CN110607253A - 一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用 - Google Patents

一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用。所述菌株DMST‑H2分离于内蒙古家庭自制酸奶，已于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏编号为GDMCC 60642。通过优化增殖培养基，所述菌株的活菌数可增殖至109CFU/mL以上。最优条件下活菌数可达4.2×109CFU/mL，是培养条件优化前的37.8倍。本发明菌株更适合中国人的肠道，且成本更低。此外，该菌株具有耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液的能力，同时具有突出的抗氧化能力，尤其是DPPH清除能力。

Description

一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株来源于中国传统发酵乳的嗜热链球菌DMST-H2及其增殖培养方法。
背景技术
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是多种发酵制品的发酵剂菌种，是仅次于乳酸乳球菌的第二重要的工业乳酸菌种。人类每年消耗约1021嗜热链球菌活菌，致使这一菌种的市值达到了400亿美元。在乳品工业中，嗜热链球菌通常与德氏乳杆菌保加利亚亚种一起作为发酵乳直投式发酵剂的主要发酵菌株。在发酵过程中，嗜热链球菌可快速酸化培养基，抑制细菌和酵母等杂菌的生长。多数嗜热链球菌可产生并释放叶酸，而叶酸是人类饮食中不可缺少的重要组分。经过发酵，嗜热链球菌可产生多种特征风味物质，赋予发酵制品独特的感官品质，极大地影响着发酵制品的质量。
当前，我国乳品企业所用直投式发酵剂95％源于进口。进口直投式发酵剂菌株源于国外且价格昂贵，具有潜在的健康安全隐患和高价垄断弊端。有研究发现，来自本族群的原生菌或原籍菌最适合于本族人体。因此，筛选源于中国本土的发酵菌株，对外来菌株进行代替势在必行。此外，针对嗜热链球菌大量需求的现状，优化适宜菌体生长的培养基、培养条件，改善提高菌体的生长繁殖能力，是研制开发高效稳定发酵剂的基础。
李康宁等利用响应面法优化了嗜热链球菌增殖培养基，活菌数最终为 2.34×109CFU/mL，较优化前提高了2～3倍。但仅对培养基成分进行了优化，未涉及温度、pH、接种量等培养条件的优化，优化条件不足，且未起到很明显的优化效果。
田洪涛等通过向MRS培养基中添加不同营养物质，优化了嗜热链球菌的增殖培养基，最终活菌数可达4.69×109CFU/mL，活菌数较优化前提高了40.78 倍。但在MRS培养基配方的基础上直接添加玉米浆、番茄汁等营养物质，致使有效成分不明晰，不同批次的玉米浆、番茄汁等可能会对嗜热链球菌的增殖产生不同的效果，同时也增加了成本。
上述技术指出了增殖培养的优化方向，主要包括培养基组分的优化及温度、 pH、接种量等培养条件的优化，但仍存在优化条件不足等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株源于中国本土传统发酵乳的嗜热链球菌菌株 DMST-H2及其增殖培养的方法，为本土来源的嗜热链球菌的研究和实际应用提供理论基础。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一株源于中国传统发酵乳——内蒙古家庭自制酸奶中分离得到的嗜热链球菌DMST-H2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏编号为GDMCC 60642。该嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株DMST-H2 的生物学特征是：在MRS培养基平板上划线分离，37～48℃培养48～72h，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，菌落乳白色，表面湿润光滑。经革兰氏染色镜检可知为革兰氏阳性菌，菌体球形，两两一对，链成长链，无芽孢(如图1所示)。生理生化试验结果表明菌株KOH试验阴性，过氧化氢酶试验阴性，兼性厌氧，能水解淀粉，不液化明胶，吲哚试验阴性。根据16S rDNA寡核苷酸序列和生理生化特性鉴定DMST-H2为嗜热链球菌。其16S rDNA序列如SEQ ID NO： 1所示。
一种嗜热链球菌，该菌株为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) DMST-H2，于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称 GDMCC，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60642。
上述嗜热链球菌的增殖培养方法，按以下步骤进行：
(1)将嗜热链球菌DMST-H2接种到MRS培养基中活化，得到种子液；
(2)将种子液到增殖培养基中，静置培养12～24h即可；
