WO2005083102A1 - 光学活性1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体の製造方法 - Google Patents

光学活性1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2005083102A1
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benzodioxin
carboxylic acid
formula
microorganism
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PCT/JP2005/002541
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Asako Toyoda
Masashi Yoshida
Katsura Kaneko
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Mercian Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D319/20—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring with substituents attached to the hetero ring
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to an optically active 1,4-benzodioxin-2, which is an intermediate for the synthesis of a medicament having a selective) 83 receptor agonistic action and effective for treating or improving symptoms of digestive diseases.
  • the present invention relates to a method for producing a carboxylic acid derivative.
  • Optically active 6- (2-hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivatives represented by (III) or (IV) are known to be useful (International Publication (W0) No. 00/06562 pamphlet (referred to as “Reference 1” hereinafter).
  • R represents (R) -1-phenylethylamino or (S) -1-phenylethylamino.
  • R represents (R) -1-phenylethylamino or (S) -1-phenylethylamino
  • X represents an acyl group.
  • the present invention relates to the problems of the above-mentioned optical resolution method or stereoselective reduction method (for example, by-products of an optically active substance having a configuration opposite to that of a desired optically active substance; Use of 6- (2-oxopropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative as the raw material by optically active 6- (2- It is intended to provide a novel method for producing a hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2-force rubonic acid derivative.
  • the present inventors have developed a 6- (2-oxopropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative represented by the following formula (I) from a wide variety of microorganisms.
  • a microorganism capable of stereoselectively reducing the -oxopropyl group and converting it to an optically active 2-hydroxypropyl group was searched, many microorganisms having high selectivity were found, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a compound represented by the formula (I):
  • R represents a protecting group for a hydroxyl group or a carboxyl group.
  • R represents a protecting group for a hydroxyl group or a carboxyl group, and * represents an asymmetric carbon.
  • optically active 6- (2-hydroxypropyl) represented by the formula (II) by a biological conversion method to an optically active 6- (2-hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2--2-carboxylic acid derivative represented by Propyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative,
  • a 6- (2-oxomouth pill) represented by the formula (I): A step of incubating the 1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative;
  • R represents a protecting group for a hydroxyl group or a carboxyl group.
  • R represents a protecting group for a hydroxyl group or a carboxyl group, and * represents an asymmetric carbon.
  • optically active 6- (2-hydroxypropyl) represented by the formula (II) by a biological conversion method to an optically active 6- (2-hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2--2-carboxylic acid derivative represented by Propyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative,
  • a 6- (2-oxomouth pill) represented by the formula (I): A step of incubating the 1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative;
  • Examples of the carboxyl-protecting group in the formulas (I) and (11) include, for example, The known carboxyl protecting groups described in "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991, can be used without any restriction. Specific examples of these protecting groups include a lower alkoxy group which may have a substituent, a cycloalkyloxy group, an aryloxy group, a silyloxy group, a lower alkylamino group and a group which may have a substituent. And a diarylamino group.
  • the lower alkoxy group includes, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an iso-propoxy group, an n-butoxy group, an iso-butoxy group, a sec-butoxy group, and a tert-butoxy group And the like.
  • Cycloalkyloxy groups include cyclopentyloxy and cyclohexyloxy groups
  • aryloxy groups include benzyloxy, diphenylmethyloxy, triphenylmethyloxy, and phenoxy groups, and silyloxy groups.
  • Examples thereof include a trimethylsilyloxy group and a t-butyldimethylsilyloxy group
  • examples of the lower alkylamino group include a methylamino group, a dimethylamino group and an ethylamino group.
  • examples of the arylamino group include a benzylamino group and a 1-phenethylamino group.
  • substituent "which may have a substituent" include a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group and the like.
  • Genus (Cryptococcus), genus Yarrowia, genus Pachysolen, genus Aspergi Ilus, genus Penici 11ium, genus Paeci lomyces, genus Acremonium, Genus Gliochophalotrichum, Rhizopus, Mucor, Absidia, Guignardia, Coriolus, Streptomyces, Streptomyces Rhodococcus
  • microorganisms include Candida methanosorbosa ⁇ Candida ⁇ Candida lipolytics, Candida utilis, Candida gui 11 iermondi i ), Candida mel ibiosica, Pichia angusta, Hikia membranaefaciens, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces
  • Streptomyces californicus Streptomyces cal ifornicus
  • Streptomyces' billidochromogenes Rhodococcus erythropol is, Saccharothr ix aeroco I on i genes, etc.
  • Microorganisms belonging thereto can be mentioned as preferred microorganisms.
  • Coriolus hirsutus Coriolus hirsutus
  • Streptomyces californicus Str mark tomyces cal ifornicus
  • Streptomyces Specific examples include Rhodococcus erythropolis ATCC27854, Saccharothrix aerocolonigenes NBRC3837, and the like.
  • Candida methanosorbosa Y327 (FERM BP-10175).
  • Candida lipoliteica ATCC8661 is NBRC0619, Pichia angusta Y285 (FERM BP-10173).
  • Pichia membranaefaciens (Pichia membranaefaciens) Y299 (FERM BP-10174), Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans) NBRC0608, Polya NBRC1542, Pachysolen tannophi lus NBRC1007.
  • Candida's methanosolposa (Candida)
  • the bacteriological properties of the Y327 strain are as follows.
  • Pichia angusta Y285 strain was established on February 5, 2004 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Deposited in Japan at Central No. 6), assigned a deposit number of FERM P-19665, and transferred to the international deposit as FERM BP-10173 on December 6, 2004.
  • strain Y285 The mycological properties of strain Y285 are as follows.
  • Pichia membranaefaciens Y299 strain was filed on February 5, 2004 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary One (Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Deposited at 1-chome No. 1 1 Chuo No. 6), deposited under FERM P-19666, and transferred to the international deposit as FERM BP-10174 on December 6, 2004.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • the bacteriological properties of the Y299 strain are as follows.
  • FC405 strain was established on February 5, 2004 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 6) Deposited domestically, given a deposit number of FERM P-19668, and transferred to the international deposit as FERM BP-10176 on December 6, 2004
  • the bacteriological properties of the FC405 strain are as follows.
  • Gliocephalotricum sp. FC554 strain was established on February 5, 2004 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary Center 1 (Tsukuba, Ibaraki, Japan) It was deposited domestically at Ichihigashi 1-1 chome 1 Chuo No. 6), assigned a deposit number of FERM P-19669, and transferred to the international deposit as FERM BP-10177 on December 6, 2004.
  • FC554 strain The mycological properties of the FC554 strain are as follows.
  • a colony of 80-85mm is formed, the surface of the colony is grayish-yellow and fluffy, and the center is velvety.
  • the back side is not colored and does not produce soluble dye.
  • Hyphae are formed on or in the agar surface, and the formation of colorless to brown colored septa mycelia is observed.
  • Two bristles (seta) are formed from the lower part of the tip of the conidium (Benicillus).
  • the colony forms 83 85 mm colonies and the colony surface is brownish gray to yellowish brown fluffy.
  • the back side is not colored and does not produce soluble dye.
  • a colony of 85 86 mm is formed, and the colony surface is brown fluff.
  • the back side is not colored and does not produce soluble pigment.
  • the other microorganisms are stored in a preservation agency assigned to their strain names, and can be easily obtained.
  • the preservation institutions are as follows. NBRC: Biological Resources, Biotechnology Division, National Institute of Technology and Evaluation ATCC: American Type Culture Collection, I AM: Institute for Applied Microorganisms, The University of Tokyo.
  • 6- (2-oxopropyl) -1,4 which is a starting material (substrate) in the presence of a cultured cell of a microorganism having the above-described properties or a preparation of the cultured cell is used.
  • -The benzodioxin-2-carboxylic acid derivative is incubated. This treatment is performed by adding a substrate to the culture solution when culturing the microorganism, or optionally, by culturing cells of the microorganism, for example, as it is, or in a suspension of a homogenized preparation. Incubation can also be performed by adding a substrate.
  • the substrate may be added to the culture solution at any time before the cultivation or after a certain period of time from the start of the cultivation.
  • the cells can be produced by inoculating the above microorganisms into a nutrient source-containing medium and aerobically culturing the cells.
  • the cultivation of microorganisms for preparing such a preparation of cultured cells and the cultivation of microorganisms with a substrate added can be performed in principle according to a general method for culturing microorganisms. Usually, it is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture by liquid culture and aeration and stirring culture.
  • the medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source that can be used by these microorganisms, and any of various synthetic media, semi-synthetic media, natural media, and the like can be used.
  • the medium composition is glucose, maltose, xylose, and fruc! ⁇ , Sucrose, starch, dextrin, glycerin, mannitol, oatmeal, etc. can be used alone or in combination.
  • Nitrogen sources include peptone, meat extract, soy flour, casein, amino acids, malt extract, yeast extract, organic nitrogen sources such as urea, sodium nitrate, nitric acid, ammonium sulfate, ammonium chloride, and phosphoric acid.
  • Inorganic nitrogen sources such as ammonium hydrogen and ammonium dihydrogen phosphate can be used alone or in combination.
  • Culture conditions can be appropriately selected within a range where the microorganism can grow well. Usually, culture at pH 2.0-9.5, 25 at 30 ° C for about 28 times. The above-described various culture conditions can be appropriately changed according to the type and characteristics of the microorganism used, external conditions, and the like, and optimal conditions can be selected.
