JP2004254630A - 生物学的変換方法による１−ペンタノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ｎ−ペンタンを原料とし、生物学的変換方法を利用して１−ペンタノールを製造する新規な方法を提供すること、及びこの方法に利用可能なｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物を提供すること。
【解決手段】ｎ−ペンタンから１−ペンタノールを製造する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む製造方法。（Ａ）ｎ−ペンタンの存在下で、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、かつｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換しうる菌株をインキュベーションする工程。（Ｂ）工程（Ａ）で得られるインキュベーション液から１−ペンタノールを採取する工程。
ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物、例えば、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）。ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物、例えば、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６）。
【選択図】なし
【解決手段】ｎ−ペンタンから１−ペンタノールを製造する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む製造方法。（Ａ）ｎ−ペンタンの存在下で、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、かつｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換しうる菌株をインキュベーションする工程。（Ｂ）工程（Ａ）で得られるインキュベーション液から１−ペンタノールを採取する工程。
ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物、例えば、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）。ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物、例えば、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６）。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−ペンタノールの生物学的な製造方法、及びｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルコール類は種々の用途を有する重要な一群の工業用化学物質であり、その１つである１−ペンタノールも溶媒、エステル製造の中間体、食品添加物、芳香性物質として用いられている。
【０００３】
微生物を用いてアルコール類を製造する方法に関しては、例えば、アルカン資化微生物またはアルカン分解微生物を用いる方法（特許文献１参照）があり、さらにそれら微生物の酵素を用いる方法も知られている（特許文献２および特許文献３参照）。しかし、これらの文献には１−ペンタノールの製造について具体的な記載はない。またｎ−ペンタンを資化する微生物として、シュードモナス属微生物（非特許文献１および２参照）あるいはノカルディオイデス属微生物（非特許文献３参照）が知られているが、ｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換することは確かめられていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−１４２７６４号公報
【特許文献２】
特開２００１−２７５６５３号公報
【特許文献３】
米国特許５１９０８７０号公報
【非特許文献１】
テオ（Ｔｈｅｏ） Ｈ． Ｍ． スミツ（Ｓｍｉｔｓ）， マルチナ ロスリスベルガー（Ｍａｒｔｉｎａ Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ）， ベルナルド ウィトルト（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｗｉｔｈｏｌｔ） 及び ジャン（Ｊａｎ） Ｂ． ファン バイレン（ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ）、「グラム陰性及びグラム陽性菌でのアルカンハイドロキシレース遺伝子の分子スクリーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｌｋａｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ．） 」、エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、１９９９年、１巻、ｐ．３０７−３１７
【非特許文献２】
タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）， Ｊ、「シュードモナス・ブタノボラ・エスピー・ノブ）によるｎ−ブタンからの細胞内及び細胞外タンパク質の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｎ−ｂｕｔａｎｅ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ ｓｐ． ｎｏｖ．）」、アドバンシーズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８０年、２６巻、ｐ．１１７−１２７
【非特許文献３】