所述增殖培养基配方为：以质量比计，碳源1.5～2.5份、酵母提取物 4.25～4.75份、磷酸氢二钾0.15～0.25份、柠檬酸三铵0.15～0.25份、乙酸钠 0.45～0.55份、七水硫酸镁0.015～0.025份、四水硫酸锰0.005～0.007份、吐温 80 0.1～0.3份、碳酸钙0.06～0.08份、半胱氨酸0.0163～0.0176份、维生素C 0.0001～0.0005份，蒸馏水定容到100份；所述碳源为乳糖、蔗糖和甘露糖中至少一种。
优选地，所述增殖培养基中七水硫酸镁与四水硫酸锰的质量比为(2～4):1。
优选地，所述增殖培养基配方为：以质量比计，乳糖2份、酵母提取物4.525 份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁0.019 份、四水硫酸锰0.006份、吐温80 0.1份、碳酸钙0.07份、半胱氨酸0.017份、维生素C 0.0003份。
优选地，所述嗜热链球菌DMST-H2在增殖培养基中的培养初始pH为 5.0～6.0。
优选地，所述嗜热链球菌DMST-H2在35℃～45℃下培养。
优选地，所述嗜热链球菌DMST-H2按体积比3％～4％的接种量接种到增殖培养基中。
优选地，步骤(2)所述培养条件为：初始pH值5.5、接种量3.5％、培养温度40℃，恒温厌氧培养12～24h。
优选地，所述MRS培养基配方为：以质量比计，牛肉膏0.5～1.0份，酵母膏0.5～0.7份，蛋白胨0.8～1.0份，葡萄糖1.5～2.5份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，醋酸钠0.4～0.5份，七水硫酸镁0.015～0.025份，四水硫酸锰0.004～0.006份，吐温80 0.1～0.3份，柠檬酸三铵0.15～0.25份，蒸馏水定容至100份，灭菌前 pH为6.2～6.6。
本发明与现有技术相比有如下优势和有益效果：
(1)本发明公开了一株嗜热链球菌菌株DMST-H2，该菌筛选自中国传统发酵乳制品——内蒙古家庭自制酸奶，经急性毒理证明食用安全，相对国外进口菌株更适合中国人的肠道，且成本更低。
(2)本发明公开了嗜热链球菌DMST-H2的增殖培养基，其配方为：以质量比计，乳糖1.5～2.5份、酵母提取物4.25～4.75份、磷酸氢二钾0.15～0.25份、柠檬酸三铵0.15～0.25份、乙酸钠0.45～0.55份、七水硫酸镁0.015～0.025份、四水硫酸锰0.005～0.007份、吐温80 0.1～0.3份、碳酸钙0.06～0.08份、半胱氨酸0.0163～0.0176份、维生素C 0.0001～0.0005份，蒸馏水定容到100份。
(3)本发明公开了嗜热链球菌DMST-H2的增殖培养条件为：初始pH 5.0～6.0；接种量体积比3％～4％；培养温度35℃～45℃。
(4)在本发明公开的增殖培养基和培养条件下，嗜热链球菌DMST-H2 的活菌数可达4.2×109CFU/mL，是培养条件优化前的37.8倍，极大地提高了活菌数，为该菌株后继的研究、生产奠定基础。
(5)本发明的菌株具有耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液的能力，同时具有突出的抗氧化能力，尤其是DPPH清除能力，具有潜在的益生价值。
附图说明
图1是实施例1中嗜热链球菌DMST-H2的10×100显微镜图。
图2是实施例3中不同单因素对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响。其中， (a)是不同碳源(甘露糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉)对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(b)是不同氮源(牛肉膏、酵母提取物、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、麦芽提取物)对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(c) 是不同微量元素(镁、锰、铜、铁的水合物)对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(d)是镁锰不同复配比例(1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)对嗜热链球菌 DMST-H2生长的影响；(e)是分别添加0.0001份、0.0003份、0.0005份的维生素C和维生素B对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(f)是分别添加 0.01份、0.03份、0.05份的组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(g)是分别添加质量分数为0.05份、0.1 份、0.15份的碳酸钙对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响。