  • a preparation of cultured cells is prepared by suspending cells isolated by centrifugation or filtration or homogenized cells in an appropriate solution after completion of the culture.
  • the solution that can be used for suspending the cells is the above-mentioned medium, or a buffer such as Tris-acetic acid, Tris-hydrochloric acid, sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate, potassium phosphate, or the like. Single or mixed. Add nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) [NAD (P)] as necessary.
  • the pH of the buffer is preferably 6.00, more preferably 7.08.5.
  • the 6- (2-oxopropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative serving as a substrate may be a liquid in the case of a solid, powder, or oil, or may be a water-soluble organic solvent such as methanol, It can be diluted with ethanol, acetone, dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMS0), etc., and added to the culture solution or cell suspension. 1 litter 400 mg is preferred.
  • shaking or aeration and stirring are performed for 13 days, preferably 1 day, and the reaction is allowed to proceed to give 6- (2-oxopropyl) represented by the formula (I) which is a substrate.
  • 4-Benzodioxin-2-force Convert rubonic acid derivative to desired optically active 6- (2-hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative represented by formula (II) can do.
  • the 6- (2-oxopropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative represented by the formula (I) has an asymmetric carbon at the 2-position of the 1,4-benzodioxane ring.
  • optical isomers There are two types of optical isomers, and both optical isomers are converted to the corresponding 6- (2-hydroxypropyl) -1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative by the method of the present invention. can do.
  • 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide is converted to 6- (2- (S) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydrido mouth-1,4-benzodioxin- (N--(R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide or 6- (2- (R) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R) -Yeast having the ability to convert to lipoxamide is screened as follows. went.
  • a liquid medium consisting of 5 g of peptone (Difco) / 3 g of yeast extract (Difco) / 3 g of malt extract / 10 g / g of glucose was dispensed into a 250 mL Erlenmeyer flask at 25 ° C, Autoclaved for 20 minutes. This was inoculated with the strains shown in Table 1, and cultured with shaking at 30 ° C for 48 hours.
  • the liquid medium consisting of L is sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and mixed with 2 mL of medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate. did.
  • dimethyl sulfoxide of 32 mg / mL 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide (DMS0 ) 25 L of the solution was added, and the mixture was shaken at 30 ° C for 24 hours.
  • reaction solution was extracted with 2 mL of ethyl acetate, extracted, desolvated, dissolved in the same amount of acetonitrile, and quantified by liquid-force ram chromatography using an optical resolution ram and its optical purity. was measured.
  • AD-RH CH I RALPAK AD-RH, 4.6 mml.D. x150 Hidden, Daicel Chemical Industries, Ltd.
  • 6- (2- (R) -t-droxip pill) -2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N-- (R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide retention time: 19.6 minutes.
  • 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide is converted to 6- (2- (S) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydrido mouth-1,4-benzodioxin- (N--(R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide or 6- (2- (R) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl)) -2- (R)- I went as follows.
  • Potato starch 20g / g glucose 10g / g Soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co.) 20g / g potassium dihydrogen phosphate 1g / g and a 250mL liquid medium consisting of magnesium sulfate heptahydrate 0.5g / L Each 25 mL was dispensed into a flask and sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes. The strains shown in Table 2 were inoculated thereto and cultured with shaking at 25 ° C for 72 hours.
  • the cells collected by centrifuging 2 mL of the obtained culture solution were mixed with glycerin 5 g / dihydrogen phosphate phosphate 2.8 g / dihydrogen phosphate phosphate 1.2 g / dilute sodium chloride 1 g / L, sulfuric acid
  • a liquid medium consisting of 2 g / L of ammonium was sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and 2 mL of a medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • Penicillium purpurogenum ATCC 46581 63 78
  • Rhizopus semarangensis [AM 6251 7 100
  • 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide is converted to 6- (2- (S) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydrido mouth-1,4-benzodioxin- (N--(R) -phenylethyl))-2- (R) -carboxamide or 6- (2- (R) -hydroxypropyl ) -2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (R) -phenylethyl))-2- (R)-
  • the screening for actinomycetes was performed as follows.
  • a liquid medium consisting of 5 g of peptone (Difco) / 3 g of yeast extract (Difco) / 3 g of malt extract / 10 g / g of glucose was dispensed into a 250 mL Erlenmeyer flask at 25 ° C, and the temperature was adjusted to 121 ° C. Autoclaved for 20 minutes. The strains shown in Table 4 were inoculated here, and cultured with shaking at 30 ° C for 48 hours.
  • the liquid medium consisting of L was sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and 2 mL of medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • reaction mixture was extracted with 2 mL of ethyl acetate, extracted, desolvated, dissolved in the same amount of isopropanol, and quantified by liquid-phase column chromatography using an optical resolution column and the optical purity was determined. A measurement was made.
  • Optical resolution column is a chiral cell
  • Measurement was performed by detecting UV absorption at 210 nm at 1.0 mL / min.
  • Potato starch 20g / glucose 10g / g Soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co.) 20g / g potassium dihydrogen phosphate 1g / g Magnesium sulfate heptahydrate 0.5g / L
  • a 250mL triangular liquid medium Each 25 mL was dispensed into a flask and sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes. The strains shown in Table 5 were inoculated thereto, and cultured with shaking at 25 ° C for 72 hours.
  • the cells collected by centrifuging 2 mL of the obtained culture solution were mixed with glycerin 5 g / dihydrogen phosphate phosphate 2.8 g / dihydrogen phosphate phosphate 1.2 g / dilute sodium chloride 1 g / L, sulfuric acid
  • a liquid medium consisting of 2 g / L of ammonium was sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and 2 mL of a medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin- (N- (1- (S) -phenylethyl))-2- (S) -carboxamide is converted to 6- (2- (S) -hydroxypropyl ) -2,3-Dialdehyde Mouth-1,4-benzodioxin- (N--(s) -phenylethyl))
  • Screening for yeast capable of converting to 2- (S) -carboxamide is as follows. went.
  • a liquid medium consisting of 5 g of peptone (Difco) / 3 g of yeast extract (Difco) / 3 g of malt extract / 10 g / g of glucose was dispensed into a 250 mL Erlenmeyer flask at 25 ° C, Autoclaved for 20 minutes.
  • the strains shown in Table 6 were inoculated here and cultured with shaking at 30 ° C for 48 hours.
  • the liquid medium consisting of L was sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and 2 mL of medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • the reaction mixture was extracted with 2 mL of ethyl acetate, extracted, desolvated, dissolved in the same amount of isopropanol, and quantified by liquid-phase ram chromatography using an optical resolution ram and the optical purity was determined. A measurement was made.
  • Measurement was performed by detecting UV absorption at 210 nm at 1.0 mL / min.
  • Potato starch 20g / glucose 10g / g Soybean flour (Essan Meat, Ajinomoto Co.) 20g / g potassium dihydrogen phosphate 1g / g Magnesium sulfate heptahydrate 0.5g / L
  • a 250mL triangular liquid medium Each 25 mL was dispensed into a flask and sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes. This was inoculated with the strains shown in Table 7, and cultured with shaking at 25 ° C for 72 hours.
  • the cells collected by centrifugation of 2 mL of the obtained culture solution were mixed with 5 g of glycerin / 2 g of hydrogen phosphate phosphate 2.8 g / kg of hydrogen phosphate dihydrogen 1.2 g / kg of sodium phosphate 1 g / L, sulfuric acid
  • a liquid medium consisting of 2 g / L of ammonium was sterilized by high pressure steam at 121 ° C for 20 minutes, and 2 mL of a medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • Liquid medium consisting of 5 g of peptone (Difco) / 3 g of yeast extract (Difco) / 3 g of malt extract / 10 g / g of glucose is dispensed into 25 250 mL Erlenmeyer flasks in 25 mL aliquots at 121 ° C. Autoclaved for 20 minutes. These media were inoculated with Cryptococcus neoformans NBRC0608 and cultured with shaking at 30 ° C for 48 hours.
  • the obtained culture was centrifuged and collected into cells.Glycerin 5 g / dipotassium hydrogen phosphate 2.8 g / potassium dihydrogen phosphate 1.2 g / sodium chloride 1 g / ammonium sulfate 2 g / L
  • the resulting liquid medium was subjected to high-pressure steam sterilization at 121 ° C for 20 minutes, and 25 mL of medium containing 0.2 g / L of magnesium sulfate was added and mixed.
  • Example 10 A culture cell preparation was prepared using Candida methanosorbosa Y327 (FERM BP-10175) in the same manner as in Example 8, and 32 mg / mL 6-acetonyl-2,3-dihydro-1,4- 312 L of each of benzodioxin- (N- (1- (S) -phenylethyl))-2- (S) -carboxamide DMS0 solution was added, and the mixture was shaken at 30 ° C for 24 hours. 250 mL (pH 6.1) of the conversion reaction solution was treated in the same manner as in Example 8 to obtain 140.3 mg of a residue.
