CN110869487A - 用于萜类化合物产物的微生物生产的代谢工程化 - Google Patents
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Abstract
在各个方面和实施方案中，本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的细菌菌株和方法。本发明提供了具有改善的通过MEP途径的碳通量的细菌菌株，从而通过用碳源诸如葡萄糖发酵来增加萜烯和/或萜类化合物产物产率。
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背景技术
食品和饮料行业以及诸如香水、化妆品和医疗保健行业等其他行业通常使用萜烯和/或萜类化合物产物，包括用作风味剂和芳香剂。但是，因素诸如：(i)植物原料的可用性和高价格；(ii)植物中相对较低的萜烯含量；以及(iii)在工业规模上生产足够量的萜烯产物的繁琐且低效的提取方法，这些原因都刺激了使用与植物无关的系统生物合成萜烯的研究。因此，已经花费了很多努力来开发用于对微生物进行工程化以将诸如葡萄糖的可再生资源转化为萜类化合物产物的技术。与传统方法相比，微生物具有快速生长的优势，而不需要土地来维持发育。
对于必需的类异戊二烯前体异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，存在两种主要的生物合成途径：甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径。MVA途径存在于大多数真核生物、古细菌和少数真细菌中。MEP途径存在于真细菌、植物的叶绿体、蓝细菌、藻类和顶复门寄生虫中。大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌利用MEP途径合成IPP和DMAPP代谢前体。虽然MEP途径提供了比MVA途径理论上更好的化学计量产率，但是大肠杆菌和其他细菌中的MEP途径具有多种内在调节机制，其控制和/或限制通过该途径的碳通量。参见Zhao等人，Methylerythritol Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis，Annu Rev.Biochem.2013；82：497-530；Ajikumar PK，等人，Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.Science2010；330-70-74。
在细菌系统中以工业规模生产萜烯和萜类化合物需要用于改善通过MEP途径的碳通量的微生物菌株和方法。
发明内容
在各个方面，本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的方法和细菌菌株(诸如大肠杆菌)。在某些方面，本发明提供了具有改善的通过MEP途径的碳通量的细菌菌株，从而通过用碳源(诸如葡萄糖)发酵来增加萜烯和/或萜类化合物产物产率。例如，在一些实施方案中，所述方法包括提供一种细菌菌株，其通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物。当用碳源(诸如葡萄糖)培养时，细菌菌株通过MEP途径代谢大于1％的进入糖酵解的碳，并且在各种实施方案中，通过MEP途径代谢大于15％的进入糖酵解的碳(大于15％的“MEP碳”)。
在各种实施方案中，本发明涉及“调”低细菌生产菌株中一种或多种竞争性酶或途径的表达或活性，诸如泛醌合成途径，而对菌株生长或活力没有明显或可测量的影响。在一些实施方案中，降低IspB酶的表达或活性，任选地通过修饰核糖体结合序列(RBS)、启动子或氨基酸序列或用IspB直系同源物替换进行。
可替代地或另外，本发明涉及增加Fe-S簇蛋白的可用性或活性，以便支持Fe-S酶IspG和/或IspH的更高活性，任选地通过改变isc操纵子的表达和/或通过ryhB小RNA的缺失进行。
可替代地或另外，在一些实施方案中，本发明涉及通过过表达和/或通过选择一种或多种有益突变体或直系同源物来调节IspG和/或IspH的活性。此类突变体或直系同源物可以通过沿MEP途径进一步向下拉动碳来增加MEP碳。可替代地或另外，如通过代谢组学评估的MEP酶补充可以鉴定产生高MEP碳的MEP酶补充，其中碳沿所述途径进一步向下拉动到MEcPP中间体。
在某些实施方案中，细菌细胞产生一种或多种萜类化合物，诸如单萜类化合物、倍半萜类化合物和二萜类化合物等。此类萜类化合物可用于香料(例如，广藿香醇)、风味剂行业(例如，诺卡酮)、甜味剂(例如，甜菊醇糖苷)或治疗剂(例如，紫杉醇)。宿主细胞通常含有重组下游途径，其由IPP和DMAPP前体产生萜烯或萜类化合物。
回收的萜烯或萜类化合物可以掺入产品(例如，消费产品或工业产品)中。例如，所述产品可以是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。在本发明的实施方案中产生的较高产率可以提供显著的成本优势以及萜烯或萜类化合物成分的可持续性和质量控制。
在其他方面，本发明提供细菌细胞，诸如大肠杆菌，其具有一种或多种增加MEP碳的遗传修饰，如本文详细描述的。
本发明的其他方面和实施方案将根据以下对本发明的详细描述而是显而易见的。
附图说明
图1是通过MEP途径产生萜类化合物的示意图。示出了一个细菌细胞，所述细菌细胞吸收葡萄糖作为碳源。葡萄糖通过TCA循环转化为生物质，或通过MEP途径传送至所需的萜类化合物产物。葡萄糖进入细胞并转化为丙酮酸(PYR)，其中甘油醛-3-磷酸作为中间体(GAP)。将PYR和GAP组合以制备DOXP，其转化为MEP并将所述途径致力于FPP(经过MEcPP)。DOX和ME分别是DOXP和MEP的去磷酸化产物。DOX、ME和MEcPP位于细胞外。被迫进入MEP途径的通量越多，在细胞外发现的这些产物就越多。这些副产物可以用作MEP途径中瓶颈的标记，并用于识别工程化目标。黑色箭头显示酶介导的对萜类化合物的生化反应，浅灰色箭头显示竞争性副产物，深灰色箭头显示产物在细胞外的转运，并且白色箭头简示了浓缩途径。
图2说明了对大肠杆菌菌株底物的遗传修饰，以提高通过MEP途径进行的示例性萜类化合物产物(产物A)的萜类化合物产生。
图3示出了从菌株G2到菌株G4中对产物A菌株的修饰(参见图2)。这些修饰使碳能够在MEP生化途径中“向下游”移动，从而将中间体产物池从DOXP(和细胞外DOX)推动到MEP(和细胞外ME)。大的MEP途径中间体池的细胞外积累可以用于通知意图将碳通量沿所述途径向下推动并到MEcPP的工程化设计。图3示出了在从菌株G2到G4中观察到40％碳从DOX向ME转移的实验。
图4示出了对大肠杆菌菌株底物的遗传修饰，以提高通过MEP途径进行的产物B的萜类化合物产生。在高产克隆中鉴定pgi突变体修饰。
图5示出了来自转录物组分析实验的结果，其提供ryhB和isc操纵子参与的证据。响应于用于产生产物A或产物B的下游萜类化合物途径的安装，在大肠杆菌中，ryhB的表达上调，并且isc操纵子通常下调。
图6示出了ryhB和isc操纵子修饰的组合效果。鉴于铁和硫-硫(Fe-S)簇生物化学在MEP萜类化合物代谢中的重要性，进行对生产底物进行的一系列修饰以增加产物(产物A)的滴度。按顺序，使G2产物A底物缺失ryhB，然后用组成型启动子序列替换iscS的野生型启动子，并且使天然iscR基因缺失。在每种修饰的情况下，产物A的滴度增加。