图3是实施例3中BBD设计的各因素交互作用3D响应面及等高线图。其中，(a)是碳酸钙和酵母提取物的响应面及等高线图；(b)是半胱氨酸和酵母提取物的响应面及等高线图；(c)是碳酸钙和半胱氨酸的响应面等高线图。
图4是初始pH、接种量、温度对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响。其中(a)是不同初始培养pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)对嗜热链球菌DMST-H2 生长的影响；(b)是不同接种量(2％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％) (v/v)对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响；(c)是不同培养温度(30℃、 35℃、40℃、45℃)对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响。
图5是嗜热链球菌DMST-H2对人工胃肠道的耐受性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。
实施例1一株源于中国本土传统发酵乳制品的嗜热链球菌DMST-H2
本实施例为一株源于中国传统发酵乳的嗜热链球菌DMST-H2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏编号为GDMCC 60642。该嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌株DMST-H2的生物学特征是：在MRS培养基平板上划线分离，37℃培养48h，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，菌落乳白色，表面湿润光滑。经革兰氏染色镜检可知为革兰氏阳性菌，菌体球形，两两一对，链成长链，无芽孢。生理生化试验结果表明菌株KOH试验阴性，过氧化氢酶试验阴性，兼性厌氧，能水解淀粉，不液化明胶，吲哚试验阴性。根据16S rDNA寡核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)和生理生化特性鉴定DMST-H2为嗜热链球菌。
实施例2嗜热链球菌DMST-H2的分离纯化
本实施例为一株源于中国传统发酵乳的嗜热链球菌DMST-H2的分离纯化方法，该方法按如下步骤进行：
(1)将内蒙古家庭自制酸奶样品用旋涡振荡器振荡5min，在无菌条件下，吸取0.5mL乳样于4.5mL无菌生理盐水中混匀，此为10-1稀释液，如此，稀释到10-7，选取10-5、10-6、10-7稀释度，吸取100μL涂布于MRS平板上，置于厌氧培养罐中37℃培养48h；
(2)观察菌落生长情况，待平板上长出特征菌落后挑选特征单菌落；
(3)将单菌落划线接种到MRS固体培养基上，37℃培养24h，再次挑取单菌落划线，如此进行6次纯化；
(4)将纯化后的单菌落接种到液体MRS培养基中，37℃培养至菌液浑浊。
(5)在无菌条件下，取0.5mL菌液和0.5mL30％无菌甘油于1.5mL离心管中，1:1等体积混合后，存放于-80℃冰箱。
所述MRS液体培养基为：以重量份数计，牛肉膏1份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，葡萄糖2份，磷酸氢二钾0.2份，醋酸钠0.5份，七水硫酸镁0.02 份，四水硫酸锰0.005份，吐温800.1份，柠檬酸三铵0.2份，琼脂1.5份，蒸馏水定容至100份，灭菌前pH为6.6。
实施例3嗜热链球菌DMST-H2培养基的优化
(1)单因素试验及结果
碳源单因素试验中，以MRS培养基为基础，采用2份的甘露糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉替代MRS培养基中的碳源(葡萄糖)，设置不加碳源的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的嗜热链球菌DMST-H2，37℃培养24h，测定OD600，根据菌体生长情况优劣选取最佳碳源。结果如图2(a)所示，乳糖培养嗜热链球菌DMST-H2得到的菌体密度最大，其次为蔗糖和甘露糖。乳糖试验组的菌体密度显著高于其他糖类(p<0.05)。因此选用乳糖进行下一步研究。
氮源单因素试验中，以MRS培养基为基础，采用2.5份的牛肉膏、酵母提取物、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、麦芽提取物替代MRS培养基中的氮源，设置不加氮源的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的嗜热链球菌DMST-H2，37℃培养24h，测定OD600，根据菌体生长情况优劣选取最佳氮源。结果如图2(b)所示，酵母提取物培养的嗜热链球菌 DMST-H2的菌体密度大于MRS，但无显著差异。但MRS中氮源种类多，配制复杂，选用酵母提取物可简化培养基配方且达到相同效果。因此选用酵母提取物进行下一步研究。