  • Preparative TLC (MERCK si I ica gel60 F 1.05744,
  • the absolute configuration of the optically active product obtained in Example 8 was determined as follows. 13.4 mg of the alcohol product as a product isolated in Example 8 was dissolved in 250 L of pyridine, and (-)-hy-methoxy-hy-trifluo-methylphenylacetyl chloride ((-)-MTPA -CI) After adding 17 L, the mixture was stirred at room temperature for 23 hours. ⁇ , ⁇ -Dimethyl-1,3-propanediamine was added thereto, the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and the solvent was distilled off under reduced pressure. Preparative TLC (MERCK si I ica gel 60 F 1.05744, n-hexane: vinegar)
  • (+)-MTPA-CI 17 L After adding (+)-MTPA-CI 17 L and reacting in the same manner as above, processing was performed, and (+)-MTPA
  • the absolute configuration of the optically active product obtained in Example 9 was determined as follows. 7.9 mg of the alcohol product, which was the product isolated in Example 9, was dissolved in 200 L of pyridine, and 10 L of (-)-MTPA-CI was added. The mixture was treated in the same manner as in Example 11 to obtain (-)- 5.8 mg (yield 44.9%) of the MTPA compound was obtained. Further, 7.9 mg of the alcohol compound isolated in Example 9 was dissolved in 200 L of pyridine, and 10 L of (+)-MTPA-CI was added. (62.0% yield).
  • the absolute configuration of the optically active product obtained in Example 10 was determined as follows. 9.5 mg of the alcohol compound, which was the product isolated in Example 10, was dissolved in 200 L of pyridine, and 12 L of (-)-MTPA-CI was added. The mixture was treated in the same manner as in Example 11; 9.80 ⁇ (63.2% yield) was obtained. Further, 10.3 mg of the alcohol isolated in Example 10 was dissolved in 200 L of pyridine, and 12 L of (+)-MTPA-CI was added. (82.1% yield).
  • an optically active 1,4-benzodioxin-2-carboxylic acid derivative that can be used as an intermediate for synthesizing an optically active drug can be efficiently obtained by a biological conversion method.

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Abstract

光学活性な医薬品の合成中間体として利用可能な光学活性1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体の生物学的変換による新規な製造方法を提供する。 出発原料である6-(2-オキソプロピル)-1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体を、光学活性な6-(2-ヒドロキシプロピル)-1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体に変換する能力を有する微生物の培養菌体またはその培養菌体の調製物の存在下、出発原料をインキュベーション処理し、その処理液から目的物である光学活性な6-(2-ヒドロキシプロピル)-1,4-ベンゾジオキシン-2-カルボン酸誘導体を採取する。

Description

明 細 書
光学活性 1 4-ベンゾジォキシン- 2-力ルポン酸誘導体の製造方法 技術分野
[0001] 本発明は選択的 )83受容体作動作用を有し、 消化器疾患の治療或いは症状を 改善するのに有効な医薬の合成用中間体である光学活性 1,4-ベンゾジォキシ ン -2-カルボン酸誘導体の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 選択的 )83受容体作動作用を有し、 消化器疾患の治療および症状改善に有効 な、 あるいは糖尿病や肥満症等の予防および治療に有効な医薬の合成用中間 体として、 下記式（III)または（IV)で表される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロ ピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体が有用であることが知られ ている （国際公開 (W0)第 00/06562号パンフレット （以下、 「文献 1」 という ) 参照） 。
[化 1]
Figure imgf000002_0001
(式中、 Rは（R)-1-フエニルェチルァミノまたは (S)-1-フエニルェチルァミノ を表す。 ）
[0004] これら誘導体の製造方法として、 下記反応式に示したラセミ体のアル
ル （式 (V)) を加水分解酵素の存在下、 ァシル化剤と反応させ光学分割する方 法が開示されている （文献 1参照） 。
[化 2]
Figure imgf000002_0002
(式中、 Rは（R) -1 -フエニルェチルァミノまたは (S) -1 -フエニルェチルァミノ を表し、 Xはァシル基を表す。 ）
[0005] しかしながら、 分割によって副生する、 所望の物質とは反対の (R) -体のァ ルコール誘導体を有効に利用するには、 一般にラセミ化ゃ立体反転等合成的 手法をさらに駆使する必要がある。
[0006] また、 光学活性なアルコールの製造方法としてはケトン体を種々の光学活 性金属水素化物を用いた立体選択還元する方法が知られているが、 ァセトフ ェノンタイプのケ卜ンの立体選択的還元には有効であるが本化合物のような
2-ォキソプロピル基をもつケトンでは選択性が低下することが知られている (実験化学講座第 4版 26巻 23 68) 。 従って、 さらに効率の良い光学活性なァ ルコール体の製造方法の開発が求められている。
発明の開示
[0007] 本発明は、 前記した光学分割法あるいは立体選択的還元法が抱える問題点（ 例えば、 所望とする光学活性体と反対の立体配置をもつ光学活性体の副生、 毒性の高い化合物の使用、 選択性の低下、 等） の少ない生物学的変換方法に よる 6- (2-ォキソプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を原 料とした光学活性な 6- (2-ヒドロキシプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体の新規な製造方法を提供するものである。
[0008] 本発明者らは、 上記課題を解決するために広範な微生物群から下記式（I )で 示される 6- (2-ォキソプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体 の 2-ォキソプロピル基を立体選択的に還元し、 光学活性な 2-ヒドロキシプロ ピル基に変換しうる微生物を探索したところ、 高い選択性を有する微生物を 多数見出し、 本発明を完成した。
[0009] すなわち、 本発明は、 式（I )
Figure imgf000004_0001
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表す。 ）
で示される 6- (2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導 体の、
式（I I)
[化 4]
Figure imgf000004_0002
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表し、 *は不斉炭素を表す o )
で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体への生物学的変換方法による、 式（I I)で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体の製 造方法であって、
(A)前記生物学的変換方法を行うことができる微生物の培養菌体またはその培 養菌体の調製物の存在下で、 式（ I )で示される 6- (2-ォキソプ口ピル) -1 , 4-ベ ンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体をインキュベーション処理する工程、
(B)インキュベーション処理液から式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキ シプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を採取する工程、 を含む方法、 を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の製造方法は、
式（I)
Figure imgf000005_0001
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表す。 ）
で示される 6- (2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導 体の、
式（II)
[化 6]
Figure imgf000005_0002
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表し、 *は不斉炭素を表す o )
で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体への生物学的変換方法による、 式（I I)で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体の製 造方法であって、
(A)前記生物学的変換方法を行うことができる微生物の培養菌体またはその培 養菌体の調製物の存在下で、 式（ I )で示される 6- (2-ォキソプ口ピル) -1 , 4-ベ ンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体をインキュベーション処理する工程、
(B)インキュベーション処理液から式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキ シプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を採取する工程、 を含む方法
である。
式（ I )および式（ 11 )におけるカルボキシル基の保護基としては、 例えば、 "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991に言己 載されている既知のカルボキシル基の保護基を何等制限なく用いることがで きる。 これらの保護基を具体的に例示すると、 置換基を有していてもよい低 級アルコキシ基、 シクロアルキルォキシ基、 ァリールォキシ基、 シリルォキ シ基、 低級アルキルァミノ基または置換基を有していてもよぃァリールァミ ノ基等を挙げることができる。
[0012] ここで、 低級アルコキシ基としては、 例えば、 メ トキシ基、 エトキシ基、 n-プロポキシ基、 iso-プロポキシ基、 n-ブトキシ基、 iso-ブトキシ基、 sec- ブトキシ基、 tert-ブトキシ基等を挙げることができる。 シクロアルキルォキ シ基としてはシクロペンチルォキシ基、 シクロへキシルォキシ基等を、 ァリ ールォキシ基としてはべンジルォキシ基、 ジフ Iニルメチルォキシ基、 トリ フエニルメチルォキシ基、 フエノキシ基等を、 シリルォキシ基としてはトリ メチルシリルォキシ基、 t-プチルジメチルシリルォキシ基等を、 低級アルキ ルァミノ基としてはメチルァミノ基、 ジメチルァミノ基、 ェチルアミノ基等 をそれぞれ挙げることができる。 ァリールアミノ基としては、 ベンジルアミ ノ基、 1-フエネチルアミノ基等を挙げることができる。 また 「置換基を有し ていてもよい」 の置換基とは、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 シァノ 基、 ニトロ基等を挙げることができる。
