의 대식세포 및 단핵구 관련세포에 작용하여 세포전사인자인 NF-κB를 활성화시켜 선택적으로 사이토카인을 생성하고 면역력 상승작용을 촉진함으로서, 면역억제 및 면역계가 손상된 환자에게 면역력 조절을 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

Description

면역조절제의 활성을 갖는 잣버섯 추출물 및 이를 포함하는 조성물{An Extract of Lentinus lepideus and Composition comprising the same having Immune Modulating activity}

본 발명은 면역조절제로서의 활성을 갖는 잣버섯(Lentinus lepideus) 추출물 및 이를 포함하는 약학조성물에 관한 것이다.

균사 또는 버섯의 많은 다양한 자실체들은 생물학적 반응 조절제(biological response modifiers, BRMs)를 포함하고 있다는 것이 밝혀져 왔으며, 사실 약으로 사용되는 버섯으로부터의 다양한 추출물은 항바이러스, 항균, 항염, 혈당저하, 혈압강하 활성을 보임이 보고되어 왔다(Kabir Y et al.;J. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo),33, pp341-346, 1987). 가장 널리 알려진 균류 화합물의 효능은 항암 및 면역 조절 활성을 갖는 불로초(영지)(Ganoderma lucidum),표고버섯(Lentinusedodes) 및 잎새버섯(Grifola frondosa)으로부터 추출된 BRMs에 의해 보여졌으며, 예를 들면, 표고버섯의 분쇄된 자실체를 경구 투여함으로써 C3H/He 마우스에서 상피세포암(carcinoma)의 성장을 억제하는데 효과가 있음을 밝혔고(Nanba H and Kuroda H ;Chem. Pharm. Bull.(Tokyo),35, pp2459-64, 1987), 표고버섯을 투여함으로써 자연살해세포(Natural Killer, NK) 및 림포카인 활성 살해세포 (Lymphokine-Activated Killer, LAK)의 세포독성 활성을 유의적으로 증가시킴이 보고되었다(Nanba H and Kuroda H ;Chem. Pharm. Bull.(Tokyo),35, pp2459-64, 1987 ; Nanba H et al.;Chem. Pharm. Bull.(Tokyo),35, pp2453-2458, 1987). 면역억제 발암 물질을 처리한 마우스에 표고버섯, 잎새버섯 및 느타리 버섯을 포함한 버섯강화식이(mushroom-enriched diet)를 투여하여 대식세포의 화학주성활성 및 림프구가 유사분열물질(mitogen)에 반응하여 증식하도록 하는 능력이 정상수준까지 회복되었으며(Kurashige S et al.;Immunopharmacol. Immunotoxicol.,19, pp175-183, 1997), 다수의 이러한 생리 활성 성분은 다른 많은 버섯종에서 검증되었다.

대부분 가지친 (1→3)-β-D-글루칸인 폴리사카라이드들은 항암 활성 및 다양한 면역세포와의 상호작용으로 면역조절 활성을 가지고 있음이 보고되고 있다. 표고버섯의 렌티난(lentinan) 및 치마버섯(Schizophillium commune)의 스키조필란 (schizophyllan) 같은 물에 가용한 글루칸들은 일본에서 15년 이상 암의 면역치료에 사용되어 왔으며(Okamura et al.;Biotherapy,1, pp103-107, 1989; Suto et al.;Cancer Chemother. Pharmacol.,33, pp145-148, 1994), 이런 BRM들은 조혈(hematopoiesis) 유도, 사이토카인 시스템 활성화, 암세포 성장 억제 및 바이러스 또는 세균 감염에 저항성을 유도하는 등 많은 생물학적 활성을 갖고 있다 (Borchers et al.;Pro. Soc. Exp. Biol. Med.,221, pp281-293, 1999). 현재까지의 임상연구에서 렌티난이 특별히 위암(gastric cancer) 및 결장암(colorectal cancer)의 환자에 있어서 생명을 연장시키는데 효과가 있음을 증명하였으며(Nakano et al.;Hepatogastroenterology,46, pp2662-2668, 1999), LAK 및 NK 세포활성은 렌티난의 정맥내 주사 후에 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(Arinaga et al..;Int. J. Immunopharmacol.,14, pp535-539, 1992). 이는 렌티난 처리시 인간 대식세포에서 계속적으로 IL-2 에 대한 T 세포반응이 증가하고, LAK 및 NK 세포가 활성화되면서(Suzuki et al.;Cancer Immunol. Immunother.,38, pp1-8, 1994), IL-1 및 종양괴사인자인 TNF-α의 수준이 증가됨을 보여주었다(Fruehauf et al.;Immunopharmocology,5, pp65-74, 1982; Liu et al.;Life Sci.,64, pp1005-1011, 1999; Takeshita et al.;Surg. Oncol.,5, pp23-28, 1996)

한편, 방사성치료 또는 화학치료는 종종 조혈과 면역작용의 형성에 장애를 가져오는데, 조혈모세포들이 조혈과정 중 손상을 입게 되어 연속적으로 관련된 조혈세포와 면역세포들이 감소하기 때문이다. 궁극적으로, 환자들은 종종 빈혈과 림프구 감소증, 혈소판 감소증 또는 과립백혈구 감소증을 경험하게 되며, 이것은 심각하고 치명적인 감염을 일으키고 환자들의 사망률을 높이게 된다. 특히, 방사선 조사(irradiation)는 세포분열 중인, 특히 골수에 존재하는 초기 모세포(blast)를 포함하는 거의 모든 아세포군(subpopulation)에 영향을 미치게 되므로, 환자의 빠른 치료 유무는 방사성치료나 화학치료 도중이나 치료 후에 남게 되는 잔존하는 혈액 줄기 세포(stem cell)의 퍼센트에 달려있다.

현재 상기의 혈액 줄기 세포를 보호하거나 손상된 혈액 줄기 세포를 회복하도록 돕는 방법으로 생물학적 반응조절제(biological responsive modifiers, BRMs)가 주목을 받고 있으며, 다양한 화합물들, 특히 버섯들(mushrooms), 효모들 (yeasts) 및 식물들로부터 분리된 탄수화물들이 골수와 말초혈액세포에 영향을 미치며, 조혈작용을 유도한다고 보고되었다(Hofer M. et al.;J.Leukoc. Biol.,53, pp185-189, 1993). 예를 들면, 뇌한(Omphalia lapidescens)으로부터 유래된 OL-2는 복강과 비장(spleen)에서 림프구와 다양한 면역세포의 수를 증가시키는 반면에, 균핵(Sclerotium glucanicum)으로부터 유래된 스클레로글루칸(Scleroglucan)을 1회 복강 투여시, 골수세포수(bone marrow cellularity)가 증가됨이 보고되었다(Pretus HA et al.;J. Pharmacol. Exp. Ther.,257, pp500-510, 1991). 가용 글루칸인 글루탄-F를 정맥 주사하는 경우, GM-콜로니 형성(colony forming unit, cfu) 및 적혈구 콜로니 형성 수를 증가시켰음(Patchen M. L. et al.;J. Immunopharmacol.,8, pp407-425, 1986 : Patchen ML. et al.;J. Biol. Response. Mod.,3, pp627-633, 1984 : Patchen ML and Macvittie TJ;J. Biol. Response. Mod.,5, pp45-60, 1986)이 보고되었으나, 상기의 결과에서 의미하는 메카니즘은 아직 확실히 밝혀지지 않고 있다. 알로에(Aloe barbadenis)로부터 분리된 CARN750(수용성 β-(1,4)-linked 아세틸화 만난)같은 조혈활성을 가진 탄수화물들(Egger SF et al.;Int. J. Immunopharmacol.,18, pp113-126, 1996)은 대식세포들과 단핵구들을 활성화시켜 IL-1(InterLeukin-1), IL-6, 인터페론 및 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)의 생산을 유도하는 것이 보고되었다(Zhang L and Tizard IR.;Immunopharmacology,35, pp119-128, 1996).

본 발명에서 사용한 잣버섯(Lentinus lepideus)은 담자균아문 (Basidiomycotina)의 주름버섯목(Agaricales)에 속한 단생 또는 속생하는 목재 갈색 부후성 버섯으로 식용할 수 있으며, 성분으로는 유리아미노산 26종, 에르고스테롤, 포화지방산 6종 및 불포화지방산 43종, 미량금속원소 8종, 아니식산메틸 (anisic acid methyl), 에뷰리코익산(eburicoic acid), 렌티나마이신 A, B(lentinamycin A, B), 비스-메틸설포닐메틸이설피드(bis-methylsulfonylmethyldi sulfide), β-1,3-글루카네이즈(glucanase)등이 함유되어있고, 약리작용으로는 항종양, 항균, 항진균, 체조(體調)조절 등이 알려져 있다(박 완희 및 이 호득, 한국 약용버섯도감, 교학사, p392-393, 1999 참조).

국내특허 공개 제1997-0005304호에는 고지 곰팡이과의 누룩곰팡이 (Aspergillus Oryzae)와 담자균류의 표고버섯을 이용하여 면역력증강물질 및 제조방법에 대한 것이 기재되어 있으며, 국내특허 공개 제2001-0046746호에는 치마버섯, 균핵균 및 표고버섯 유래의 β-1,6-분지-β-1,3-글루칸을 함유하는 항염증 및 피부자극 완화효과를 갖는 조성물에 대해 기재되어 있다.

그러나, 상기문헌의 어디에도 잣버섯의 면역 손상 또는 면역 억제에 대한 면역력 조절에 대해 개시된 바 없다.

