KR20230099659A - 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 이용한 면역증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물 또는 그 추출물이 특별한 세포독성을 나타내지 않으면서 마우스 대식세포 RAW 264.7 cell에 처리하였을 때 농도 의존적으로 산화질소(Nitric Oxide) 및 면역증진 바이오마커인 사이토카인 TNF-α의 생성을 생성을 촉진할 뿐만 아니라, 동물실험에서도 비장세포의 증식을 촉진하고 비장세포의 사이토카인(IL-6, TNF-α)의 생성을 촉진하는 활성을 보인다는 점에 기초하여, 그 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물 또는 그 추출물의 면역 증진 활성을 개시한다.

Description

바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 이용한 면역증진용 조성물{Composition for enhancing immunity using Bacillus haynesii culture or Extracts Thereof}

본 발명은 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 이용한 면역증진용 조성물에 관한 것이다.

면역은 생체 내에서 외부 인자에 대하여 방어하는 현상으로 우리 몸에서 면역을 담당하는 면역계는 외부 인자 감염으로부터 스스로를 보호하기 위하여 여러 종류의 세포들과 분자들로 이루어져 있으며, 면역은 크게 선천성 면역(innate immunity)과 적응성 면역(adaptive immunity)으로 구분되어 있다(N. Engl. J. Med. 343:37-49. 2000). 선천성 면역은 백혈구(leukocyte), 대식세포(macrophage), 보체(complement), 사이토카인(cytokine) 등으로 구성되어 있으며, T림프구(T lymphocyte)와 B림프구(B lymphocyte)로 이루어지는 적응성 면역보다 외부 인자에 신속하게 반응한다.

인체에 존재하는 다양한 면역세포 중, 선청성 면역반응에서 중요한 역할을 하는 대식세포는 포식작용을 통해 외부 병원체로부터 인체를 보호하며, 산화질소(nitric oxide;NO), 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS), 인터루킨-1베타(interleukin1β;IL-1β), 인터루킨-6(interleukin-6;IL-6) 그리고 종양괴사인자(tumor necrosis factorα;TNF-α) 등의 면역조절인자를 분비하여 후천성 면역세포인 T림프구와 B림프구를 활성화시킨다고 알려져 있다(Front. Immunol. 5:491. 2014; J. Allergy Clin. Immunol. 116(2):241-249. 2005). 그러므로 대식세포는 선천성 면역반응뿐만 아니라 적응성 면역반응에도 관여하기 때문에 대식세포의 활성화는 외부 병원체로부터 야기되는 질병을 근원적으로 차단할 수 있다고 알려져 있다.

NO는 혈관계에서는 혈소판의 응집 및 호중성구의 집합 작용, 골격근에서는 대사 조절 등 다양한 생리학적 기능을 하며, 염증 반응에서 핵심적인 역할을 하는 세포 신호전달 물질로 대식세포, 백혈구, T림프구 등 면역에 관련된 많은 세포들에 의해 합성된다. 대식세포 활성화 지표 중의 하나인 NO는 사이토카인이나 미생물의 영향을 받아 대식세포에서 생성되는 반응질소 중간체로서 iNOS와 산소가 결합하고, L-아르기닌(L-arginine)을 산화시켜 NO가 생성된다. 생성된 NO는 세포 내 감염을 일으키는 미생물과 암세포를 제어하는 것으로 보고되어 있고, NO가 필요 이상 생성되면 혈관확장, 염증반응에 의한 조직 손상, 돌연변이 등을 일으켜 생체 내 유해 작용을 나타내는 것으로도 알려져 있다. 따라서, NO는 이중적 특성을 나타내어, 약물 처리 시 세포독성을 유발하지 않는 농도에서 NO 생성을 촉진하면 면역기능을 증가시키는 것으로 판단할 수 있다.

또한 대식세포는 NO 뿐만 아니라 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 자신의 포식작용을 증가시키거나, 자연살해세포(natural killer cells;NK cells), 수지상세포(dendritic cell; DC) 등의 선천성 면역의 활성을 유도하는 한편 외부 항원을 인식한 후 T림프구에 전달하여 세포의 활성화와 분화를 조절함으로써 적응성 면역의 활성에도 기여하는 것으로 알려져 있다(J. Korean. Obstet. Gynecol. 27(1):1-16. 2014).