[0013] 本発明の生物学的変換方法では、 キャンディダ (Candida)属、 ピキア
(Pichia)属、 サッカロマイセス (Saccharomyces)属、 クリプトコッカス
(Cryptococcus)属、 ャロビア（Yarrow i a)属、 パキソレン（Pachysolen)属、 ァ スペルギルス（Aspergi I lus)属、 ぺニシリウム（Penici 11 ium)属、 パェシロマ イセス (Paeci lomyces)属、 アクレモニゥム (Acremonium)属、 ヮリオセファロ 卜リカム (Gl iocephalotr ichum)属、 リゾプス (Rhizopus)属、 ムコーレ (Mucor) 属、 アブシジァ (Absidia)属、 グイダナルジァ（Guignardia)属、 コリオ一ラス (Coriolus)属、 ストレプトマイセス (Streptomyces)属、 ロドコッカス
(Rhodococcus)属またはサッカロスリックス（Saccharothr i x)属のいずれかの 属に属し、 前記式（I)で示される 6-(2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシ ン -2-力ルボン酸誘導体を前記式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキシプ 口ピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体へ変換する能力を有する 微生物の培養菌体またはその培養菌体の調製物であれば、 種および株の種類 を問うことなく使用することができる。
そのような微生物の好ましい例として、 キャンディダ，メタノソルボーザ (Candida methanosorbosa ^ キャンディタ ■ リポリティ力 (Candida l ipolytics)、 キャンディダ■ゥッリス（Candida uti l is)、 キャンディダ-ギ リエルモンジィ（Candida gui 11 iermondi i)、 キャンディダ■メリビオシ力 (Candida mel ibiosica)、 ヒキア -アンヮスタ (Pichia angusta)、 ヒキア -メ ンブラナエファシエンス (Pichia membranaefaciens)、 サッカロマィセス■バ ャナス (Saccharomyces bayanus)、 サッカロマイセス■セレヒンェ
(Saccharomyces cerev i s i ae)、 クリプ卜コッカス -ネオフォ レマンス
(Cryptococcus neoformans)、 ャロビア - リホリティカ (Yarowia l ipolytics) 、 パキソレン■タノフィラス（Pachysolen tannophi I us). ァスペルギルス■ 才リゼ (Aspergi I lus oryzae)、 アスペスレギレス■テレウス (Aspergi I lus terreus)、 ァスペルギルス■二ガー（Aspergi I lus niger)、 ァスペルギルス■ ブレヒぺス (Aspergi I lus brevipes)、 ぺニシリウム ' リヒダム (Penici 11 ium l ividum)、 ぺニシリウム■ルテゥム (Penici 11 ium I uteum ^ ぺニシリウム ' /《一プロゲナム (Penici 11 ium purpurogenum)、 /《ェシロマイセス■カ レネゥ ス (Paec i I omyces carneus)、 アクレモニゥム■エスピー (Acremon ium sp.)、 グリオセファロトリカム■エスピー（Gl iocepha lot ri chum sp. ). リゾプス■ ォリゼ（Rhizopus oryzae)、 リゾプス■セマランゲンシス（Rhizopus semarangensis). ムコール■シルシネロイデス■エフ■グリセォ-シアヌス (Mucor ci rcinel loides f . gr i seo - cyanus)、 アブンジァ■ブラケスレエアナ (Absidia blakesleeana)、 グイグナレジァ■ラリシナ (Guignardia lar icina) 、 コリオ一ラス■ ヒルスタス（Coriolus hirsutus). ストレプトマイセス■グ リセオフラバス (Streptomyces gr iseof lavus)、 ス卜レプ卜マイセス -シラタ ス（Str印 tomyces cirratus). ストレプトマイセス■カリフォルニカス (Streptomyces cal ifornicus)、 ストレプトマイセス ' ビリ ドクロモジェンシ ス (Streptomyces vi r idochromogenes)、 口ドコッカス■エリス口ホリス (Rhodococcus erythropol is)、 サッカロスリックス■ァエロコロニゲネス (Saccharothr i x aeroco I on i genes)等に属する微生物を挙げることができる。
[0015] これらの微生物の中で、 式（I I)で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピ ル) -1,4-ベンゾジォキサン- 2-カルボン酸誘導体における、 *で示される不斉 炭素の立体配置が R配置である誘導体の製造にあたっては、 キャンディダ-ギ リエルモンジィ（Candida gui 11 iermondi i)、 キャンディダ■メリビオシ力 (Candida mel ibiosica)、 サッカロマイセス■ハヤナス (Saccharomyces bayanus)、 サッカロマイセス -セレヒンェ (Saccharomyces cerevisiae)、 ァ スペルギルス■ォリゼ (Aspergi I lus oryzae)、 ァスペルギルス■テレウス (Aspergi I lus terreus)、 ぺニシリウム - リヒタム (Penici 11 ium l ividum)、 ぺニシリウム■ レテゥム（Penici 11 ium luteum)、 リゾブス -オリゼ（Rhizopus oryzae)、 リゾプス -セマランゲンシス (Rhizopus semarangensis) ^ ムコ一 ル■シルシネロイデス ' エフ 'グリセォ-シアヌス（Mucor circinel loides f . gr i seo - cyanus)、 アブシシ /■ブラケスレエアナ (Absidia blakesleeana) 、 グイグナルジァ■ラリシナ（Guignardia laricina)、 コリオ一ラス■ ヒルス タス（Coriolus hirsutus). ストレプトマイセス■力リフォルニカス
(Streptomyces cal ifornicus)、 ストレプトマイセス ' ビリ ドクロモジェンシ ス (Streptomyces vi r idochromogenes)、 口ドコッカス■エリス口ホリス (Rhodococcus erythropol is)、 サッカロスリックス■ァエロコロニゲネス (Saccharothr ix aeroco Ion i genes)等に属する微生物を好ましい微生物として 挙げることができる。
[0016] それらの中で特に好ましい例として、 キャンディダ'ギリエルモンジィ
(Candida gui 11 iermondi i) IAM4412、 キャンディダ■メリビオシ力 (Candida mel ibiosica) IAM4488、 サッカロマイセス■バヤナス (Saccharomyces bayanus) IAM4325、 サッカロマイセス■セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) NBRC0224、 ァスペルギルス■ォリゼ（Aspergi I lus oryzae) IAM2600、 ァスペルギルス■テレウス（Aspergi I lus terreus) ATCC46503、 ぺ ニシリウム ' リビダム（Penici 11 ium I ividum) IAM719U ぺニシリウム .ルテ ゥム（Penici 11 ium I uteum) ATCC9644、 リゾプス■ォリゼ（Rhizopus oryzae) ATCC11145. リゾプス■セマランゲンシス（Rhizopus semarangensis) IAM6251 、 ムコール■シルシネロイデス■エフ■グリセォ-シアヌス（Mucor
ci rcinel loides f . gr i seo-cyanus) NBRC4563、 アブンシァ ·ブラケスレエア ナ（Absidia blakesleeana) ATCC10148B. グイグナルジァ■ラリシァ
(Guignardia laricina) NBRC7887. コリオ一ラス ' ヒルスタス（Coriolus hirsutus) NBRC4917、 ストレプトマイセス■カリフォルニカス（Str印 tomyces cal ifornicus) ATCC3312、 ストレブトマイセス . ビリ ドクロモジェンシス (Streptomyces vi r idochromogenes) NBRC3113、 口ドコッカス■エリス口ポリ ス（Rhodococcus erythropol is) ATCC27854、 サッカロスリックス■ァエロコ ロニゲネス（Saccharothrix aerocol on i genes) NBRC3837等を具体的に挙げる ことができる。
他方、 式（I I)で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジ ォキシン- 2-カルボン酸誘導体における、 *で示される不斉炭素の立体配置が S 配置である誘導体の製造にあたっては、 キャンディダ，メタノソルボーザ (Candida methanosorbosa ^ キャン亍イタ ■ リポリティ力 (Candida l ipolytics)、 キャンディダ■ゥッリス（Candida uti l is)、 ピキア■アンダス タ（Pichia angusta) . ピキア■メンブラナエファシエンス（Pichia
membranaefac i ens)、 クリプ卜コッカス -ネオフォ レマンス (Cryptococcus neoformans)、 ャロヒア■ リポリティ力 (Yarowia l ipolytica)、 パキソレン ' タノフィラス (Pachysolen tannophi lus)、 アスペスレギレス■二ガー
(Aspergi l lus niger)、 アスペスレ千 レス ■ ブレヒぺス (Aspergi I lus brevipes) 、 ぺニシリウム■パープロケナム (Penici 11 ium purpurogenum)、 パェシロマ イセス■カ レネウス (Paeci lomyces carneus)、 アクレモニゥム■エスピ一 (Acremonium sp. )、 ヮリォセファ口卜リカム■エスヒー (Gl iocephalotr ichum sp.)、 ストレプトマイセス■グリゼオフラバス（Streptomyces gr iseof lavus)、 ストレプトマイセス -シラタス (Streptomyces cirratus)等 に属する微生物を好ましい微生物として挙げることができる。
[0018] それらの中で特に好ましい例として、 キャンディダ，メタノソルポーサ (Candida methanosorbosa) Y327 (FERM BP-10175). キャンディダ' リポリテ イカ（Candida l ipolytics) ATCC8661、 キャンディダ■ゥッリス（Candida uti I is) NBRC0619、 ピキア■アングスタ（Pichia angusta) Y285 (FERM BP-10173). ピキア■メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens) Y299 (FERM BP-10174)、 クリプトコッカス■ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans) NBRC0608、 ャロビア■ リポリティ力（Yarowia l ipolytics) NBRC1542、 パキソレン■タノフィラス（Pachysolen tannophi lus) NBRC1007. ァスペルギルス■二ガー（Aspergi I lus niger) ATCC11394. ァスペルギルス■ ブレビベス（Aspergi I lus brevipes) NBRC5821. ぺニシリウム■パープロゲナ ム（Penici 11 ium purpurogenum) ATCC46581、 パェシロマイセス■カルネウス (Paec i I omyces carneus) ATCC46579、 アクレモニゥム -エス t:一 (Acremonium sp.) FC405(FERM BP-10176). ダリオセファロトリカム■エスピー
(Gl iocephalotrichum sp. ) FC554(FERM BP-10177)、 ストレブトマイセス -グ リゼオフラバス（Streptomyces gr iseof lavus) NBRC13044、 ストレプトマイセ ス■シラタス（Streptomyces cirratus) NBRC13398等を具体的に挙げることが できる。
[0019] 前記微生物のうち、 キャンディダ'メタノソルポーサ (Candida