본 발명자는 잣버섯 수용성 추출물인 PG101-1 및 PG101-2를 인간 세포주 및 방사선 조사된 마우스의 골수세포에 시험을 하여 혈청 내의 사이토카인 생성, 혈액조혈모 세포 및 과립구 분화 및 관련 세포 증식을 유도하는 것을 확인함으로서 면역 억제 및 면역 손상된 사람들에게 본 발명의 잣버섯 추출물이 면역 증강제로 사용될 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역증강 및 면역조절효과를 나타내는 잣버섯(Lentinus lepideus) 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명은 잣버섯 추출물을 함유하는 감염성질환의 예방 및 면역저하된 환자의 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 감염성 질환의 예방 및 면역저하된 환자를 치료하기 위한 치료제를 제조하기 위한 잣버섯 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명은 백신의 어쥬반트에 첨가되어 백신을 제조하기 위한 잣버섯 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명은 인간이나 포유류의 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위해 잣버섯 추출물을 투여하는 것을 특징으로 하는 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은 잣버섯 추출물을 함유하는 감염성질환의 예방 및 면역증강을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

도 1 은 실시예 1에서 제조된 PG101-1의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석 그래프이며,

도 2 는 PG101-1의 투여농도에 따른 인간 말초 혈액 세포에서의 사이토카인의 유도를 나타낸 도이며,

도 3 은 PG101-1 10㎍/㎖를 투여한 후, 시간에 따른 인간 말초 혈액 세포에서의 사이토카인의 유도를 나타낸 도이고,

도 4 는 사이토카인 유전자의 프로모터의 구조도이며,

도 5는 PG101-1 투여 후, NF-κB 리포터 플라스미드를 사용한 루시퍼라제 활성수치를 나타낸 도이고,

도 6은 인간 단핵구 세포주에서 PG101-1로 유도된 NF-κB 결합활성을 전기적 이동 변화 실험(Electro Mobility Shift Assay, EMSA)으로 나타낸 도이며,

도 7a는 TNF-α에 대한 PG101-1 및 피롤리딘 디티오카바메이트(PDTC)의 영향을 나타낸 도이며, 도 7b는 IL-1β에 대한 PG101-1 및 PDTC의 영향을 나타낸 도이며, 도 7c은 IL-10에 대한 PG101-1 및 PDTC의 영향을 나타낸 도이며, 도 7d는 IL-12에 대한 PG101-1 및 PDTC의 영향을 나타낸 도이며, 도 7e는 GM-CSF에 대한 PG101-1 및 PDTC의 영향을 나타낸 도이며, 도 7f는 IL-18에 대한 PG101-1 및 PDTC의 영향을 나타낸 도이며,

도 8a 및 도 8b는 PG101-1에 대한 U937세포주, 암세포주인 HT1080(ATCC사)과 말초혈액 단핵구세포(PBMC) 세포에서의 MTT 어세이 결과를 나타낸 도이다.

도 9a 는 방사선을 조사하지 않은 마우스(이하 대조군이라 함), 방사선 조사 후 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor) 투여군 마우스의 CFCs 콜로니 형성을 비교한 도이며, 도 9b는 대조군, 방사선 조사 후 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스의 CFU-GM(colony forming unit-granulocyte and monocyte-committed stem cells) 콜로니 형성을 비교한 도이며, 도 9c는 대조군, 방사선 조사 후 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스의 BFU-E(Burst forming unit-erythroid) 콜로니 형성을 비교한 도이고,

도 10a는 정상 마우스 골수세포에 ER-MP12와 ER-MP20 항체를 사용한 유세포 분석도이며, 도 10b는 방사선 조사된 PBS 투여군 마우스 골수세포에 ER-MP12과 ER-MP20 항체를 사용한 유세포 분석도이고, 도 10c는 방사선 조사된 PG101-1 투여군 마우스 골수세포에 ER-MP12와 ER-MP20 항체를 사용한 유세포 분석도이며, 도 10d는 방사선 조사된 G-CSF 투여군 마우스 골수세포에 ER-MP12와 ER-MP20 항체를 사용한 유세포 분석도이고,

도 11a는 대조군의 골수세포 분포도이며, 도 11b, 도 11c 및 도 11d는 방사선 조사된 마우스에 각 PBS, PG101-1, G-CSF를 16일간 처리한 군의 골수세포의 분포도이며, 도 11e, 도 11f, 도 11g 및 도 11h는 상기에서 얻어진 각 골수세포군을 피코에리트린(PE)이 콘쥬게이트된 c-Kit(anti-CD117) 항체와 반응시 얻은 히스토그램에서의 형광패턴을 나타낸 도이고, 도 11i는 대조군의 골수세포 분포도이며, 도 11j, 도 11k 및 도 11l은 방사선 조사된 마우스에 PBS, PG101, G-CSF를 24일간 처리한 군의 골수세포의 분포도이며, 도 11m, 도 11n, 도 11o 및 도 11p는 각 군의 골수세포를 피코에리트린(PE)이 콘쥬게이트된 c-Kit (anti-CD117) 항체와 반응시 얻은 히스토그램에서의 형광패턴을 나타낸 도이고, 도 11q, 도 11r, 도 11s 및 도 11t는 각 군의 골수세포를 피코에리트린(PE)이 콘쥬게이트된 Gr-1(anti-Ly 6C) 항체와 반응시킨 후 얻은 히스토그램에서의 형광패턴을 나타낸 도이고,

도 12a는 대조군, 방사선 조사된 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스 혈청 중의 IL-1β(InterLeukin-1β) 사이토카인의 생성을 나타낸 도이며, 도 12b는 대조군, 방사선 조사된 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스 혈청 중의 IL-6 사이토카인의 생성을 나타낸 도이며, 도 12c는 대조군, 방사선 조사된 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스 혈청 중의 GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor) 사이토카인의 생성을 나타낸 도이며, 도 12d는 대조군, 방사선 조사된 각 PBS, PG101-1 및 G-CSF 투여군 마우스 혈청 중의 TNF-α사이토카인의 생성을 나타낸 도이다.

도 13a 는 TNF-α에 대한 PG101-1, PG101-2 및 렌티난의 효과를 나타낸 도이고, 도 13b 는 IL-1β에 대한 PG101-1, PG101-2 및 렌티난의 효과를 나타낸 도이고, 도 13c 는 IL-10에 대한 PG101-1, PG101-2 및 렌티난의 효과를 나타낸 도이고, 도 13d 는 IL-12에 대한 PG101-1, PG101-2 및 렌티난의 효과를 나타낸 도이고, 도 13e 는 GM-CSF에 대한 PG101-1, PG101-2 및 렌티난의 효과를 나타낸 도이고,

도 14 는 PG101-1을 처리했을 때, 여러 사이토카인들의 유전자 발현변화를 분석한 노던블롯 결과도이고,

도 15 는 여러 사이토카인들의 유전자발현에 대한 PG101-1 및 시클로헥사미드의 효과를 나타낸 노던블롯 결과도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역증강 및 면역조절 활성을 갖는 잣버섯(Lentinus lepideus) 추출물을 제공한다.

상기 잣버섯은 잣버섯의 균사체 또는 자실체를 포함하고, 자연산 또는 인공배양된 잣버섯을 포함한다.

또한 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 수가용성 추출물을 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시예로, 잣버섯의 균사체를 액체배양하고, 필터를 사용하여 배양배지로부터 수집한 후 증류수로 세척 및 건조하여 수득한 잣버섯 균사체 또는 건조된 잣버섯 자실체를 증류수와 혼합하여 열수추출한 다음, 이의 상층액을 얻어 농축 및 건조과정을 거쳐 수득되는 글루코스, 만노오스, 갈락토오스와 같은 단당류 및 헤테로글리칸을 함유하는, 갈색분말의 면역증강 및 면역조절활성을 갖는 잣버섯 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 감염질환 예방 및 치료용, 면역계질환 환자의 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 (a)아가 배지에서 보관된 잣버섯의 균사체를 15 내지 35℃에서, 30 내지 200rpm으로 교반하면서 1일 내지 20일 동안 액체배지에서 배양하고, (b) 필터를 사용하여 수집한 다음, (c) 잣버섯 균사체를 증류수로 세척하여 건조한 후, 무게(㎏)의 약 5배 내지 20배 부피의 증류수, 메탄올, 에탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매를 사용하여, 50 내지 100℃에서 1시간 내지 48시간, 2회 내지5회에 걸쳐 추출한 후, 원심분리하여 상층액을 수집하고, 농축, 건조하는 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잣버섯 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 감염질환의 예방 및 면역력이 저하된 환자의 치료를 위한 약학조성물을 제조하기 위한 잣버섯 추출물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 백신 제조시, 어쥬반트로 사용하기 위한 잣버섯 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명은 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 인간 및 다른 포유동물에게 투여함을 특징으로 하는 면역력 증강, 감염질환의 예방 및 면역계질환 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 면역력 증강을 위한 약학조성물은, 조성물 총중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 ~ 95 중량%, 바람직하게는 0.5 ~ 80 중량%로 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 잣버섯 추출물은 (a) 아가 배지에서 보관한 잣버섯의 균사를 15 내지 35℃, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 30 내지 200rpm, 바람직하게는 50 내지 150rpm으로 교반하면서 1일 내지 20일 동안 글루코오스, 펩톤, 효모 추출물, 몰트 추출물, 인산칼륨 및 황산마그네슘 등의 혼합물로 된 액체배지에서 배양하고, (b) 필터를 사용하여 수집한 다음, (c) 잣버섯 균사체를 증류수로 세척하여 건조한 후, 무게(㎏)의 약 5배 내지 20배, 바람직하게는 약 10배 내지 15배 부피의 증류수, 메탄올, 에탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 증류수를 사용하여, 50 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃에서, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안, 2회 내지 5회에 걸쳐 열수추출하고 원심분리하여, 상층액을 수집한 다음, 회전증발 또는 감압농축한 후 냉동건조 또는 진공건조하여 수득할 수 있다.

또는, 건조된 잣버섯을 세절하고, 무게(㎏)의 약 5배 내지 20배, 바람직하게는 약 10배 내지 15배 부피의 증류수, 메탄올, 에탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 증류수를 사용하여, 50 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃에서, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간동안, 2회 내지 5회에 걸쳐 추출하고 원심분리하고, 상층액을 수집하여 회전증발 또는 감압농축한 후 냉동건조 또는 진공건조하여 본 발명의 잣버섯 추출물을 수득할 수 있다.

상기 잣버섯은 자연산 또는 인공재배한 잣버섯을 포함한다.

그러므로, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 면역증강 및 면역조절 활성을 갖는 잣버섯 추출물을 제공한다.

상기 잣버섯 추출물은 글루코스, 만노오스, 갈락토오스 및 헤테로글리칸을 함유하며, 본 발명의 바람직한 실시예의 잣버섯 추출물은 55.6%, 만노오스 18.5%, 갈락토오스 25.9% 및 헤테로글리칸을 함유한다.

상기 제조과정을 통해 수득된 잣버섯의 균사체 추출물은 PG101-1로 명명하고, 잣버섯의 자실체 추출물은 PG101-2로 명명하였다.