ナツコ・ハマムラ（Ｎａｔｓｕｋｏ Ｈａｍａｍｕｒａ）， クリス（Ｃｈｒｉｓ） Ｍ． イーガー（Ｙｅａｇｅｒ） 及びダニエル（Ｄａｎｉｅｌ） Ｊ． アルプ（Ａｒｐ）、「ノカルディオイデス・エスピー株ＣＦ８におけるアルカン酸化のための２つの異なるモノオキシゲナーゼ（Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｆｏｒ ａｌｋａｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＣＦ８．）」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイロクバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００１年、６７巻、ｐ．４９９２−４９９８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、ｎ−ペンタンを原料とし、生物学的変換方法を利用して１−ペンタノールを製造する新規な方法を提供すること、及びこの方法に利用可能なｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために広範な微生物群からｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換しうる微生物を探索した。その結果、細菌に分類されるミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物が前記変換能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
従って、本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）ｎ−ペンタンから１−ペンタノールを製造する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）ｎ−ペンタンの存在下で、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、かつｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換しうる菌株をインキュベーションする工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られるインキュベーション液から１−ペンタノールを採取する工程。
【０００８】
（２）前記ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株がミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である前記（１）記載の製造方法。
（３）前記ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株がゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６）である前記（１）記載の製造方法。
（４） ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物。
（５）ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である（４）に記載の微生物。
（６）ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物。
（７）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６） である（６）に記載の微生物。
【０００９】
本発明者らは、前述のように、細菌に分類されるミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株がｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換しうることを見出した。本発明者らが知る限り、これまで、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株に、ｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換して、１−ペンタノールを生産するものは知られていない。本発明者らが新たに見出した微生物は、いずれも土壌から分離されたミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株及びゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株である。
【００１０】
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１月３１日付けでＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＰＮ４として寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）。またゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株は、同じく独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１月３１日付けでＧｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ＰＮ８として寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６））。
【００１１】
なお、上記２つの菌株の菌学的性状は表１〜３に示すとおりである。尚、各菌株の同定については後述の実施例において詳述する。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
本発明の製造方法では、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物であって、ｎ−ペンタンを１−ペンタノールへ変換する能力を有する微生物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できる。但し、好ましい微生物としては、いずれも土壌から分離されたミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株またはゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株を挙げることができる。
【００１６】
本発明の製造方法においては、まず工程（Ａ）において、出発原料（基質）であるｎ−ペンタンの存在下で、前記菌株がインキュベーションされる。このインキュベーションは、酸素含有雰囲気下で行うことができる。具体的には、菌株の好気的条件下でのインキュベーションは、培養液中に基質であるｎ−ペンタンを添加し、酸素を含む気体、例えば空気を通気しながら行うこともできる。
【００１７】
培養液への基質の添加は、培養開始前に行なう。
上記菌体は、例えば、上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができる。但し、通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００１８】