methanosorbosa) Y327株は、 2004年 2月 5日付で、 独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央 第 6) に国内寄託され、 FERM P-19667の受託番号が付与され、 2004年 12月 6曰 付で FERM BP-10175として国際寄託に移管された。
[0020] Y327株の菌学的性状は次のとおリである。
〔各種培地における生育状態 (25°C、 7日間）〕
(1)ッァペック酵母エキス寒天培地
22 27隱のコロニーを形成し、 コロニー表面はベルベット状で、 放射状のし わを形成する。 分生子は白色、 菌糸は白色、 滲出液は透明である。 裏面は暗 緑色で黄色可溶性色素を産生する。
(2)麦芽エキス寒天培地
22 27隱のコロニーを形成し、 コロニー表面は羊毛状である。 分生子は白色 、 菌糸は白色、 滲出液は見られない。 裏面は着色せず、 可溶性色素は産生し ない。
[0021 ] ピキア■アングスタ（P i ch i a angusta) Y285株は、 2004年 2月 5日付で独立行 政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に国内寄託され、 FERM P-19665の受託番号が付与 され、 2004年 12月 6日付で FERM BP-10173として国際寄託に移管された。
Y285株の菌学的性状は次のとおリである。
〔5%麦芽エキス寒天培地における生育状態 (25°C、 3日間）〕
(1 . 8 4. 6) X (1 . 9 5. 3) mの細胞が単体、 対、 または小さなクラスタ一とし て存在し、 バター状で白褐色となる。
[0022] ピキア■メンブラナエファシエンス（P i ch i a membranaefac i ens) Y299株は 、 2004年 2月 5日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に国内寄託され、 FERM P-19666の受託番号が付与され、 2004年 12月 6日付で FERM BP-10174として国際 寄託に移管された。
Y299株の菌学的性状は次のとおリである。
〔5%麦芽エキス寒天培地における生育状態 (25°C、 3日間）〕
(1 . 8 4. 5) X (2. 5 17. 0) mの卵形のコロニーを単体、 対、 鎖状、 またはク ラスターとして形成し、 コロニー表面は黄褐色で滑らかまたはひだを生じる
[0023] アクレモニゥム■エスピー（Acremon i um sp. ) FC405株は、 2004年 2月 5日付 で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県 つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に国内寄託され、 FERM P-19668の受託番 号が付与され、 2004年 12月 6日付で FERM BP-10176として国際寄託に移管され FC405株の菌学的性状は次のとおリである。
〔ポテトデキストロース寒天培地における生育状態 (25°C、 3日間）〕 分生子柄は （フィアライド） は無色、 直立、 単純まれに分枝、 基部から次第 に細くなリ先端に球状の胞子塊を着生、 分生胞子は無色、 単胞、 円錐形また は長楕円形、 一端または両端が尖り、 3 7個の油球を含む。
[0024] グリオセファロトリカム■エスピー（G l i ocepha l ot r i chum sp. ) FC554株は 、 2004年 2月 5日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に国内寄託され、 FERM P-19669の受託番号が付与され、 2004年 12月 6日付で FERM BP-10177として国際 寄託に移管された。
[0025] FC554株の菌学的性状は次のとおりである。
〔各種培地における生育状態 (25°C、 7日間）〕
(1 )ポテトデキストロース寒天培地
80 85mmのコロニーを形成し、 コロニー表面は灰色がかった黄色の綿毛状で 、 中心部はビロード状である。 裏面は着色せず、 可溶性色素は産生しない。 菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、 無色から褐色に着色した有隔 壁菌糸の形成が認められる。 分生子柄の先端域 (ベニシラス） より下部から 2 本の剛毛（seta)が形成されている。
(2)麦芽エキス寒天培地
83 85mmのコロニーを形成し、 コロニー表面は茶色がかった灰色から黄みが かった茶色の綿毛状である。 裏面は着色せず、 可溶性色素は産生しない。
(3)オートミール寒天培地
85 86mmのコロニーを形成し、 コロニー表面は茶色の綿毛状である。 裏面は 着色せず、 可溶性色素は産生しない。
[0026] またその他の前記微生物は、 それらの株名に付与されている保存機関に保 存されており、 容易に入手することができる。 保存機関は以下のとおりであ る。 NBRC :独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資 源部門、 ATCC : Amer i can Type Cu l ture Co l l ect i on, I AM :東京大学応用微生物 研究所。
[0027] 本発明によれば、 前述した性質をもつ微生物の培養菌体またはその培養菌 体の調製物の存在下で、 出発原料 (基質） である 6- (2-ォキソプロピル) -1 , 4- ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体がインキュベーション処理される。 こ の処理は前記微生物を培養する際に、 その培養液中に基質を添加して行うか 、 あるいは場合により前記微生物の培養菌体を、 例えばそのまま、 もしくは ホモジナイズした調製物の懸濁液中に基質を添加し、 ィンキュベーシヨンし て行うこともできる。
[0028] 培養液への基質の添加は、 培養前または培養開始後一定期間経過したとき のいずれの時期に行ってもよい。 上記菌体は上記の微生物を栄養源含有培地 に接種し、 好気的に培養することにより製造できる。 このような培養菌体の 調製物を用意するための微生物の培養および、 基質が添加された状態で行わ れる微生物の培養は、 原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことが できるが、 通常は液体培養による振とう培養、 通気攪拌培養等の好気的条件 下で実施するのが好ましい。
[0029] 培養に用いられる培地としては、 これら微生物が利用できる栄養源を含有 する培地であればよく、 各種の合成培地、 半合成培地、 天然培地等いずれも 利用可能である。 培地組成としては炭素源としてのグルコース、 マルトース 、 キシロース、 フルク！ ^一ス、 シユークロース、 スターチ、 デキストリン、 グリセリン、 マンニトール、 オートミール等を単独または組合せて用いるこ とができる。
[0030] 窒素源としては、 ペプトン、 肉エキス、 大豆粉、 カゼイン、 アミノ酸、 麦 芽エキス、 酵母エキス、 尿素等の有機窒素源、 硝酸ナトリウム、 硝酸力リウ ム、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸水素アンモニゥム、 リン 酸二水素アンモニゥム等の無機窒素源を、 単独または組合せて用いることが できる。 その他、 例えば塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 炭酸カルシウム、 硫酸マグネシウム、 リン酸ナトリウム、 リン酸カリウム、 塩化コバルト等の 塩類、 ビタミン類も必要に応じ添加して使用することができる。 なお、 培養 中発泡が著しいときは、 公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもで さる。
[0031 ] 培養条件は、 上記微生物が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することが できる。 通常、 pH2. 0^9. 5、 25 30°Cで 2 8曰程度培養する。 上述した各種 の培養条件は、 使用する微生物の種類や特性、 外部条件等に応じて適宜変更 でき、 最適条件を選択できる。
[0032] また、 培養菌体の調製物は、 培養終了後、 遠心分離または濾過により分離 した菌体またはホモジナイズした菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。 菌 体の懸濁に使用できる溶液は、 前記した培地であるか、 あるいは卜リス-酢酸 、 卜リス-塩酸、 コハク酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 リン酸ナトリウ ム、 リン酸カリウム等の緩衝液を単独または混合したものである。 また、 必 要に応じてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （リン酸） 〔NAD (P)〕 を 添加する。 緩衝液の pHは、 好ましくは 6. 0 9. 0、 さらに好ましくは 7. 0 8. 5 である。
[0033] 基質となる 6- (2-ォキソプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘 導体は、 固体、 粉末、 油状の場合は液体のままか、 あるいは水溶性有機溶媒 、 例えばメタノール、 エタノール、 アセトン、 ジメチルホルムアミド（DMF)、 ジメチルスルホキシド (DMS0)等に希釈して培養液または菌体の懸濁液に添加 することができ、 その添加量は、 例えば、 培養液の場合、 培養液 1 リツトル 当リ 400 1000mgが好ましい。 基質添加後は、 1 3日間、 好ましくは 1日間 、 振とうあるいは通気攪拌等の操作を行い、 反応を進行させることによリ基 質である式（I )で示される 6- (2-ォキソプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体を、 式（I I )で示される目的の光学活性 6- (2-ヒドロキシプロピ ル) -1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体に変換することができる。
[0034] こうして生成した、 目的の光学活性 6- (2-ヒドロキシプロピル) -1 , 4-ベンゾ ジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を反応混合物から単離するには、 種々の既知 精製手段を選択、 組合せて行うことができる。 例えば、 疎水性吸着樹脂への 吸着■溶出や、 酢酸ェチル、 n-ブタノール等を用いた溶媒抽出、 シリカゲル 等によるカラムクロマ卜グラフィ一法、 あるいは薄層クロマ卜グラフィー、 逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー、 結晶化等を、 単独 あるいは適宜組合せ、 場合により反復使用することにより、 分離精製するこ とができる。
[0035] なお、 式（I)で示される 6-(2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体は、 1 , 4-ベンゾジォキサン環の 2位が不斉炭素となっており、 2種類の光学異性体が存在するが、 いずれの光学異性体も本発明の方法によ リ対応する 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸 誘導体に変換することができる。
実施例
[0036] 以下、 本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、 本発明をこ れらの例に限定することを意図するものではない。 なお、 下記の例中のパー セント（％)は、 特に断りのない限り、 容量パーセントを示す。
[0037] 実施例 1
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミ ド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキ シン- (N- (1 - (R) -フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドへ変換する能力を もつ酵母のスクリーニングを以下のとおり行った。
[0038] ペプトン (Difco社) 5g/し 酵母エキス（Difco社) 3g/し 麦芽エキス 3g/し グ ルコース 10g/Lからなる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌した。 これに表 1に示す菌株を接種し、 30°C、 48 時間震盪培養した。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセ リン 5g /し リン酸水素二カリウム 2.8g /し リン酸二水素カリウム 1.2g/し 塩 化ナトリウム 1g/し 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間 高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和 した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン -(N-(1-(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドのジメチルスルホキシ ド (DMS0)溶液を 25 Lを加え、 30°C、 24時間震盪反応した。
