CN111971395A - 子囊菌的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于子囊菌发酵的方法、通过该方法生产的β‑葡聚糖以及该β‑葡聚糖作为流变改性剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于子囊菌(Ascomycota)发酵的方法、通过该方法产生的β-葡聚糖以及该β-葡聚糖作为流变改性剂的用途。
背景技术
子囊菌(Ascomycetes)是酵母样真菌，其能够产生多种多样的有价值的不同生物产物，例如酶、色素和生物聚合物如β-葡聚糖。这些β-葡聚糖具有很高的经济重要性，因为它们可以广泛用于食品、制药、农业以及化学应用中。
但是，这些真菌的发酵已证明是具有挑战性的。迄今为止，来自例如微生物学、生物化学工程、过程工程和遗传学的多个学科的方法旨在满足提供可实现工业规模生产所需的β-葡聚糖产量的稳定和可靠的过程的需求。Zhenming等(Bioproducts fromAureobasidium pullulans,a biotechnologically important yeast；Appl MicrobiolBiotechnol 2009,82；793-804)评价了各种糖源和特定酶活性对发酵的影响。考虑到所遇到的困难，作者得出的结论是，遗传修饰将是实现有效的工业生产规模的更有希望的途径，但这将需要全基因组的分析。
发明内容
本发明的发明人将自己的任务设定为开发用于属于子囊菌门的真菌的发酵方法，该方法导致所需发酵产物，尤其是β-葡聚糖的足够高的产率，同时将成本保持在适合工业规模生产的水平。
该任务通过包括以下步骤的子囊菌发酵方法解决：
a)提供具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于子囊菌门的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加至少一种碳源；
d)根据步骤d)混合培养基和至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.5范围的相对气体含量(relativegas content)下进行。
本发明的方法保证了可以在任何现有技术的发酵反应器中实施的稳定和可靠的过程。另外，本发明的方法不涉及遗传工程或使用遗传修饰的微生物，其增加成本，且也限制了所生产的β-葡聚糖的应用和消费者的接受度。此外，本发明的方法保证了β-葡聚糖产率比现有技术条件下的方法高3.5倍以上(见实施例1)。
在下文中，将更详细地描述本发明的要素。这些要素随具体的实施方式一起列出，但是应该理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以创建另外的实施方式。各种不同地描述的实施例和实施方式不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方式。这种描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方式与多种公开的要素相结合的实施方式。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有所描述的要素的任何排列和组合。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“含有和“包括”的变体将被理解为意味着包含所陈述的成员、整体或步骤或者成员、整体或步骤的组，但不排除任何其他成员、整体或步骤或者成员、整体或步骤的组。在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个”和“该”以及类似的指称应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的陈述仅旨在用作分别指称落入该范围内的各个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则各个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独指称一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”、“例如”，“具体的”，“具体的实施例”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不构成对于另外的要求保护的发明的范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对实施本发明必要的任何非要求保护的要素。
在本发明中，术语“子囊菌”应理解为包含属于真菌界的该部门(division)或门(phylum)的任何真菌。子囊菌门属于双核菌亚界。适用于本发明方法的子囊菌包含但不限于落入座囊菌纲(Dothideomycetes)的任何真菌，例如，短梗霉科(Aureobasidiaceae)。本发明的方法特别适合于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)也称为Aureobasidiumoleae、Azymocandida malicola、Candida malicola、Cladosporium pullulans、Dematiumpullulans、Exobasidium vitis、Hormonema oleae、Hormonema pullulans、发酵茁霉(Pullularia fermentans)、发酵茁霉schoenii种(Pullularia fermentansvar.schoenii)、出芽茁霉(Pullularia pullulans)、Torula oleae或Torula schoenii的发酵。它们全部应理解为同义的。属于子囊菌门的真菌通常被称为子囊菌。