图7说明了IspG酶工程化。基于结构模型的预测变化，设计野生型大肠杆菌IspG基因的突变文库(图7A)。设计文库以改善动力学、蛋白质稳定性或菌株稳健性。在每个单独的文库中在序列中的离散位置处引入特定变体(图7B)。使用～1000种不同的ispG直系同源物的序列比对来设计总计9个组合文库。
图8示出了对野生型大肠杆菌ispG基因突变文库的筛选，以替换制备产物A的三个菌株中的野生型基因。对整合文库的初步筛选引起20％-40％的引入变体，从而产生提高的产品滴度，观察到萜类化合物产物增加1.5倍。
图9示出了由初步筛选产生的先导物的验证和二次重新筛选的结果。将G11变体并入产物A和产物B两者的生产底物中。
图10示出了在生产菌株中将野生型ispG基因补充所选的突变形式的结果。所述补充引起产物滴度的20％增加。无论萜类化合物产物如何，改善的完全转化表明可以支持通过MEP途径进行任何萜类化合物的高水平生产的“通用底物”的可能性。
图11示出了通过修饰天然RBS序列来调节ispB的翻译率，这改善了萜类化合物产物的生产。在天然ispB RBS上引入野生型(WT)ispB RBS(核糖体结合位点)的各种突变体以调节蛋白质翻译。这些RBS变化影响萜类化合物生产，其中一些引起生产改善。从初步筛选中鉴定若干先导物，得到具有产物A的1.7x改善和产物B的2x改善的菌株。最左列是亲本对照，其设定值为1。重复并验证先导物命中，进行完全测序，并且然后转移到每个产物菌株的先导代中。
图12示出了通过复制的二次筛选验证的四种突变体菌株，从而证实了在ispB RBS的初级筛选中观察到的改善。
图13示出了MEP基因的过表达导致产物滴度的下降。与G5亲本水平相比，增加MEP基因的表达水平引起产生的萜类化合物产物A减少～50％，更强表达(+++)相对于更弱表达(+)加剧降低。相比之下，向表达dxr的操纵子添加ispG和ispH基因使得能够将产物滴度恢复至亲本水平，从而指示在此途径中小心平衡基因表达实现高萜类化合物产物滴度。
图14示出了虽然滴度下降，但更多的碳进入MEP途径中。虽然MEP途径补充工作显示产物A滴度响应于基因表达变化而下降或保持不变，但中间体MEP途径代谢物的浓度显著增加更多。针对真实标准通过液相色谱法和质谱法定量MEP碳代谢物，并且发现与对照G5菌株相比，MEP碳代谢物在补充菌株中显著增加。以摩尔浓度表示所得的代谢物浓度，以关注通过MEP途径到所需产物的碳分子的流量。在细胞外观察到MEP中间体的大部分，DOX、ME和MEcPP代表大部分；主要的细胞内产物是CDP-ME，在补充菌株中观察到增加的积累。虽然dxr过表达导致产物A滴度下降2x，但进入MEP途径并作为中间体积累的碳量达到6x；即，更多的碳进入MEP途径，但更少的碳排出。此外，虽然G5亲本主要积累DOX(和一些MEcPP)，但dxr(将DOXP转化为MEP)的增加使碳沿所述途径移动，从而使得更多碳作为ME和MEcPP汇集在细胞外。在dxr之上增加ispE表达将MEP途径中的碳量进一步增加至相对于G5亲本的几乎10x，并且几乎将所有碳向下游转移至MEcPP。有趣的是，除dxr之外过表达ispG和ispH给出与仅过表达dxr非常相似的中间体分布，尽管产物滴度在前一种情况下加倍。
图15示出了如果图14中在MEP途径中积累的所有碳成功转化为最终产物而产生的产物A的总量。数据显示补充空质粒相对于表达MEP途径基因的相同质粒骨架的G5菌株的生产潜力(从+到+++增加的不同表达水平)。将MEP途径中的碳总量(如图14中定量)转化为产物A等效物显示，通过所述途径的碳通量在补充的情况下增加，在这些菌株中实现几乎9x更多的产物A潜力。
具体实施方式
在各个方面，本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的细菌菌株和方法。在某些方面，本发明提供了具有改善的通过MEP途径的碳通量的细菌菌株，从而通过用碳源(诸如葡萄糖)发酵来增加萜烯和/或萜类化合物产物产率。例如，在一些实施方案中，所述方法包括提供一种细菌菌株，其通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物。当用碳源(诸如葡萄糖)培养时，细菌菌株通过MEP途径代谢大于1％的进入糖酵解的碳(大于1％的“MEP碳”)。在一些实施方案中，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约17％或至少约20％的进入糖酵解的碳变成MEP碳。在又其他实施方案中，至少约22％或至少约25％或至少约27％的进入糖酵解的碳变成MEP碳。以葡萄糖为碳源，进入MEP途径的碳的理论最大值在大肠杆菌中为约30％。在一些实施方案中，菌株基本上达到此MEP碳的理论最大产率，这意味着菌株提供最大理论产率的至少约80％。文献中报告的MEP碳的先前产率小于1％。参见Zhou K，Zou R，Stephanopoulos G，Too H-P(2012)Metabolite Profiling Identified Methylerythritol Cyclodiphosphate Efflux as a Limiting Step in Microbial Isoprenoid Production.PLoS ONE 7(11)：e47513.doi：10.1371/journal.pone.0047513。
在各种实施方案中，微生物菌株是选自埃希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、红细菌属(Rhodobacter spp.)、发酵单胞菌属(Zymomonas spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的细菌。在一些实施方案中，细菌物种选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在一些实施方案中，细菌菌株是大肠杆菌。
宿主细菌细胞表达产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的MEP途径。葡萄糖进入细胞并转化为丙酮酸(PYR)，其中甘油醛-3-磷酸作为中间体(G3P或GAP)。将G3P和PYR组合以制备1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)，其转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)并且使所述途径致力于IPP和DMAPP。DOX、ME和MEcPP位于细胞外。进入MEP途径的通量越多，在细胞外发现的这些产物就越多。参见图1。
MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸)途径也称为MEP/DOXP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸)途径或非甲羟戊酸途径或不依赖甲羟戊酸的途径。所述途径通常涉及以下酶的作用：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr或IspC)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(IspH)以及异戊烯基二磷酸异构酶(Idi)。MEP途径以及构成MEP途径的基因和酶描述于US 8，512，988中，其特此以引用的方式整体并入。因此，构成MEP途径的基因包括dxs、dxr(或ispC)、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispA。