工程（Ａ）のインキュベーション及びそれに供する菌株の培養に用いられる培地としては、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としての、ｎ−アルカン、グルコース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、大豆油等を単独または組み合わせて用いることができる。但し、ｎ−ペンタンを水酸化し１−ペンタノールを生産する能力が高い菌体を得るためにはｎ−アルカン、中でも特にｎ−ペンタンを単独で用いることが好ましい。
【００１９】
窒素源としては、ペプトン、肉エキス、グルテンミール、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を単独または組み合わせて用い得る。その他、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化マンガン、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミンＢおよびビオチン等のビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。
【００２０】
工程（Ａ）のインキュベーション及びそれに供する菌株の培養条件は、該菌株が良好に生育して、ｎ−ペンタンを水酸化し１−ペンタノールを生産し得る範囲内で適宜選択し得る。例えば培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２６〜３０℃に保つのが良い。培養日数は１〜８日程度で、通常２〜５日程度である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。
【００２１】
工程（Ａ）において、基質となるｎ−ペンタンは、通常液体のまま培養液に添加する。 その添加量は、例えば、培養液の場合、培養液１Ｌ当り１０ｇ程度が好ましい。基質添加後は、２８℃で約１〜７日間、振とうあるいは通気攪拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより基質であるｎ−ペンタンを目的の１−ペンタノールに変換することができる。
【００２２】
次に、工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたインキュベーション液から目的の１−ペンタノールを採取する。１−ペンタノールを工程（Ａ）の反応混合物から単離するには、一般にアルカノール類を発酵産物から単離するために用いられる種々の既知精製手段（例えば、有機溶媒による抽出や蒸留）を選択、組合せて行うことができる。
例えば、インキュベーション液にジエチルエーテル、酢酸エチル等の有機溶媒を加えて撹拌し、１−ペンタノールを抽出する。このときインキュベーション液に塩類（例えば、塩化ナトリウム等）、酸類（例えば、硫酸等）を加えてインキュベーション液のイオン強度を高めると１−ペンタノールの有機溶媒への抽出率が向上する。その後、用いた有機溶媒と１−ペンタノールの沸点の差を利用して蒸留し、目的の１−ペンタノールを精製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。
【００２４】
実施例１
微生物の取得及び同定
［１］ｎ−ペンタン資化微生物の分離
ｎ−ペンタンを唯一の炭素源とした培地を用いて集積培養を行ない、ｎ−ペンタン資化微生物を弊社の工場プラント周辺の土壌から２株分離した。この２株の微生物をＰＮ４株及びＰＮ８株と命名した。その詳細を以下に示した。
（１）培地組成
炭素源のｎ−ペンタンを下記の組成の無機塩類溶液に加えたものを培地とした。ｎ−ペンタンについては予め別にろ過滅菌して、液体培地（スクリューキャップ付試験管を用いて調製）の際はそのまま液体として添加した。平板培地（１．５％寒天及びシャーレを用いて調製）の際は、小型バイアルに詰めた脱脂綿にｎ−ペンタンを染み込ませ蒸気として培地系へ供給した。ｎ−ペンタンの培地系への添加は、微生物の植菌後に行なった。
【００２５】
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０ ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ
ＮａＣｌ ５．０ ｇ
微量ミネラル溶液 １．０ ｍＬ
脱イオン水 １０００ｍＬ
但し、微量ミネラル溶液の組成は次の通りである（脱イオン水１０００ｍＬ当りの各成分量を表記）。
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ
ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０００ｍｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ
【００２６】
（２）培養条件
液体培養は２８℃にて回転数２２０ｒｐｍで振とうして行ない、平板培養は２８℃にて静置して行なった。
【００２７】
（３）分離手順
▲１▼滅菌水２ｍＬにミクロスパーテル１杯分の土壌を懸濁して、その懸濁液の１白金耳分を前記平板培地に塗布し最長１１日間まで微生物を培養した。
▲２▼生育してきた微生物をｎ−ペンタンを供給する系と供給しない系でそれぞれ平板培養し、前者の系における生育が後者の系におけるそれと比べて良好な微生物を分離した。
▲３▼分離微生物について、１％ｎ−ペンタンの有無による液体培地での生育を同様に比較した。まず分離微生物をブイヨン（肉汁）液体培地２ｍＬで前培養（２８℃、２２０ｒｐｍ）し、この培養物１０μＬをｎ−ペンタンが存在する系と存在しない系の各液体培地２ｍＬに植菌して最長１１日間培養した。
▲４▼上記▲３▼において、ｎ−ペンタン存在下で良好に生育した微生物をｎ−ペンタン資化微生物とした。
【００２８】
［２］取得したｎ−ペンタン資化微生物の同定
分離されたｎ−ペンタン資化微生物のゲノムＤＮＡをＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ及びＦａｓｔ ＤＮＡ Ｋｉｔ（フナコシ社）を用いて抽出した。この抽出ＤＮＡを鋳型として、９Ｆ：５’−ＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ、５３６Ｒ：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧプライマー及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲ反応により、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部（５００ｂｐ）を増幅した。増幅産物の塩基配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析し、系統解析を行なった。その結果、ＰＮ４株はミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌に、ＰＮ８株はゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属細菌に近縁であることが示唆された。
