WO2011024422A1 - 微生物醗酵生産物の製造方法 - Google Patents

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WO2011024422A1
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solvent
culture
value
microorganisms
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紗輝 濱田
伸吾 小山
和洋 小野塚
渡邉　高明
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花王株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group

Definitions

  • the present invention relates to 1- (2-hydroxyethyl) -2,5,5,8a-tetra, which is useful as an intermediate for the production of 3a, 6,6,9a-tetramethyldodecahydronaphtho [2,1-b] furan.
  • the present invention relates to a process for producing methyldecahydronaphthalen-2-ol.
  • Compound A 6,6,9a-Tetramethyldodecahydronaphtho [2,1-b] furan
  • Compound A is contained in the pathological secretion amber grease produced in the body of the perfumed whale It is an aroma component and an important compound indispensable as an amber fragrance.
  • Compound A is mainly produced by a chemical synthesis method using sclareol extracted from Clary sage (Salvia sclarea L.) as a starting material.
  • Intermediates of Compound A include 3a, 6,6,9a-tetramethyldecahydronaphtho [2,1-b] furan-2 (1H) -one (hereinafter referred to as “sclareolide”) and 1- ( 2-Hydroxyethyl) -2,5,5,8a-tetramethyldecahydronaphthalen-2-ol (hereinafter referred to as “diol form”) is known.
  • the chemical synthesis method has a problem that the environmental load is large and the yield and purity cannot be sufficiently secured.
  • Patent Documents 1 and 2 a method has been reported in which an intermediate of compound A is obtained from sclareol by microbial conversion, and this is cyclized to produce compound A (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the separation and purification of the diol obtained by microbial conversion is performed by subjecting the culture solution to solvent extraction with ethyl acetate and then drying the resulting extract in warm hexane / ethyl acetate or hexane / chloroform. And is crystallized from the solution.
  • the culture solution obtained by microbial conversion from sclareol unreacted sclareol, sclareolide, microorganisms, medium components, etc.
  • the present invention has the following formula (1a) and / or (1b)
  • the diol crystallized product obtained by the solvent extraction method using ethyl acetate was not only low in purity of the diol but also yellowish and had a strong off-flavor.
  • the culture odor derived from microorganisms is strong and a diol body is obtained by crystallization, further purification for reducing the off-flavor and improving the hue is necessary, and the production process becomes very complicated.
  • the strong culture odor derived from microorganisms remains in the obtained diol body, which is a big problem considering that the diol body becomes a perfume raw material.
  • the method of separating bacterial cells with a filter, and dissolving and filtering in ethanol requires filtration twice, so that the manufacturing process is complicated.
  • the present invention relates to a method capable of efficiently producing a diol having a good hue and a low off-flavor strength with fewer steps.
  • the present inventors have found that the culture obtained by microbial conversion is a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0 [(cal / cm 3 ) 1/2 ]. It has been found that when mixed with diol, impurities derived from microorganisms are not extracted, so that a diol body having a good hue and having reduced off-flavors, particularly reduced culture odor, can be recovered.
  • the diol can be recovered from the culture in a single separation step with a high yield because the diol can be dissolved in the solvent and extracted directly.
  • the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) is used as a substrate to produce a compound A intermediate diol, which is produced outside the cell.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it has the ability, but examples include microorganisms belonging to the genus Ascomycetes, microorganisms belonging to the genus Cryptococcus, microorganisms belonging to the class of basidiomycetes, microorganisms belonging to the genus Hyphozyma, and the like. It is done.
  • microorganisms belonging to the Ascomycetes class are preferred.
  • microorganisms belonging to the Ascomycetes class include Ascomycete sp. It was named KSM-JL2842, and was deposited on January 12, 2006 as FERM P-20759 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biological Depositary Center (address: 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki).
  • Microorganisms examples include ATCC 20624 strain described in Japanese Patent No. 2547713.
  • Microorganisms that can be used for microbial conversion can be isolated from soil using the ability to form a diol, which is an intermediate of Compound A, as an index.