IPP和DMAPP(MEP途径的产物)是萜烯和萜类化合物的前体，包括单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物和三萜类化合物，其在风味剂、芳香剂、化妆品和食品领域中具有特别的用途。萜烯和萜类化合物的合成通过异戊二烯基转移酶(例如GPPS、FPPS或GGPPS)的作用将IPP和DMAPP前体转化为香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)或香叶基香叶基二磷酸(GGPP)进行。此类酶是已知的，并且描述于例如US 8,927,241、WO 2016/073740和WO 2016/029153中，其特此以引用的方式整体并入。
如本文所用，术语“MEP碳”是指作为MEP途径的输入、中间体、代谢物或产物存在的总碳。代谢物包括衍生物，诸如分解产物，以及磷酸化和去磷酸化的产物。MEP碳包括下游途径(包括萜类化合物合成途径)的产物和中间体。出于本公开的目的，MEP碳包括MEP途径的以下输入、中间体和代谢物：D-甘油醛3-磷酸、丙酮酸、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸、1-脱氧-D-木酮糖、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-5-磷酸、2-C-甲基-D-赤藓糖醇、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇、2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇、2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸、异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。MEP碳还包括由细胞表达的下游萜类化合物合成途径中的中间体和关键代谢物。虽然同一性将根据所采用的途径和酶而变化，但此类产物包括：香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)或香叶基法呢基二磷酸(FGPP)；它们的单磷酸化形式，香叶基磷酸、法呢基磷酸、香叶基香叶基磷酸或香叶基法呢基磷酸；它们的醇类，香叶醇、法呢醇、香叶基香叶醇或香叶基法呢醇；以及下游萜烯和萜类化合物产物。MEP碳还包括衍生自FPP或使用FPP的途径的化合物，包括角鲨烯、十一异戊二烯基二磷酸(UPP)、十一异戊二烯基磷酸、十异戊二烯基二磷酸(OPP)、4-羟基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、2-十异戊二烯基苯酚、3-十异戊二烯基苯-1，2-二醇、2-甲氧基-6-十异戊二烯基-2-甲氧基-1，4-苯醌醇、6-甲氧基-3-甲基十异戊二烯基-1，4-苯醌醇、3-去甲基泛醇-8、泛醇-8、泛醌、2-羧基-1，4-萘醌醇、去甲基甲基萘醌-8、甲基萘醌-8和甲基萘醌。MEP碳还包括异戊烯醇、戊烯醇、异戊烯基磷酸和二甲基烯丙基磷酸代谢物。MEP碳还包括异戊二烯化的代谢物和蛋白质，包括异戊二烯化的吲哚。MEP碳(上述中间体和代谢物)可以通过质谱法(MS)定量，诸如通过三重四极杆(QQQ)质量检测器的串联质谱法(MS/MS)。示例性系统是Agilent6460 QQQ；可替代地，具有定量飞行时间(QTOF)、飞行时间(TOF)或离子阱质量检测器。
可以根据本发明产生的示例性萜烯或萜类化合物产物描述于US 8,927,241中，其特此以引用的方式并入，并且包括：α-愈创木烯、α-甜橙醛、紫穗槐二烯、青蒿酸、β-红没药烯、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、香叶醇、柠檬烯、薄荷醇、薄荷酮、香叶烯、诺卡酮、诺卡醇、广藿香、胡椒酮、莎草薁酮、玫瑰醚、桧烯、甜菊醇、甜菊醣苷(包括瑞鲍迪甙D(Rebaudioside D)或瑞鲍迪甙M)、紫杉烯、百里酚以及瓦伦烯。用于在大肠杆菌中重组构建途径的酶描述于US 8,927,241，WO 2016/073740和WO 2016/029153中，其特此以引用的方式并入。
在一些实施方案中，微生物菌株具有dxs、ispD、ispF和/或idi基因中的一种或多种的至少一个额外拷贝，其可以是速率限制的，并且可以在质粒上或整合到细菌染色体中由操纵子或模块表达。在一些实施方案中，细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子或模块。在这些实施方案中，与野生型相比，菌株提供通过MEP途径的增加的通量。如下所述的MEP途径的补充可以是除dxs、ispD、ispF和/或idi过表达之外的补充。
在各种实施方案中，本发明涉及“调”低一种或多种竞争性酶或途径的表达或活性，诸如泛醌合成途径或IspB酶，其竞争FPP。可替代地或另外，本发明涉及增加Fe-S簇蛋白的可用性或活性，以便支持作为Fe-S酶的IspG和IspH的更高活性。可替代地或另外，在一些实施方案中，本发明涉及例如通过选择有益突变体或直系同源物来过表达IspG和/或IspH或调节IspG和/或IspH的表达或活性，所述有益突变体或直系同源物通过沿所述途径进一步向下拉动碳而具有增加MEP碳的作用。可替代地或另外，如通过代谢组学评估的进一步MEP酶补充可以鉴定产生高MEP碳的MEP酶补充。以下详细地描述这些和其他实施方案。
在各种实施方案中，微生物菌株以葡萄糖作为碳源提供MEP碳的明显增加，而对于菌株生长和活力没有明显影响，例如，如通过培养物中的光密度(O.D.)、峰值O.D.和/或生长速率来确定。例如，尽管如本文所述对一种或多种必需基因或途径进行修饰，但微生物菌株的峰值O.D.没有表现出超过约20％的下降，或在一些实施方案中，峰值O.D.没有表现出超过约15％、或超过约10％、或超过约5％的下降。在一些实施方案中，所述菌株对菌株生长或活力没有表现出可测量的影响，如例如通过测量生长速率或峰值O.D.所确定的。
在一些实施方案中，例如通过降低使用IPP和FPP底物的IspB的表达或活性来下调泛醌生物合成途径。ispB基因编码十异戊二烯基二磷酸合酶，其控制泛醌的合成，并且因此直接与FPP合酶竞争IPP和DMAPP前体。IspB是大肠杆菌中的必需基因。参见Kainou T，等人，Dimer formation of octaprenyl-diphosphate Synthase(IspB)is essential for chain length determination of ubiquinone，J.Biol.Chem.276(11)：7867-7883(2001)。然而，通过修饰ispB RBS序列并调低mRNA的翻译来降低细胞中IspB酶的量可以使碳通量朝向萜类化合物重组途径转移，而对菌株的生长和活力没有明显或可测量的影响。在一些实施方案中，IspB活性或表达降低至亲本菌株的约80％或更少、或亲本菌株的约70％或更少、或亲本菌株的50％或更少、或亲本的40％或更少、或亲本菌株的25％或更少。