これら２株は新規なｎ−ペンタン資化微生物と考えられた。さらに、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株はｎ−アルカン資化微生物としても新規であると考えられた。
【００２９】
［３］取得したｎ−ペンタン資化微生物の各種ｎ−アルカンの資化性
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．） ＰＮ４株及びゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株について、それぞれの菌株の１白金耳量の菌体を保存用スラントからブイヨン液体培地２ｍＬに植菌し、２８℃及び２２０ｒｐｍで３日間の前培養を行なった。この前培養物１０μＬを１％の各種ｎ−アルカン（炭素数５〜１６）を含む液体培地２ｍＬに添加して最長８日間培養した。その結果、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株は炭素数５のｎ−ペンタンの他に炭素数１０〜１６のｎ−アルカンで、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株は供試した全てのｎ−アルカンで良好な生育を示した。
【００３０】
実施例２
ミクロバクテリウム・エスピー（ Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ） ＰＮ４ 株による ｎ− ペンタンからの １− ペンタノールの生成
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株を保存用スラントからブイヨン液体培地２ｍＬに１白金耳分の菌量を植菌し、２８℃及び２２０ｒｐｍで３日間の前培養を行なった。この前培養物１０μＬを１％ｎ−ペンタンを含む液体培地２ｍＬに添加して培養した。
培養液を経時的に採取して、培養液の濁度の測定、ｎ−ペンタン代謝産物の同定及び定量を行なった。培養液の濁度は生育した微生物の菌体濃度の指標であり、６００ｎｍ光を用いて測定しＯＤ６００で表した。代謝産物は培養液から抽出してガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）により検出及び定量した。培養液０．７ｍＬに飽和塩化ナトリウム水溶液０．７ｍＬと酢酸エチル（内部標準物質として３０ｐｐｍの１，１２−ドデカンジオールを含有）１．４ｍＬを添加し１０分間激しく振盪した。この混合液を遠心分離（３，０００ｒｐｍで５分間）して、上層の酢酸エチル１．０ｍＬを回収した。この酢酸エチル相をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のＴｕｒｂｏＭａｓｓ Ｇｏｌｄ型ＧＣ−ＭＳ装置により分析した。その操作条件は以下の通りである。
【００３１】
カラム：ＳＰＢ−５（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製キャピラリーカラム、内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
キャリアガス：ヘリウム（２０ｍＬ／分で、１９：１のスプリット）
カラム温度：５０℃で１０分、１５℃／分で８０℃、２５℃／分で３００℃、３００℃で２分
インジェクター温度：２５０℃
試料注入量：１μＬ
培養液の濁度測定の結果、本菌株は培養３日目では生育しているとは言えないが培養６日目ではＯＤ６００値は比較的低いものの生育が確認できた。ＧＣ−ＭＳ分析においては、保持時間（２．８分）及び質量フラグメント開裂パターンが市販標準品（和光純薬）と一致したため、１−ペンタノールと同定した。１−ペンタノールの生成量は３、６、７日目の培養液においてそれぞれ３１、２０４、５１６ｐｐｍであった。以上の結果を表４にまとめた。反応収率は培養７日目で５．２％であった。
【００３２】
【表４】
【００３３】
次に、ｎ−ペンタン濃度を１、２、５％として、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株を培養し、その生育と１−ペンタノールの生成量を調べた。その結果、ｎ−ペンタン濃度が２及び５％では微生物のさらなる生育は認められなかったが、１−ペンタノールの生成量はｎ−ペンタン濃度が２及び５％でそれぞれ２７６、１６ｐｐｍであった。
【００３４】
実施例３
ゴルドニア・エスピー（ Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ） ＰＮ８ 株による ｎ− ペンタンからの １− ペンタノールの生成
前記実施例２に示した方法に準じて、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．） ＰＮ８株について１％ｎ−ペンタン存在下の生育とそれからの１−ペンタノールの生成を検討した。
培養液の濁度測定の結果、本菌株は培養１６時間目で生育しており、４８時間目までＯＤ６００値で０．２程度の生育を示した。他方、１−ペンタノールの生成量は、培養１６、２０、２６時間目においてそれぞれ１１、２６、２８ｐｐｍであったが、４８時間目では１２ｐｐｍに減少した。以上の結果を表５にまとめた。反応収率は培養２６時間目で０．２８％であった。
【００３５】
【表５】
【００３６】
次に、ｎ−ペンタン濃度を１、２、５％としてゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株を培養し、その生育と１−ペンタノールの生成量を調べた。その結果、ｎ−ペンタン濃度が２及び５％では微生物のさらなる生育は認められなかったが、１−ペンタノールの生成量はｎ−ペンタン濃度が２及び５％でそれぞれ２５、２９ｐｐｍであった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物が提供されるとともに、ｎ−ペンタンを原料とし、生物学的変換方法を利用して１−ペンタノールを製造する新規な方法を提供することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−ペンタノールの生物学的な製造方法、及びｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルコール類は種々の用途を有する重要な一群の工業用化学物質であり、その１つである１−ペンタノールも溶媒、エステル製造の中間体、食品添加物、芳香性物質として用いられている。