  • the ability to produce a diol compound that is a compound A intermediate is a compound A intermediate contained in the medium by culturing a test microorganism in a compound-containing medium represented by the formula (1a) and / or (1b). It can evaluate by detecting a diol body.
  • gas chromatography gas-liquid chromatography (GLC), thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), infrared spectrum (IR)
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the culture conditions at the time of microbial conversion are not particularly limited, and any medium can be used as long as it contains the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) and is capable of growing the microorganism.
  • Examples of usable media include carbon sources such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, and organic acid salts; nitrogen sources such as inorganic and organic ammonium salts, nitrogen-containing organic substances, and amino acids; sodium chloride, ferrous sulfate, Examples thereof include solid media and liquid media containing metal minerals such as magnesium sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, and calcium carbonate, vitamins, and the like. Moreover, you may add surfactant and an antifoamer according to culture
  • the optimum pH range and the optimum temperature are not particularly limited.
  • the pH is 3 to 8, preferably pH 4 to 8, more preferably pH 5 to 7, and the liquid temperature is 10 to 35 ° C., preferably 15 to 30. ° C, more preferably 20-30 ° C.
  • the number of culture days is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 days from the addition of the substrate.
  • aeration culture, agitation culture, anaerobic culture, stationary culture, and culture using a fermentation layer culture can be carried out by resting cell reaction and immobilized cell reaction.
  • the concentration of the compound represented by the formula (1a) and / or (1b) added to the medium as a substrate is 0.1 to 50 mass in the medium from the viewpoint of the production efficiency of the diol compound that is the intermediate of Compound A. % (Hereinafter simply referred to as “%”).
  • the substrate may be added to the medium prior to culturing or may be added during the culturing.
  • microorganisms used for microbial conversion are mixed, but in the present invention, these microorganisms remain contained. Use cultures.
  • the culture may contain impurities such as unreacted sclareol, sclareolide, and medium components.
  • the culture containing microorganisms is mixed with a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0 [(cal / cm 3 ) 1/2 ] (hereinafter abbreviated as a unit).
  • a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0 [(cal / cm 3 ) 1/2 ] (hereinafter abbreviated as a unit).
  • physical treatment such as crushing and crushing the microorganism, surfactant It is desirable not to perform chemical treatment such as treatment or biochemical treatment such as lytic enzyme.
  • the culture containing microorganisms before mixing the culture containing microorganisms with a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0.
  • a part of water such as medium components in the culture by centrifugation or the like in advance.
  • a general centrifugal separator such as a separation plate type, a cylindrical type, or a decanter type can be used, and any of a batch type and a continuous type can be used.
  • the temperature is preferably 5 to 60 ° C.
  • the centrifugal force can be appropriately set depending on the solid content in the culture, but is preferably 500 to 20000 G, more preferably 1000 to 10000 G.
  • the treatment time can be appropriately set depending on the acceleration, but is preferably 1 to 60 minutes, and more preferably 2 to 30 minutes.
  • the number of rotations used for centrifugation is preferably 2000 to 12000 r / min, more preferably 3000 to 12000 r / min, and particularly preferably 7000 to 12000 r / min.
  • the moisture in the culture after removing a part of the moisture (hereinafter also referred to as “precipitate”) is preferably 80% by mass or less, more preferably 70% by mass or less, and further preferably 60% by mass or less.
  • Solvents with a SP value in the range of 7.5 to 9.0 that are mixed with the culture containing microorganisms include, for example, cyclohexane (SP value 8.2), 4-methyl-2-pentanone (SP value). 8.4), xylene (SP value 8.8), toluene (SP value 8.9) and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • a solvent outside the SP value range of 7.5 to 9.0 is appropriately combined so that the SP value of the solvent after mixing is within the above range, and the SP value is adjusted within the above range. It may be used.
  • a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0 the extraction time of the diol can be shortened and the amount of the solvent used during the extraction can be reduced, so that the working efficiency is improved.
  • the SP value indicates a solubility parameter.
  • SP value basics / application and calculation method (Information Organization, 2005), Polymer handbook Third edition (A Wiley-Interscience publication, 1989), etc. are listed.