Shine-Dalgarno(SD)序列是细菌中的核糖体结合位点，并且通常位于起始密码子AUG上游约8个碱基处。RNA序列通过将核糖体与起始密码子对齐来帮助将核糖体募集到信使RNA(mRNA)以启动蛋白质合成。在一些实施方案中，ispB基因中的六碱基SD序列改变为CGTGCT或CGTGCC，或其具有CGTGCT或CGTGCC的一个或两个核苷酸变化的修饰。在此类实施方案中，调低IspB翻译，从而允许增加的到萜类化合物生物合成的碳通量，而对大肠杆菌生长和活力没有明显或可测量的影响。
在一些实施方案中，通过改变ispB基因的表达，即通过改变启动子区域以减少转录，或通过增强ispB RNA或编码蛋白质的降解速率来改变IspB的表达或活性。在一些实施方案中，通过ispB氨基酸序列的突变或选择在细菌菌株中具有降低的活性的ispB直系同源物来降低ispB酶的活性。来自大肠杆菌的野生型IspB氨基酸序列在本文中提供为SEQ IDNO：3。在一些实施方案中，对IspB氨基酸序列(SEQ ID NO：3)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以降低蛋白质的活性，包括对底物结合位点和/或活性位点的一个或多个取代。在一些实施方案中，氨基酸序列(无论是直系同源物或突变体序列)与SEQ IDNO：3具有约50％至约99％的序列同一性，或与SEQ ID NO：3具有约60％至约99％的序列同一性，或与SEQ ID NO：3具有约70％至约99％的序列同一性，或与SEQ ID NO：3具有约80％至约99％的序列同一性，或与SEQ ID NO：3具有约90％至约99％的序列同一性，或与SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有约95％至约99％的序列同一性。此类突变体或直系同源物可以通过以下获知：Kainou T，等人，Dimer formation of octaprenyl-diphosphate Synthase (IspB)is essential for chain length determination of ubiquinone，J.Biol.Chem.276(11)：7867-7883(2001)；或Han，等人，Crystal structures of ligand- bound octaprenyl pyrophosphate synthase from Escherichia coli reveal the catalytic and chain-length determining mechanisms Proteins 2015 Jan；83(1)：37-45。
在一些实施方案中，细菌菌株支持Fe-S酶(诸如IspG和/或IspH)的增强的生物学，以潜在地提高菌株中MEP碳的量。MEP途径中的IspG和IspH酶是铁-硫簇酶，这意味着它们需要Fe-S离子在其活性位点中特殊排列来起作用和进行其化学反应。这些Fe-S簇对生命至关重要，并且对氧气和氧化非常敏感，氧气和氧化使它们失活。在厌氧或好氧生长条件下，iscR抑制编码Fe-S簇生物发生途径的基因的操纵子iscRSUA的转录。通过iscR对isc操纵子的抑制响应于培养基中对于Fe-S簇的需求，因为iscR必须与Fe-S基团结合才能抑制isc操纵子的转录。在厌氧条件下，对Fe-S基团的需求低于在好氧条件下，并且因此对操纵子的抑制比在好氧条件下更强。iscR识别并结合两个与启动子序列重叠的DNA结合位点，以抑制iscRSUA操纵子的转录。当蛋白质与这些位点结合时，RNA聚合酶很可能不能与启动子区域结合以开始转录。
在一些实施方案中，使用强、中或弱细菌启动子在用于萜烯或萜类化合物生产的条件下表达isc操纵子。可以改变和调节启动子的强度以改善萜类化合物产物。启动子可以是组成型或诱导型。在一些实施方案中，启动子是强组成型启动子。
在使isc操纵子的启动子和第一基因(即iscR)缺失并用组成型或诱导型启动子替换它以驱动操纵子中剩余基因的表达时，获得了铁-硫簇酶性能的改善。因此，在一些实施方案中，细菌菌株(例如，大肠杆菌)含有iscR缺失，具有iscSUA的诱导型或组成型过表达。大肠杆菌的诱导型和组成型启动子是已知的，并且可由本领域技术人员选择以调节操纵子的表达。在各种实施方案中，iscR基因完全或部分缺失，或通过对RBS或起始密码子的一个或多个突变来失活。在一些实施方案中，iscR基因通过氨基酸突变来失活。在各种实施方案中，对Fe-S酶调节的修饰增加MEP碳而对菌株的生长或活力没有明显或可测量的影响，包括通常用于在大肠杆菌中生产萜类化合物的好氧或微氧条件下。isc操纵子进一步在以下中查看：Santos JA，What a difference a cluster makes：The multifaceted roles of IscR in gene regulation and DNA recognition，Biochim.Biophys.Acta 1854(9)：1102-12(2015)。
在一些实施方案中，大肠杆菌含有ryhB缺失或失活。RyhB是一种小RNA，其作用来通过下调含铁蛋白(包括TCA循环和有氧呼吸链的酶)的表达来在低铁条件下减少铁消耗。此外，ryhB促进铁载体肠杆菌素的合成。RyhB是长度为大约90nt的小RNA。RyhB促进iscR与iscS开放阅读框之间的多顺反子iscRSUA mRNA的切割。编码IscR的5′片段保持稳定，而iscSUA 3′片段似乎被降解。参见Mandin等人，(2016)A regulatory circuit composed of a transcription factor，IscR，and a regulatory RNA，RyhB，controls Fe-S cluster delivery，mBio 7(5)：e00966-16。在各种实施方案中，ryhB的缺失或失活(例如，通过核苷酸突变)增加MEP碳，而对菌株生长或活力没有明显或可测量的影响，包括在用于筛选菌株或生产萜类化合物的好氧、微氧或厌氧条件下。
在一些实施方案中，例如通过补充额外酶拷贝(无论是在质粒上还是整合到基因组中)来改变或平衡MEP酶表达或活性，以使碳沿所述途径进一步向下移动。如图13所示，MEP基因的过表达可以导致产物滴度的下降。例如，与G5亲本水平相比，增加MEP基因的表达水平引起产生的萜类化合物产物A减少～50％，更强表达(+++)相对于更弱表达(+)加剧降低。相比之下，向表达dxr的操纵子添加ispG和ispH基因使得能够将产物滴度恢复至亲本水平，从而指示在此途径中小心平衡基因表达实现高萜类化合物产物滴度。
虽然产物A滴度在MEP补充的情况下下降或保持不变，但中间体MEP途径代谢物的浓度显著增加更多。在细胞外观察到MEP中间体的大部分，DOX、ME和MEcPP代表大部分；主要的细胞内产物是CDP-ME，在补充菌株中观察到增加的积累。虽然dxr过表达导致产物A滴度下降2倍，但进入MEP途径并作为中间体积累的碳量达到6倍；即，更多的碳进入MEP途径，但更少的碳排出。此外，虽然G5亲本主要积累DOX(和一些MEcPP)，但dxr(将DOXP转化为MEP)的增加使碳沿所述途径移动，从而使得更多碳作为ME和MEcPP汇集在细胞外。在dxr之上增加ispE表达将MEP途径中的碳量进一步增加至相对于G5亲本的几乎10倍，并且几乎将所有碳向下游转移至MEcPP。有趣的是，除dxr之外过表达ispG和ispH给出与仅过表达dxr非常相似的中间体分布，尽管产物滴度在前一种情况下加倍。