在本发明方法的步骤a)中提供的培养基的特征在于干物质含量选自0.1至0.3wt.-％的范围，其中选自0.15至0.25wt.-％的范围的干物质含量也在本发明的范围内。术语“干物质含量”是指使用IR天平在从样品中除去水和其他挥发性化合物后确定的质量。
本发明方法的步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.50范围的相对气体含量下进行，其中0.0075至0.40、0.01至0.35和0.01至0.20的范围是也在本发明的范围内。
在本发明中，相对气体含量由下式定义：
在本发明中，术语“输入功率”被定义为P＝Ne*ρL*n3*d5(其中Ne是牛顿数，ρL是根据步骤a)的培养基、至少一种真菌和至少一种碳源的密度[kg/m3]，n为搅拌器的频率[s-1]，d为搅拌器的直径[m])。在本发明中，术语表观气体速度定义为
其中QG是体积气体流量[m3/s]，被理解为每秒喷洒到培养基、至少一种真菌和至少一种碳源中的空气的体积，和Dr是容器的内径。
培养基可以在本领域技术人员已知适合于本发明方法的任何容器中提供，例如分批或补料分批反应器、气升式反应器、搅拌釜式反应器或鼓泡塔式反应器。在本发明的具体的实施方式中，容器的顶部空间中的绝对压力选自1至11巴的范围，其中1.1至10巴、1.2至9巴和1.3至8巴的范围为也在本发明的范围内。在本发明的另一个具体的实施方式中，该容器配备有提供至少300Lux的光强度的光源。在合适的实施方式中，光源可以在如步骤d)中所述时间的至少40％内放置在发酵培养基的表面上方。1Lux定义为每平方米1流明。在另一个示例性的合适实施方式中，光源可以被放置在容器旁边和外部。在这种情况下，容器可以配备有窗口或者可以包含透明材料或由透明材料组成。在另一个示例性的合适实施方式中，光源可以放置在容器内部浸没在发酵培养基中。
在本发明方法的步骤b)内，培养基用至少一种属于子囊菌门的真菌接种，其接种密度选自0.01gCDW/L至50gCDW/L的范围。“接种”可以通过本领域技术人员已知适合于本发明方法的任何方法进行，例如该至少一种真菌以纯化形式或以预培养形式添加。在本发明的方法中，该至少一种真菌的浓度选自0.01gCDW/L至50gCDW/L的范围，其中0.02gCDW/L至25gCDW/L、0.03gCDW/L至20gCDW/L以及0.05gCDW/L至15gCDW/L的范围也在本发明的范围内。因此参数“L”涉及根据本发明方法的步骤a)的培养基的体积。
在本发明方法中使用的至少一种真菌是，例如仅一种单一类型的真菌或不同真菌的混合物。术语“细胞干重”(CDW)应理解为，在发酵样品离心，除去上清液，用9g/L的NaCl溶液洗涤，再次离心，再次除去上清液和在90℃下干燥直到达到恒定重量后，总生物量的重量除以发酵样品的体积。
在本发明中，术语“预培养物”应理解为包含任何用于预培养至少一种真菌的发酵或培养介质的组合物。术语“预培养物”是发酵领域的任何技术人员众所周知的。在具体的实施方式中，至少一种真菌预培养达到2gCDW/L–30gCDW/L的细胞干重，然后根据本发明方法的步骤b)添加至培养基中。本发明方法的特别优势在于，可以在保持预培养物的体积相对较低的同时获得高的β-葡聚糖产率，因为例如使用0.1至0.5wt.-％(预培养物重量比培养基重量)就足够了。
在本发明的特别的实施方式中，根据步骤a)的培养基的氮含量选自0.003至0.02wt.-％的范围，其中0.005至0.015wt.-％和0.006至0.01wt.-％的范围也在本发明的范围内。
在本发明的特别的实施方式中，本发明方法的步骤b)进行1分钟至8小时的时间段，其中2分钟至7小时、3分钟至6小时和5分钟至5小时的时间段也在本发明的范围内。因此，特别适合的是通过在该时间段的开始时一次全部添加至少一种真菌来进行接种。
在本发明方法的步骤c)中，以1至20wt.-％的浓度添加至少一种碳源，其中2至18wt.-％、3至15wt.-％以及4至12wt.-％的浓度也在本发明的范围内。可以通过本领域技术人员已知适合于本发明方法的任何方法来进行“添加”。步骤c)可以在本发明方法的步骤b)之后进行，但是也可以在步骤b)之前进行，或者步骤b)和c)也可以同时进行。在本发明的另一个实施方式中，步骤a)和c)可以同时并且在步骤b)之前进行。
在本发明方法的步骤d)中，培养基和至少一种真菌混合24至400小时的时间段，其中30至350小时、35至300小时、40至250小时以及50至200小时的时间段也在本发明的范围内。可以通过本领域技术人员已知适合于本发明方法的任何方法进行“混合”。
在时间和能量消耗方面显示出特别优势的方法是通过从容器的底部到顶部连续地泵送培养基和至少一种真菌来进行混合。
在特别有利的实施方式中，混合在不使用任何种类的旋转装置如搅拌器的情况下进行。有利于进行本发明方法的系统例如是鼓泡塔式反应器(bubble column reactor)。
在具体的实施方式中，混合可以以2至12.000W/m3的比功率输入P/V进行，其中100至1.000W/m3的比输入功率也在本发明的范围内。
在搅拌混合系统(例如搅拌釜式反应器)中，术语“比功率输入”理解为
其中P是输入功率[W]，Ne是牛顿数[-]，ρ是根据步骤a)的培养基的密度[kg/m3]，n是搅拌频率[s-1]，d是叶轮的直径[m]和V是根据步骤a)的培养基、碳源和至少一种真菌的体积。
在没有任何种类的叶轮或搅拌器的系统(例如鼓泡塔式反应器)中，比功率输入应理解为
其中g是重力加速度[m s-2]，和ug是如上定义的表观气体速度。
在另一个具体的实施方式中，进行混合直到在步骤d)中培养基和至少一种真菌在20s-1剪切速率且20℃温度下的动态粘度在40至600mPas的范围内，其中50至550mPas、70至500mPas、90至450mPas和100至400mPas的范围也在本发明的范围内。