  • solvents whose specific SP values are not described in the above-mentioned documents see, for example, “SP Value Basics / Applications and Calculation Methods” or Polymer Engineering and Science, Vol. 14, no. 2, 147-154 (1974) and the like, the SP value can be obtained using the Fedors method.
  • the volume average value of SP values of each solvent is calculated.
  • the solvent it is preferable to use a solvent having an SP value of 8.0 to 9.0 from the viewpoint of improving the recovery rate (yield) and purity of the diol, and improving the odor and hue. Preference is given to solvents having an SP value of 8.2 to 9.0, in particular an SP value of 8.5 to 9.0, in particular an SP value of 8.5 to 8.9.
  • the amount of the solvent used is preferably set as appropriate depending on the solvent used, but the solubility of the diol body, the odor and hue of the diol body to be produced, and the recovery of the diol body From the viewpoint of rate (yield), it is preferably 10 to 1000 mL, more preferably 10 to 100 mL, with respect to 100 mL of the culture solution.
  • the amount is preferably 1 to 1000 mL, and more preferably 10 to 100 mL, with respect to 1 g of the diol compound present in the culture medium.
  • the temperature of the mixed solution when the culture and the solvent are mixed is preferably 0 to 80 ° C., more preferably 20 to 65 ° C.
  • the mixing time at this time is preferably 1 to 120 minutes, preferably 5 to 60 minutes, from the viewpoint of the solubility of the diol body and the odor and hue of the produced diol body. It is more preferable.
  • the mixed solution is separated into a solvent phase and an aqueous phase, and the aqueous phase is removed.
  • the water phase contains microorganisms, microorganism-derived impurities, and the like, which can remove impurities and the like. Moreover, culture odor can also be reduced.
  • means for separating the solvent phase and the aqueous phase include stationary separation and centrifugation.
  • the stationary separation is preferably carried out for 10 to 60 minutes to separate the solvent phase.
  • the temperature for the stationary separation is not particularly limited, but is preferably 0 to 80 ° C, more preferably 20 to 65 ° C.
  • the above-mentioned conditions can be used for centrifugation, conditions can be appropriately adjusted according to the state of separation.
  • the solvent phase after removing the aqueous phase may be further filtered if necessary from the viewpoint of removing suspended matters in the solvent phase.
  • a general method such as suction filtration, pressure filtration, centrifugal filtration or natural filtration can be used. Of these, suction filtration is preferred.
  • the size of the filtration filter used for filtration is preferably from 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably from 0.2 to 1 ⁇ m, in view of improving the recovery rate and purity of the diol.
  • the material of the filtration filter is not particularly limited as long as it has solvent resistance, and specific examples include resin such as polypropylene, polyester, and nylon, ceramic, and metal.
  • the solvent phase or filtrate thus obtained can be obtained in good yield by drying and / or crystallization usually performed in the purification step. Since the diol obtained by the method of the present invention has a good hue and a reduced culture odor derived from microorganisms, the purification process for improving the hue and reducing the off-flavor can be simplified.
  • the form of the diol body may be any form such as powder, solid, and liquid.
  • the method is not particularly limited, but the drying temperature is preferably room temperature to 90 ° C. Moreover, you may dry under reduced pressure.
  • the method is not particularly limited.
  • the obtained solvent phase or filtrate is subjected to impurities removal operation such as activated carbon filtration or microfiltration, if necessary, and then cooled and concentrated.
  • impurities removal operation such as activated carbon filtration or microfiltration, if necessary, and then cooled and concentrated.
  • the organic solvent used for crystallization include methanol, ethanol, isopropanol, acetone, tetrahydrofuran, ethyl acetate, and acetonitrile.
  • Methanol, ethanol, and isopropanol are preferable, and ethanol is particularly preferable.
  • These organic solvents may be used alone or in combination of two or more. In the case of adding a poor solvent, it is preferable to use hexane or water.
  • the recovery rate (yield) of the diol after drying and / or crystallization is 60% or more, more 65% or more, particularly 70% or more, and particularly 80% or more.