在一些实施方案中，细菌菌株含有dxr或其同源物或直系同源物和ispG和/或ispH的过表达，任选地具有ispD、ispE和ispF的过表达中的一种或多种。基因可以个别地过表达或在操纵子中过表达。额外拷贝可以由质粒表达或整合到基因组中。dxr的过表达将DOXP推至ME和MEcPP并将瓶颈推向下游。参见图1。在一些实施方案中，dxr和ispE(或其同源物、直系同源物或衍生物)过表达，其主要将DOXP推至MEcPP。参见图14。在将瓶颈转移至MEcPP后，可以观察到MEP途径电位增至三倍(图15)。
来自大肠杆菌的野生型Dxr氨基酸序列提供为SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，野生型dxr活性补充有一个或多个额外基因拷贝，其可以编码野生型酶，或可以编码具有一个或多个氨基酸修饰以增加酶活性或稳定性的非天然或修饰的酶(例如，一至十个独立地选自取代、插入和缺失的修饰)。在一些实施方案中，细菌菌株补充有比大肠杆菌酶具有更高活性的dxr直系同源物。
在一些实施方案中，细菌菌株表达流产布鲁氏菌(Brucella abortus)DRL酶(SEQID NO：8)，它是与大肠杆菌Dxr具有低序列同源性的Dxr样酶。Pérez-Gil，J.，等人，2012.Crystal structure of brucella abortus deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase-like(DRL)enzyme involved in isoprenoid biosynthesis.Journalof Biological Chemistry，287(19)，pp.15803-15809。在一些实施方案中，DRL酶具有一个或多个氨基酸修饰(例如，一至十个独立地选自取代、插入和缺失的修饰)，其针对在细菌宿主细胞中的活性和/或表达改善酶的特性。
例如，在各种实施方案中，细菌菌株过表达或补充有Dxr酶，其与SEQ ID NO：4或8具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：4或8的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，Dxr酶相对于Dxr或DRL氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：4或8)包含1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入，以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点和/或活性位点中的一个或多个的取代。此类突变体可以通过本领域可获得的酶结构来获知，包括Yajima S，等人，Structure of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in a quaternary complex with a magnesium ion，NADPH and the antimalarial drug fosmidomycin，Acta Cryst.F63，466-470(2007)和Perez-Gil，等人，Crystal structure of brucella abortus deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase-like(DRL)enzyme involved in isoprenoid biosynthesis，Journal of Biological Chemistry，287(19)：15803-15809(2012)。
在一些实施方案中，野生型IspE活性补充有一个或多个额外基因拷贝，其可以编码野生型酶，或可以编码具有一个或多个氨基酸修饰以增加酶活性或稳定性的修饰的酶(例如，一至十个独立地选自取代、插入和缺失的修饰)。在一些实施方案中，细菌菌株补充有比大肠杆菌或天然细菌酶具有更高活性的IspE直系同源物。大肠杆菌IspE氨基酸序列提供为SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，细菌菌株表达ispE或其衍生物、同源物或直系同源物的至少一个额外基因拷贝。在一些实施方案中，额外的IspE酶是大肠杆菌IspE或包含一个或多个氨基酸修饰(例如，一至十个独立地选自取代、插入和缺失的修饰)，其可以提供增加的酶活性和/或稳定性。
例如，在各种实施方案中，细菌菌株过表达或补充有IspE酶，其与SEQ ID NO：7具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少97％的序列同一性。
在一些实施方案中，菌株包括补充IspG和/或IspH。在一些实施方案中，额外的基因可以与天然基因相同或基本上相同，或者可以被修饰以增加活性，或者可以是具有与天然细菌(例如，大肠杆菌)酶相比更高活性的IspG或IspH直系同源物。例如，关于IspG，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：5具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约97％的序列同一性。在一些实施方案中，对IspG氨基酸序列(SEQ ID NO：5)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。可以通过构建同源性模型来获知对大肠杆菌或其他IspG的修饰。例如，用于构建大肠杆菌IspG同源性模型的合适同源物公开于：Lee M，等人Biosynthesis of isoprenoids： crystal structure of the[4Fe-4S]cluster proteinIspG.J Mol Biol.2010年12月10日；404(4)：600-10。
在一些实施方案中，IspG酶在选自以下的位置处含有一个或多个突变：V30、S32、T34、N35、R37、V59、V61、S62、V63、L83、V84、C104、L105、P131、I132、I134、A138、K143、F176、K177、V178、V180、A182、L205、I207、A210、G212、A213、L236、V238、A241、A242、D243、R259、S262、R263、I265、N266、F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289、S301、I302、I303、V306。在一些实施方案中，在选自以下的多个位置处进行修饰：(1)V30、S32、T34、N35、IR37；或(2)V59、V61、S62、V63、L83、V84；或(3)C104、L105、S301、I302、I303、V306；或(4)P131、I132、I134、A138、K143；或(5)F176、K177、V178、V180、A182；或(6)L205、I207、A210、G212、A213；或(7)L236、V238、A241、A242、D243；或(8)R259、S262、R263、I265、N266；或(9)F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289。
在一些实施方案中，IspG酶具有以下突变中的一个、两个、三个或全部：L205V、A210S、G212T和A213I。