본 발명의 잣버섯 추출물은 인간의 대식세포/단핵세포에 작용하며, 주로 세포전사인자인 NF-κB(nuclear factor kappa-B)를 조절하여 사이토카인을 활성화하고, 사이토카인인 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β, IL-10, IL-12, GM-CSF와 IL-18의 생성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 세포분리 실험, 리포터 플라스미드의 일시적 형질 도입 실험, 젤 리타데이션(Gel Retardation) 실험과 특정 억제제의 사용을 포함한 다양한 실험을 수행하였고, 방사선 조사된 마우스 모델에 PG101-2를 투여한 후, 과립백혈구와 조혈모세포가 분화, 증식하여 면역증강활성을 갖음을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 제법으로 제조된 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는, 박테리아나 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 및 면역계 질환 환자의 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 잣버섯은 잣버섯의 자실체 또는 균사체를 포함하고, 자연산 잣버섯 및 인공재배산 잣버섯을 포함한다.

상기 면역계질환은 면역결핍으로 인한 질환이거나 또는 저하된 면역으로 인한 질환을 의미한다.

본 발명의 약학조성물은 화학요법 및 방사선요법과 같은 항암요법에 의해 면역기능이 저하된 환자, 에이즈 및 암과 같은 질환에 의하여 면역기능이 저하된 환자에게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 면역증강 및 면역조절활성을 갖고 있으며, 본 발명의 약학조성물은 면역증강제에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 세균 또는 독감과 같은 바이러스에 의한 감염질환의 예방을 위해서 투여될 수 있으며, 또한 백신의 어쥬반트로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조과정으로 수득된 추출물을 유효성분으로 포함하고, 면역계질환 환자를 치료하기 위한 유효량으로 포함하며 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역조절제를 제공한다.

또한 본 발명은 치료제를 제조하기 위한 상기 제조방법에 의해 수득된 본 발명의 잣버섯 추출물을 함유하는 조성물의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 면역 저하로 인한 세균 또는 바이러스 감염 예방 및 면역증강이 요구되는 환자의 치료를 위한, 인간 또는 포유동물에게 상기 제조방법에 의해 수득된 본 발명의 잣버섯 추출물의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

그리고, 본 발명은 인간 또는 포유동물에게 상기 제조방법에 의해 수득된 본 발명의 추출물을 유효량으로 함유하고 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역력을 증강시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 면역증강을 목적으로 면역저하된 환자에게 상기 제조방법에 의해 수득된 본 발명의 추출물의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 잣버섯 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton PA).

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 5 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 100 내지 250 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 잣버섯 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 잣버섯 추출물 및 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 면역조절을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 건강기능식품은 건강을 위한 건강식품, 건강음료, 식품첨가물 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 면역력 조절 및 증강을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 잣버섯 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능 식품류 등이 있다.

본 발명의 상기 추출물은 면역조절을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태가 가능하다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 추출물의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 전체조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 감염성 질환에 대한 면역력 증강을 위한 상기 제조방법으로 수득된 잣버섯 추출물을 함유하는 가축사료 조성물 및 사료첨가물을 제공한다.

본 발명의 사료첨가물은 감염성 질환에 대한 면역력을 증강시키기 위하여 사료조성물의 총 중량에 대하여, 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 80중량%의 범위내에서 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명은 감염성질환에 대한 면역력 증강을 위한 가축 사료 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 잣버섯 추출물의 용도를 제공한다.

그리고 본 발명은 가축의 면역증강을 위해 상기 본 발명의 잣버섯 추출물을 함유한 사료 및 사료첨가물을 투여하는 것을 포함하는 감염성질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.

상기와 같은 조성물은 통상의 가축사료로 사용되어 가축에게 약효가 검증된 생약재를 투여함으로써, 항생제를 대체할 수 있어 청정 육제품을 생산하여 국민 건강을 지킬 수 있게 된다.

본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 잣버섯 추출물 PG101-1 의 제조

한국임업연구원에서 제공받은 잣버섯(Lentinus lepideus)의 균사는 아가(agar) 배지에 보관하였고, 잣버섯 균사는 온도 20 내지 30℃에서 공기를 공급하면서, 50 내지 150 rpm으로 교반하여 5 내지 10일간 4 ℓ의 액체배지(글루코오스 80 g, 펩톤 4g, 몰트 추출물 80 g, pH 5.5)에서 배양하였다. 균사는 ADVANTEC 필터 No 2(Toyo사, 일본)로 정제하여 수집되었고, 증류수로 5회 세척 후, 56℃에서16시간 동안 건조하여 얻어진 14g의 균사는 뜨거운 물에서 3시간 동안 2회에 걸쳐 처리된 후, 총 추출물을 합하여 5,000×g로 10분간 원심분리하고, 필터를 통해 정제 및 원심분리하여 상층액을 수집하였고, 감압농축기 (N-1000, EYELA사, 일본)를 사용하여 농축 및 냉동건조하여 1.96g(수득률 14%)의 갈색의 수용성 추출물 분말을 얻었으며, 이를 PG101-1이라 명명하였고, 하기 실험에서 시료로 사용하였다.

실시예 2. 잣버섯 추출물 PG101-2 의 제조

강원대에서 제공받은 건조된 잣버섯(Lentinus lepideus) 11.1g을 80℃의 증류수 200㎖로 3시간 동안 2회에 걸쳐 처리하고, 총 추출물을 합하여 5,000×g로 10분간 원심분리한 다음, 필터를 통해 정제 및 원심분리하여 상층액을 수집하였고, 감압농축기 (N-1000, EYELA사, 일본)를 사용하여 농축 및 냉동건조하여 2.26g(수득률 20.4%)의 갈색의 수용성 추출물 분말(PG101-2)을 얻었으며, 이를 시료로 사용하였다.

실험예 1. PG101-1의 HPLC 분석

본 발명의 실시예 1에서 제조된 PG101-1 및 단당류 혼합물(GalNAC, Xyl, GlcNAc, Glc, Man, Fuc, Gal)은 증류수로 적절히 희석시키고, 50㎕의 희석액을 농축시켜 글리코택 바이알(GlycoTAG vial)에서 건조시켰으며, 시료들은 100℃에서 4시간동안 4N 염산/4M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 가수분해시킨 후, 100 pmol의 피리딜아미노산(pyridyl amino acid, PA)을 첨가하였고, PA 유도체들은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 시스템(1100 series, Agilent사, 미국)에서 팔팍(PALPAK) 타입 A 컬럼을 사용하여 분석되었으며 각각의 단당류의 양은 피크높이(peak height method)로 계산되었다(HPLC의 유속; 0.3 ㎖/분, 이동상; 0.7 M Borate-K (pH 9.0): 아세토니트릴 9:1, 검출기 : Ex 310 mm, 컬럼 온도 ; 65 ℃).

실험 결과, HPLC 분석을 통하여 글루코스 55.6%, 만노스(mannose) 18.5%, 갈락토스 25.9%인 단당류 부분으로 이루어졌음을 알 수 있었고, PG101-1이 이형글리칸(heteroglycan)을 포함하는 것을 확인하였다(도 1 참조).

실험예 2. 리물러스 시험법(Limulus test)

실시예 1 및 2에서 제조된 PG101-1과 PG101-2의 엔도톡신을 검출하기 위해, LAL 파이로겐 키트(Pyrogen kit, Biowittak Walkersville, MD, 미국)를 사용하여 엔도톡신이 없는 실험조건에서 수행하였으며, 100㎕의 표준물질과 PG101-1, PG101-2 또는 대조물질인 PBS(Phosphate Buffered Saline) 100㎕을 100㎕의 LAL 시약과 섞고 1시간 동안 37℃에서 방치한 후, 각 튜브의 젤라틴화 상태를 확인하였다.

LAL(Limulus Amebocyte Lysate)은 투구게(Limulus polyphemus)의 순환혈액세포의 추출물로 엔도톡신과 만나게 되면 다단계의 효소반응에 의해 최종적으로 겔을 형성하는 반응을 일으키며, 이를 기초로 엔도톡신에 의한 오염을 검출하는데 사용되게 된다.

실험 결과, PG101-1 및 PG101-2의 엔도톡신양은 0.015 EU/㎎이하였음을 확인하였다.

실험예 3. PG101-1에 의한 단핵구세포에서의 사이토카인 생성 확인

PG101-1의 면역증강효과를 확인하기 위해, PG101-1을 인간 말초혈액의 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 처리하여 사이토카인의 변화를 측정하였다.

혈액 샘플은 건강한 자원자들로부터 수집되어 항응혈제인 EDTA를 처리하였고, 단핵구세포인 PBMC는 피콜-하이파큐(Ficoll-Hypaque, Amersham pharmacia Biotech사) 농도구배 원심분리에 의해 분리되었다. 단핵구와 대식세포로서, 대략 1×10⁷개의 CD11b/Mac-1 (BD PharMingen사, 미국) 세포를 사용하였으며, B 세포로서 CD19(BD PharMingen사, 미국) 항체를 0℃ 에서 40분간 처리하였고, 세포들은 항-마우스 IgG(10㎍/㎖)로 코팅된 배양디쉬에 놓고 4℃에서 1시간 동안 처리하였으며, 세포들을 1% 소태아혈청(FBS)를 함유한 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.2)로 수세하고, 스크래퍼(scrapper)를 사용하여 디쉬에 붙은 세포를 수집하였다. T 세포를 분리하기 위하여, PBMCs에 인간 CD3에 대한 마우스 단일클론 항체(Miltenyi Biotech사, 독일)가 컨쥬게이트된 마이크로비드 (microbead)를 4℃에서 30분 동안 처리하였고, 제조회사의 방법에 따라 세포-항체 혼합액을 자성 컬럼(magnetics column)에 통과시켰다. 이 컬럼을 1% 알부민이 함유된 PBS로 씻은 후, 컬럼에 붙어있는 세포들을 같은 완충액으로 용리(elution) 시키고, 분리된 세포들은 형광활성세포수집기(FACS)를 사용하여 분석하였으며, 주어진 항체에 80% 이상의 정제도를 보인 세포들을 본 실험에 사용하였다. 위 세포들에 PG101-1 10 ㎍/㎖를 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였으며, 양성대조군으로 지질 다당체인 LPS(Sigma사) 10ng/㎖를 사용하였고, 세포 배양액에서의 사이토카인 수치는 상용화된 ELISA 키트(Endogen사, 미국)를 사용하였다. 24시간 후의 사이토카인 생성 정도를 발색에 의하여 측정하였으며, 마이크로 플레이트 리더(Versamax tunable microplate reader, Molecular Devices사, 미국)를 사용하여 흡광도를 측정한 후, 표준 농도 곡선에서 사이토카인의 양을 계산하였다. 이들 사이토카인에 미치는 PG101-1의 효과정도에 따라 4가지 카테고리로 분류하였다.