微量元素单因素试验中，以MRS培养基为基础，采用0.025份的微量元素(包括镁、锰、铜、铁的水合物)替代MRS培养基中的微量元素，设置不加微量元素的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的嗜热链球菌DMST-H2，37℃培养24h，测定OD600，根据菌体生长情况优劣选取最佳微量元素种类。结果如图2(c)(d)所示，镁锰复配对应的MRS 的菌体密度高于单一微量元素的菌体密度，因此选用镁和锰比例为1:3、1:2、 1:1、2:1、3:1进行复配。结果如图2(d)所示，镁锰比例为3:1时菌体密度最高，且显著高于其他组(p<0.05)，因此选用镁锰比例为3:1进行下一步研究。
向培养基中分别添加0.01份、0.03份、0.05份的氨基酸(组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸)或0.0001份、0.0003份、0.0005份的维生素C和复合维生素B，以不添加生长因子的MRS培养基为对照。接种对数生长期的嗜热链球菌DMST-H2，37℃培养24h，测定OD600，根据菌体生长情况优劣选取最佳生长因子。不同种类和浓度的氨基酸对嗜热链球菌DMST-H2生长的影响结果如图2(e)所示，在各种氨基酸中，0.01份半胱氨酸培养的菌体浓度最大，且显著优于其他种类氨基酸，因此选用半胱氨酸作为最佳氨基酸进行下一步研究。不同种类和浓度的维生素对嗜热链球菌 DMST-H2生长的影响结果如图2(f)所示，在不同浓度的维生素C和复合维生素B中，0.0003份的维生素C培养的菌体浓度最大，且显著优于其他种类和浓度的维生素，因此选用0.0003份的维生素C作为最佳维生素进行下一步研究。
向培养基中添加0.05份、0.1份、0.15份的碳酸钙，以不添加碳酸钙的MRS培养基为对照。接种对数生长期的嗜热链球菌DMST-H2，37℃培养24h，测定活菌数，根据菌体生长情况优劣选取最佳碳酸钙浓度。结果如图2(g) 所示，添加碳酸钙后对数期由12h缩短为8h，且活菌数高于未加碳酸钙的对照组，由此说明碳酸钙可缩短生长周期同时提高最大活菌数，提高生产效率。对比不同浓度处理组的最大活菌数，碳酸钙为0.1份时活菌数最大，因此选用 0.1份的碳酸钙进行下一步研究。
(2)Plackett-Burman试验筛选得到显著影响因素
将乳糖、酵母提取粉、3:1镁锰微量元素、0.01份半胱氨酸、0.0003份的维生素C、0.1份碳酸钙进行Plackett-Burman设计，筛选对嗜热链球菌DMST-H2 最大活菌数影响最为显著的因素。各因素编号及水平如表1所示。
表1 Plackett-Burman试验设计中各因素编号及水平
试验设计及响应值如表2所示。
表2 Plackett-Burman试验设计方案及响应值
利用Design Expert软件进行分析，酵母提取物、半胱氨酸和碳酸钙为显著影响因子，且模型显著(p<0.05)。并确定碳酸钙最陡爬坡实验的变化方向为负向，酵母提取物和碳酸钙的最陡爬坡方向为正。
(3)最陡爬坡试验
根据三个因素效应大小的比例设定步长，实验设计及结果如表3所示。可见，序号4的条件为响应面实验的中心点。
表3最陡爬坡试验设计及结果
(4)Box-Behnken响应面设计及验证
将酵母提取物、半胱氨酸和碳酸钙进行Box-Benhnken实验设计，每个因素选取3个水平：酵母提取物4.25份、4.5份、4.75份，半胱氨酸0.0163份、 0.01695份、0.0176份，碳酸钙0.06份、0.07份、0.08份，以活菌数CFU/mL 为响应值。试验设计及结果如表4所示。
表4 BBD设计方案及结果
运用软件分析得到活菌数对酵母提取物、半胱氨酸和碳酸钙的回归方程为：活菌数(CFU/mL)＝-3.45462×1011+4.13538×1010×酵母提取物+2.41696×1013×半胱氨酸+1.40865×1012×碳酸钙+5.53846×1013×酵母提取物×半胱氨酸 -9.65×1010×酵母提取物×碳酸钙-3.11538×1013×半胱氨酸×碳酸钙-4.866×109×酵母提取物2-7.22781×1014×半胱氨酸2-3.19125×1012×碳酸钙2。该模型的F值为 47.41，p<0.01，模型显著，失拟项p值为0.9826，p>0.05，失拟项不显著。该模型的R2＝0.9839，Radj 2＝0.9631，说明模型的预测值与实际值的拟合程度较好，使用该模型可解释96.31％的响应值的变化。实验设计结果的3D响应面图见图 3。
由结果可知，当酵母提取物为4.525份，半胱氨酸为0.017份，碳酸钙为 0.0705份时，活菌数可达到理论最大值1.96442×109CFU/mL。
用优化后的培养基进行三次验证试验，得到活菌数为1.93×109CFU/mL，与预测值相符。因此优化后的培养基为：以质量比计，乳糖2份、酵母提取物 4.525份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁 0.019份、四水硫酸锰0.006份、吐温800.1份、碳酸钙0.07份、半胱氨酸0.017 份、维生素C 0.0003份。最终活菌数可达1.93×109CFU/mL，是优化前MRS 培养基活菌数的27.2倍。
实施例4
