KR20170137985A - 베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 속 ari 6131 균주 - Google Patents

베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 속 ari 6131 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주, 이의 배양물 및 상기 균주를 이용하여 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주에 의하여 발효 생산된 세포외 분비형 베타-글루칸은 물에 대한 용해성이 우수하고, 점성이 비교적 적고 분자량이 비교적 적은 50,000-200,000 달톤의 무색, 무취의 우수한 성상을 가지고 있어 대량생산이 용이하고, 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제로서 널리 쓰일 수 있다.

Description

베타-글루칸 고생산성 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주{Aureobasidium sp. ARI 6131 having high productivity of beta-glucan}
본 발명은 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주, 이의 배양물 및 상기 균주를 이용하여 베타-글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.
베타-글루칸(β-glucan)은 우수한 생체 조절 기능성, 예를 들면, 지질대사 개선작용, 정장작용, 혈당치 상승 억제 또는 면역증강 효과 등이 밝혀짐에 따라 주목받고 있는 소재이다. 또한, 베타-글루칸은 보습능, 주름개선 효과, 피부자극 완화, 세포재생 등의 효과가 있어, 화장품 원료로서 이용되고 있다.
베타-글루칸은 미생물류, 담자균류 및 식물의 세포벽에 주로 포함되어 있으며, 이러한 생물체의 골격인 세포벽을 구성하는 성분으로서 존재하고 있다. 베타-글루칸의 구조는 β－1－2, 1－3, 1－4, 1－6－D－글루코피라노스(glucopyranose) 결합이 적어도 2종류 이상을 갖는 글루코오스의 중합체를 주성분으로 한다. 동물의 면역계에 대한 활성 증진력을 갖는 베타-글루칸은 여러 가지 종류의 식용버섯, 효모, 보리, 귀리 등에 함유되어 있는 것으로서 알려져 있다.
버섯류에서 생산되는 베타-글루칸은 알코올 농축·정제과정이 극히 까다롭고, 생산수율이 매우 낮으며, 불순물의 함유로 인한 순수정제의 어려움이 있다. 이런 베타-글루칸의 생산 단점을 보완하기 위해서 국내외에서 많은 연구가 이루어 졌으며, 그중에서도 괄목할 만한 것은 효모벽의 베타-글루칸의 기능 및 성분이 버섯 유래의 그것과 같다는 것을 발견한 것이다. 그러나, 효모의 세포벽이 극히 견고하고 분해하기 어려워 글루칸 이용률이 낮다는 단점이 있어 베타-글루칸을 이용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 시점이다.
이런 점에서, 세포외로 베타-글루칸을 분비하는 균주를 이용한 베타-글루칸의 분리 정제는 그 처리를 별도로 하지 않아도 된다는 장점을 가지고 있어, 상대적으로 베타-글루칸의 생산이 용이하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0085675호 (2011.07.27 공개)
본 발명자들은 베타-글루칸을 세포 밖으로 고농도로 분비하는 균주를 스크리닝 하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 야생의 꽃가루, 나뭇잎 및 화분가루에서 채취한 시료로부터 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주인 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 분리 동정하고, 최적의 베타-글루칸 생산조건을 확립함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양액을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 제공한다.
본 발명자들은 베타-글루칸을 세포 밖으로 고농도로 분비하는 균주를 스크리닝 하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 야생의 꽃가루, 나뭇잎 및 화분가루에서 채취한 시료로부터 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주인 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 분리 동정하고, 최적의 베타-글루칸 생산조건을 확립하였다.
본 발명자들은 면역증강 활성과 피부개선 효과 등 다양한 기능성을 갖는 저분자 베타-글루칸을 생산하는 균주를 야생의 꽃가루, 나뭇잎 및 화분가루에서 채취한 시료로부터 분리하였다. 상기 균주는 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주로서, 균주의 유전자 분석을 통하여 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.)에 속하는 균주임을 확인하고, 이를 오레오바시디움 속 ARI 6131로 명명하였다. 상기 ARI 6131 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2016년 1월 5일자로 기탁되어 기탁번호 KCTC 12971BP를 부여받았다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주는 상술한 바와 같이, 세포 밖으로 베타-글루칸(세포외 분비형 베타-글루칸)을 분비한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 50,000-200,000 달톤의 저분자량을 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 50,000-150,000 달톤의 저분자량을 갖는다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 50,000-100,000 달톤의 저분자량을 갖는다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 81,000-82,000 달톤의 저분자량을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 β-1,3/1,6-글루칸이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주는 서열목록 제1서열로 표시되는 ribosomal RNA 유전자를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주는 야생의 꽃가루, 나뭇잎 또는 화분가루에서 분리된 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)의 배양액을 제공한다.