[0039] 反応液に酢酸ェチル 2mLを加え抽出し、 脱溶媒した後、 同量のァセトニ卜リ ルに溶解し、 光学分割力ラムを用いた液体力ラムクロマトグラフィーによリ 定量とその光学純度を測定を行った。 光学分割カラムは、 キラルパック
AD-RH (CH I RALPAK AD-RH, 4.6mml.D. x150隱、 ダイセル化学工業社） を用い、 カラム温度 30°Cで、 ァセトニトリル：水 =45： 55の溶離液を流速 0.7mL/minで 通じ、 210nmにおける UV吸収を検出することで測定を行った [6-(2-(S)_ヒドロ キシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドの保持時間： 12.8分、 6-(2-(R)-tドロキシプ 口ピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエニルェチル ) )-2- (R)-カルボキサミドの保持時間： 19.6分]。
[0040] 分析結果を表 1に示す。 その結果、 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジ ヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキ サミド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジ ォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドが生成してい ることが確認できた。
[0041] [表 1]
(s) -アルコール
菌株名 変換率 (％) 光学純度 (%de)
Candida methanosorbosa Y327 46 93
Candida lipolytica ATCC 8661 49 91
Candida utilis NBRC 0619 26 72
Pichia angusta 丫 285 20 82
Pichia membranaefaciens Y299 29 89
Cryptococcus neoformans NBRC 0608 69 95
Yarrowia lipolytica NBRC 1542 27 74
Pachysolen tannophilus NBRC 1007 29 78
(R) -アルコール
菌株名 変換率 ) 光学純度 (%de)
Candida guilliermondii IAM 4412 2 100
Candida melibiosica IAM 4488 21 100
Saccharomyces bayanus IAM 4325 2 100
Saccharomyces cerevisiae NBRC 0224 2 100
[0042] 実施例 2
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミ ド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキ シン- (N- (1 - (R) -フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドへ変換する能力を もつ力ビのスクリーニングを以下のとおり行った。
[0043] ポテト澱粉 20g/し グルコース 10g/し 大豆粉 （エスサンミート、 味の素社 ) 20g/し リン酸二水素カリウム 1g/し 硫酸マグネシウム七水和物 0.5g/Lから なる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧 蒸気滅菌した。 これに表 2に示す菌株を接種し、 25°C、 72時間震盪培養した 。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセリン 5g/し リン酸 水素二力リゥム 2.8g/し リン酸ニ水素力リゥム 1.2g/し 塩化ナ卜リゥム 1g/L 、 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエ 二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え、 25°C、 24時間 震盪反応した。
[0044] 反応液中に含まれる 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベ ンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドは、 実 施例 1に記載した方法に従って定量及び光学純度の測定を行った。 分析結果 を表 2に示す。 その結果、 光学活性な6-(2-(3)-ヒドロキシプロピル)-2,3-ジ ヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキ サミド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジ ォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドが生成してい ることが確認できた。
[0045] [表 2]
(S)-アルコール
菌株名 変換率 (%) 光学純度 (%de)
Aspergillus niger ATCC 11394 23 88
Aspergillus brevipes NBRC 5821 53 95
Penicillium purpurogenum ATCC 46581 63 78
Paecilomyces carneus ATCC 46579 26 77
Acremonium sp. FC405 55 95
Gliocephalotnchum sp. FC554 76 95
(R)-アルコール
菌株名 変換率 (%) 光学純度 (%de)
Aspergillus oryzae [AM 2600 7 100
Aspergillus terreus ATCC 46503 12 100
Penicillium lividum [AM 7191 7 100
Penicillium luteum ATCC 9644 4 100
Rhizopus oryzae ATCC 11145 9 100
Rhizopus semarangensis [AM 6251 7 100
Mucor circinelloides f.griseo-cyanus NBRC 4563 11 100
Absidia blakesleeana ATCC 10148B 13 100
Guignardia lancina NBRC 7887 8 100
Coriolus irsutus NBRC 4917 7 100
[0046] 実施例 3
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミ ド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキ シン- (N- (1 - (R) -フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドへ変換する能力を もつ放線菌のスクリーニングを以下のとおり行った。
[0047] ポテト澱粉 20g/し グルコース 20g/し 大豆粉 （エスサンミート、 味の素社 ) 20g/し 酵母エキス（オリエンタル酵母工業社） 5g/し 塩化ナトリウム
2.5g/し 炭酸カルシウム 3.2g/し 硫酸銅五水和物 0.005g/し 硫酸亜鉛七水和 物 0.005g/し 塩化マンガン四水和物 0.005g/Lからなる液体培地 (pH7.4)を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌した。 これに表 3に示す菌株を接種し、 28°C、 48時間震盪培養した。 得られた培養 液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセリン 5g/し リン酸水素二カリウム 2.8g/し リン酸二水素カリウム 1.2g /し 塩化ナトリウム 1g/し 硫酸アンモニ ゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌し、 硫酸マグネシゥ ム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)- カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え、 28°C、 24時間震盪反応した。
[0048] 反応液中に含まれる 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベ ンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドは、 実 施例 1に記載した方法に従って定量及び光学純度の測定を行った。 分析結果 を表 3に示す。 その結果、 光学活性な6-(2-(3)-ヒドロキシプロピル)-2,3-ジ ヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキ サミド、 または 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジ ォキシン- (N- -(R)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドが生成してい ることが確認できた。
[0049] [表 3]
(s)-アルコール
菌 ¼名 変換率 (%) 光学純度 (%de)
Streptomyces griseoflavus NBRC 13044 6 79
Streptomvces cirratus NBRC 13398 13 79
(R)_アルコール
菌株名 変換率 (%) 光学純度 (％de)
Streptomyces californicus ATCC 3312 12 100
Streptomyces vindochromogenes NBRC 3113 41 91
Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 12 95
Saccharothrix aerocolonigenes NBRC 3837 7 92 [0050] 実施例 4
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(S)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミ ドへ変換する能力をもつ酵母のスクリーニングを以下のとおり行った。
[0051] ペプトン (Difco社) 5g/し 酵母エキス（Difco社) 3g/し 麦芽エキス 3g/し グ ルコース 10g/Lからなる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌した。 ここに表 4に示す菌株を接種し、 30°C、 48 時間震盪培養した。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセ リン 5g /し リン酸水素二カリウム 2.8g /し リン酸二水素カリウム 1.2g/し 塩 化ナトリウム 1g/し 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間 高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和 した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン - (N- (卜 (S)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え 、 30°C、 24時間震盪反応した。
[0052] 反応液に酢酸ェチル 2mLを加え抽出し、 脱溶媒した後、 同量のイソプロパノ ールに溶解し、 光学分割力ラムを用いた液体力ラムクロマトグラフィーによ リ定量とその光学純度を測定を行った。 光学分割カラムは、 キラルセル
0J-H(CHIRALCEL 0J-H, 4.6mml . D. x 250mm. ダイセル化学工業社） を用い、 力 ラム温度 30°Cで、 n-へキサン：イソプロパノール =80： 20の溶離液を流速
1.0mL/minで通じ、 210nmにおける UV吸収を検出することで測定を行った
[6-(2-(S)_ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン
- (N- (卜 (S)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの保持時間： 15.9分、 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン
- (N- (卜 (S)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの保持時間： 18.4分]。
[0053] 分析結果を表 4に示す。 その結果、 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピ ル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(S)-フエニルェチル
) ) -2- (R) -力ルポキサミドが生成していることが確認できた。 [0054] [表 4]
(s)-アルコール
菌株名 変換率 (％) 光学純度 ( e)
Candida methanosorbosa Y327 59 100
Candida lipolytica ATCC 8661 40 95