制备MRS固体培养基，以质量比计，牛肉膏1份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，葡萄糖2份，磷酸氢二钾0.2份，醋酸钠0.5份，七水硫酸镁0.02份，四水硫酸锰0.005份，吐温80 0.1份，柠檬酸三铵0.2份，琼脂1.5份，蒸馏水定容至100份，灭菌前pH为6.6，用于倾注法平板计数(方法参照国标)。
将处于对数期的嗜热链球菌DMST-H2以1×107CFU/mL的接种量接种于增殖培养基中，37℃厌氧培养24h后取样测定活菌数；所述增殖培养基配方为：以质量比计，乳糖2份、酵母提取物4.5份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁0.019份、四水硫酸锰0.006份、吐温 80 0.1份、碳酸钙0.07份、半胱氨酸0.01695份、维生素C 0.0003份；测得活菌数为2.06×109CFU/mL。
实施例5
制备MRS固体培养基，以质量比计，牛肉膏1份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，葡萄糖2份，磷酸氢二钾0.2份，醋酸钠0.5份，七水硫酸镁0.02份，四水硫酸锰0.005份，吐温80 0.1份，柠檬酸三铵0.2份，琼脂1.5份，蒸馏水定容至100份，灭菌前pH为6.6，用于倾注法平板计数(方法参照国标)。
将处于对数期的嗜热链球菌DMST-H2以1×107CFU/mL的接种量接种于优化培养基中，37℃厌氧培养24h后取样测定活菌数；所述优化培养基为：以重量份数计，乳糖2份、酵母提取物4.25份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁0.019份、四水硫酸锰0.006份、吐温 80 0.1份、碳酸钙0.07份、半胱氨酸0.0176份、维生素C 0.0003份；测得活菌数为1.22×109CFU/mL。
实施例6
制备MRS固体培养基，以质量比计，牛肉膏1份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，葡萄糖2份，磷酸氢二钾0.2份，醋酸钠0.5份，七水硫酸镁0.02份，四水硫酸锰0.005份，吐温80 0.1份，柠檬酸三铵0.2份，琼脂1.5份，蒸馏水定容至100份，灭菌前pH为6.6，用于倾注法平板计数(方法参照国标)。
将处于对数期的嗜热链球菌DMST-H2以1×107CFU/mL的接种量接种于优化培养基中，37℃厌氧培养24h后取样测定活菌数；所述优化培养基为：以重量份数计，乳糖2份、酵母提取物4.75份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁0.019份、四水硫酸锰0.006份、吐温 80 0.1份、碳酸钙0.08份、半胱氨酸0.1695份、维生素C 0.0003份；测得活菌数为1.64×109CFU/mL。
实施例7嗜热链球菌DMSY-H2培养条件的优化
分别以初始培养pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、液接种量(2％、 2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％)(v/v)以及培养温度(30℃、35℃、40℃、 45℃)作为试验因素，测定嗜热链球菌DMST-H2的OD600，分析各个因素对 DMST-H2菌体密度的影响。结果如图4所示，可知最优静态培养条件为初始 pH值5.5、接种量3.5％、培养温度40℃。将优化后的培养基和优化后的静态培养条件结合，恒温厌氧培养12～24h后，所得活菌数为4.2×109CFU/mL，是优化前的37.8倍。
实施例8嗜热链球菌DMSY-H2的益生性质
1、嗜热链球菌DMSY-H2的耐酸、耐胆盐特性
将活化两次后的菌液于8000r/min离心10min，用灭菌的生理盐水洗涤两次，将重悬菌液按2％(v/v)接种到pH为2、3、4、5、6的MRS培养基中， 3h后取样进行活菌计数。将活化两次后的菌液于8000r/min离心10min，用灭菌的生理盐水洗涤两次，将重悬菌液按2％(v/v)接种到胆盐浓度为0％、 0.25％、0.5％、0.75％、1％(w/v)的MRS培养基中，3h后取样进行活菌计数，菌株存活率结果如表5所示。
可知，菌株DMST-H2在pH 5和pH 6的条件下可生长繁殖；从pH4开始，随着pH值的降低，菌株的存活率逐渐降低，且在pH2时，存活率小于20％，表明DMST-H2在低pH条件下生长虽受抑制，但仍能存活。随着胆盐添加量的增大，DMST-H2的存活率逐渐减小，当添加量增大到1％时，存活率仍可达18.7％。
表5嗜热链球菌DMSY-H2的耐酸、耐胆盐能力
2、嗜热链球菌DMSY-H2的耐人工胃肠液特性
在胃肠道基础液(氯化钙0.11g；氯化钾1.12g；氯化钠2.0g；磷酸二氢钾0.4g，蒸馏水1L，pH 4.0，121℃高压灭菌15min)中加入0.32g/L猪胃蛋白酶，用1mol/L盐酸将pH值调整为4.0，无菌滤膜过滤，制成人工胃液。将活化两次后的菌液于8000r/min离心10min，用灭菌的生理盐水洗涤两次，将重悬菌液按2％(v/v)接种到人工胃液中，37℃、200rpm培养1h后取样测定活菌数。之后向上述人工胃液中加入1.0g/L猪胰蛋白酶，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0，制成人工肠液，37℃、200rpm培养2h和4h后取样进行活菌计数。菌株在人工胃肠液中的存活率结果如图5所示。