  • the diol obtained by the method of the present invention can be dehydrated in various solvents using an acidic catalyst such as p-toluenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid chloride, a catalytic amount of sulfuric acid or an acidic ion exchanger. It can be converted to compound A by cyclization.
  • a substrate consisting of 10% Tween 80 (registered trademark) and 20% sclareol was added so that the concentration of sclareol in the culture medium was 5%, and pH 6.0 control with 1N NaOH and 1N HCl was performed for 4 days after the addition of the substrate.
  • Aeration stirring culture was performed to obtain a culture solution.
  • the culture broth contained 2.4% of diol, 0.3% of sclareol, 96.5% of water, and 0.6% of other solid contents (such as bacterial cells).
  • FID Fluorescence Detector
  • the inlet temperature is 250 ° C.
  • the injection method is split mode (split ratio 100: 1)
  • the total flow is 200 mL / min
  • the column The flow rate was 0.4 mL / min
  • DB-WAX ⁇ 0.1 mm ⁇ 10 m
  • J & W was used as the column
  • the oven temperature was 250 ° C.
  • the water content of the culture solution was dried for 2 hours using an electric dryer at 120 ° C. and calculated from the mass loss.
  • Example 1 500 mL of toluene (SP value 8.9) is added to 500 mL of the culture solution obtained in the above [microorganism conversion], mixed for 15 minutes (liquid temperature 25 ° C.) to dissolve the diol, and then separated by standing for 30 minutes. The aqueous phase containing microorganisms was removed. Next, the solvent phase of the obtained solvent phase was distilled off at 60 to 80 ° C. under reduced pressure to precipitate a diol. Subsequently, the diol-form crystal
  • Example 2 Using a cylindrical centrifuge (apparatus: HITACHI CR22GII), 500 mL of the culture solution obtained in the above [microorganism conversion] was treated at an acceleration of 3000 G for 5 minutes at 25 ° C. to obtain a precipitate. The moisture in the precipitate was 60% by mass. To 500 mL of toluene (SP value 8.9), the precipitate of the culture solution is added, mixed for 15 minutes (solution temperature 25 ° C.) to dissolve the diol, and 6000 G at 25 ° C. using the same centrifuge. The mixture was treated at an acceleration for 10 minutes to remove the aqueous phase containing microorganisms. Next, the solvent phase of the obtained solvent phase was distilled off at 60 to 80 ° C. under reduced pressure to precipitate a diol. Subsequently, the diol-form crystal
  • Example 3 125 mL of toluene (SP value 8.9) is added to 500 mL of the culture solution obtained in the above [microorganism conversion], mixed for 15 minutes (liquid temperature 60 ° C.) to dissolve the diol, and then left for 30 minutes by stationary separation. The aqueous phase containing microorganisms was removed. Next, the solvent phase of the obtained solvent phase was distilled off at 60 to 80 ° C. under reduced pressure to precipitate a diol. Subsequently, the diol-form crystal
  • Example 4 Diol crystals were obtained in the same manner as in Example 2 except that toluene was replaced with 4-methyl-2-pentanone (SP value 8.4). The results are shown in Table 1.
  • the diol body obtained by mixing the culture and a solvent having an SP value in the range of 7.5 to 9.0, removing the aqueous phase and then distilling the solvent,
  • the SP value of the solvent was out of the range of the present invention, it was yellowish and the culture odor was strong.
  • the hue was further improved, the culture odor was reduced, and the yield of the diol was also improved.
  • the recovery rate (yield) of the diol was as high as 70% or more, which was a sufficient efficiency as a production method.