Pichia angusta Y285 41 100
Pichia membranaefaciens Y299 29 100
Crypto co ecus neoformans NBRC 0608 74 100
[0055] 実施例 5
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエニルェ チル)）-2- (R)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(S)-フエ二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミ ドへ変換する能力をもつカビのスクリーニングを以下のとおり行った。
[0056] ポテト澱粉 20g/し グルコース 10g/し 大豆粉 （エスサンミート、 味の素社 ) 20g/し リン酸二水素カリウム 1g/し 硫酸マグネシウム七水和物 0.5g/Lから なる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧 蒸気滅菌した。 これに表 5に示す菌株を接種し、 25°C、 72時間震盪培養した 。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセリン 5g/し リン酸 水素二力リゥム 2.8g/し リン酸ニ水素力リゥム 1.2g/し 塩化ナ卜リゥム 1g/L 、 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエ 二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え、 25°C、 24時間 震盪反応した。
[0057] 反応液中に含まれる 6-(2-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾ ジォキシン- (N- -(S)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドは、 実施例 4に従って定量及び光学純度の測定を行った。 分析結果を表 5に示す。 その 結果、 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾ ジォキシン- (N- -(S)-フエ二ルェチル)） -2-(R)-カルボキサミドが生成して いることが確認できた。 [0058] [表 5]
(s)-アルコール
菌株名 変換率 (%) 光学純度 (%de)
Aspergillus niger ATCC 11394 5 100
Aspergillus brevipes NBRC 5821 95 100
Acremonium sp. FC405 80 97
Gliocephalotrichum sp. FC554 83 100
[0059] 実施例 6
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエニルェ チル)）-2- (S)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(s)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミ ドへ変換する能力をもつ酵母のスクリーニングを以下のとおり行った。
[0060] ペプトン (Difco社) 5g/し 酵母エキス（Difco社) 3g/し 麦芽エキス 3g/し グ ルコース 10g/Lからなる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌した。 ここに表 6に示す菌株を接種し、 30°C、 48 時間震盪培養した。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセ リン 5g /し リン酸水素二カリウム 2.8g /し リン酸二水素カリウム 1.2g/し 塩 化ナトリウム 1g/し 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間 高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和 した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン -(N-a-(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え 、 30°C、 24時間震盪反応した。
[0061] 反応液に酢酸ェチル 2mLを加え抽出し、 脱溶媒した後、 同量のイソプロパノ ールに溶解し、 光学分割力ラムを用いた液体力ラムクロマトグラフィーによ リ定量とその光学純度を測定を行った。 光学分割カラムは、 キラルパック AS-H (CH I RALPAK AS-H, 4.6mm I . D. x 250mm. ダイセル化学工業社） を用い、 力 ラム温度 30°Cで、 n-へキサン：イソプロパノール =85： 15の溶離液を流速
1.0mL/minで通じ、 210nmにおける UV吸収を検出することで測定を行った
[6-(2-(S)_ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン
-(N-a-(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドの保持時間： 24.8分、 6-(2-(R)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン
-(N-(1-(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドの保持時間： 22.6分]。
[0062] 分析結果を表 6に示す。 その結果、 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピ ル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(S)-フエニルェチル
) ) -2- (S) -力ルポキサミドが生成していることが確認できた。
[0063] [表 6]
(S)-アルコール
菌 te-D 変換率 (¾) 光学純度 (%de)
Candida methanosorbosa Y327 56 100
Candida lipolytica ATCC 8661 47 100
Pichia angusta Y285 29 100
Pichia tnembranaefaciens Y299 44 100
Cryptococcus neoformans NBRC 0608 35 100
[0064] 実施例 7
6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエニルェ チル)）-2- (S)-カルボキサミドを 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒド 口- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(s)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミ ドへ変換する能力をもつカビのスクリーニングを以下のとおり行った。
[0065] ポテト澱粉 20g/し グルコース 10g/し 大豆粉 （エスサンミート、 味の素社 ) 20g/し リン酸二水素カリウム 1g/し 硫酸マグネシウム七水和物 0.5g/Lから なる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ分注し、 121°C、 20分間高圧 蒸気滅菌した。 これに表 7に示す菌株を接種し、 25°C、 72時間震盪培養した 。 得られた培養液 2mLを遠心分離して集めた菌体に、 グリセリン 5g/し リン酸 水素二力リゥム 2.8g/し リン酸ニ水素力リゥム 1.2g/し 塩化ナ卜リゥム 1g/L 、 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 2mLを加え混和した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエ 二ルェチル)） -2- (S)-カルボキサミドの DMS0溶液 25 Lを加え、 25°C、 24時間 震盪反応した。
[0066] 反応液中に含まれる 6-(2-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾ ジォキシン- (N-(1-(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドは、 実施例 6に従って定量及び光学純度の測定を行った。 分析結果を表 7に示す。 その 結果、 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾ ジォキシン- (N- -(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドが生成して いることが確認できた。
[0067] [表 7]
(S)-アルコール
も 変換率 (°/。） 光学純度 (％de)
Acremonium sp. FC405 63 100
Gliocephalotnchum sp. FC554 60 100
[0068] 実施例 8
ペプトン (Difco社) 5g /し 酵母エキス（Difco社) 3g /し 麦芽エキス 3g /し グ ルコース 10g/Lからなる液体培地を 250mL容三角フラスコに 25mLずつ 10本に分 注し、 121°C、 20分間高圧蒸気滅菌した。 これらの培地にクリプトコッカス - ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans) NBRC0608を接種し、 30°C、 48 時間震盪培養した。 得られた培養液を遠心分離して集めた菌体に、 グリセリ ン 5g/し リン酸水素二カリウム 2.8g /し リン酸二水素カリウム 1.2g/し 塩化 ナトリウム 1g/し 硫酸アンモニゥム 2g/Lからなる液体培地を 121°C、 20分間高 圧蒸気滅菌し、 さらに硫酸マグネシウム 0.2g/Lを加えた培地 25mLをそれぞれ 加え混和した。 次いで 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォ キシン- (N- (1 - (R) -フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドの DMS0溶液各 312 Lを加え、 30°C、 24時間震盪反応した。
[0069] 得られた変換反応液をまとめ、 pHを測定した後、 変換反応液 250mL(pH6.9) に酢酸ェチル 250mLを加え、 20分撹拌した。 これを遠心分離 (8000rpm、 20m in) して酢酸ェチル層を分取した後、 飽和食塩水 (30mL)で洗浄、 硫酸ナトリウム で乾燥、 濾過し溶媒を減圧留去したところ、 残渣を 128.7mg得た。 これを Preparative TLC (MERCK si l ica gel 60 F 1.05744、 n-へキサン：酢酸ェチル
254
=1:1)にて精製し未反応の基質を 40.8mg (回収率 40.8%)回収し、 生成物である 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン
- (N- (1 - (R) -フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドを 44.4mg (収率 44.4%) 回収した。 各々回収した物質の構造は NMRにて確認した。
[0070] また遠心分離後の酢酸ェチル層を 200 Lとり、 溶媒を乾固した後、 ァセト 二卜リル 200 Lに溶解したものを HPLCサンプルとした。 これを実施例 1に従 つて光学純度の測定を行ったところ。 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピ ル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(R)-フエニルェチル
) )-2- (R)-カルボキサミドが生成していることが確認でき、 その光学純度は 92 %deであった。
[0071] 実施例 9
実施例 8と同様にキャンディダ'メタノソルボーザ （Candida
methanosorbosa) Y327 (FERM P-19667)を用いて培養菌体調製物を調製し、 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエ 二ルェチル)） -2- (R)-カルボキサミドの DMS0溶液各 312 Lを加え、 30°C、 24時 間震盪反応した。
実施例 8と同様に変換反応液 250mL(pH6.2)を処理し、 残渣を 160. Omg得た。 こ れを Preparative TLC (MERCK si l ica gel 60 F 1.05744、 n-へキサン：酢酸ェ
254
チル =1:1)にて精製し、 未反応の基質を 13.7mg (回収率 13.7%)回収し、 生成物 である 6-(2-(S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン - (N- (1— (S) フエニルェチル) ) -2- (R) -力ルポキサミドを 36.4mg (収率 36.4%) 回収した。 各々回収した物質の構造は NMRにて確認した。