실험 결과, 하기의 표 1과 같이 많은 사이토카인의 기본적 수치는 매우 낮거나 측정되지 않는 범위에 있었으나, PG101-1을 처리함으로써 몇몇의 사이토카인의 수치는 매우 급격히 증가하였다. TNF-α및 IL-1β가 속해있는 제 1군 사이토카인은 PG101-1에 의해 1,000배 이상의 증가 수치를 보이며, 양성대조군으로 사용한 LPS에 의한 것보다 훨씬 높았음을 확인할 수 있었다. IL-10 및 IL-12가 속해있는 제 2군 사이토카인은 평균 100배 정도 증가하였으며, GM-CSF 및 IL-18이 속해있는 제 3군 사이토카인은 PG101-1 처리 전에 존재하는 기본적 수치가 매우 높은 특징이 있으며, 실제로 PG101-1 처리시 10배 이하까지 증가되었다. 그리고 IFN-α 및 IL-4가 속해있는 제 4군은 PG101-1을 높은 농도로 처리하여도 반응을 보이지 않았다. 실제로 PG101-1이 몇몇 선택적인 사이토카인의 수치를 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, PG101-1 10㎍/㎖는 대부분의 사이토카인에 있어서 최상의 효과를 보이는 농도라는 것을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

PG101-1의 사이토카인 생성 영향

군	사이토카인	유도 배수(Fold Induction)
		PG101-1(10㎍/㎖)	LPS(10ng/㎖)
1	TNF-α	1,400 ±21	915 ±61
	IL-1β	1,540 ±391	97 ±2
2	IL-10	223 ±17	201 ±78
	IL-12	223 ±24	136 ±2
3	GM-CSF	9 ±0.4	7 ±0.3
	IL-18	8 ±0.6	4 ±0.6
4	IFN-α	-	-
	IL-4	-	-

실험예 4. PG101-1 농도 변화에 의한 사이토카인 의존도 실험

PG101-1의 단핵구 세포내에서의 사이토카인의 생성을 유발하는 것을 확인하고, PG101-1의 농도변화에 따른 의존도 실험을 수행하였다.

상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실시하였으며, 각 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 PG101-1을 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였으며, 24시간 후 상용화된 ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여, PG101-1에 반응을 보인 제 1군 내지 제 3군의 사이토카인 수치를 측정하였다.

실험 결과, 제 1군 및 제 2군 사이토카인은 PG101-1 1㎍/㎖일 때, 대수적인 증가를 보였으며, 더 높은 농도에서는 하향하는 추세를 보였다. 제 1군 사이토카인의 수치는 PG101-1 100㎍/㎖일 때 가장 높았으며, 제 2군 사이토카인의 최고 수치는 PG101-1 10㎍/㎖ 농도일 때였고, 제 3군 사이토카인들의 반응은 특징적으로 느렸으며, PG101-1 10㎍/㎖일 때 가장 높았고, PG101-1에 영향을 받은 대부분의 사이토카인들이 농도 의존적임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

실험예 5. PG101-1 투여 시간에 의한 사이토카인 의존도 실험

PG101-1의 투여 시간에 따른 사이토카인의 생성 관계를 규명하기 위해, 시간 의존도 실험을 수행하였다.

상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실시하였으며, 10 ㎍/㎖의 PG101-1을 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였으며, 2, 6, 12 및 24시간마다 상용화된 ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여, PG101-1에 반응을 보인 제 1군 내지 제 3군의 사이토카인 수치를 측정하였다.

실험 결과, 대부분의 경우는 하기의 표 2와 같이 PG101-1 처리 후, 12시간 내지 24시간이 경과시 최고의 생성도를 보였다(표 2 및 도 3 참조). 최초로 검출되는 사이토카인은 제 1군의 TNF-α로서, PBMCs에 PG101-1 10㎍/㎖ 처리한 후, 2시간 만에 TNF-α의 수치가 100배 이상 증가하였으며, 같은 제 1군인 IL-1β의 반응은 TNF-α보다 느렸고, PG101-1 처리 6시간 후 대략 40배 정도로 증가하였다. 제 2군의 사이토카인에 대하여는 PG101-1의 처리 후 12시간에 50배 정도 증가하는 것으로 나타났는데, 그중 IL-12의 반응은 처리 후 2시간에 2배 정도 증가하기 시작하였으며, 제 3군의 사이토카인인 GM-CSF 및 IL-18은 PG101-1 처리 후 24시간 경과시에 활성화된 것을 볼 수 있었다. 결과적으로 10배 정도의 활성화를 기준으로 하였을 때, TNF-α, IL-1β, IL-10/IL-12, GM-CSF/IL-18의 순서대로 활성화되는 것을 알 수 있었으며, 시간 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

PG101-1에 의한 사이토카인-시간의존도 생성 확인 (단위; 배)

군	사이토카인	시 간
		2시간	6시간	12시간	24시간
1	TNF-α	100 ±14	550 ±26	1105 ±8	1450 ±34
	IL-1β	1 ±0.4	38 ±2	211 ±5	493 ±40
2	IL-10	1 ±0.2	1 ±0.5	50 ±1	150 ±30
	IL-12	2 ±0.3	7.7 ±0.4	51 ±22	75 ±39
3	GM-CSF	1 ±0.5	1.3 ±0.7	2.9 ±1.6	7.5 ±3.6
	IL-18	1 ±0	3 ±0.5	3 ±1.2	17 ±5

실험예 6. PG101-1에 반응하는 면역세포의 결정

PG101-1에 영향을 받는 주세포 타입을 결정하기 위하여, PBMCs에 세포막 단백질에 대한 항체를 이용하였다.

PBMCs에 각각의 세포에 특이적 항체를 사용하는 패닝(Panning) 방법으로서 대식세포/단핵구, T 세포 및 B 세포로 분류하였다. 각각 대식세포/단핵구를 분리하기 위해서는 CD11b/Mac-1, B 세포는 CD19 세포표면단백질에 대한 항체와 배양한 후, 항-IgG에 대한 항체로 도포되어 있는 용기에서 배양한 후 용기에 붙은 세포만을 얻었다. T 세포를 분리하기 위해서는 CD3에 대한 항체가 결합된 마그네틱 비드를 PBMCs와 함께 배양한 후, 자석 세포 분리기(MiniMACs, Miltenyi Brotec, 미국)를 사용하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포의 정제도는 같은 항체를 사용한 FACS 분석으로 확인하였다.

결과적으로, 각 세포군은 80% 이상 동일한 종류의 세포로 구성되어 있었다. 각 세포군에서 PG101-1에 의하여 사이토카인이 생성되는지 보기 위하여 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

실험 결과, 하기 표 3과 같이 B 세포, T 세포는 사이토카인 생성에 있어서 PG101-1의 영향을 받지 않았음을 확인할 수 있었고, 대조적으로 대식세포/단핵구의 계통을 포함하는 CD11b/Mac-1 양성세포는 PBMCs와 유사하게 PG101-1에 반응함을 알 수 있었다(표 3 참조), 결과적으로 대식세포/단핵구 및 관련 세포가 PG101-1이 작용하는 주요 세포 타입이라는 것을 확인할 수 있었다.

인간 PBMC를 이용한 PG101-1의 세포 타입 결정

군	사이토카인	세포 타입
		PBMCs	대식세포(CD11b+)	B 세포(CD19+)	T 세포(CD3+)
1	TNF-α	+++	+++	-	-
	IL-1β	+++	++	-	-
2	IL-10	++	-	-	-
	IL-12	++	+	+/-	-
3	GM-CSF	+	+++	-	-
	IL-18	+	-	-	-
4	IFN-α	-	-	-	-
	IL-4	-	-	-	-

(++++; 500배 이상, ++; 50 ~ 500배, +; 10배, -; 변화 없음)

실험예 7. PG101-1을 처리한 인간 세포 주에서의 사이토카인 측정

단핵구 기원인 인간 세포주를 사용하여 PG101-1의 주요 세포 타입을 확인하기 위하여, T 림포이드세포주인 Jurkat(ATCC사) 및 인간 다능적혈구모세포성 백혈병세포주(human erythroblastic leukemia)인 K562(ATCC사), 인간 전단구(premonocyte) 세포주인 U937(ATCC사)를 사용하였고, 각 세포주는 FBS를 10% 함유한 DMEM 또는 RPMI 1640 배지(200㎍/㎖ 스트렙토마이신, 120㎍/㎖ 페니실린 G 첨가)에서 유지되었으며, 각 세포주에 PG101-1 250㎍/㎖를 처리하여, 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였고, 24시간 후, PG101-1을 처리한 세포에서의 유발된 사이토카인의 양을 측정하기 위해, TNF-α(Endogen사, 미국), IFN-γ(Endogen사, 미국), IL-1β(Endogen사, 미국), IL-4(Endogen사, 미국), IL-10(Endogen사, 미국), IL-12(Endogen사, 미국), GM-CSF(Endogen사, 미국) 및 IL-18(Medical and biological Laboratories사, 일본)의 상용화된 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

실험 결과, Jurkat과 K562 세포주는 PG101-1에 거의 영향을 받지 않았고, 반면에 U937은 PBMCs 또는 일차 단핵구/대식세포와 유사한 반응을 나타내었으며, 이로서 PG101-1의 주요 세포 타입이 대식세포 계통의 세포들이라는 것을 확인할 수 있었다.

다양한 인간 세포주를 이용한 PG101-1의 영향

군	사이토카인	세포주
		U937	K562	Jurkat
1	TNF-α	++	-	+
	IL-1β	+++	-	-
2	IL-10	++	-	-
	IL-12	++	-	-
3	GM-CSF	++	++	-

(+++; 500배 이상, ++; 50 ~ 500배, -; 변화 없음)

실험예 8. PG101-1에 의한 NF-κB 활성화 확인 실험

8-1. 리포터 플라스미드를 이용한 세포내 일시적 형질 도입

PG101-1에 의한 다양한 사이토카인의 활성의 분자적 기작을 밝혀내기 위하여 세포전사인자에 대한 PG101-1의 영향을 알아보는 실험을 수행하였다.