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Abstract

　次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ） で表される化合物を基質として微生物変換し、得られる微生物が含まれたままの培養物とＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内にある溶剤とを混合し、次いで水相を除去する、式（２） で表される１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－２－オールの製造方法。

Description

微生物醗酵生産物の製造方法
　本発明は、３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フランの製造中間体として有用な１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－２－オールの製造方法に関する。
　３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と表記する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系香料として欠かせない重要化合物である。化合物Ａは、主にクラリーセージ（Ｓａｌｖｉａ　ｓｃｌａｒｅａ　Ｌ．）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。化合物Ａの中間体としては、３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン－２（１Ｈ）－オン（以下、「スクラレオリド」と表記する）及び１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－２－オール（以下、「ジオール体」と表記する）が知られている。
　しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。
　そこで、スクラレオールから微生物変換により化合物Ａの中間体を得、これを環化させて化合物Ａを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。
　特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。
　しかし、スクラレオールから微生物変換により得られる培養液中には、ジオール体の他に未反応のスクラレオールやスクラレオリド、微生物、培地成分等が混在しているため、酢酸エチルを用いた溶剤抽出法ではジオール体のみの分離・精製は非常に困難であった。
　そのため、培養液を特定範囲の目開きのフィルターを用いて濾過することにより菌体を分離後、フィルター上の残渣をエタノールに溶解して再度濾過等する方法により、ジオール体を高純度で回収する方法が報告されている（特許文献３）。
特開平３－２２４４７８号公報 特開昭６２－７４２８１号公報 特開２００８－２１２０８７号公報
　本発明は、次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
で表される化合物を基質として微生物変換し、得られる微生物が含まれたままの培養物とＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内にある溶剤とを混合し、次いで水相を除去する、式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
で表される１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－２－オールの製造方法を提供するものである。
　上述のように酢酸エチルを用いた溶剤抽出法で得られたジオール体の結晶化物は、ジオール体の純度が低いばかりか、黄色味がかり、異臭が強いものであった。特に、微生物由来の培養臭が強く、晶析によりジオール体を得たとしても、異臭低減、色相改善のための更なる精製が必要となり、製造工程が非常に煩雑となることが判明した。得られるジオール体に微生物由来の培養臭が強く残存することは、ジオール体が香料原料となることを考慮すれば、大きな問題である。
　一方、菌体をフィルターで分離後、エタノールに溶解して濾過する方法は、２度の濾過を必要とすることからやはり製造工程が煩雑である。
　従って、本発明は、色相が良好で、異臭強度の小さいジオール体を、より少ない工程で効率よく製造できる方法に関する。
　本発明者は、ジオール体の製造方法について鋭意検討したところ、微生物変換により得られる培養物をＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内にある溶剤に混合すると、微生物由来の不純物を抽出することがないため、色相が良好で、異臭、特に培養臭の低減されたジオール体を回収できることを見出した。また、培養物をエタノールに混合したのでは溶剤相と水相に分離しないため、ジオール体を溶剤抽出することはできないが、ＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内にある溶剤であれば、ジオール体が該溶剤に溶解し、直接ジオール体を抽出できるので、培養物から一度の分離工程でジオール体を収率よく回収できることを見出した。
　本発明によれば、色相が良好で、異臭の低減された高品質のジオール体を、少ない工程で効率よく製造できる。
　本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として化合物Ａ中間体であるジオール体を生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物、担子菌綱に属する微生物、ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、子嚢菌綱に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌綱に属する微生物としては、例えば、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ　ｓｐ．　ＫＳＭ－ＪＬ２８４２と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）にＦＥＲＭ　Ｐ－２０７５９として２００６年１月１２日に寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第２５４７７１３号明細書に記載のＡＴＣＣ２０６２４株が挙げられる。