면역증진 기능성 소재 중에서 특히 다당 성분의 경우 식품분야에서는 주로 에너지원이나 생체 구조성분으로 인식되었으나, 최근 미생물에 의해 생성된 세포외다당류(exopolysaccharide)가 살아있는 개체의 생체 방어 기전을 증강할 수 있는, 즉 면역력 증진 활성이 있다는 것이 알려져, 기능성 다당을 생산하는 새로운 미생물 자원의 발굴을 통한 의약품 등 신약개발 분야 뿐만 아니라 향후 건강기능식품 소재 개발을 위한 식품생물공학 분야가 핵심 연구 분야로 부상될 것으로 예상되고 있다(Korean Soc. Food Sci. Nutr. 46(1):26-33. 2017, Korean J. Food Preserv. 27(5):671-683. 2020, Curr. Top. Lact. Acid Bact. Probiotics 7(1):14-22. 2021).

본 발명에서는 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물 또는 그 추출물의 면역 증진 활성을 확인하였다.

본 발명은 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물의 면역 증진의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 전복 내장 젓갈로부터 분리·동정한 제주 토착 미생물 균주인 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물과 그 추출물이 특별한 세포독성을 나타내지 않으면서 마우스 대식세포 RAW 264.7 cell에 처리하였을 때 농도 의존적으로 산화질소(Nitric Oxide) 및 면역증진 바이오마커인 사이토카인 TNF-α의 생성을 촉진할 뿐만 아니라, 동물실험에서도 비장세포의 증식을 촉진하고 비장세포의 사이토카인(IL-6, TNF-α)의 생성을 촉진하는 것을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물로 파악할 수 있다.

또 본 명세서에서, "추출물"은 추출 대상을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 에틸아세테이트를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "배양물"은 탄소원, 질소원 및 미량원소를 포함하는 배지에 해당 균주를 접종하고 배양하여 얻어진 것을 의미한다. 이 배양물은 그대로 이용되거나, 감압농축 및/또는 동결건조시켜 액상 또는 분말상으로 이용되거나, 전술한 바의 방식으로 물, 에탄올 등을 사용하여 추출하거나, 그 추출물을 분획하거나, 그 추출물 또는 분획물을 농축 하여 이용될 수 있다.

상기 배양물의 제조에 있어서, 상기 탄소원은 바람직하게는 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 예컨대 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 전분, 전분 가수분해물 등이 사용할 수 있다. 당밀이나 당 정제 과정의 부산물 등 복합 화합물이 또한 사용될 수 있다. 경우에 따라서는 대두유, 해바라기유 등 오일이나 아세트산 등의 유기산, 글리세롤 등이 탄소원으로서 바람직할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물로 상기 배지에 포함될 수 있으며, 단독으로 배지에 포함되든, 2종 이상의 혼합물로 배지에 포함되든 2%(w/w) 내지 20%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다. 전분이나 전분 가수분해물 등 천연물 또는 천연물 가공물을 탄소원으로 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이들 탄소원을 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

또 상기 배양물의 제조에 있어서, 상기 질소원으로서는 통상적으로 무기 질소 화합물, 유기 질소 화합물 또는 이들 화합물들을 포함하는 복합 화합물일 수 있다. 예컨대 무기 질소 화합물로서는 암모니아, 암모늄염(예컨대, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트, 암모늄 니트레이트 등), 니트레이트 등을 들 수 있고, 유기 질소 화합물로서는 우레아, 아미노산 등을 들 수 있으며, 복합 화합물로서는 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 육즙, 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원 등을 들 수 있다. 이들 질소원도 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 0.1%(w/w) 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 천연 탄소원을 사용할 경우와 관련하여 설명한 바와 동일한 이유에서 멸균하여 사용하는 것이 바람직하다.

또 상기 배양물의 제조에 있어서, 상기 미량원소로서는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철, 인, 황 등을 포함하며 이들 미량원소는 염 화합물 형태로 배지에 첨가될 수 있으며, 이들 미량 원소의 배지에서 용해도를 높이고 용액 상태를 유지하기 위해 킬레이트제 예컨대 카테콜, 시트르산 등이 함께 첨가될 수 있다. 상기 염 화합물 형태로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있다. 이들 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001%(w/w) 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.