在本发明的特别的实施方式中，在整个过程中pH保持在4.0至6.0的范围内，其中4.25至5.75、4.25至5.5和4.25至4.75的范围也在本发明的范围内。在本发明的另一个特别的实施方式中，通过添加碱在整个过程中pH保持在4.75以上，例如在4.75至5.25的范围内，其中碱可以是发酵领域的技术人员已知适合用于发酵且不含氮的任何碱(例如NaOH或KOH)。本发明方法的特别优势是不需要使用酸来调节pH水平。
在本发明的特别的实施方式中，在整个过程中温度保持在22至30℃的范围内，其中23至30℃的范围、24至29℃的范围和24至28℃的范围也在本发明的范围内。
在本发明方法的步骤e)中，去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌，其中40至85wt.-％、45至80wt.-％、50至75wt.-％和55至65wt.-％的范围也在本发明的范围内。由此“去除”可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明方法的任何手段和方法来进行。
在本发明方法的步骤f)中，30至90wt.-％的如本发明方法的步骤a)中所定义的且另外包含碳源的培养基添加到剩余的培养基和至少一种真菌中，其中40-85wt.-％、45-80wt.-％、50-75wt.-％和55-65wt.-％的范围也在本发明的范围内。由此可以理解，30-90wt.-％的范围包含培养基和碳源的重量。由此，“添加”可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明方法的任何手段和方法来进行。由此，重要的是，除去的培养基和真菌的量与新培养基的量相等，其中可容许最大30％，优选小于10％的偏差。
在本发明方法的步骤g)中，将步骤c)至f)重复2至100次，其中重复2至80次、2至70次、2至50次和2至25次也在本发明的范围内。本发明方法的特别有利的是可以收获细胞和发酵产物多达100次而不需要重新接种。由本发明的发明人开发的发酵方法和培养基组合物保证β-葡聚糖的高产率。步骤c)至f)的重复是特别有利的，因为β-葡聚糖的产率随着第一次重复显著增加。另外，清洁费用可以被最小化，因为仅在完成本发明方法的步骤g)之后才需要清洁反应器，这有助于进一步节省成本，预培养物制备的成本可以最小化，因为仅需对该方法的第二至第100次迭代进行预培养物制备。另外，生产设备的停机时间(非生产阶段)得以最小化，因为生产可以在没有收获、灭菌、清洁和填充的时间损失的情况下保持运行。然而，通过不重复步骤c)至f)而是仅执行一次步骤c)至f)而获得合适的β-葡聚糖产率也是可能的。
在本发明中，术语“生物聚合物”应理解为由活生物体产生的任何聚合物。本发明的方法和系统特别适合于在20至100℃范围内或在20至80℃范围内表现出非温度相关的粘度的生物聚合物。本发明的方法特别适合于包含共价键合的单体单元的生物聚合物，例如聚合物碳水化合物结构、橡胶、木栓质、黑色素和木质素。在示例性的实施方式中，至少一种生物聚合物的分子量为至少0.8兆道尔顿，例如硬葡聚糖、支链淀粉或β-葡聚糖。在另一个示例性实施方式中，至少一种生物聚合物具有最大0.5至5.0百万道尔顿(兆道尔顿)或0.75至3.5百万道尔顿(兆道尔顿)或1.0至2.0百万道尔顿(兆道尔顿)的分子量分布。在示例性的实施方式中，生物聚合物具有由常数b描述的剪切稀化行为，其中b是两对值x1/y1和x2/y2之间的梯度，其中x是0.1-100s-1范围内的剪切速率[s-1]，和y是在给定的剪切速率下和在20℃至80℃的生物聚合物温度和0.05至0.5wt.-％的浓度下的动态粘度[mPas]。常数b可以由公式b＝-((lg(y1/y2)/(lg(x1/x2))描述。在合适的但示例性的实施方式中，b选自0.65至1.05的范围。在另一个示例性实施方式中，b选自0.7至1.0的范围。在另一个示例性实施方式中，b选自0.75至0.9的范围。在本发明中，术语“β-葡聚糖”应理解为是指任何β-D-葡萄糖多糖，其特征在于形成具有1-3β-糖苷键的线性骨架。在本发明的特别的实施方式中，β-葡聚糖具有最大0.5至5.0百万道尔顿(兆道尔顿)或0.75至3.5百万道尔顿(兆道尔顿)或1.0至2.0百万道尔顿(兆道尔顿)的分子量分布。
本发明的具体实施方式
以下具体实施方式限定了特别有利于通过属于短梗霉(Aureobasidiaceae)科的真菌产生β-葡聚糖的实施方式。这些实施方式无意在任何方面限制本申请的范围。
具体实施方式A
用于短梗霉科的发酵的方法，包括以下步骤：
a)提供具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于出芽短梗霉种的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加至少一种碳源；
d)根据步骤d)混合培养基和至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.5范围的相对气体含量下进行。
具体实施方式B
用于短梗霉科的发酵的方法，包括以下步骤：
a)提供具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于出芽短梗霉种的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加蔗糖；
d)根据步骤d)混合培养基和至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.2范围的相对气体含量下进行。
具体实施方式C
用于短梗霉科的发酵的方法，包括以下步骤：