핵 전사 인자인 NF-κB(Nuclear factor kappa-B), 세포내 활성 전사 인자인 AP-1(Activator Protein-1) 및 cAMP 신호 전달 기작에 기능을 하는 전사 인자인 CREB가 결합하는 CRE(cyclic AMP respose element) 부위를 가지고 있는 리포터 플라스미드들(stratagene사, 미국)을 사용하였으며, 이것은 루시퍼라제 (luciferase)를 암호화하는 염기서열을 가지고 있다. 2㎍의 리포터 플라스미드와 0.5㎍의 β-갈락토시다제(galactosidase) 플라스미드를 인간 배아 신장세포(human embryonic kidney cell) 293세포(ATCC사)에 일시적으로 도입시킴(Pear et al.;P.N.A.S. USA,90, pp8392-8396, 1993)으로써 전사인자의 활성을 측정하였고, 도입 후 6시간 후, 세포에 PG101-1 250㎍/㎖를 처리하여 18내지 24시간 정도 배양하였다. 세포질 단백질을 준비하여 루시퍼라제 리포터 키트(Promega사)와 리포터 마이크로플레이트 루미노메터(Turner Instruments사)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

사이토카인 유전자의 프로모터의 구조는 도 4에 나타나 있으며, NF-κB 결합 염기서열은 IL-10, IL-18을 제외한 4개의 프로모터에서 발견되었고 (Hiscott et al.;Mol. Cell. Biol.,13, pp6231-6240, 1993), AP-1 결합 부위는 TNF-α, IL-1β 및 GM-CSF의 프로모터 내에서 또한 발견되며(Abe et al.;J. Rheumatol.,24, pp420-429, 1997 : Rhoades et al.;J. Biol. Chem.,267, pp22102-22107, 1992),TNF-α, IL-1β 및 IL-12의 프로모터는 CREB와 상호작용할 수 있는 염기서열을 가지고 있다(Chandra et al.;J. Immunol.,155, pp4535-4543, 1995 : Yao et al.;J. Biol. Chem.,272, pp17795-17801, 1997). 이 결과를 기초로 하여 PG101-1의 세 전사인자에 대한 효과들을 확인하기 위해, 처음으로 리포터플라스미드들을 사용하여 일시적 형질 도입(transient transfection)을 수행하였으며, 이 플라스미드들 내에 합성된 프로모터는 최소의 일반적인 전사 기구와 각각 전사인자가 결합하는 짧은 염기서열의 다수의 복사본(copies)으로 구성되어 유전자 발현을 일으키게 된다. 루시퍼라제의 암호화서열은 이 조절부위로부터 아랫부분에 위치하고 있으며, 이 루시퍼라제의 발현은 각각의 전사인자의 존재여부에 의존하게 된다. 293세포는 각각의 리포터 플라스미드들로 형질 도입되어졌으며, PG101-1을 처리하고 24시간 후, 세포질 단백질을 사용하여 루시퍼라제 활성 수치를 측정하였다. 100 ㎕ 세포질 단백질에 루시퍼라제 기질 용액 100 ㎕를 혼합한 후 루미노미터를 이용하여 활성수치를 측정하여 PG101-1을 처리하지 않은 군에서 나타나는 대조값에 대한 배율 (fold induction)로서 활성을 비교하였다.

실험 결과, PG101-1을 처리한 NF-κB 리포터 플라스미드를 사용하였을 때의 루시퍼라제 활성수치는 60배까지 증가하였으며(도 5 참조), CREB 리포터 플라스미드로부터의 루시퍼라제 활성 수치는 5배 미만으로 증가하였고, AP-1는 어떤 유의적인 효과를 나타내지 않았다(도 5 참조). 이로서 PG101-1에 의해 NF-κB가 유의적으로 활성화됨을 확인할 수 있었다.

8-2. 전기적 이동변화실험(Electro Mobility Shift Assay, EMSA)

세포내 전사조절인자들의 상호작용과 PG101-1에 의한 NF-κB의 발현에 미치는 영향에 대해 전기적 이동변화실험(EMSA)의 분자유전학 방법을 이용하여 수행하였다.

NF-κB는 면역과 염증과정을 조절하는 중요한 인자로서, PG101-1에 의한 NF-κB 발현을 확인하기 위해, U937세포 5 ×10⁵개/㎖를 16 내지 20시간 배양하여 지정된 시간에 PG101-1로 자극하고, PG101-1 처리전과 처리후의 세포를 이용하여 핵 추출물(nuclear extracts)을 준비하였다(Phares et al.;J. Virol. 66, pp7490-7498, 1992). 3㎍의 폴리(dI-dC), 0.3ng의 방사성표지된 이중나선 NF-κB 프로브(서열번호 1) 및 3㎍의 핵추출물을 결합완충액(10mM 트리스-염산, pH 7.5, 50mM 염화나트륨, 1mM DTT, 5% 글리세롤, 2㎍ BSA, 3mM GTP)에 첨가하여 반응혼합액 최종부피 20㎕로 상온에서 20분간 반응시켰으며, 그 후, 반응액은 낮은 이온 강도를 갖는 4% 폴리아크릴아마이드젤에서 러닝완충액(6.7mM Tris-HCl, pH 7.5, 3.3mM 소디움 아세테이트, pH 7.0, 1mM EDTA, pH 7.5)을 사용하여 분석하였다. 지연된(retarded) 복합체의 특이성은 정상타입 또는 돌연변이 형태의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2)를 40배 이상 사용하여 경쟁을 시킴으로써 확인하였다. 상기 NF-κB 프로브는 NF-κB와 상호작용하는 것으로 알려진 HIV LTR 프로모터의 -86 내지 -116부분에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를³²P로 표지하여 함께 반응시켰다.

실험 결과, PG101-1을 처리하지 않은 세포는 NF-κB 활성에서 매우 낮은 기본적인 수치를 나타내었으며, 반면에 PG101-1을 처리한 세포는 전기영동상 지연된 DNA-단백질 복합체의 양이 매우 증가하였음을 확인하였다(도 6의 레인 3 참조). 이것은 표지하지 않은 정상 타입 NF-κB 염기서열에 의해 효과적으로 경쟁되며, 또한 3개의 염기서열 변화가 있는 돌연변이 올리고뉴클레오타이드에 의해서도 효과적으로 경쟁되어지기 않으므로(도 6의 레인 4, 5 참조), 이 복합체는 NF-κB에 특이적이라는 것을 확인할 수 있었다.

8-3. PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate) 실험

PG101-1 매개 사이토카인의 활성화에 있어서 NF-κB의 관계를 상세히 확인하기 위하여, NF-κB의 활성을 특이적으로 억제하는 피롤리딘디티오카바메이트(PDTC, Sigma사, 미국)에 의해서 PG101-1에 의한 사이토카인의 활성이 억제될 수 있는지 실험을 수행하였다(Ziegler-Heitbrock et al.;J. Immunology,151, pp6986-6993, 1993).

100 μM농도로 PDTC를 인간 혈액으로 분리한 PBMCs에 처리한 후 한시간 뒤에 PG101-1 10 ㎍/㎖을 처리한 후, 24 시간에 세포배양액의 사이토카인 수치를 실시예 3과 같은 방법으로 측정하였다.

실험 결과, PDTC 100μM을 처리하였을 때의 각 TNF-α, IL-1β, IL-10, IL-12 및 GM-CSF의 사이토카인 수치는 완벽하게 억제되었으며(도 7a, 도 7b, 도 7d, 도 7e 참조), 프로모터내에 NF-κB 결합부위를 갖고 있지 않은 IL-10과 IL-18 의 경우에도 그 활성화가 저해 되는 것을 관찰하였는데 (도 7c, 도 7f 참조), PG101-1에 의한 IL-10과 IL-18의 활성화에 NF-κB가 간접적으로 관여하고 있을 가능성을 나타낸다. 결과적으로 PG101-1이 세포전사인자인 NF-κB를 조절하여 이 NF-κB로부터 영향받는 사이토카인들의 발현을 조절할 수 있다는 사실을 명백히 확인할 수 있었다.

이로서, PG101-1은 면역 관련 세포전사인자인 NF-κB를 조절하여 다양한 면역관련 사이토카인의 발현을 증강시키고 면역력을 상승시켜주므로, 안전하고 효과적인 면역 조절제로서 면역 질환에 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 9. MTT 시험법을 이용한 PG101-1의 독성검사

PG101-1의 독성을 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 티아졸일 블루) 시험법을 수행하였다.

백혈병 세포주인 U937, 암세포주인 HT1080(ATCC사)과 말초혈액 단핵구세포인 PBMC 세포를 96 웰 플레이트에 한 웰당 5,000개 정도로 넣고, PG101-1의 농도를 각 0 내지 10,000 ㎍/㎖(0, 312.5, 625, 1250, 2500, 5000, 10,000)를 넣어 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에 넣어 배양하였다. 96시간 후에 살아있는 세포를 MTT(Sigma사) 5 ㎎/㎖로 30분 동안 염색시키고, 배양액을 제거한 후, 200㎕ 디메틸술폭시드(DMSO, dimethyl sulfoxide, Sigma사, 미국)를 첨가하여 포마잔 결정을 용해시켰으며, 540nm에서 ELISA 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하였다. IC₅₀수치는 무처리 대조군에 비해 세포의 수가 50% 감소되는 때의 약물의 농도로 정의하였으며, 이들 수치는 생존율(%)과 약물농도의 세미로그플랏트로부터 구해진다(도 8a 와 도 8b 참조).

실험 결과, 96시간 배양 후 50%의 성장 억제를 보이는 IC₅₀일 때, HT1080 세포의 PG101-1 수치는 976㎍/㎖이었으며, U937세포에서는 1951㎍/㎖, PBMCs는 703㎍/㎖ 이었음을 확인하였다.

실험예 10. 콜로니 형성 분석

방사선 조사 후의 콜로니 형성을 통한 PG101-1의 면역 증강 효과를 알아보기 위해, 실험을 수행하였다.