　微生物変換に利用できる微生物は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれる化合物Ａ中間体であるジオール体を検出することで評価することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、赤外スペクトル（ＩＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等従来公知の分析方法を用いることができる。
　微生物変換時の培養条件としては、特に限定されず、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
　培養条件として、至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、例えばｐＨ３～８、好ましくはｐＨ４～８、より好ましくはｐＨ５～７で、また液温１０～３５℃、好ましくは１５～３０℃、より好ましくは２０～３０℃である。培養日数は特に限定されず、例えば、基質添加から１～１０日である。培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
　基質として培地に添加する前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物の濃度は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、培地中に０．１～５０質量％（以下、単に「％」と記載する）とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
　微生物変換によって得られる培養物には、前記式（２）で表されるジオール体の他に微生物変換に用いた微生物が混在しているが、本発明においては、この微生物が含まれたままの培養物を用いる。なお、培養物には、未反応のスクラレオール、スクラレオリド、培地成分等の不純物が含まれていてもよい。
　微生物が含まれたままの培養物は、ＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕（以下、単位を略す）の範囲内にある溶剤と混合する前に、菌体内に存在する夾雑物の溶剤への混入を抑制し、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、微生物に対して破砕・粉砕等の物理的処理、界面活性剤処理等の化学的処理、溶菌酵素等の生化学的処理等を行なわないことが望ましい。
　また、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、微生物が含まれたままの培養物とＳＰ値７．５～９．０の範囲内にある溶剤とを混合する前に、培養物中の培地成分等の水分の一部をあらかじめ遠心分離等で除去することが好ましい。
　遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用いることができ、バッチ式、連続式のいずれを用いることもできる。遠心分離の条件としては、温度は５～６０℃であるのが好ましい。遠心力は培養物中の固形分量により適宜設定できるが、５００～２００００Ｇが好ましく、１０００～１００００Ｇがより好ましい。処理時間は、加速度により適宜設定できるが、１～６０分が好ましく、２～３０分がより好ましい。遠心分離に用いられる回転数は、例えば円筒型の場合、２０００～１２０００ｒ／ｍｉｎ、更に３０００～１２０００ｒ／ｍｉｎ、特に７０００～１２０００ｒ／ｍｉｎが好ましい。
　水分を一部除去した後の培養物（以下、「沈殿物」ともいう）中の水分は８０質量％以下が好ましく、７０質量％以下がより好ましく、６０質量％以下がさらに好ましい。
　微生物が含まれたままの培養物と混合するＳＰ値７．５～９．０の範囲内にある溶剤としては、例えばシクロヘキサン（ＳＰ値８．２）、４－メチル－２－ペンタノン（ＳＰ値８．４）、キシレン（ＳＰ値８．８）、トルエン（ＳＰ値８．９）等が挙げられる。これらは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　また、混合後の溶剤のＳＰ値が前記範囲となるように、ＳＰ値７．５～９．０の範囲外にある溶剤をも適宜組み合わせて、ＳＰ値が前記範囲となるように調製して用いてもよい。ＳＰ値７．５～９．０の範囲内にある溶剤を用いることで、ジオール体の抽出時間を短縮化できると共に抽出時の溶剤の使用量を低減できるので、作業効率も向上する。
　ここで、ＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）、Ｐｏｌｙｍｅｒ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８９）等に記載されている。また、ＳＰ値の具体的数値が前記文献に記載されていない溶剤については、例えば、前記「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」又はＰｏｌｙｍｅｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２，１４７－１５４（１９７４）等に記載されているＦｅｄｏｒｓ法を用いて、そのＳＰ値を求めることができる。複数の溶剤を組み合わせて用いる場合は、各溶剤のＳＰ値の体積平均値を計算することにより求める。
　溶剤は、ジオール体の回収率（歩留まり）や純度を向上させる点、及び匂い、色相を良好なものとする点から、ＳＰ値８．０～９．０の溶剤を使用することが好ましく、更にＳＰ値８．２～９．０、特にＳＰ値８．５～９．０、殊更ＳＰ値８．５～８．９の溶剤が好ましい。