a)提供具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于出芽短梗霉种的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加蔗糖；
d)根据步骤d)混合培养基和至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.2范围的相对气体含量下以及24至30℃的温度和4至6的pH下进行。
具体实施方式D
用于短梗霉科的发酵的方法，包括以下步骤：
a)提供具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于出芽短梗霉种的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加蔗糖；
d)根据步骤d)混合培养基和至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的培养基和至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.2范围的相对气体含量下以及24至30℃的温度和4至6的pH下进行，且步骤b)在步骤c)之前进行1分钟到8小时的时间段。
实施例和附图
在下文中，通过具体的实施例和附图描述本发明。实施例和附图仅用于说明目的，并不限制本发明的范围。
附图列表
图1显示了干物质和氮含量对产物形成的影响。
图2显示了温度对产物形成的影响。
图3显示了pH对产物形成的影响。
图4显示了碳源对产物形成的影响。
图5显示了重复分批过程的示意性概述。
图6显示了重复发批生产中每批的产物形成。
图7显示了相对气体含量对产物形成的影响。
图8显示了饥饿期(starvation phase)对产物形成的影响。
实施例1：
干物质和氮含量的影响
制备了100kg以下培养基，并在Techfors 150反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟：
PDB-培养基(马铃薯葡萄糖肉汤，干物质含量为0.4wt.-％，氮含量为0.008wt.-％；现有技术)：3g/kg马铃薯提取物(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，1g/kg消泡剂204(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，在自来水中(Osin′ska-Jaroszuk等，Extracellular polysaccharides from Ascomycota and Basidiomycota:productionconditions,biochemical characteristics,and biological properties；World JMicrobiol Biotechnol.2015 31:1823–1844)，
PM-培养基(生产培养基，干物质含量为0.5wt.-％，氮含量为0.02wt.-％)；现有技术)：2g/kg(NH4)2SO4(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，1g/kg K2HPO2(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.5g/kg KCl(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.5g/kgMgSO4*7H2O(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.01g/kg FeSO4*7H2O(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.4G/kg酵母提取物(Lallemand,Montreal,Canada)，1g/kg消泡剂204，自来水中(Youssef等，Pullulan production by a non-pigmented strain ofAureobasidium pullulans using batch and fed-batch culture；ProcessBiochemistry 34(1999)355–366)，和
OM-培养基(本发明)：0.4g/kg NaNO3(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.4g/kg K2HPO4，0.4g/kg NaCl(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.4g/kg MgSO4*7H2O(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.2g/kg酵母提取物(Lallemand,Montreal,Canada)，1g/kg消泡剂204(Sigma Aldrich)。
在高压灭菌之前，将50g/kg的蔗糖(Südzucker AG)添加到各个培养基中。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，使用5M H2SO4和5M NaOH将pH调节至4.5+/-0.25，并对于剩余的发酵用5M NaOH控制在4.5+/-0.25，将培养基搅拌并在0.016的相对气体含量和0.2巴的顶空压力下充气。
当达到恒定状态时，每种培养基接种至0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉菌。该生物体在上述条件下在相应的培养基中培养144小时。