체중 18 내지 20g의 8 내지 10주령 암컷 Balb/c 마우스(서울대학교 실험동물센터)를 환기되는 상자에 넣은 후, 4개의 군으로 나누어 양측면으로 코발트-60 소스 텔레테라피 유니트(Cobalt-60 source teletherapy unit, Model V9, Picker사)의 감마선을 조사하였으며, 노출시간은 각 실험동물에게 조직에 흡수되는 양이 평균 6 Gy 정도 되도록 조절하였다. 제 1군의 마우스는 방사선 조사 하지 않았으며 음용수를 처리하였으며, 제 2군의 마우스는 6 Gy의 방사선을 조사한 후, PBS(Phosphate buffered saline, pH 3.2)를 투여하였고, 제 3군은 방사선 조사된 마우스에 한 마리당 본 발명의 실시예 1에서 제조된 PG101-1 10 ㎎을 매일 24일 동안 경구투여 하였으며, 제 4군은 방사선 조사된 마우스에게 골수세포를 과립백혈구로 분화하도록 유도하는 콜로니 자극인자 G-CSF(granulogyte-colony stimulating factor) 3㎍을매일 피하주사 하였으며, 처리 후 각 8일, 16일, 24일에 제 1군 내지 제 3군의 마우스를 경추 탈골시킨 후, 골수 세포 1×10⁵/웰을, 성장인자를 포함하는 메틸셀룰로오즈(IMDM 배지에 녹인 1% 메틸셀룰로오스, 15% 소태아혈청(FBS), 10⁴M β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 10ng/㎖ IL-3, 50ng/㎖ SCF 및 3 유니트/㎖ 에리트로포이에틴(Stem Cell technologies사, 캐나다) 분석시스템의 플레이트에서 1×10⁵세포/㎖의 농도로 37℃, 5% 이산화탄소를 함유한 인큐베이터에서 배양시켜, 10일 후에 형성된 총 콜로니 수를 측정하였으며, 대조군으로 사용할 제 4군의 비방사선 조사 마우스의 골수세포도 수세한 대퇴골로부터 수집되어 IMDM 배지에서 배양되어 상기와 동일한 방법으로 생성된 콜로니 수를 측정하였다. 50개 이상의 세포로 구성되었을 경우를 1 개의 콜로니로 카운트하여, 모두 각 3개의 웰에서 실험하여 평균과 표준편차를 구하였으며, 생성된 콜로니 타입을 형태학적 관찰로 분류하였다.

실험 결과, 제 2군인 PBS 투여군의 골수세포에서는 8일째에도 CFCs를 거의 형성하지 않았고, 24일까지 낮은 수준으로 유지되었으며, 이와는 대조적으로 제 3군인 PG101-1 투여군으로부터 분리한 골수세포에서는 CFCs의 수가 8일째에 거의 정상수준에 가까웠으며, 24일 동안 높은 수치를 계속 유지하였고, 제 4군인 G-CSF 투여군도 또한 거의 정상치의 CFCs를 형성하였다(도 9a 참조).

형성된 콜로니 타입의 형태학적인 특징을 살펴보면, 제 2군인 PBS 투여군은 과립구계 또는 단구계의 콜로니를 만들 수 있는 세포인 CFU-GM(colony forming unit-granulocyte and monocyte-committed stem cells) 또는 적혈구계의 큰 세포집락을 형성하는 BFU-E(Burst forming unit-erythroid) 등의 콜로니가 형성되지 않았고, 대조군보다 훨씬 낮은 수치로 나타났으며, 반면에 제 3군인 PG101-1 투여군은 CFU-GM 수는 제 1군인 비방사선 조사된 정상마우스와 필적할만한 수준이었으며, 제 4군인 G-CSF 투여군은 CFU-GM의 비정상적인 증가를 보여주었다(도 9b 참조). 또한, PG101-1 투여군은 8일째의 BFU-E 수치가 비방사선 처리한 대조군의 절반 수준이었으나 24일째는 거의 정상수준에 도달하였고, G-CSF 투여군은 BFU-E에서도 높은 수치를 나타내었다(도 9c 참조). 결과적으로, PG101-1 투여는 과립백혈구와 대식세포로 분화할 조혈모 세포를 포함한 다양한 초기의 조혈모 세포의 형성을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 11. 유세포 분석(flow cytometric analysis)

PG101-1에 의해 영향 받는 골수 세포군 및 세포 계열에 대한 PG101-1의 효능을 알아보기 위해, 항체를 사용한 유세포 분석법(flow cytometric analysis)을 실시하였으며, 항체로는 ER-MP12(anti-CD31, PharMingen사) 및 FITC가 결합된 ER-MP20(anti-Ly-6C, PharMingen사), 바이오틴화된 c-Kit(anti-CD117, PharMingen사), Gr-1(anti-Ly-6G, PharMingen사) 및 이차 콘쥬게이트 항체인 피코에리트린 (phycoerythrin, PE)이 콘쥬게이트된 스트렙트아비딘(SAv-PE, Sigma사)을 사용하였다.

11-1. ER-MP12 및 ER-MP-20 항체를 이용한 유세포분석

대퇴골수세포를 2% FBS와 0.1% 소디움아지드를 함유한 PBS(FACS 완충액)로 수세한 후, 25% 정상 래트 혈청을 함유한 FACS 완충액에서 4℃에서 30분 동안 전배양(preincubation)시켰으며, 이 세포들에 바이오틴화된 항-마우스 ER-MP12의 포화양을 함유한 혼합액 100㎕를 첨가하여 4℃, 어두운 곳에서 30분 동안 반응을 수행한 후, FACS 완충액으로 2번 수세하고 PE가 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 (SAv-PE, Sigma사) 또는 FITC가 컨쥬게이트된 ER-MP20과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포들을 다시 FACS 완충액으로 수세한 후 500㎕ FACS 완충액에 녹였고, 유세포 분석은 FACSort(Becton Dickinson사)와 데이터 수집 및 분석 소프트웨어인 셀퀘스트(Cellquest, Becton Dickinson사)로 수행하였으며, 모든 실험에 있어서, 비특이적 염색은 이소타입 항체를 사용하여 확인하였다.

ER-MP12는 세포 표면 위에 있는 CD31/PECAM-1과 결합하는데, 조혈모 세포에서 CD31/PECAM-1은 초기 조혈단계에서 발현되지만, 분화의 후반 단계 동안에는 존재하지 않는 특징이 있고(Slieker WA et al.;Int. Immunol.,5, pp1099-1107, 1993), ER-MP20은 콜로니 형성세포가 과립백혈구와 단핵구로 분화하는 동안에 발현되는 Ly-6C 단백질과 결합한다는(de Bruijn MF et al.;Eur. J. Immunol.,24, pp2279-2284, 1994 : de Bruijn MF et al.;J. Immunol. Methods,217, pp27-39, 1998) 것이 알려져 있다. 도 10a에서 보는 바와 같이, 이들 단백질들의 상대적인 존재에 따라 골수 세포를 서로 다른 6종류의 아개체군으로 나눌 수 있으며(van de Loo Jc et al.;Blood,85, pp952-962, 1995), 편의상 각 아개체군은 부분집합군 1내지 6으로 명명하였다. 두 가지색 유세포 분석에 의해, 골수 아개체군내의 변화는 PG101-1 처리 후에 분석되었으며, 대조군으로 방사선 조사 후 PBS 또는 G-CSF를 투여한 마우스에서 분리한 골수세포를 사용하였다.

실험 결과, 정상마우스의 골수세포의 특징적 두 가지 염색 패턴은 도면 2a에 나타나 있으며, 방사선 조사된 PBS 투여군 마우스의 제 3 부분집합 세포수는 유의할만하게 증가되었다(도 10b 참조). 이런 부분집합군들은 주로 적혈구세포이거나 죽은 세포들로 이루어졌으므로, 증가된 세포의 수는 손상된 세포의 수가 증가했다는 것을 나타내었다. PG101-1 투여군의 경우 제 4 부분집합군 및 제 5 부분집합군(ER-MP12⁺20⁺및 ER-MP12^-20^med)에서의 세포의 수는 효과적으로 증가되어 정상마우스에서와 거의 동등했으며(도 10c), G-CSF 투여군에서도 유사한 결과를 볼 수 있었다(도 10d).

이로서 PG101-1이 과립백혈구 또는 초기 골수계열 조혈모세포에 작용하여 세포 증식을 유도함을 확인할 수 있었다.

11-2. c-Kit와 Gr-1을 이용한 유세포 분석

과립백혈구 계통의 골수세포의 분화에 대한 PG101-1의 효능을 알아보기 위해, 상기 실험예 11-1과 동일한 방법을 수행하여 실시하였다.

골수세포에서 c-Kit과 Gr-1의 발현을 조사하기 위하여, PE가 컨쥬게이트된 항마우스 c-Kit 항체 또는 PE가 컨쥬게이트된 항마우스 Gr-1 항체를 각각 동일한실험조건(4℃, 30분) 하에서 사용하였으며, 유세포 분석은 FACSort(Becton Dickinson사)와 데이터 수집 및 분석 소프트웨어인 셀퀘스트(Cellquest, Becton Dickinson사)로 수행하였고, 모든 실험에 있어서 비특이적 염색은 이소타입 항체를 사용하여 확인하였다.

c-Kit은 줄기 세포 인자(stem cell factor)에 대한 수용체로서, 원시 전능 줄기 세포 (pluripotent stem cell)에서는 발현이 매우 낮게 유지되고 있다가 다음 단계에서 다능 조혈모 세포 (multipotent progenitor)로 분화될 때, c-Kit 단백질의 발현이 증가하게 되고(Doi H et al.;P.N.A.S.USA,94; pp2513-2517, 1997), 반면에, 세포가 특정 계통으로 분화된(lineage-committed) 세포로 성숙하게 될 때는 c-Kit의 발현은 감소한다고 알려져 있으며(Muller-Sieburg CE;J. Exp. Med.,167, pp1825-1840, 1988), 본 발명자는 또한 조혈모 세포에서는 발현되지 않지만 조혈모 세포가 대식세포 또는 과립백혈구 계통으로 분화됨에 따라 높게 발현이 되는 Gr-1 단백질(Fleming T. J. et al.;J. Immunol.,151, pp2399-2408, 1993)의 발현 정도를 조사하기 위하여, 골수 세포들을 c-Kit 또는 Gr-1 항체를 사용한 단색 유세포 분석방법으로 분석하였다.