상기 배양액에는 베타-글루칸이 함유되어 있고, 베타-글루칸은 면역증강 활성과 주름, 미백, 탄력, 보습 및 윤기 등의 피부상태를 개선하는 효과를 나타내는바, 본 발명의 베타-글루칸-함유 배양액을 원료로 사용하여 면역증강용 건강기능식품과 피부상태 개선용 화장품을 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 배양하여 상기 ARI 6131 균주 또는 그 배양물로부터 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "배양"은 미생물을 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 ARI 6131 균주의 배양을 위하여, 당업계에 공지된 배양방법을 이용할 수 있으며, 상기 균주를 성장시키기 위해 사용되는 배지는 당업계에 사용되는 다양한 미생물 배지 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 배양은 배양 배지의 총 중량을 기준으로, 당(예컨대, 서당 또는 포도당) 3.0-15.0 중량%, 효모엑기스 0.025-0.050 중량%, 식물 오일 0.5-2.0 중량%, 아스콜빈산 0.01-0.05 중량%, 구연산 0.01-0.05 중량%, 황산마그네슘 0.5-1.0 중량%, 황산제일철 0.001-0.01 중량%, 제이인산칼륨 0.5-1.0 중량% 및 질산칼륨 0.015-0.050 중량%를 포함하는 배양 배지에서 이루어진다.
상기 식물 오일로는, 예를 들어, 카놀라 오일, 코코낫 오일, 면실박 오일, 올리브 오일, 팜유, 대두유, 팜유, 해바라기씨 기름, 땅콩 기름 및 미강유 등의 오일을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 올리브 오일을 사용한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 세포외 분비형 베타-글루칸 고생산성 균주, 이의 배양물 및 상기 균주를 이용하여 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명자들은 산과 들의 야생의 꽃과 나뭇잎, 그리고 벌 나비들이 가져오는 화분가루로부터 세포 바깥으로 고농도로 베타-글루칸을 분비하는 흑효모를 분리 동정하였다.
(ⅲ) 본 발명의 균주에 의하여 발효 생산된 세포외 분비형 베타-글루칸은 물에 대한 용해성이 우수하고, 점성이 비교적 적고 분자량이 비교적 적은 50,000-200,000 달톤의 무색, 무취의 우수한 성상을 가지고 있어 대량생산이 용이하고, 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제로서 널리 쓰일 수 있다.
도 1은 ITS1, 5.8S rDNA 및 ITS2 유전자 서열을 기초로 작성한 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP) 및 관련 균주의 분자계통수를 보여준다.
도 2는 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주의 HPLC에 의한 유비퀴논 조성 분석표를 보여준다.
(상) 유비퀴논 스탠다드 분석 크로마토그램, (하) 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주의 유비퀴논 분석 크로마토그램.
도 3은 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주의 5 L 발효조에서의 회분식 배양결과를 보여준다. 배양 기간 5일 동안 용존산소의 변화 및 베타-글루칸과 총 폴리사카라이드 함량의 변화를 나타내었다.
도 4는 생산된 베타-글루칸을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말의 분자량을 GPC(Gel Permeation Chromatography)를 이용하여 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 베타-글루칸 생산 균주의 분리
본 발명자들은 용인, 분당, 이천, 제천, 제주, 광교산, 지리산 및 한라산 등에서 야생의 꽃가루, 나뭇잎 및 화분가루로부터 소량의 시료를 채취하고, 채취한 시료를 10-20%의 서당 용액 10 ml에 담근 다음 2-3일 적응시켜 설탕의 삼투압에서 견디는 균주를 선별하였다. 구체적으로, 서당 10-20 중량%, 효모엑기스 0.1-0.5 중량%, 염화카리움 1.0-4.0 중량%, 황산마그네슘 0.5-1.0 중량%, 황산제일철 0.001-0.01 중량%, 제이인산칼륨 0.5-1.0 중량% 및 한천 1.5 중량%를 함유하며, pH 6.0으로 조정된 고체 배지에 3분 도말법으로 평판 배양하고, 나타나는 콜로니(집락) 중에서 흑색을 띄면서 점질성을 보이는 것을 별도의 평판 배지에 옮겨 심어 1차 80여주를 분리하였다. 일차 분리된 80여주를 동일 배지 조성의 액체 배지 50 ml에 접종하고, 28℃, 180 rpm으로 5일간 배양한 후 12,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 균체를 제거하고, 상등액에 2배량의 에탄올을 가하여 고분자 물질을 침전시키고, 침전된 고분자 물질을 70% 에탄올로 씻어낸 다음 60℃의 건조기에서 하룻밤 동안 건조시킨 후 중량을 달아 고분자 물질을 정량하였다.