使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN53019用旋转流变仪和同轴圆筒，对作为产物形成的量度的粘度进行测量。自行开发的培养基获得的改进在图1中通过培养基成本(所有培养基成分成本的总和)和培养144小时后发酵液的动态粘度(作为产物形成的量度)来显示。结果表明，干物质含量为0.16wt.-％且氮含量为0.0066wt.-％的OM培养基显示出最高的粘度(和因此最高的β-葡聚糖产率)，同时将成本保持在最低水平。
实施例2：
温度对β-葡聚糖产率的影响
将2kg OM培养基和50g/kg蔗糖(Südzucker AG)在配备一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮的Labfors 5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在24至32℃范围的温度(见图2)，pH使用5M H2SO4和5M NaOH调节至4.5+/-0.25，且对于剩余的发酵用5M NaOH控制至4.5+/-0.25，将培养基在0.03的相对气体含量下搅拌并充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种至0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉。在上述条件下在相应的培养基中培养该生物体144小时。使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN 53019用旋转流变仪和同轴圆筒对作为产物形成的量度的粘度进行测量。
如图2所示，在24至30℃，最佳26℃的温度下获得了最佳结果(培养144h后作为β葡聚糖产率的量度的发酵液的动态粘度)。
实施例3：
pH值对β-葡聚糖产率的影响
将2kg OM培养基和50g/kg蔗糖(Südzucker AG)在配备一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮的Labfors 5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，pH使用5M H2SO4和5M NaOH调节并将其控制在图3中给出的值，培养基在0.03的相对气体含量下搅拌和充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种至0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉。在上述条件下在相应的培养基中培养该生物体144小时。使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN 53019用旋转流变仪和同轴圆筒对作为产物形成的量度的粘度进行测量。
如图3所示，在4至6的pH值(最佳为5)下获得了最佳结果(培养144小时后作为β葡聚糖产率的量度的发酵液动态粘度)。
通过培养144小时后作为产物形成的量度的发酵液的动态粘度于图3中显示pH值设定到5.0的改进。
实施例4
不同碳源对β-葡聚糖产率的影响
将2kg OM培养基和图4中给出的等于50g总糖/kg的不同C源在配备一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮的Labfors 5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，pH使用NaOH和H2SO4调节至4.75±0.25，并使用5M H2SO4和5M NaOH控制至4.75±0.25，将培养基在0.03的相对气体含量下搅拌和充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种达到0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉。在上述条件下在相应的培养基中培养该生物体144小时。使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN53019用旋转流变仪和同轴圆筒对作为产物形成的量度的粘度进行测量。
如图4所示，使用蔗糖作为碳源可获得最佳结果(培养144小时后作为β-葡聚糖产率的量度的发酵液动态粘度)。
实施例5
重复分批生产
将2kg OM培养基和50g/kg蔗糖(Südzucker AG)在配备一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮的Labfors 5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，pH使用NaOH和H2SO4调节至4.75±0.25，并使用5M H2SO4和5M NaOH控制至4.75±0.25，将培养基在0.03的相对气体含量下搅拌和充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种达到0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉。在上述条件下培养该生物体。当pH增加到5以上时，收获75％的培养基，并且用新鲜的OM培养基(组成如上定义)重新填充发酵罐。在前九个循环中，通过添加5％工作体积的生长培养基(30g/kg蔗糖(Südzucker AG)和20g/kg酵母提取物((Lallemand,Montreal,Canada)包括2天的另外的生长期。在第10到第12批中，不包括生长期。该收获和重新填充的循环重复数次，如图5所示。使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN 53019，用旋转流变仪和同轴圆筒对作为产物形成的量度的样品粘度进行测量。