실험 결과, 방사선 조사된 마우스에서의 c-Kit 양성세포(전체 골수의 17.8%에 해당하는 대퇴골수로부터 얻어진 세포)의 백분율은 16일째에 19.52% 이었고(도 11f 참조), PG101-1 투여군에서는 24.87% 정도로, 실제로 PG101-1을 투여한 마우스에서 c-Kit 양성세포의 수가 훨씬 높은 수치를 나타냈으며, G-CSF 투여군 마우스에서도 비슷한 양상을 관찰할 수 있었다(도 11g, 도 11h 참조). 보통 c-Kit 양성세포의 백분율이 골수에서는 매우 낮은 수준으로 유지되기 때문에, 대조군 마우스와 비교하였을 때 PG101-1 투여군의 c-Kit 양성세포가 25% 가량이 증가한 것은 매우 중요한 사실이며, 이것은 PG101-1이 c-Kit 양성 조혈모 세포들의 발달에 자극을 주는 탁월한 효과가 있다는 것을 알려주는 것이다.

24일째부터는 전체 골수세포에서의 c-Kit의 발현이 더 이상 증가되지 않았으며, 더욱 흥미로운 것은 PG101-1 투여군에서 16일째에는 보이지 않았던 새로운 세포 집단이 발생한 것으로서(도 11c를 도 11k와 비교 참조), 대조군의 도트 플랏트(dot plot)와 전체적으로 유사한 패턴을 나타내고 있다(도 11i 및 도 11k 비교 참조). 또한, 방사선 조사된 PBS 투여군 마우스에서 c-Kit 음성이면서 Gr-1 양성인 세포수는 매우 낮았으며(도 11n, 도 11r 참조), G-CSF 투여군에서도 비슷한 결과를 보였다(도 11p, 도 11t 참조). 형광 패턴에서 c-Kit 음성이고, Gr-1 양성임을 나타내는 것을 성숙한 과립백혈구의 수가 증가하는 것을 의미하며(도 11o, 도11s 참조), 결과적으로 PG101-1이 조혈모 세포의 분화와 과립백혈구 계통과 관련된 세포들의 증식을 효과적으로 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 12. 사이토카인 함량 측정

방사선 조사된 마우스에 PG101-1 투여시의 사이토카인 생성을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

실험예 10의 방법에 따라 방사선 조사된 마우스에 PG101-1를 매일 10mg씩 경구투여하여, 8, 16, 24일째에 혈청내 유발된 사이토카인의 양을 측정하기 위해 상용화된 TNF-α(Endogen사, 미국), IL-1β(Endogen사, 미국), IL-6 (Endogen사, 미국), GM-CSF(Endogen사, 미국)의 ELISA 키트를 사용하여 PG101-1을 투여한 마우스에서의 유발된 사이토카인의 양을 측정하였다.

방사선은 사이토카인 발현에 있어서 심각한 조절장애를 가져온다고 알려져 있으며(Neta R and Oppenheim J. J;Blood,72, pp1093-1095, 1998), 현재 GM-CSF는 골수세포들의 증식과 분화에 중요한 역할을 하는 반면(Neta R et al.;Lymphokine Res.,5, p105-110,1986), IL-1β 및 IL-6은 방사선 조사후 혈액세포의 회복에 관련이 있다고 보고되었다(Neta R. et al.;J. Exp. Med.,175, pp689-694, 1992; Zeidler C et al.;Blood,80, pp2740-2745, 1992). 반면에 방사선에 의한 조직 손상은 TNF-α의 생성을 촉진하며 이는 생체에 유해한 영향을 나타낸다는 것이 보고되었다 (Socie G et al.;C. R. Acad. Sci. Ⅲ,319, pp711-716, 1996; Teramura M and Mizoguchi H;Oncologist,1, pp187-189, 1996).

실험 결과, 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 GM-CSF의 경우는 PG101-1 투여군에서 매우 증가하였으며(도 12a, 도 12b, 도 12c 참조), 이와 대조적으로, TNF-α의 함량은 방사선 조사 후에 증가하였으나 시간이 지남에 따라 감소하였다 (도 12d 참조). PG101-1은 방사선 조사에 대하여 회복력을 가지는 사이토카인의 혈액내 농도를 증가시키는 반면, 방사선 조사에 의하여 병리적 현상을 유도하는 사이토카인의 생성은 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 PG101-1은 면역계가 손상된 경우에 효과적인 BRM으로 사용될 수 있다.

실험예 13. 인간의 PBMCs 활성화 정도에 대한 PG101-1, PG101-2, 렌티난의 비교

잣버섯 균사체로부터 얻어진 물질, PG101-1이 PBMCs에 나타내는 활성정도를 비교하기 위해 잣버섯 자실체 추출물(PG101-2)과 표고버섯 자실체 추출물 (lentinan)을 PBMCs에 처리하는 실험을 수행하였다. 렌티난(lentinan)의 추출방법은 실시예 2의 추출방법과 동일하였다.

PBMCs는 건강한 사람으로부터 얻었으며 피콜-하이파큐(Ficoll-hypaque, Amersham-Pharmacia사)를 사용하여 농도구배를 통해 얻었다. 세포의 농도는 ㎖당 10⁶개로 10% FBS가 들어있는 RPMI 배지에 세포배양시키고 각 추출물을 10 ㎍/㎖로 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 배양된 배지를 얻어 상용화된 ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 각 추출물에 반응을 보인 사이토카인을 측정하였다.

실험결과, PG101-1에 의해 TNF-α의 발현이 PG101-2보다 2배 이상 많았지만 IL-12는 오히려 PG101-2 처리군에서 2배 이상 발현되었다. IL-1β, IL-10, GM-CSF에서는 두개간의 발현이 비슷하였다. 렌티난의 경우 모든 사이토카인의 생성에 있어서 PG101-1, PG101-2보다 10배 이상 적게 발현되었다(도 13a 내지 도 13e 참조). 결과적으로 본 발명의 잣버섯 추출물 PG101-1 및 PG101-2가 렌티난보다 월등히 면역활성화에 유리한 것을 확인하였다.

실험예 14. PG101-1이 인간의 PBMCs에서 활성화시키는 사이토카인에 대한 칩분석

PG101-1이 활성화 시킬 수 있는 사이토카인에 대한 전반적인 분석을 하기 위하여 cDNA chip 분석을 실시하였다.

실험예 13과 같은 방법으로 인간의 PBMCs를 분리하고 PG101-1을 처리하였다. TRIzol(GibcoBRL, 미국)을 사용하여 PBMCs의 RNA를 추출하였다. 상용화된 RNA 형광 표지 도구를 사용하였다. 이때 등장액 처리한 대조군의 RNA를 이용하여 Cy3로 표지한 cDNA와 PG101-1 처리한 실험군의 RNA를 이용하여 Cy5로 표지된 cDNA를 얻었다. 각기 20 ㎍의 RNA를 사용하였으며 표지된 cDNA를 혼합하여 cDNA Chip (IntelliGene® Human Cytokine CHIP Version 2.0, Takara사, 일본)에 65℃에서 혼성화시킨 뒤 아피메트릭스 418 어레이 스캐너 (Affymetrix 418 array scanner, Affymetrix사, 미국)로 형광정도를 확인하였다. 칩에 심어진 각 유전자 점(spot)의 형광값에서 배경값을 빼서 발현값으로 하였다. 발현값은 대조군과 실험군에서 각기 얻었다. 활성값은 실험군의 발현값을 대조군의 발현값으로 나누어 얻었다. 표준화를 위하여 칩에 심어진 4개의 베타액틴(beta-actin) 유전자 점의 활성값에 대한 평균이 1이 되도록 모든 유전자의 활성값에 곱해주어 표준화된 활성값을 구했다. 표준화된 감소값은 대조군의 발현값을 실험군의 발현값으로 나누어 얻어진 감소값에 베타액틴으로 표준화시켜 얻었다.

실험결과, 표 5와 같은 유전자가 활성화 되었으며 표준화된 활성값은 같이 표기하였다. 표 6에서는 감소된 유전자를 표시하였다. 총 240개의 사이토카인과 그에 관련된 유전자가 심어진 유전자 칩 중에서 42개의 유전자가 PG101-1에 의해 활성화 되었으며 28개의 유전자가 발현이 감소한 것으로 나타났다.

유전자	Genebank Accession No.	활성화된 배수
I-309	M57506	188.3
IL-6	X04430	69.4
M-CSF	M37435	49.2
CCL20	U64197	40.4
GROα	X54489	33.7
Inhibin β	J03634	31.6
SPP1	AF052124	30.2
IL-1β	M28983	27.7
IL-1β	M15330	19.8
MIP-2α	M36820	16.6
MMP1	AK024818	15.8
SCYα3L	D90145	10.0
MMP15	Z48482	8.8
Hsp70	U56725	8.1
FLT	X51602	8.1
TNF-α	X02910	5.8
PDGFα	X06374	5.4
LIF	NM_00230	5.1
PDGFRα	M21574	5.0
MIP-1α	D90144	4.8
STM 16	U16261	4.6
BMP6	NM_00171	4.3
B Thrombin	M54995	4.0
MIP-1β	X01057	4.0
IL2Rα	J04130	2.4
MCP-1	M26683	2.2

유전자	Genebank Accession No.	활성화된 배수
CSF-1	X3663	-8.9
CCR2α	U95626	-8.4
IGR1	AL050337	-7.2
G-CSFR1	M59820	-7.1
Endoglin	NM_00011	-6.2
CD4	U47924	-5.3
TIMP2	AL110197	-4.7
CD86	U04343	-4.7
IFN-γinduced monokine	X72755	-3.7
CX3CR1	U20350	-3.0
TNF member 13	AF114012	-2.8
IL1R2	X59770	-2.8
IFN-αR2	U05875	-2.8
IL-10Rα	U00672	-2.7
HLA-DR7	M16941	-2.6
TNF member 10	U37518	-2.5
CXCR4	A147204	-2.5
G-CSFR2β	M59941	-2.5
TNF member 5	X68550	-2.4
HGFR	J02958	-2.4
Vitronectin R	M14648	-2.2
IL-10Rβ	Z17727	-2.2
Heme oxigenase 1	Z82244	-2.1
Caspase 3	U13737	-2.1
DRβ1	M32578	-2.0
E2D1	AF020761	-2.0

실험예 15. 노던 블롯을 통한 PG101-1에 의한 사이토카인의 활성화 측정

유전자 칩 실험을 통해 나온 유전자 활성을 재현하기 위하여 노던 블롯(northern blot)을 수행하였다.