또 상기 배양물의 제조에 있어서, 상기 배지는 선택적으로 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트, 피리독신 등의 성장 촉진제를 포함하여 조제될 수 있다.

배지 조성의 최적화에 대해서는 문헌(Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)을 포함하여 당업계에 많은 문헌이 공지되어 있으며, 이들 공지된 문헌을 참조할 수 있다.

배지는 해당 미생물의 접종 전에 불필요한 미생물의 증식을 방지하기 위하여 멸균하여 사용하는 것이 바람직한데, 배지의 멸균 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 멸균 방법 중 적합한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 고압 증기 멸균, 자외선을 이용한 멸균 방법 등이 적합할 수 있다.

배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 25℃ 내지 30℃이다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 6.0 내지 7.0이다. 배지 pH는 배양이 진행되는 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수성 암모니아 등의 염기성 화합물이나, 인산, 황산 등의 산성 화합물을 첨가하여 조절될 수 있다. 배양 중 형성되는 거품의 제거를 위해서 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 첨가될 수 있다.

배양 중 배양 미생물의 증식 특성에 따라 호기 조건 또는 혐기 조건을 만들어 주는 것이 유리할 수 있다.

배양은 회분식(batchwise), 반-회분식(semi-batchwise) 또는 연속식으로 이루어질 수 있다. 적합한 구체적인 배양법은 예컨대 문헌(Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 문헌(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994), 미국세균학회(the American Society for Bacteriology)가 발행한 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C., USA, 1981) 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 면역증진용 조성물에서 그 유효성분은 의도한 면역증진 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 의도한 면역증진 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 면역증진 효과의 상승·보강을 위하여 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성이 확인된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 「대한민국약전」), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 「건강기능식품 기준 및 규격」임), 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 「약사법」임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물 등이 포함된다. 예컨대 그러한 화합물 또는 추출물로서 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 면역증진 기능성을 가지는 것으로 인정된 것으로, L-글루타민, 게르마늄 효모, 금사상황버섯, 당귀혼합추출물, 동충하초 주정추출물, 스피루리나, 클로렐라, 청국장균 배양 정제물(폴리감마글루탐산칼륨), 표고버섯균사체, 효모베타글루칸 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 「대한민국약전」을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물의 면역 증진의 용도를 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 조성물은 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 본 발명의 자체 분리한 바실러스 헤이네시의 16S rRNA 서열이다.
도 2는 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물이 산화질소의 생성에 미치는 영향과 세포독성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물이 TNF-α의 생성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물이 동물실험에서 비장세포 증식에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물이 동물실험에서 비장세포의 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물의 면역 증진의 용도

1. 시료 준비

바실러스 헤이네시 JBRI-B21058 균주(Bacillus haynesii JBRI-B21058)는 자체 분리·동정하여 사용하였다.

구체적으로 전복 내장 젓갈 10 g을 0.85% 멸균 생리식염수 용액 90 ml에 넣어 믹서기로 분쇄하여 현탁용액을 제조한 후 25℃에서 150 rpm의 속도로 1시간 교반시켰다. 교반 된 현탁용액은 연속희석법으로 10^-1부터 10^-5까지 희석하여 접종샘플로 제조되었고, 10^-4와 10^-5 희석샘플을 MRS(L 당 Proteose peptone 10 g, Beef extract 10 g, Yeast extract 5 g, Dextrose 20 g, Polysorbate80 1 g, Ammonium citrate 2 g, Sodium acetate 5 g, Magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05 g, Dipotassium phosphate 2 g, Agar 15 g) 유산균 고체배지에 200 ul씩 3번 반복으로 도말하였다. 샘플이 접종 된 배지는 35℃에서 24~48시간 내에 암배양하였다. 미생물 균주의 순수분리를 위하여 배양된 배지에서 단일 콜로니를 세차례 걸쳐 계대배양하여 순수분리 미생물 균주인 바실러스 헤이네시 JBRI-B21058 균주를 선발하였다. 균주 동정은 서열번호 1(도 1)의 16S rRNA 유전자 서열을 가지고, 미국국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 Blast 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 기존 보고된 균주와 서열 상동성 비교하여 기존 바실러스 헤이네시 유사 균주(Bacillus haynesii sp.)와 99.45% 상동성을 보여 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii)로 동정하였고, 해당 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KFCC)에 기탁하고 기탁번호 KFCC11923P를 부여받았다.