实施例6
相对气体含量的影响
将0.8L OM培养基和50g/kg蔗糖(Südzucker AG)在配备有两个Rushton涡轮的DasGip反应器(DasGip Bioblock搅拌容器,Eppendorf AG,Hamburg,Germany)中于121℃下高压灭菌20分钟，或者将2L OM培养基和50g/kg蔗糖在配备有一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮和一个斜叶式叶轮的Labfors 5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中在121℃下高压灭菌20分钟，或将100kg OM培养基和50g/kg蔗糖(Südzucker AG)在Techfors150反应器(Infors AG，Bottmingen，Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟，或25m3 OM培养基和50g/kg的蔗糖(Südzucker AG)通过超高温处理(150℃，10分钟)灭菌并转移到30m3搅拌釜反应器中。对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，pH使用NaOH和H2SO4调节至4.75±0.25，并使用5M H2SO4和5M NaOH控制至4.75±0.25，培养基以100至12.000W/m3范围的比功率输入搅拌，且以每体积培养基和每分钟0.5至1.5体积空气充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种达到0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉菌。在上述条件下培养该生物体。
实施例7
饥饿期的影响
2kg OM培养基(0.4g/kg NaNO3(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.4g/kgK2HPO4，0.4g/kg NaCl(Sigma Aldrich,Steinheim,Germany)，0.4g/kg MgSO4*7H2O(SigmaAldrich,Steinheim,Germany)，0.2g/kg酵母提取物(Lallemand，Montral，Canada)，1g/kgAntifoam 204(Sigma Aldrich))在配备有一个Rushton涡轮和一个斜叶式叶轮的Labfors5BioEtOH反应器(Infors AG,Bottmingen,Switzerland)中于121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌后，对于实验的其余部分，将温度控制在26℃，pH使用5M H2SO4和5M NaOH调节并控制在4.75，培养基在0.017的相对气体含量下搅拌并充气。
当达到恒定状态时，将培养基接种达到0.019g/kg CDW浓度的出芽短梗霉。在上述条件下在相应的培养基中培养该生物体144小时。分别在0h、2h和4h后，一次性将无菌蔗糖溶液添加到培养基中以达到50g/kg的蔗糖浓度。使用Malvern Kinexus Lab+-流变仪(Malvern Panalytical Ltd.,Almelo,Netherlands)，以20s-1的剪切速率和20℃的温度根据DIN 53019用旋转流变仪和同轴圆筒对作为产物形成的量度的粘度进行测量。
如图8所示，实施4小时的饥饿期获得了最佳结果(培养144小时后作为β-葡聚糖产率的量度的发酵液动态粘度)。
Claims (8)
1.一种用于子囊菌发酵的方法，其包括以下步骤：
a)提供一种具有选自0.1至0.3wt.-％的范围的干物质含量，并且含有少于0.1wt.-％的有机氮源的培养基；
b)用至少一种属于子囊菌门的真菌以选自0.01gCDW/L至50gCDW/L范围的接种密度接种所述培养基；
c)以1至20wt.-％的浓度添加至少一种碳源；
d)根据步骤d)混合所述培养基和所述至少一种真菌24至400小时的时间段；
e)去除30至90wt.-％的所述培养基和所述至少一种真菌；
f)添加30至90wt.-的另外包含碳源的如步骤a)中定义的培养基；
g)重复步骤c)至f)2至100次；
其中步骤c)至g)中的至少一个在选自0.005至0.5范围的相对气体含量下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中所述培养基的细胞干重CDW选自0.01至50gCDW/L的范围。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤a)的所述培养基的氮含量选自0.003至0.02wt.-％的范围。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在整个过程中将pH保持在4.0至6.0的范围内。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在整个过程中将温度T保持在22至30℃的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)的过程中所述培养基的动态粘度选自40至600mPas的范围。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)进行1分钟至8小时的时间段。
8.通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法生产的β-葡聚糖。
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