结果表明，嗜热链球菌DMSY-H2在人工胃液中的存活率为88.68％在人工肠液中2h后存活率为86.86％，4h后存活率仍为82.04％。
3、嗜热链球菌DMSY-H2的抗氧化能力
将活化两次后的菌液于8000r/min离心10min得上清液与菌体，菌体用生理盐水重悬后，相同条件二次离心并重悬，将重悬液用超声波细菌破碎机破碎，得细胞破碎液。上清液和细胞破碎液分别测定抗氧化能力，结果如表8 所示。
(1)DPPH清除率
将0.2mmol/L DPPH乙醇溶液与待测菌悬液或细胞破碎液按1:1混合，震荡，室温下暗反应30min后，经3500r/min离心10min，收集上清，于517nm 波长处测定吸光值。清除率(％)＝(1-(Ai-Aj)/Ac)×100，式中Ai为1mL待测菌悬液加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值(OD517)；Aj为1mL待测菌悬液加1mL无水乙醇的吸光值(OD517)；Ac为1m L PBS加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值 (OD517)。
(2)·OH清除率
按表6中的顺序依次加入试剂，于37℃恒温水浴锅中反应1h，3500r/min 离心10min，上清液于536nm测定吸光值。清除率(％)＝(Am-An)/(A0-An)×100
表6·OH清除率反应体系
(3)O2－清除率
按表7中的顺序依次加入试剂，25℃水浴20min后3500r/min心10min，于325nm波长下测定吸光值。清除率(％)＝(1-(A11-A10)/(A01-A00))×100
表7 O2－清除率反应体系
由表8可以看出，在检测的3中氧化物中，菌株对DPPH的清除率很高，且上清液的清除率大大高于细胞破碎液，属于优势菌株。
表8嗜热链球菌DMSY-H2的抗氧化能力
因此，用嗜热链球菌DMSY-H2制备的发酵乳品，在肠道中的活菌数高，同时具有良好的抗氧化能力。
序列表
<120> 一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcgt gctgatccgc gattactagc gattccgact 120
tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagatt ggctttaaga gattagctcg 180
ccgtcaccga ctcgcaactc gttgtaccaa ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttattacc ggcagtctcg 300
ctagagtgcc caactgaatg atggcaacta acaatagggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360
aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ccgatgtacc 420
gaagtaactt tctatctcta gaaatagcat cgggatgtca agacctggta aggttcttcg 480
cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540
agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcggcact 600
gaatcccgga aaggatccaa cacctagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660
tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcga gcctcagcgt cagttacaga ccagagagcc 720
gctttcgcca ccggtgttcc tccatatatc tacgcatttc accgctacac atggaattcc 780
actctcccct tctgcactca agtttgacag tttccaaagc gaactatggt tgagccacag 840
cctttaactt cagacttatc aaaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata aatccggaca 900
acgctcggga cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtc cctttctggt 960
aagctaccgt cacagtgtga actttccact ctcacacccg ttcttgactt acaacagagc 1020