【０００３】
微生物を用いてアルコール類を製造する方法に関しては、例えば、アルカン資化微生物またはアルカン分解微生物を用いる方法（特許文献１参照）があり、さらにそれら微生物の酵素を用いる方法も知られている（特許文献２および特許文献３参照）。しかし、これらの文献には１−ペンタノールの製造について具体的な記載はない。またｎ−ペンタンを資化する微生物として、シュードモナス属微生物（非特許文献１および２参照）あるいはノカルディオイデス属微生物（非特許文献３参照）が知られているが、ｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換することは確かめられていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−１４２７６４号公報
【特許文献２】
特開２００１−２７５６５３号公報
【特許文献３】
米国特許５１９０８７０号公報
【非特許文献１】
テオ（Ｔｈｅｏ） Ｈ． Ｍ． スミツ（Ｓｍｉｔｓ）， マルチナ ロスリスベルガー（Ｍａｒｔｉｎａ Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ）， ベルナルド ウィトルト（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｗｉｔｈｏｌｔ） 及び ジャン（Ｊａｎ） Ｂ． ファン バイレン（ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ）、「グラム陰性及びグラム陽性菌でのアルカンハイドロキシレース遺伝子の分子スクリーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｌｋａｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ．） 」、エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、１９９９年、１巻、ｐ．３０７−３１７
【非特許文献２】
タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）， Ｊ、「シュードモナス・ブタノボラ・エスピー・ノブ）によるｎ−ブタンからの細胞内及び細胞外タンパク質の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｎ−ｂｕｔａｎｅ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ ｓｐ． ｎｏｖ．）」、アドバンシーズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８０年、２６巻、ｐ．１１７−１２７
【非特許文献３】
ナツコ・ハマムラ（Ｎａｔｓｕｋｏ Ｈａｍａｍｕｒａ）， クリス（Ｃｈｒｉｓ） Ｍ． イーガー（Ｙｅａｇｅｒ） 及びダニエル（Ｄａｎｉｅｌ） Ｊ． アルプ（Ａｒｐ）、「ノカルディオイデス・エスピー株ＣＦ８におけるアルカン酸化のための２つの異なるモノオキシゲナーゼ（Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｆｏｒ ａｌｋａｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＣＦ８．）」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイロクバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００１年、６７巻、ｐ．４９９２−４９９８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、ｎ−ペンタンを原料とし、生物学的変換方法を利用して１−ペンタノールを製造する新規な方法を提供すること、及びこの方法に利用可能なｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために広範な微生物群からｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換しうる微生物を探索した。その結果、細菌に分類されるミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物が前記変換能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
従って、本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）ｎ−ペンタンから１−ペンタノールを製造する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）ｎ−ペンタンの存在下で、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、かつｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換しうる菌株をインキュベーションする工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られるインキュベーション液から１−ペンタノールを採取する工程。
【０００８】
（２）前記ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株がミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である前記（１）記載の製造方法。
（３）前記ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株がゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６）である前記（１）記載の製造方法。
（４） ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物。
（５）ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である（４）に記載の微生物。
（６）ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物。
（７）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６） である（６）に記載の微生物。