상기 실험예 14와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다. 20㎍의 RNA를 포름알데히드(Formaldehyde)가 들어있는 아가로스젤에 전기영동을 시켜 RNA의 크기별로 분리하였다. 분리된 RNA를 모세관현상방법을 사용하여 나일론 막으로 이동시키고 80℃ 오븐에서 2시간동안 고착시켰다. TNF-α, IL-1β, IL-10 등의 프로브를 제작하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 사람의 PBMC에서 얻은 RNA 1㎍을 상용화된 역전사효소 킷트 (Superscript^TMII RT, Invtrogen사)를 사용해 역전사시켰다. 역전사된 cDNA와 각 프로브에 해당하는 프라이머를 이용하여 PCR 사이클러(PCR cycler)로 DNA를 증폭시켰다. 각 유전자의 프라이머 염기서열은 다음과 같다. TNF-α프라이머쌍은 서열번호 3에 기재된 5'-TTGAATTCTTAGTGGTTGCCAGCAC-3', 서열번호 4에 기재된 5'-GTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTG-3', IL-1β프라이머쌍은 서열번호 5에 기재된 5'-TCATCTTTCAACACGCAGGACAGGT-3', 서열번호 6에 기재된 5'-TCATCTTCAACACGCAGGACAGGT-3', IL-10 프라이머쌍은 서열번호 7에 기재된 5'-CTGCACCCACTTCCCAGGCAAC-3' 및 서열번호 8에 기재된 5'-CCCCAGCCCAGAGACAAGATAAA-3'을 사용하였다. 각 유전자의 프로브는 랜덤 프라이머 라벨링 키트(Prime-it RmT Random Primer Labeling Kit)을 사용하여³²P로 표지된 dCTP로 방사능표지를 하였다. 표지된 프로브와 RNA가 고착된 나일론 막을 혼성화시켜 각 프로브가 자신과 상보적인 RNA에 결합하도록 한 뒤 상보적으로 결합된 프로브는 X-ray 필름으로 감광시켜 확인하였다.

실험결과 유전자 칩에 의해 활성화 된 TNF-α, IL-1β, IL-10 등의 유전자 발현이 노던 블롯(northern blot)으로 재현됨으로서 유전자 칩의 결과를 신뢰할 수 있음을 확인하였다(도 14 참조).

실험예 16. PG101-1이 직접적으로 영향을 미치는 사이토카인의 규명

PG101-1에 의해 다양하게 분비되는 사이토카인 중에서 PG101-1이 직접적으로 발현을 유도시키는 사이토카인을 규명하기 위해 유전자 칩을 이용한 실험을 하였다.

상기 실험예 13과 동일한 방법으로 인간의 PBMC를 분리하였다. 실험군에는 PG101-1을 처리하기 1시간 전에 사이토카인의 단백질 합성을 저해하는 시클로헥사미드(cycloheximide)를 10 ㎍/㎖로 처리하였으며 PG101-1은 100 ㎍/㎖로 4시간동안 처리하였다. 대조군에는 시클로헥사미드만을 10 ㎍/㎖로 처리하였다. 이 후 실험방법은 실험예 2와 마찬가지 방법으로 수행하였다.

실험 결과 총 7개의 유전자가 활성화 된 것을 확인하였다(표 7 참조). 가장 많이 활성화가 된 유전자는 TNF-α로 14.7배 활성화되었으며 그 다음으로 Mip-1α와 같은 Mip 계열의 유전자가 활성화되었다. 또한 IL-8이 활성화되었다.

유전자	Genebank accession No.	활성화 배수	PG101-1 만
TNF-α	X02910	14.7	5.8
SCYA3L1	D90145	9.4	10
MIP-1α	D90144	7.2	4.9
MIP-1β	X01057	6.5	2.5
GRO2	M36820	6.3	16.6
IL-8	M26383	3.9	1.7
MIP-3α	U64197	2.5	40
IL-1β	M15330	1.3	20

실험예 17. PG101-1이 직접적으로 영향을 미치는 사이토카인의 규명에 대한 재현

상기 실험예 16에 의해 확인된 유전자를 노던블롯을 통해 재현을 하였다.

상기 실험예 14와 같은 방법으로 Trizol(Gibco BRL, 미국)을 사용하여 RNA를 추출한 뒤 상기 실험예 15와 같은 방법으로 노던 블롯을 수행하였다. 이때 IL-8과 Mip-1α의 유전자에 대해서도 프로브를 제작하여 노던 블롯을 하였다. IL-8의 프라이머쌍은 서열번호 9에 기재된 5'-GACATACTCCAAACCTTTCCA-3' 및 서열번호 10에 기재된 5'-ACTGTGAGGTAAGATGGTGGC-3'이며 Mip-1α의 프라이머쌍은 서열번호 11에 기재된 5'-AGCCTTGGGAAACATGCGT-3' 및 서열번호 12에 기재된 5'-CCCTGAACAAAAGCATCCGAT-3'을 사용하였다.

실험 결과, TNF-α, Mip-1α, IL-8은 시클로헥사미드에 상관없이 PG101-1에 의해서 유전자의 활성이 나타나고 있다. 이것은 PG101-1이 직접 이들 유전자를 활성화시킴을 다시 한번 증명한 것이다. 반면 IL-1β의 경우 시클로헥사미드를 처리하면 PG101-1에 의한 유전자의 활성이 감소하는데 이것은 IL-1βIL-1βIL-1β 의해 직접 활성화가 될 뿐만 아니라 다른 사이토카인에 의해서도 유전자의 활성이 나타난다는 것을 의미한다. 반면 IL-10의 경우 시클로헥사미드를 처리하면 완전히 활성이 사라지므로 IL-10은 발현된 다른 사이토카인에 의해서 활성이 나타나는 것을 알 수 있었다(도 15 참조).

실험예 18. PG101-1을 이용한 동물실험

실시예 1에서 제조된 PG101-1의 독성을 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.

ICR계 마우스(서울대학교 실험동물센터)와 5주령의 스프라구 도울리 (Sprague Dawley: SD)계 250 내지 300g 정도의 수컷을 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음, 본 발명의 PG101-1을 생물학적 유효 농도보다 20배 높은 4g/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여 후, 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.

본 발명의 잣버섯 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 PG101-1100 ㎎

소디움 메타비설파이트3.0 ㎎

메틸파라벤0.8 ㎎

프로필파라벤0.1 ㎎

주사용 멸균증류수적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 PG101-1200 ㎎

유당100 ㎎

전분100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 PG101-1100 ㎎

유당50 ㎎

전분50 ㎎

탈크2 ㎎

스테아린산마그네슘적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1의 PG101-11000 ㎎

설탕20 g

이성화당20 g

레몬향적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강식품의 제조

실시예 1의 PG101-11000 ㎎

비타민 혼합물적량

비타민 A 아세테이트70 ㎍

비타민 E1.0 ㎎

비타민 B₁0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C10 ㎎

비오틴10 ㎍

니코틴산아미드1.7 ㎎

엽산50 ㎍

판토텐산 칼슘0.5 ㎎

무기질 혼합물적량

황산제1철1.75 ㎎

산화아연0.82 ㎎

탄산마그네슘25.3 ㎎

제1인산칼륨15 ㎎

제2인산칼슘55 ㎎

구연산칼륨90 ㎎

탄산칼슘100 ㎎

염화마그네슘24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

실시예 1의 PG101-11000 ㎎

구연산1000 ㎎

올리고당100 g

매실농축액2 g

타우린1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 잣버섯 추출물은 면역과 염증의 중요인자인 NF-κB를 조절하여 다양한 타입의 면역 세포를 조절하는데 관여하는 사이토카인의 발현을 유도하고 면역력 상승작용을 촉진하므로, 세균 또는 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있고, 항암요법으로 면역 저하된 환자, AIDS 또는 암으로 인해 면역 억제된 환자에게 면역력 증강 및 조절을 위한 의약 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명의 조성물은 백신의 어쥬반트로도 사용할 수 있다.

Claims (15)

1. 잣버섯 균사체를 액체배양하고, 필터를 사용하여 배양배지로부터 수집한 후 증류수로 세척 및 건조하여 수득한 잣버섯 균사체 또는 건조된 잣버섯 자실체를 증류수와 혼합하여 열수추출하고, 이의 상층액을 얻어 농축 및 건조과정을 거쳐 수득되는, 글루코스, 만노오스, 갈락토오스와 같은 단당류 및 헤테로글리칸을 함유하는 갈색분말의 면역증강 및 면역조절활성을 갖는 잣버섯(Lentinus lepideus) 추출물.
2. 제 1항에 있어서, 상기의 잣버섯은 자연산 또는 인공재배한 버섯인 추출물.
3. (a)아가 배지에서 보관된 잣버섯의 균사체를 15 내지 35℃에서, 30 내지 200 rpm으로 교반하면서 1일 내지 20일 동안 액체배지에서 배양하고, (b) 필터를 사용하여 수집한 다음, (c) 잣버섯 균사체를 증류수로 세척하여 건조한 후, 무게(㎏)의 약 5배 내지 20배 부피의 물, 메탄올, 에탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매를 사용하여, 50 내지 100℃에서 1시간 내지 48시간, 2회 내지 5회에 걸쳐 추출한 후, 원심분리하여 상층액을 수집하고, 이를 농축, 건조하여 수득하는 것을 특징으로 하는 잣버섯 추출물의 제조방법.
4. 제 1항의 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 감염성질환의 예방 및 면역계질환으로 인한 환자의 치료를 위한 약학조성물.
5. 제 4항에 있어서, 면역계 질환은 면역력 결핍 또는 면역력 저하로 인한 것인 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 환자는 화학요법 및 방사선요법 같은 항암치료로 인해 면역이 저하된 환자인 조성물.
7. 제 4항에 있어서, 환자는 에이즈 또는 암질환을 가진 환자인 조성물.
8. 제 4항에 있어서, 조성물 총중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 ~ 95 중량%로 포함하는 조성물.
9. 제 4항에 있어서, 약제학적으로 사용되는 제제 형태가 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 액제, 주사제 중에서 선택된 어느 하나인 조성물.
10. 제 1항의 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 면역계질환 환자의 치료를 위한 면역조절제.
11. 제 1항의 잣버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 감염성질환에 대한 면역력 증강을 위한 가축용 사료 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 조성물 총중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 ~ 95 중량%로 포함하는 사료 조성물.
13. 제 1항의 잣버섯 추출물 및 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 면역조절을 위한 건강기능식품.
14. 제 13항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강기능식품.
15. 제 13항에 있어서, 추출물의 비율이 전체조성물 100 중량부 당 1 내지 약 20 중량부인 건강기능식품.