분리된 미생물 균주(JBRI-B21058)는 MRS 유산균 액체배지에 10%로 접종하여 35℃에서 24시간 이상 암조건에서 교반배양하였다. 배양액 탁도는 흡광도 OD₆₀₀로 확인하여 OD₆₀₀값 2.8이상 시 충분히 배양 된 것으로 선정하였다. 배양액에 에틸아세테이트(EtOAc)를 1:1 비율로 첨가하여 2시간 동안 초음파로 미생물 세포들을 파쇄한 후 24시간 동안 교반시켜 물질이 추출되도록 하였다. 24시간 교반 후 분리된 상층액을 0.45 um pore size로 여과시키고, 여과된 추출액을 감압회전농축기로 용매를 완전히 제거한 후 미생물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.

2. 세포 배양

대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7세포는 ATCC (American Type Culture Collection, VA, USA)로부터 분양 받아 penicillin-streptomycin 100 units/mL과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지 (GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

3. 면역 증진 효능 평가

3.1 In vitro 효력 시험

3.1.1 산화질소 생성 활성

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 미생물 추출물 등 시료 및/또는 자극제인 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양물 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

3.1.2 세포독성 평가

RAW 264.7 (1.5×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지에 미생물 추출물 시료와 자극제인 LPS (1 μg/mL)를 동시 또는 미생물 추출물 시료만 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 μL와 reconstituted substrate mix를 50 μL를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μL의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

3.1.3 면역 조절 바이오 마커인 사이토카인 (TNF-α) 생성 효능 평가

RAW 264.7 (1.5×10⁵cells/mL) 세포를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10 배 농도 (1 mg/mL)로 조제된 미생물 추출물 시료와 자극물질 LPS(1 ug/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리한 군과 미생물 추출물 시료만 처리한 군을 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 면역 조절 바이오 마커인 사이토카인 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20 ℃ 이하에 보관하였다. 면역 조절 바이오 마커인 사이토카인 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

3.2 In vivo 효력 시험

3.2.1 실험동물

수컷 5주령의 C57BL/6 생쥐는 중앙실험동물 (Central Lab. Ani. Inc, Korea)에서 공급받았다. 동물은 1주간 고형사료와 물을 자유공급하고, 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 15% 조건하에서 12시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 그룹별 3마리로 나누었고 정상대조군 (NC), 상미생물 배양물 처리군 (200 uL/day)으로 총 2 그룹이며, 시료는 존대를 이용해서 강제로 식이하였고 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 제주대학교 동물실험윤리위원회 (Jeju National University Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 참고로 In vitro 효력 시험에서는 배양물 또는 그 추출물을 처리하였지만 In vivo 효력시험에서는 배양물(배양액 형태)을 처리하였다.

3.2.2 시험물질 투여

생쥐를 1주간 기본사료로 적응시킨 후 정상대조군에는 정수 (filtered water)를, 다른 그룹에는 균주 배양물을 2주간 매일 1회 경구투여용 금속제 존대 (zonde)를 이용하여 위 내로 강제 투여 하였다.

3.2.3 비장세포 분리 및 증식능 측정

마우스의 비장은 40, 70 μm cell strainer (BD Biosciences, CA, USA)로 필터 및 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 세포 현탁액은 원심분리 후 RBC lysis buffer (eBioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 적혈구를 제거하고 세포수를 측정하였다. 각 그룹별로 분리된 비장세포는 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 96-well plate에 분주하였고 mitogen으로 T 세포를 증식시키는 concanavalin A(ConA; SigmaAldrich Co, USA)를 최종 농도가 5 μg/mL이 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 ez-cytox (DoGen, Daejeon, Republic of Korea) 용액을 96-well plate의 각 well에 10 μL씩 분주하여 3시간 반응시키고 ELISA reader를 이용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

3.2.4 비장조직 내 사이토카인 측정

시료 투여 후 각 실험동물로부터 분리한 혈액 내 혈청에서 TNF-α와 IL-6 농도를 ELISA kit (R&D system; St. Louis, MO. USA)를 이용하여 측정하였다. 비장세포 분리 후 대식세포 제거하고 Con A로 48시간 자극 후 사이토카인 생성 분석을 위해 각 well에 혈정 100 uL를 분주하였다.