tttacgatcc gaaaaccttc ttcactcacg cggcgttgct cggtcagggt tgcccccatt 1080
gccgaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140
ggccgatcac cctctcaggt cggctatgta tcgtcgccta ggtgagccat tacctcacct 1200
actagctaat acaacgcagg tccatcttgt agtggagcaa ttgccccttt caaataaatg 1260
acatgtgtca tccattgtta tgcggtatta gctatcgttt ccaatagtta tcccccgcta 1320
caaggcaggt tacctacgcg ttactcaccc gttcgcaact catccaagaa gagcaagctc 1380
ctctcttcag cgttctactg catg 1404

Claims (10)

1.一种嗜热链球菌，其特征在于，该菌株为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)DMST-H2，于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为GDMCC No：60642。
2.权利要求1所述的嗜热链球菌的增殖培养方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)将嗜热链球菌DMST-H2接种到MRS培养基中活化，得到种子液；
(2)将种子液到增殖培养基中，静置培养12～24h即可；
所述增殖培养基配方为：以质量比计，碳源1.5～2.5份、酵母提取物4.25～4.75份、磷酸氢二钾0.15～0.25份、柠檬酸三铵0.15～0.25份、乙酸钠0.45～0.55份、七水硫酸镁0.015～0.025份、四水硫酸锰0.005～0.007份、吐温80 0.1～0.3份、碳酸钙0.06～0.08份、半胱氨酸0.0163～0.0176份、维生素C0.0001～0.0005份，蒸馏水定容到100份；所述碳源为乳糖、蔗糖和甘露糖中至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基中七水硫酸镁与四水硫酸锰的质量比为(2～4):1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基配方为：以质量比计，乳糖2份、酵母提取物4.525份、磷酸氢二钾0.2份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、七水硫酸镁0.019份、四水硫酸锰0.006份、吐温80 0.1份、碳酸钙0.07份、半胱氨酸0.017份、维生素C0.0003份。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嗜热链球菌DMST-H2在增殖培养基中的培养初始pH为5.0～6.0。
6.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，所述嗜热链球菌DMST-H2在35℃～45℃下培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述嗜热链球菌DMST-H2按体积比3％～4％的接种量接种到增殖培养基中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养条件为：初始pH值5.5、接种量3.5％、培养温度40℃，恒温厌氧培养12～24h。
9.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基配方为：以质量比计，牛肉膏0.5～1.0份，酵母膏0.5～0.7份，蛋白胨0.8～1.0份，葡萄糖1.5～2.5份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，醋酸钠0.4～0.5份，七水硫酸镁0.015～0.025份，四水硫酸锰0.004～0.006份，吐温80 0.1～0.3份，柠檬酸三铵0.15～0.25份，蒸馏水定容至100份，灭菌前pH为6.2～6.6。
10.权利要求1所述的嗜热链球菌在制备发酵乳品中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941004A (zh) * 2021-05-07 2021-06-11 威凯海思(山东)生物工程有限公司 一种促进乳酸菌增殖的生长因子的配方及其应用方法
CN113861303A (zh) * 2021-10-21 2021-12-31 华南理工大学 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328469A (zh) * 2008-07-09 2008-12-24 扬州大学 具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途