　本発明において、溶剤の使用量は、使用する溶剤により適宜設定することが好ましいが、ジオール体の溶解性、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点、及びジオール体の回収率（歩留まり）の点から、培養液１００ｍＬに対して１０～１０００ｍＬとするのが好ましく、１０～１００ｍＬとするのがより好ましい。特に、培養液に存在するジオール体１ｇに対し、１～１０００ｍＬであるのが好ましく、１０～１００ｍＬであるのが好ましい。
　また、培養物と溶剤を混合した際の混合液の温度は、０～８０℃であることが好ましく、２０～６５℃であることがより好ましい。このときの混合時間は、ジオール体の溶解性の点、及び製造されるジオール体の匂い・色相を良好なものとする点から、１～１２０分であることが好ましく、５～６０分であることがより好ましい。
　次いで、混合液を溶剤相と水相に分離させ、水相を除去する。水相には、微生物や微生物由来の不純物等が含まれており、これにより不純物等を除去できる。また、培養臭も低減できる。溶剤相と水相を分離する手段としては、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
　静置分離は、１０～６０分行い、溶剤相を分取することが好ましい。静置分離の温度は特に規定されないが、０～８０℃であることが好ましく、２０～６５℃であることがより好ましい。
　また、遠心分離は、前述の条件を用いることができるが、分離の状態により適宜条件を調整することができる。
　水相を除去した後の溶剤相は、溶剤相中の浮遊物を除去する点から、必要に応じて、さらに濾過してもよい。濾過は、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過や自然濾過等の一般的な方法を用いることができる。このうち吸引濾過が好ましい。濾過に用いる濾過フィルターの大きさは、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、目開き０．１～１０μｍが好ましく、特に目開き０．２～１μｍが好ましい。濾過フィルターの材質としては、溶剤耐性のあるものであれば特に限定されず、具体的には、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン等の樹脂製、セラミック製、金属製等が挙げられる。
　かくして得られる溶剤相又は濾過液を、精製工程で通常行われる乾燥及び／又は晶析等することにより、ジオール体を収率よく得ることができる。本発明の方法により得られるジオール体は、色相が良好で、微生物由来の培養臭が低減されているため、色相改善・異臭低減のための精製工程を簡略化することができる。ジオール体の形態は、粉末状、固体状、液状等のいずれの形態であってもよい。
　精製工程で乾燥を行う場合、その方法は特に制限されないが、乾燥温度は室温～９０℃が好ましい。また、減圧乾燥を行ってもよい。
　精製工程で晶析を行う場合、その方法は特に制限されないが、例えば、前記得られた溶剤相又は濾過液を、必要により活性炭濾過や精密濾過等の不純物除去操作を行った後、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法がある。晶析に用いられる有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられ、メタノール、エタノール、イソプロパノールが好ましく、特にエタノールが好ましい。これら有機溶剤は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　貧溶媒の添加による場合は、ヘキサンや水を用いることが好ましい。
　本発明においては、乾燥及び／又は晶析等した後のジオール体の回収率（歩留まり）が６０％以上、更に６５％以上、特に７０％以上、殊更８０％以上であることが製造効率の点から好ましい。
　更に、本発明の方法により得られるジオール体は、酸性触媒、例えばｐ－トルエンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸又は酸性イオン交換体等を用いて、種々の溶媒中で脱水環化により化合物Ａに変換することができる。
［微生物変換］
　Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ　ｓｐ．ＫＳＭ－ＪＬ２８４２（ＦＥＲＭ　Ｐ－２０７５９）株を２．１％ＹＭブロスに１白金耳植菌し、２５℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、種菌を２．１％ＹＭブロス、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に０．３％植菌し、３０Ｌ培養槽にて液温２４℃、空気通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒ／ｍｉｎにて３日通気撹拌培養を行った。その後、１０％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、２０％スクラレオールからなる基質を、培養液中のスクラレオール濃度が５％になるように添加し、基質添加から４日間１Ｎ　ＮａＯＨおよび１Ｎ　ＨＣｌによるｐＨ６．０制御の通気撹拌培養を行い、培養液を得た。なお、当該培養液には、ジオール体２．４％、スクラレオール０．３％、水分９６．５％、その他固形分（菌体等）０．６％が含まれていた。
［分析法］
　スクラレオール、スクラレオリド及びジオール体は、培養液から酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を行い、その含有量を測定した。ＧＣ分析装置は６８９０Ｎ　ＧＣ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはＦＩＤ（Ｆｌａｍｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、注入口温度を２５０℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比１００：１）とし、トータルフローを２００ｍＬ／分とし、カラム流速を０．４ｍＬ／分とし、カラムはＤＢ－ＷＡＸ（φ０．１ｍｍ×１０ｍ）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を２５０℃とした。