실온에서 2시간 반응시킨 후 마우스 TNF-α 또는 IL-6 항체와 avidin-HRP를 투여하여 반응시켰고 기질반응 용액 A/B를 분주하여 20분 동안 암소에서 반응시켰다. 반응정지 용액을 투여 후 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 분석하였다.

4. 실험결과

4.1 In vitro 효력 시험 결과

4.1.1 산화질소 생성 평가

결과를 도 2에 나타내었다. RAW 264.7세포에 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였을 때, 농도 의존적으로 산화질소 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군(PC) 시료로는 2-Amino-4-methylpyrimidine을 사용하였으며(20 uM), 이 양성대조군 시료는 LPS(1μg/mL)의해 증가된 산화질소 생성 억제효과를 나타내었고, 또 LPS 처리가 없을 경우는 약간의 산화질소 생성 증가 효과를 보였다.

4.1.2 세포독성 평가

결과를 도 2에 함께 나타내었다. RAW 264.7세포에 LPS(1μg/mL) 또는 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양 한 후 세포독성 유무를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성이 없다는 것을 확인할 수 있었다.

4.1.3 사이토카인(TNF-α) 생성 평가

결과를 도 3에 나타내었다. RAW 264.7세포에 바실러스 헤이네시 배양물 또는 그 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였을 때, 농도 의존적으로 TNF-α 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군 시료는 LPS(1μg/mL)의해 증가된 TNF-α의 생성 억제 효과를 보였고, LPS 처리가 없을 경우는 약간의 TNF-α 생성 증가 효과를 보였다.

4.2 In vivo 효력 시험 결과

4.2.1 비장세포 증식능 분석

혈액 내 항원에 대한 면역방어기능을 담당하는 비장은 세포성 면역 반응을 일으키는 T 세포와 대식세포, 체액성 면역 반응을 일으키는 B 세포 등의 림프구가 존재하는 면역기관이다. 또한, 비장에서는 항원과 같은 면역활성물질의 자극에 의한 림프구의 증식 및 분화가 유도되기 때문에 비장세포의 증식은 면역반응에 있어 중요한 의미가 있다. 따라서 미생물 배양물 또는 그 추출물 시료가 비장세포의 증식에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 시료 처리군과 정상대조군에서 분리한 비장세포를 ConA(콘카나발린 A)로 48시간 자극 후 비장세포의 증식을 확인한 결과, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 미생물 배양물 또는 그 추출물 시료 처리군에서 비장세포의 증식이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

4.2.2 비장 조직 내 사이토카인 생성 변화

초기 면역반응에 중요한 역할을 하는 TNF-α는 미성숙 면역세포를 성숙된 면역세포 유도하고 IL-6는 B 림프구를 자극하여 항체 생산을 유도하거나 다양한 사이토카인들과 함께 T 림프구의 분화에 작용하는 등의 기능을 가지고 있다. 따라서 미생물 배양물 또는 그 추출물 시료가 혈중 TNF-α와 IL-6 생성에 미치는 영향을 ELISA를 이용하여 분석하였다. 시료 처리군과 정상대조군에서 분리한 비장세포를 ConA(콘카나발린 A)로 48시간 자극 후 사이토카인의 생성을 확인한 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이 비장 조직 내에서도 IL-6 및 TNF-α 함량은 정상대조군과 비교하여 미생물 배양물 시료 처리군에서 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

Claims (5)

1. 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) 배양물 또는 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분을 포함하는 면역 증진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii)는 그 16S rRNA 유전자가 서열번호 1의 염기서열을 가지는 바실러스 헤이네시(Bacillus haynesii) JBRI-B21058 균주(기탁번호: KFCC11923P)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 조성물.
   
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 조성물.
   
   

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