US20140363501A1 (en) * 2012-02-28 2014-12-11 Jiangnan University The protective effects and application of a Lactobacillus rhamnosus on the alleviation of chronic alcoholic liver injury
CN104382161A (zh) * 2014-11-03 2015-03-04 南昌大学 一种嗜热链球菌atcc 14485与芦荟共发酵饮料的制备方法
CN105112326A (zh) * 2015-08-19 2015-12-02 华南理工大学 一种芽孢杆菌及其高密度培养方法
US20160113975A1 (en) * 2013-11-15 2016-04-28 Jiangnan University Protective effects and application of a lactobacillus rhamnosus on the alleviation of chronic alcoholic liver injury
CN110628663A (zh) * 2019-08-02 2019-12-31 华南理工大学 一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328469A (zh) * 2008-07-09 2008-12-24 扬州大学 具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途
US20140363501A1 (en) * 2012-02-28 2014-12-11 Jiangnan University The protective effects and application of a Lactobacillus rhamnosus on the alleviation of chronic alcoholic liver injury
US20160113975A1 (en) * 2013-11-15 2016-04-28 Jiangnan University Protective effects and application of a lactobacillus rhamnosus on the alleviation of chronic alcoholic liver injury
CN104382161A (zh) * 2014-11-03 2015-03-04 南昌大学 一种嗜热链球菌atcc 14485与芦荟共发酵饮料的制备方法
CN105112326A (zh) * 2015-08-19 2015-12-02 华南理工大学 一种芽孢杆菌及其高密度培养方法
CN110628663A (zh) * 2019-08-02 2019-12-31 华南理工大学 一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.SHAH等: "Preparation, characterization and in vitro antioxidative potential of synbiotic fermented dairy products", 《JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY》 *
HU JINSHUANG等: "Streptococcus thermophiles DMST-H2 Promotes Recovery in Mice with Antibiotic-Associated Diarrhea", 《MICROORGANISMS》 *
S. N. LI等: "In vitro antioxidant and angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk with different culture combinations", 《JOURNAL OF DAIRY SCIENCE》 *
刘冬梅等: "中国传统发酵乳中嗜热链球菌H2的培养及益生特性评价", 《华南理工大学学报（自然科学版）》 *
王玥: "嗜热链球菌缓解细胞氧化应激的作用机制研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941004A (zh) * 2021-05-07 2021-06-11 威凯海思(山东)生物工程有限公司 一种促进乳酸菌增殖的生长因子的配方及其应用方法
CN113861303A (zh) * 2021-10-21 2021-12-31 华南理工大学 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用
WO2023066163A1 (zh) * 2021-10-21 2023-04-27 华南理工大学 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用

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