此外，关于IspH，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：6具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，对IspH氨基酸序列(SEQ ID NO：6)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。对IspH酶的修饰可以通过可用的IspH结构来获知，包括Grawert，T.，等人Structure of active IspH enzyme from Escherichia coli provides mechanistic insights into substrate reduction2009Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48：5756-5759。
在这些或其他实施方案中，并入pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)活性突变体(例如，具有降低的活性)以潜在地改变碳通量，并且可以提供产物滴度的进一步提高。在一些实施方案中，pgi部分缺失或失活。在一些实施方案中，pgi含有1至约30个氨基酸取代、插入和/或缺失(例如，约1至20个、或约1至10个氨基酸取代、插入和/或缺失)以针对产物滴度或MEP碳改变或调节酶的活性。
核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对来确定。此类比对可以用几种本领域已知的算法进行，诸如使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)，使用hmmalign(HMMER包，http：//hmmer.wustl.edu/)或使用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)。序列同一性的等级(序列匹配)可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。将类似的算法并入Altschul等人(1990)J.MolBiol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST多核苷酸搜索可以用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12。
BLAST蛋白质搜索可以用BLASTP程序进行，得分＝50，字长＝3。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述，利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，使用相应程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源映射技术补充，例如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics2003b，19 Suppl 1：154-162)或Markov随机场(Markov random fields)。
例如，“保守取代”可以基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来完成。20种天然存在的氨基酸可以分为以下六个标准氨基酸组：
(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；以及
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所用，“保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组的相同组中列出的另一种氨基酸交换。例如，由Glu交换Asp在如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，甘氨酸和脯氨酸可以基于它们破坏α-螺旋的能力而彼此取代。上述六组中的一些优选保守取代是以下子组内的交换：(i)Ala、Val、Leu和Ile；(ii)Ser和Thr；(ii)Asn和Gin；(iv)Lys和Arg；以及(v)Tyr和Phe。
如本文所用，“非保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸交换。
如本文所述的酶的修饰可以包括保守和/或非保守突变。
在一些实施方案中，“合理设计”涉及构建酶中的特定突变。合理设计是指将酶或相关酶的知识(诸如其反应热力学和动力学、其三维结构、其一个或多个活性位点、其一种或多种底物和/或酶与底物之间的相互作用)并入到特定突变的设计中。基于合理的设计方法，可以在酶中产生突变，然后可以针对于相对于对照水平增加的萜烯或萜类化合物的产生筛选突变。在一些实施方案中，可以基于同源性建模合理地设计突变。如本文所用，“同源性建模”是指由其氨基酸序列和相关同源蛋白质的三维结构来构建蛋白质的原子分辨率模型的过程。
在某些实施方案中，细菌细胞产生一种或多种萜烯或萜类化合物。萜类化合物，也称为类异戊二烯，是衍生自五碳异戊二烯单元(C5)的有机化学品。基于它们含有的异戊二烯单元的数量分类的萜类化合物的几个非限制性实例包括：半萜类化合物(1个异戊二烯单元)、单萜类化合物(2个异戊二烯单元)、倍半萜类化合物(3个异戊二烯单元)、二萜类化合物(4个异戊二烯单元)、二倍半萜类化合物(5个异戊二烯单元)、三萜类化合物(6个异戊二烯单元)、四萜类化合物(8个异戊二烯单元)和具有大量异戊二烯单元的多萜类化合物。在一个实施方案中，细菌宿主细胞产生选自单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物或三萜类化合物的萜类化合物。萜类化合物代表多样种类的分子，其提供了许多商业应用，包括食品和饮料行业以及香水、化妆品和保健行业。以举例的方式，萜类化合物可用于香料(例如广藿香醇)、香料行业(例如，诺卡酮)、甜味剂(例如，甜菊醇)或治疗剂(例如，紫杉醇)，并且许多通常从植物中提取。然而，萜类化合物分子在自然界中以ppm水平存在，并且因此需要大量收获以获得足够的量用于商业应用。
宿主细胞通常含有重组下游途径，其由IPP和DMAPP前体产生萜类化合物。萜烯诸如单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、二倍半萜(C25)和三萜(C30)衍生自异戊二烯基二磷酸底物、香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)、香叶基法呢基二磷酸(FGPP)和FPP，分别通过称为萜烯(萜类化合物)合酶的非常大的一组酶的作用衍生。这些酶通常被称为萜烯环化酶，因为反应产物被环化成各种单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜和三萜碳骨架产物。许多所得的碳骨架经细胞色素P450酶进行亚序列氧化，产生大量衍生物。
在二萜和倍半萜支架上可用的示例性细胞色素P450酶描述于WO 2016/073740和WO 2016/029153中，其特此以引用的方式并入。另外，在WO 2016/029153以及WO 2016/073740中描述了可用于本文所述的细菌菌株的细胞色素P450还原酶蛋白。