【０００９】
本発明者らは、前述のように、細菌に分類されるミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株がｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換しうることを見出した。本発明者らが知る限り、これまで、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株およびゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株に、ｎ−ペンタンの１位水素原子を水酸基に変換して、１−ペンタノールを生産するものは知られていない。本発明者らが新たに見出した微生物は、いずれも土壌から分離されたミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株及びゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株である。
【００１０】
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１月３１日付けでＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＰＮ４として寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）。またゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株は、同じく独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年１月３１日付けでＧｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ＰＮ８として寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６））。
【００１１】
なお、上記２つの菌株の菌学的性状は表１〜３に示すとおりである。尚、各菌株の同定については後述の実施例において詳述する。
【００１２】
【表１】
【表２】
【表３】
本発明の製造方法では、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物であって、ｎ−ペンタンを１−ペンタノールへ変換する能力を有する微生物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できる。但し、好ましい微生物としては、いずれも土壌から分離されたミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株またはゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株を挙げることができる。
【００１６】
本発明の製造方法においては、まず工程（Ａ）において、出発原料（基質）であるｎ−ペンタンの存在下で、前記菌株がインキュベーションされる。このインキュベーションは、酸素含有雰囲気下で行うことができる。具体的には、菌株の好気的条件下でのインキュベーションは、培養液中に基質であるｎ−ペンタンを添加し、酸素を含む気体、例えば空気を通気しながら行うこともできる。
【００１７】
培養液への基質の添加は、培養開始前に行なう。
上記菌体は、例えば、上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができる。但し、通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００１８】
工程（Ａ）のインキュベーション及びそれに供する菌株の培養に用いられる培地としては、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としての、ｎ−アルカン、グルコース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、大豆油等を単独または組み合わせて用いることができる。但し、ｎ−ペンタンを水酸化し１−ペンタノールを生産する能力が高い菌体を得るためにはｎ−アルカン、中でも特にｎ−ペンタンを単独で用いることが好ましい。
【００１９】
窒素源としては、ペプトン、肉エキス、グルテンミール、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を単独または組み合わせて用い得る。その他、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化マンガン、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミンＢおよびビオチン等のビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。
【００２０】
工程（Ａ）のインキュベーション及びそれに供する菌株の培養条件は、該菌株が良好に生育して、ｎ−ペンタンを水酸化し１−ペンタノールを生産し得る範囲内で適宜選択し得る。例えば培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２６〜３０℃に保つのが良い。培養日数は１〜８日程度で、通常２〜５日程度である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。
【００２１】
工程（Ａ）において、基質となるｎ−ペンタンは、通常液体のまま培養液に添加する。 その添加量は、例えば、培養液の場合、培養液１Ｌ当り１０ｇ程度が好ましい。基質添加後は、２８℃で約１〜７日間、振とうあるいは通気攪拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより基質であるｎ−ペンタンを目的の１−ペンタノールに変換することができる。
【００２２】
次に、工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたインキュベーション液から目的の１−ペンタノールを採取する。１−ペンタノールを工程（Ａ）の反応混合物から単離するには、一般にアルカノール類を発酵産物から単離するために用いられる種々の既知精製手段（例えば、有機溶媒による抽出や蒸留）を選択、組合せて行うことができる。
例えば、インキュベーション液にジエチルエーテル、酢酸エチル等の有機溶媒を加えて撹拌し、１−ペンタノールを抽出する。このときインキュベーション液に塩類（例えば、塩化ナトリウム等）、酸類（例えば、硫酸等）を加えてインキュベーション液のイオン強度を高めると１−ペンタノールの有機溶媒への抽出率が向上する。その後、用いた有機溶媒と１−ペンタノールの沸点の差を利用して蒸留し、目的の１−ペンタノールを精製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。