생산된 고분자 물질의 분석은 메가자임 키트에 의한 분석과 β-1,3-1,6-글루칸의 새로운 비색법(Food Chemistry, 127(2011) 791-796)으로 분석하여 생산된 고분자 물질이 베타-글루칸임을 확인하였다. 2차 선발된 균주 중에서 가장 생산성이 우수한 ARI 6131 균주를 최종 선발하고, 균주의 동정을 실시하였다.
분리균주의 폴리사카라이드 생산량 비교
균주번호 1,3-1,6-β-글루칸 함량(%w/w) 1,3-1,6-α-글루칸 함량(%w/w)
24h 48h 76h 24h 48h 76h
G42 0.231 0.459 0.561 2.241 0.585 0.673
G82 0.211 0.356 0.451 1.952 0.849 0.998
G91 0.117 0.256 0.336 1.916 0.764 0.487
G92 0.254 0.375 0.452 1.948 1.938 1.979
G812 0.289 0.311 0.366 1.780 0.983 0.874
G822 0.236 0.375 0.432 2.277 1.106 0.913
ARI 6131 0.322 0.563 0.681 2.173 1.046 1.072
DC31 0.312 0.411 0.432 1.755 1.132 1.120
DC32 0.231 0.305 0.335 2.540 1.004 0.636
DC112 0.115 0.255 0.267 1.921 0.748 1.363
DC171 0.253 0.356 0.368 1.816 2.051 1.914
DC1831 0.341 0.443 0.451 1.759 0.597 0.341
DN41 0.324 0.452 0.446 1.958 0.948 0.546
DN43 0.328 0.423 0.452 2.383 0.844 0.350
DN44 0.362 0.326 0.387 2.819 0.928 0.493
실시예 2. 분리균주의 동정
실시예 1에서 본 발명자들은 목적으로 하는 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고, 정제하기에 간편한 세포외 분비형(exo-type) 베타-글루칸을 생성하는 미생물 균주를 분리하였다. 이후, 글루코스 20 중량%, 펩톤 0.3 중량%, 효모 추출물(Yeast Extract-배지) 0.3 중량% 및 몰트 추출물(Malt Extract-배지) 0.3 중량%를 포함하고, 추가적으로 한천 1.5 중량%를 첨가하여 만든 평판 배지에 1차 배양액 200 ㎕를 도말하여 27℃에서 5일간 배양하였다. 평판 배지에서 자란 콜로니 중에서 형태학적으로 검은색을 띠는 콜로니만을 확보하여, 이들 미생물 분리 균주의 동정을 실시하였다. 요약하면, 균주 동정을 위하여 전 생물에 공통적으로 존재하며, 유전자의 치환속도가 일정하므로 진화학적으로 유사한 미생물의 상관관계 확인 및 동정을 위하여 아주 중요한 요인으로 작용하고 있는 ribosomal RNA를 코딩하는 유전자(rDNA)의 일부분인 Internal Transcribed Spacer 1(ITS1), 5.8S rDNA 및 ITS2 유전자를 사용하여 염기서열을 분석하였다.
결정된 염기서열은 Neighbor-joing법(Saitou and Nei, Mol . Biol . Evol. 4: 406∼425(1987))을 이용하여 계통수를 작성하였다(도 1). 또한, 화학분류학적으로 중요한 유비퀴논 조성을 HPLC로 분석하였다(도 2).
실험 결과, 야생의 꽃으로부터 분리한 균주는 오레오바시디움(Aureobasidium) 속에 속하였다. 또한, 유비퀴논 조성은 Q-10(H2)로 판명되었으며, 이는 오레오바시디움의 유비퀴논과 일치하였다(Suzuki and Nakase, J. Gen. Appl. Microbiol. 32: 165∼168(1986)). 이상의 결과를 토대로, 본 발명자들은 분리된 균주를 오레오바시디움 속 균주로 동정하였다. 이후, 동정한 상기 균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2016년 1월 5일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 12971BP를 부여받았다.