在一些实施方案中，本发明的产物是一种或多种氧化萜类化合物。如本文所用，术语“含氧萜类化合物”是指具有一个或多个氧合事件的萜烯支架，其产生对应的醇、醛、羧酸和/或酮。在一些实施方案中，细菌细胞产生至少一种选自松香二烯、松香酸、α-甜橙醛、青蒿酸、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、雷公藤红素、二十五烧醇(Ceroplastol)、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、葫芦烷、毛喉素、Gascardic Acid、香叶醇、Haslene、左旋海松酸、柠檬烯、羽扇豆醇、薄荷醇、薄荷酮、罗汉果苷、诺卡酮、诺卡醇、蛇孢假壳素A、广藿香、胡椒酮、瑞鲍迪甙D(RebD)、瑞鲍迪甙M(RebM)、桧烯、甜菊醇、甜菊醇糖苷、紫杉烯、百里酚和熊果酸的萜类化合物。
在一些实施方案中，升级萜类合酶以增强酶的动力学、稳定性、产物分布和/或温度耐受性，例如在WO 2016/029153和WO 2016/073740中公开，其特此以引用的方式并入。
在另一个实施方案中，细菌细胞产生瓦伦烯和/或诺卡酮。在这种实施方案中，细菌细胞可以表达生物合成途径，其还包括法呢基二磷酸合酶、瓦伦烯合酶和瓦伦烯氧化酶。法呢基二磷酸合酶(FPPS)由异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)产生法呢基二磷酸。示例性法呢基二磷酸合酶是酿酒酵母的ERG20(NCBI登录号P08524)和大肠杆菌ispA。瓦伦烯合酶产生倍半萜支架并描述于例如US 2012/0107893、US 2012/0246767和US 7,273,735中，其特此以引用的方式整体并入。用于生产包含瓦伦烯和/或诺卡酮的萜类化合物产物的基因和宿主细胞描述于WO 2016/029153中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，细菌细胞产生甜菊醇或甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)。甜菊醇由贝壳杉烯通过两种P450酶，贝壳杉烯氧化酶(KO)和贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)的作用产生。在产生甜菊醇后，可以通过一系列糖基化反应产生各种甜菊醇糖苷产物，其可以在体外或体内发生。用于产生甜菊醇和甜菊醇糖苷的途径和酶公开于US 2013/0171328、US 2012/0107893、WO2012/075030、WO 2014/122328，其特此以引用的方式整体并入。WO 2016/073740还公开了用于产生RebM的酶和细菌宿主细胞。
用于产生萜烯或萜类化合物的其他生物合成途径公开于US 8,927,241中，其特此以引用的方式整体并入。
培养细菌宿主细胞以产生萜类化合物产物，并具有增强的MEP途径通量。在一些实施方案中，采用碳底物诸如C1、C2、C3、C4、C5和/或C6碳底物以产生萜烯或萜类化合物产物。在示例性实施方案中，碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和/或甘油培养条件通常选自有氧、微氧和厌氧。
在各种实施方案中，细菌宿主细胞可以在22℃至37℃的温度下培养。虽然细菌诸如大肠杆菌中的商业生物合成可以受到过表达和/或外源酶(例如，衍生自植物的酶)稳定的温度的限制，可以对重组酶(包括萜类化合物合酶)进行工程化以使培养物维持在较高温度下，从而产生更高的产率和更高的总生产力。在一些实施方案中，培养在约22℃或更高、约23℃或更高、约24℃或更高、约25℃或更高、约26℃或更高、约27℃或更高、约28℃或更高、约29℃或更高、约30℃或更高、约31℃或更高、约32℃或更高、约33℃或更高、约34℃或更高、约35℃或更高、约36℃或更高、或约37℃下实施。
在一些实施方案中，细菌宿主细胞还适用于商业规模的商业生产。在一些实施方案中，培养物的大小为至少约100L、至少约200L、至少约500L、至少约1,000L、或至少约10,000L。在一个实施方案中，培养可以在分批培养、连续培养或半连续培养中实施。
在各种实施方案中，方法还包括从细胞培养物或细胞裂解物中回收萜烯或萜类化合物产物。在一些实施方案中，培养物产生至少约100mg/L、或至少约200mg/L、或至少约500mg/L、或至少约1g/L、或至少约2g/L、或至少约5g/L、或至少约10g/L、或至少约20g/L、或至少约30g/L、或至少约40g/L的萜烯或萜类化合物产物。
在一些实施方案中，吲哚(包括异戊二烯化的吲哚)的产生用作萜类化合物产生的替代标记，并且/或者控制培养物中吲哚的积累以增加产量。例如，在各种实施方案中，将培养物中吲哚的积累控制在低于约100mg/L、或低于约75mg/L、或低于约50mg/L、或低于约25mg/L、或低于约10mg/L。吲哚的积累可以通过使用如US 8,927,241(其特此以引用的方式并入)中描述的多变量模块方法平衡蛋白质表达和活性和/或通过化学手段来控制。
有效产生萜烯和萜类化合物的其他标记包括培养基中DOX或ME的积累。通常，本文所述的细菌菌株积累较少的这些化学物质，其在培养物中积累小于约5g/L、或小于约4g/L、或小于约3g/L、或小于约2g/L、或小于约1g/L、或小于约500mg/L、或小于约100mg/L。
通过操纵MEP途径基因以及操纵上游和下游途径来优化萜烯或萜类化合物生产，预计不是简单的线性或加成过程。相反，通过组合分析，通过平衡MEP途径以及上游和下游途径的组分来实现优化。培养物中的吲哚(包括异戊二烯化的吲哚)积累和MEP代谢物积累(例如，DOX、ME、MEcPP和/或法呢醇)可以用作指导此过程的替代标志。
例如，在一些实施方案中，细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子或模块(在质粒上或整合到基因组中)，具有本文所述的额外MEP途径补充以改善MEP碳。例如，细菌菌株可以具有dxr和ispG和/或ispH的另一个拷贝，任选地具有ispE和/或idi的另一个拷贝，调节这些基因的表达以增加MEP碳和/或提高萜烯或萜类化合物滴度。在各种实施方案中，细菌菌株具有至少dxr、ispE、ispG和ispH的另一个拷贝，任选地具有idi的另一个拷贝，调节这些基因的表达以增加MEP碳和/或提高萜烯或萜类化合物滴度
可以通过各种方法实现基因和/或蛋白质(包括基因模块)表达的操纵。例如，可以通过选择具有不同强度(例如，强、中或弱)的启动子(诸如诱导型或组成型启动子)来调节基因或操纵子的表达。不同强度的启动子的几个非限制性实例包括Trc、T5和T7。另外，可以通过操纵细胞中基因或操纵子的拷贝数来调节基因或操纵子的表达。在一些实施方案中，可以通过操纵模块内基因的顺序来调节基因或操纵子的表达，其中首先转录的基因通常以较高水平表达。在一些实施方案中，通过将一个或多个基因或操纵子整合到染色体中来调节基因或操纵子的表达。
通过选择适当的启动子和核糖体结合位点也可以实现蛋白质表达的优化。在一些实施方案中，这可以包括选择高拷贝数质粒，或单拷贝数、低拷贝数或中拷贝数质粒。转录终止步骤也可以通过引入或消除诸如茎环的结构而靶向基因表达的调节。
含有用于表达的所有必需元件的表达载体是可商购获得的并且是本领域技术人员已知的。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过将异源DNA引入细胞中来对细胞进行基因工程化。将异源DNA置于转录元件的可操作控制下，以允许异源DNA在宿主细胞中表达。