【００２４】
実施例１
微生物の取得及び同定
［１］ｎ−ペンタン資化微生物の分離
ｎ−ペンタンを唯一の炭素源とした培地を用いて集積培養を行ない、ｎ−ペンタン資化微生物を弊社の工場プラント周辺の土壌から２株分離した。この２株の微生物をＰＮ４株及びＰＮ８株と命名した。その詳細を以下に示した。
（１）培地組成
炭素源のｎ−ペンタンを下記の組成の無機塩類溶液に加えたものを培地とした。ｎ−ペンタンについては予め別にろ過滅菌して、液体培地（スクリューキャップ付試験管を用いて調製）の際はそのまま液体として添加した。平板培地（１．５％寒天及びシャーレを用いて調製）の際は、小型バイアルに詰めた脱脂綿にｎ−ペンタンを染み込ませ蒸気として培地系へ供給した。ｎ−ペンタンの培地系への添加は、微生物の植菌後に行なった。
【００２５】
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０ ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ
ＮａＣｌ ５．０ ｇ
微量ミネラル溶液 １．０ ｍＬ
脱イオン水 １０００ｍＬ
但し、微量ミネラル溶液の組成は次の通りである（脱イオン水１０００ｍＬ当りの各成分量を表記）。
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ
ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０００ｍｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ
【００２６】
（２）培養条件
液体培養は２８℃にて回転数２２０ｒｐｍで振とうして行ない、平板培養は２８℃にて静置して行なった。
【００２７】
（３）分離手順
▲１▼滅菌水２ｍＬにミクロスパーテル１杯分の土壌を懸濁して、その懸濁液の１白金耳分を前記平板培地に塗布し最長１１日間まで微生物を培養した。
▲２▼生育してきた微生物をｎ−ペンタンを供給する系と供給しない系でそれぞれ平板培養し、前者の系における生育が後者の系におけるそれと比べて良好な微生物を分離した。
▲３▼分離微生物について、１％ｎ−ペンタンの有無による液体培地での生育を同様に比較した。まず分離微生物をブイヨン（肉汁）液体培地２ｍＬで前培養（２８℃、２２０ｒｐｍ）し、この培養物１０μＬをｎ−ペンタンが存在する系と存在しない系の各液体培地２ｍＬに植菌して最長１１日間培養した。
▲４▼上記▲３▼において、ｎ−ペンタン存在下で良好に生育した微生物をｎ−ペンタン資化微生物とした。
【００２８】
［２］取得したｎ−ペンタン資化微生物の同定
分離されたｎ−ペンタン資化微生物のゲノムＤＮＡをＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ及びＦａｓｔ ＤＮＡ Ｋｉｔ（フナコシ社）を用いて抽出した。この抽出ＤＮＡを鋳型として、９Ｆ：５’−ＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ、５３６Ｒ：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧプライマー及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲ反応により、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部（５００ｂｐ）を増幅した。増幅産物の塩基配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析し、系統解析を行なった。その結果、ＰＮ４株はミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌に、ＰＮ８株はゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属細菌に近縁であることが示唆された。
これら２株は新規なｎ−ペンタン資化微生物と考えられた。さらに、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株はｎ−アルカン資化微生物としても新規であると考えられた。
【００２９】
［３］取得したｎ−ペンタン資化微生物の各種ｎ−アルカンの資化性
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．） ＰＮ４株及びゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株について、それぞれの菌株の１白金耳量の菌体を保存用スラントからブイヨン液体培地２ｍＬに植菌し、２８℃及び２２０ｒｐｍで３日間の前培養を行なった。この前培養物１０μＬを１％の各種ｎ−アルカン（炭素数５〜１６）を含む液体培地２ｍＬに添加して最長８日間培養した。その結果、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株は炭素数５のｎ−ペンタンの他に炭素数１０〜１６のｎ−アルカンで、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株は供試した全てのｎ−アルカンで良好な生育を示した。
【００３０】
実施例２
ミクロバクテリウム・エスピー（ Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ） ＰＮ４ 株による ｎ− ペンタンからの １− ペンタノールの生成
ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株を保存用スラントからブイヨン液体培地２ｍＬに１白金耳分の菌量を植菌し、２８℃及び２２０ｒｐｍで３日間の前培養を行なった。この前培養物１０μＬを１％ｎ−ペンタンを含む液体培地２ｍＬに添加して培養した。
培養液を経時的に採取して、培養液の濁度の測定、ｎ−ペンタン代謝産物の同定及び定量を行なった。培養液の濁度は生育した微生物の菌体濃度の指標であり、６００ｎｍ光を用いて測定しＯＤ６００で表した。代謝産物は培養液から抽出してガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）により検出及び定量した。培養液０．７ｍＬに飽和塩化ナトリウム水溶液０．７ｍＬと酢酸エチル（内部標準物質として３０ｐｐｍの１，１２−ドデカンジオールを含有）１．４ｍＬを添加し１０分間激しく振盪した。この混合液を遠心分離（３，０００ｒｐｍで５分間）して、上層の酢酸エチル１．０ｍＬを回収した。この酢酸エチル相をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のＴｕｒｂｏＭａｓｓ Ｇｏｌｄ型ＧＣ−ＭＳ装置により分析した。その操作条件は以下の通りである。