[0072] また遠心分離後の酢酸ェチル層を 200 Lとり、 溶媒を乾固した後、 イソプ ロバノール 200 Lに溶解したものを HPLCサンプルとした。 これを実施例 4に 従って光学純度の測定を行ったところ。 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロ ピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエニルェチル
) )-2- (R)-カルボキサミドが生成していることが確認でき、 その光学純度は 100%deであった。
[0073] 実施例 1 0 実施例 8と同様にキャンディダ'メタノソルボーザ （Candida methanosorbosa) Y327 (FERM BP-10175)を用いて培養菌体調製物を調製し、 32mg/mL 6-ァセトニル -2, 3-ジヒドロ- 1, 4-ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエ 二ルェチル)） -2- (S)-カルボキサミドの DMS0溶液各 312 Lを加え、 30°C、 24時 間震盪反応した。 実施例 8と同様に変換反応液 250mL(pH6.1)を処理し、 残渣 を 140.3mg得た。 これを Preparative TLC(MERCK si I ica gel60 F 1.05744、
254
n-へキサン：酢酸ェチル =1 :1)にて精製し、 未反応の基質を 29.5mg (回収率 29.5 %)回収し、 生成物である 6- (2- (S)-ヒドロキシプロピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4- ベンゾジォキシン- (N-(1-(S)-フエ二ルェチル)） -2-(S)-カルボキサミドを 28.7mg (収率 28.7%)回収した。 各々回収した物質の構造は NMRにて確認した。
[0074] また遠心分離後の酢酸ェチル層を 200 Lとり、 溶媒を乾固した後、 イソプ ロバノール 200 Lに溶解したものを HPLCサンプルとした。 これを実施例 6に 従って光学純度の測定を行ったところ。 光学活性な 6- (2- (S)-ヒドロキシプロ ピル) -2, 3-ジヒドロ- 1,4-ベンゾジォキシン- (N- -(S)-フエニルェチル
) )-2- (S)-カルボキサミドが生成していることが確認でき、 その光学純度は 100%deであった。
[0075] 実施例 1 1
実施例 8で得られた光学活性な生成物の絶対配置の決定を以下のとおリ行 つた。 実施例 8で単離した生成物であるアルコール体 13.4mgをピリジン 250 Lに溶解し、 （-)-ひ-メ トキシ-ひ-トリフルォ口-メチルフエニルァセチルクロ ライド（(-) -MTPA-CI)17 L加えた後、 室温で 23時間撹拌した。 ここに Ν,Ν-ジ メチル -1 , 3-プロパンジァミンを加え室温で 30分撹拌し、 溶媒を減圧留去した 。 残渣を Preparative TLC (MERCK si I ica gel 60 F 1.05744、 n-へキサン：酢
254
酸ェチル =1:1)にて精製し、 （-)-«^八体12.30^(収率56.2%)を得た。 さらに実 施例 8で単離したアルコール体 14. Omgをピリジン 250 Lに溶解し、
(+)-MTPA-CI 17 L加え上記と同様に反応後、 処理を行い、 （+)-MTPA体
13.4mg (収率 58.6%)を得た。
[0076] 各々の物質にっぃて^- !¾(5001«^,0001 )を測定し、 （-) -MTPA体のケミカル シフト値から（+)-MTPA体のケミカルシフト値を引いた厶3 (H z) の値から 、 新 Mosher法により実施例 8で単離したアルコール体は (S)-アルコールであ ることを確認した。
[0077] [化 7]
Figure imgf000027_0001
[0078] 実施例 1 2 ：絶対配置の決定
実施例 9で得られた光学活性な生成物の絶対配置の決定を以下のとおリ行 つた。 実施例 9で単離した生成物であるアルコール体 7.9mgをピリジン 200 L に溶解し、 （-) -MTPA-CI 10 Lを加え、 実施例 1 1と同様に処理したところ、 (-) -MTPA体 5.8mg (収率 44.9%)を得た。 さらに実施例 9で単離したアルコール 体 7.9mgをピリジン 200 Lに溶解し、 (+)-MTPA-CI 10 L加え上記と同様に反 応後、 処理を行い (+) -MTPA体 8. Omg (収率 62.0%)を得た。
[0079] 各々の物質にっぃて^- !¾(5001«^,0001 )を測定し、 （-) -MTPA体のケミカル
3
シフト値から（+)-MTPA体のケミカルシフト値を引いた厶3 (H z) の値から 、 新 Mosher法により実施例 9で単離したアルコール体は (S)-アルコールであ ることを確認した。
[0080] [化 8]
Figure imgf000028_0001
+2
[0081] 実施例 1 3 ：絶対配置の決定
実施例 1 0で得られた光学活性な生成物の絶対配置の決定を以下のとおり 行った。 実施例 1 0で単離した生成物であるアルコール体 9.5mgをピリジン 200 Lに溶解し、 （-) -MTPA-CI 12 Lを加え、 実施例 1 1と同様に処理したと ころ、 （-)-1^八体9.80^(収率63.2%)を得た。 さらに実施例 1 0で単離したァ ルコール体 10.3mgをピリジン 200 Lに溶解し、 （+)-MTPA-CI 12 L加え上記と 同様に反応後、 処理を行い (+)-MTPA体 13.8mg (収率 82.1%)を得た。
[0082] 各々の物質にっぃて^- !¾(5001«^,0001 )を測定し、 （-) -MTPA体のケミカル
3
シフト値から（+)-MTPA体のケミカルシフト値を引いた厶3 (H z) の値から 、 新 Mosher法により実施例 1 0で単離したアルコール体は (S)-アルコールで あることを確認した。
[0083] [化 9]
Figure imgf000028_0002
+5
産業上の利用可能性 本発明によれば、 光学活性な医薬品の合成中間体として利用可能な光学活 性 1 , 4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を生物学的変換方法によって効 率よく得ることができる。

Claims

請求の範囲 式（I)
[化 1]
Figure imgf000030_0001
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表す。 ）
で示される 6- (2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導 体の、
式（II)
[化 2]
Figure imgf000030_0002
(式中、 Rは水酸基またはカルボキシル基の保護基を表し、 *は不斉炭素を表す o )
で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-力 ルボン酸誘導体への生物学的変換方法による、 式（I I)で示される光学活性 6-(2-ヒドロキシプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体の製 造方法であって、
(A)前記生物学的変換方法を行うことができる微生物の培養菌体またはその培 養菌体の調製物の存在下で、 式（ I )で示される 6- (2-ォキソプ口ピル) -1 , 4-ベ ンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体をインキュベーション処理する工程、
(B)インキュベーション処理液から式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキ シプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体を採取する工程、 を含む方法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 ピキア (Pichia)属、 サッカロマイ セス (Saccharomyces)属、 クリプトコッカス (Cryptococcus)属、 ャロビア (Yarrowia)属、 /《キソレン（Pachysolen)属、 アスペスレギ レス（Aspergi I lus)属 、 ぺニシリウム (Penici 11 ium)属、 パェシロマイセス (Paeci lomyces)属、 ァク レモニゥム (Acremonium)属、 ヮリオセファロトリカム (Gl iocephalotr ichum) 属、 リゾブス（Rhizopus)属、 ムコール (Mucor)属、 アブシジァ（Absidia)属、 グイグナルジァ（Guignardia)属、 コリオ一ラス（Cor iolus)属、 ストレブトマ イセス (Streptomyces)属、 口ドコッカス (Rhodococcus)属またはサッカロスリ ックス（Saccharothrix)のいずれかの属に属する微生物である、 請求項 1記載 の方法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 ピキア (Pichia)属、 サッカロマイ セス (Saccharomyces)属、 アスペスレ千 レス (Aspergi I lus)属、 ぺニシリウム (Penici 11 ium)属またはリゾプス（Rhizopus)属のいずれかの属に属する微生物 である、 請求項 1記載の方法。
前記式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキシプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキ シン- 2-カルボン酸誘導体における、 *で示される不斉炭素の立体配置が R配置 である、 請求項 1記載の方法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 サッカロマイセス
(Saccharomyces)属、 アスペスレギ レス (Aspergi I lus)属、 ぺニシリウム
(Penici 11 ium)属、 リゾブス（Rhizopus)属、 ムコール（Mucor)属、 アブシジァ (Absidia)属、 グイグナルジァ（Guignardia)属、 コリオ一ラス（Cor iolus)属、 ス卜レプ卜マイセス (Streptomyces)属、 口ドコッカス (Rhodococcus)属または サッカロスリックス（Saccharothr i x)属のいずれかの属に属する微生物である 、 請求項 4記載の方法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 サッカロマイセス
(Saccharomyces)属、 アスペスレギ レス (Aspergi I lus)属、 ぺニシリウム
(Penici 11 ium)属、 リゾプス（Rhizopus)属またはス卜レブトマイセス (Streptomyces)属のいずれかの属に属する微生物である、 請求項 4記載の方 法。
前記式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキシプロピル) -1 , 4-ベンゾジォキ シン- 2-カルボン酸誘導体における、 *で示される不斉炭素の立体配置が S配置 である、 請求項 1記載の方法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 ピキア (Pichia)属、 クリプトコッ カス (Cryptococcus)属、 ャロビア (Yarrow i a)属、 パキソレン (Pachysolen)属 、 ァスペルギルス（Aspergi I lus)属、 ぺニシリウム（Penici 11 ium)属、 パェシ ロマイセス (Paeci lomyces)属、 アクレモニゥム (Acremonium)属、 ヮリオセフ ァロトリカム（Gl ioc印 halotrichum)属またはストレプトマイセス
(Streptomyces)属のいずれかの属に属する微生物である、 請求項，記載の方 法。
前記微生物が、 キャンディダ (Candida)属、 ピキア (Pichia)属、 ァスペルギル ス（Aspergi I lus)属またはス卜レプトマイセス（Str印 tomyces)属のいずれかの 属に属する微生物である、 請求項 7記載の方法。
前記式（I)で示される 6- (2-ォキソプロピル) -1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボ ン酸誘導体から前記式（ 11 )で示される光学活性 6- (2-ヒドロキシプロピル
)-1,4-ベンゾジォキシン- 2-カルボン酸誘導体への変換能を有し、 キャンディ ダ■メタノソルポーサ（Candida methanosorbosa) Y327 (寄託番号： FERM BP-10175) 、 ピキア■アングスタ (Pichia angusta) Y285 (寄託番号： FERM BP-10173) 、 ピキア■メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens) Y299 (寄託番号： FERM BP-10174) 、 アクレモニゥム■エスピー (Acremonium sp.) FC405 (寄託番号： FERM BP-10176) およびダリオセファロトリカム - エスピー（Gl iocepha lot ri chum sp. ) FC554 (寄託番号： FERM BP-10177) から なる群よリ選択される微生物。
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