　培養液の水分は、１２０℃の電気乾燥機を用いて２時間乾燥させ、質量減少量から算出した。
［におい評価方法］
　ジオール体の結晶のにおい評価は、パネル７名により次に示す基準に従って行い、その平均値をにおい評価値とした。
　５：微生物培養液のにおいが強く残っている
　４：微生物培養液のにおいがやや強く残っている
　３：微生物培養液のにおいが少ない
　２：微生物培養液のにおいが微少
　１：微生物培養液のにおいが無い
［抽出液の色の評価方法］
　ジオール体抽出液の色の評価は、抽出液を遠心分離（装置：ＨＩＴＡＣＨＩ　ＣＲ２２ＧＩＩ、ローター：Ｒ９ＡＦ２、条件：７４２０ｒ／ｍｉｎ、５分）して微生物を除去した後、得られた上澄み液の波長４２０ｎｍにおける吸光度（装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－２４５０）、およびＧＣ分析によりジオール体の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。次いで、吸光度をジオール体の濃度（ｇ／Ｌ）で除して、その値が小さいほど色相良好とした。
［結晶の色の評価方法］
　ジオール体の結晶の色は、測色色差計ＺＥ－２０００型（日本電色工業（株））で測定し、黄色味を示す値（ｂ値）が小さいほど色相良好とした。
実施例１
　上記［微生物変換］で得られた培養液５００ｍＬに、トルエン（ＳＰ値８．９）５００ｍＬを加え、１５分間混合（液温２５℃）してジオール体を溶解し、３０分の静置分離により微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を６０～８０℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、７０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
比較例１及び２
　トルエンを酢酸エチル（ＳＰ値９．１）又はヘキサン（ＳＰ値７．３）に代えた以外は、実施例１と同様についてジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
実施例２
　上記［微生物変換］で得られた培養液５００ｍＬを円筒型の遠心分離機（装置：ＨＩＴＡＣＨＩ　ＣＲ２２ＧＩＩ）を用い、２５℃にて３０００Ｇの加速度で５分間処理し、沈殿物を得た。沈殿物中の水分は６０質量％であった。トルエン（ＳＰ値８．９）５００ｍＬに、前記培養液の沈殿物を加え、１５分間混合（液温２５℃）してジオール体を溶解し、同じ遠心分離機を用い、２５℃にて６０００Ｇの加速度で１０分間処理し、微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を６０～８０℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、７０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
実施例３
　上記［微生物変換］で得られた培養液５００ｍＬに、トルエン（ＳＰ値８．９）１２５ｍＬを加え、１５分間混合（液温６０℃）してジオール体を溶解し、３０分の静置分離により微生物を含む水相を除去した。次いで、得られた溶剤相を６０～８０℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を析出させた。次いで、７０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
実施例４
　トルエンを４－メチル－２－ペンタノン（ＳＰ値８．４）に代えた以外は、実施例２と同様についてジオール体の結晶を得た。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、培養物とＳＰ値７．５～９．０の範囲内にある溶剤とを混合し、水相を除去した後に溶媒を留去することにより得られたジオール体は、色相が良好で培養臭の低減された非常に品質の高いものであったが、溶剤のＳＰ値を本発明の範囲外としたものは、黄色味がかり、培養臭が強いものであった。また、溶剤と混合する前に水分の一部を除去することにより、さらに色相が良好であり培養臭が低減され、ジオール体の収率も向上した。本発明の方法によれば、ジオール体の回収率（歩留まり）は７０％以上と高く、製造方法としては十分な効率であった。

Claims (4)

  1. 　次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される化合物を基質として微生物変換し、得られる微生物が含まれたままの培養物とＳＰ値７．５～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内にある溶剤とを混合し、次いで水相を除去する、式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で表される１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－２－オールの製造方法。
  2. 　前記溶剤のＳＰ値が８．０～９．０〔（ｃａｌ／ｃｍ３）１／２〕の範囲内である、請求項１記載の製造方法。
  3. 　前記溶剤が、シクロヘキサン、４－メチル－２－ペンタノン、キシレン及びトルエンから選ばれる１種又は２種以上である請求項１又は２記載の製造方法。
  4. 　微生物が含まれたままの培養物と前記溶剤とを混合する前に、培養物中の水分を８０質量％以下に低減する工程を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
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