【００３１】
カラム：ＳＰＢ−５（Ｓｕｐｅｌｃｏ社製キャピラリーカラム、内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
キャリアガス：ヘリウム（２０ｍＬ／分で、１９：１のスプリット）
カラム温度：５０℃で１０分、１５℃／分で８０℃、２５℃／分で３００℃、３００℃で２分
インジェクター温度：２５０℃
試料注入量：１μＬ
培養液の濁度測定の結果、本菌株は培養３日目では生育しているとは言えないが培養６日目ではＯＤ６００値は比較的低いものの生育が確認できた。ＧＣ−ＭＳ分析においては、保持時間（２．８分）及び質量フラグメント開裂パターンが市販標準品（和光純薬）と一致したため、１−ペンタノールと同定した。１−ペンタノールの生成量は３、６、７日目の培養液においてそれぞれ３１、２０４、５１６ｐｐｍであった。以上の結果を表４にまとめた。反応収率は培養７日目で５．２％であった。
【００３２】
【表４】
次に、ｎ−ペンタン濃度を１、２、５％として、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）ＰＮ４株を培養し、その生育と１−ペンタノールの生成量を調べた。その結果、ｎ−ペンタン濃度が２及び５％では微生物のさらなる生育は認められなかったが、１−ペンタノールの生成量はｎ−ペンタン濃度が２及び５％でそれぞれ２７６、１６ｐｐｍであった。
【００３４】
実施例３
ゴルドニア・エスピー（ Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ） ＰＮ８ 株による ｎ− ペンタンからの １− ペンタノールの生成
前記実施例２に示した方法に準じて、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．） ＰＮ８株について１％ｎ−ペンタン存在下の生育とそれからの１−ペンタノールの生成を検討した。
培養液の濁度測定の結果、本菌株は培養１６時間目で生育しており、４８時間目までＯＤ６００値で０．２程度の生育を示した。他方、１−ペンタノールの生成量は、培養１６、２０、２６時間目においてそれぞれ１１、２６、２８ｐｐｍであったが、４８時間目では１２ｐｐｍに減少した。以上の結果を表５にまとめた。反応収率は培養２６時間目で０．２８％であった。
【００３５】
【表５】
次に、ｎ−ペンタン濃度を１、２、５％としてゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ． ）ＰＮ８株を培養し、その生育と１−ペンタノールの生成量を調べた。その結果、ｎ−ペンタン濃度が２及び５％では微生物のさらなる生育は認められなかったが、１−ペンタノールの生成量はｎ−ペンタン濃度が２及び５％でそれぞれ２５、２９ｐｐｍであった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する新規な微生物が提供されるとともに、ｎ−ペンタンを原料とし、生物学的変換方法を利用して１−ペンタノールを製造する新規な方法を提供することができる。
Claims (7)
- ｎ−ペンタンから１−ペンタノールを製造する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）ｎ−ペンタンの存在下で、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、かつｎ−ペンタンを１−ペンタノールに変換しうる菌株をインキュベーションする工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られるインキュベーション液から１−ペンタノールを採取する工程。 - 前記ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株がミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である請求項１記載の製造方法。
- 前記ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する菌株がゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６）である請求項１記載の製造方法。
- ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物。
- ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＰＮ４株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９７）である請求項４に記載の微生物。
- ｎ−ペンタンの１−ペンタノールへの変換能を有する、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物。
- ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＰＮ８株 （ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９６） である請求項６に記載の微生物。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN115109717A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-09-27 | 自然资源部第三海洋研究所 | 高效降解聚苯乙烯塑料的戈登氏菌属菌株 |
-
2003
- 2003-02-27 JP JP2003050682A patent/JP2004254630A/ja active Pending
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| CN115109717A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-09-27 | 自然资源部第三海洋研究所 | 高效降解聚苯乙烯塑料的戈登氏菌属菌株 |
| CN115109717B (zh) * | 2022-05-19 | 2023-05-30 | 自然资源部第三海洋研究所 | 高效降解聚苯乙烯塑料的戈登氏菌属菌株 |
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