실시예 3. 베타-글루칸의 발효생산 조건 검토
분리된 균주 Aureobasidium sp. ARI 6131(기탁번호: KCTC 12971BP)을 이용하여 최적의 배지 조성과 배양 조건을 확립하였다.
최적화된 배지 조성은 서당 또는 포도당을 3.0-15.0 중량%, 효모엑기스 0.025-0.050 중량%, 식물 오일 0.5-2.0 중량%, 아스콜빈산 0.01-0.05 중량%, 구연산 0.01-0.05 중량%, 황산마그네슘 0.5-1.0 중량%, 황산제일철 0.001-0.01 중량%, 제이인산칼륨 0.5-1.0 중량%(pH 6.0) 및 질산칼륨 0.015-0.050 중량%로 하였으며, 사용된 식물오일은 카놀라 오일, 코코낫 오일, 면실박 오일, 올리브 오일, 팜유, 대두유, 팜유, 해바라기씨 기름, 땅콩 기름, 미강유 등을 사용하였으며, 올리브 오일과 카놀라 오일의 생산성이 가장 좋았다.
최적화된 배지 조성으로 50 ml의 배지를 250 ml 플라스크에 취하고, 분리균주 Aureobasidium sp. ARI 6131(기탁번호: KCTC 12971BP)을 접종하고 28℃, 180 rpm으로 3-5일간 배양하여 종균으로 사용하였고, 최적화된 배지 조성으로 5 L 발효조(한일과학상사 제품)에 3.0 L 배지에 5%의 접종량으로 접종하고, 28℃, 1.0 vvm, 400 rpm으로 3-5일간 배양하였다.
최종 생산된 베타-글루칸의 생산량은 2.5-3.5 중량%에 달하여 고생산성 흑효모 균주임을 확인하였고(도 3), 생산된 글루칸의 분자량 분포는 5,403-194,580 달톤이며, 평균 분자량은 81,527 달톤으로 비교적 저분자임을 확인하였다(도 4).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 유전자은행 KCTC12971BP 20160105
<110> ARIBIO INC. <120> Aureobasidium sp. ARI 6131 having high productivity of beta-glucan <130> PN160015 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 531 <212> DNA <213> KCTC 12971BP ribosomal RNA gene <400> 1 tgctcagcgc ccgacctcca accctttgtt gttaaaacta ccttgttgct ttggcgggac 60 cgctcggtct cgagccgctg gggattcgtc ccaggcgagc gcccgccaga gttaaaccaa 120 actcttgtta tttaaccggt cgtctgagtt aaaattttga ataaatcaaa actttcaaca 180 acggatctct tggttctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa 240 ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccctt ggtattccga 300 ggggcatgcc tgttcgagcg tcattacacc actcaagcta tgcttggtat tgggtgccgt 360 ccttagttgg gcgcgcctta aagacctcgg cgaggcctca ccggctttag gcgtagtaga 420 atttattcga acgtctgtca aaggagagga cttctgccga ctgaaacctt tatttttcta 480 ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat a 531

Claims (7)

  1. 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주는 세포 밖으로 베타-글루칸을 분비하는 것을 특징으로 균주.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포 밖으로 분비된 베타-글루칸은 50,000-200,000 달톤의 저분자량을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 오레오바시디움 속 ARI 6131 균주는 야생의 꽃가루, 나뭇잎 또는 화분가루에서 분리된 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) D-4 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)의 배양액.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) ARI 6131 균주(기탁번호: KCTC 12971BP)를 배양하여 상기 ARI 6131 균주 또는 그 배양물로부터 베타-글루칸을 제조하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 배양은 배양 배지의 총 중량을 기준으로, 당 3.0-15.0 중량%, 효모엑기스 0.025-0.050 중량%, 식물 오일 0.5-2.0 중량%, 아스콜빈산 0.01-0.05 중량%, 구연산 0.01-0.05 중량%, 황산마그네슘 0.5-1.0 중량%, 황산제일철 0.001-0.01 중량%, 제이인산칼륨 0.5-1.0 중량% 및 질산칼륨 0.015-0.050 중량%를 포함하는 배양 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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