在一些实施方案中，编辑内源基因而不是基因补充。编辑可以修饰内源启动子、核糖体结合序列或其他表达控制序列，和/或在一些实施方案中修饰基因调节中的反式作用和/或顺式作用因子。基因组编辑可以使用CRISPR/Cas基因组编辑技术或采用锌指核酸酶和TALEN的类似技术进行。在一些实施方案中，内源基因被同源重组替换。
在一些实施方案中，基因至少部分地通过控制基因拷贝数过表达。虽然可以使用具有不同拷贝数的质粒方便地控制基因拷贝数，但也可以采用基因复制和染色体整合。例如，遗传稳定的串联基因复制的方法描述于US 2011/0236927中，其特此以引用的方式整体并入。
萜烯或萜类化合物产物可以通过任何合适的方法回收，包括将所需产物分配到有机相或疏水相中。可替代地，可以回收水相，并且/或者可以回收全细胞生物质，用于进一步加工。可以例如通过气相色谱法(例如，GC-MS)确定和/或定量所需产物的产生。所需产物可以在分批或连续生物反应器系统中生产。产物的生产、回收和/或产物分析可以如US 2012/0246767中所述进行，其特此以引用的方式整体并入。例如，在一些实施方案中，使用有机溶剂(诸如烷烃，诸如庚烷或十二烷)从含水反应介质中提取产物油，然后进行分馏。在其他实施方案中，使用疏水相(诸如植物油)从含水反应介质中提取产物油，然后进行有机溶剂萃取和分馏。馏分的萜烯和萜类化合物组分可以通过GC/MS定量测量，然后将馏分共混以产生所需的产物分布。
在各种实施方案中，将回收的萜烯或萜类化合物掺入产品(例如，消费产品或工业产品)中。例如，所述产品可以是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。例如，在一些实施方案中，回收的产物包含诺卡酮，并且产物是选自饮料、口香糖、糖果或风味剂添加剂的风味剂产品，或者产品是驱虫剂或杀虫剂。在一些实施方案中，含氧产物是甜菊醇或甜菊醇糖苷(例如，RebM)，其作为甜味剂提供，或掺入配料、风味剂、饮料或食品中。
本发明还提供通过掺入本文产生的萜烯或萜类化合物制备产品的方法，所述产品诸如食品、饮料、纹理剂(texturant)(诸如淀粉、纤维、树胶、脂肪和脂肪模拟物和乳化剂)、药物产品、烟草产品、营养品、口腔卫生产品和化妆品。在本发明的实施方案中产生的此类物质的较高产率可以提供显著的成本优势以及可持续性。
在其他方面，本发明提供细菌细胞，诸如大肠杆菌，其具有一种或多种增加MEP碳的遗传修饰。在各种实施方案中，细菌细胞通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物。下游合成途径通常是重组途径，并且可以包含异戊二烯基转移酶、萜烯合酶和任选地一种或多种细胞色素P450酶和细胞色素P450还原酶(例如，各自如上所述)。此外，为了改善MEP碳，大肠杆菌具有一种或多种以下遗传修饰：
(1)降低IspB的表达或活性，任选地通过修饰RBS，并且任选地其中ispB基因中的六碱基SD序列改变为CGTGCT或CGTGCC，或其具有来自CGTGCT或CGTGCC的一个或两个核苷酸变化的修饰；
(2)全部或部分iscR基因的缺失或失活，以及组成型或诱导型启动子以在用于萜烯或萜类化合物生产的条件下驱动isc操纵子中剩余基因(例如，iscSUA)表达；
(3)ryhB缺失或失活；
(4)改变或平衡MEP酶表达或活性，使得DOX和/或ME不积累高于约2g/L或约1g/L；
(5)MEP途径补充，其包括dxr基因(任选地具有ispD、ispE和/或ispF)和ispG和/或ispH基因，其中任选地修饰IspG或IspH以增加酶活性；并且其中IspG任选地在选自以下的位置处具有一个或多个突变：V30、S32、T34、N35、R37、V59、V61、S62、V63、L83、V84、C104、L105、P131、I132、I134、A138、K143、F176、K177、V178、V180、A182、L205、I207、A210、G212、A213、L236、V238、A241、A242、D243、R259、S262、R263、I265、N266、F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289、S301、I302、I303、V306；以及任选地在选自以下的多个位置处具有修饰：(1)V30、S32、T34、N35、R37；或(2)V59、V61、S62、V63、L83、V84；或(3)C104、L105、S301、I302、I303、V306；或(4)P131、I132、I134、A138、K143；或(5)F176、K177、V178、V180、A182；或(6)L205、I207、A210、G212、A213；或(7)L236、V238、A241、A242、D243；或(8)R259、S262、R263、I265、N266；或(9)F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289；以及任选地L205V、A210S、G212T和A213I中的一个、两个、三个或全部；以及
(6)pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)中的突变，其支持增加的萜类化合物滴度或MEP碳增加。
在一些实施方案中，细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子或模块(在质粒上或整合到基因组中)。此外，细菌菌株可以具有dxr、ispE和ispG和/或ispH的另一个拷贝，调节这些基因的表达以增加MEP碳和/或提高萜烯或萜类化合物滴度。
在各种实施方案中，细菌菌株包含由以上(1)至(6)定义的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种修饰。
如本文其他部分所公开的，基因可以通过重组基因的补充而过表达，或者可以修饰内源基因以改变表达。
细菌菌株是选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的细菌。例如，细菌菌株是选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌、需钠弧菌或恶臭假单胞菌的物种。在一些实施方案中，细菌菌株是大肠杆菌。
下面参考以下实施例进一步在下文中说明本发明的方面和实施方案。
实施例
实施例1：增加的Fe-S蛋白可用性使积累从DOX转移至ME
如图3所示，G2(如图2中所述)产生相当于3.45g/L萜类化合物产物的关键细胞外代谢物(DOX+ME+MEcPP)。这与不含增加Fe-S蛋白的修饰的菌株中的7g/L的主要DOX相比。G4也具有萜类化合物产物的56％更高积累。遗传修饰包括ΔryhB、ΔiscR与isc操纵子的过表达。
对于进行工程化以产生另一种萜类化合物产物(产物B)的大肠杆菌菌株获得了相似结果，并显示相当于3.26g/L萜类化合物产物的DOX+ME+MEcPP。另外的修饰包括产生1.4x改善的对pgi的修饰，以及ispB翻译的调节。参见图4。
如图5所示，将工程化产物菌株与野生型大肠杆菌进行比较的转录物组测序和分析产生了ryhB和isc操纵子参与产物菌株的改变表型的有力证据。前一种基因在工程化菌株中强烈上调，而iscR调控基因则非常强烈地下调。
如图6所示，通过ryhB的缺失、对于iscSUA转换为组成型过表达和iscR的缺失进行的顺序修饰产生具有稳定增加的产物滴度的菌株。
实施例2：对ispG工程化以改善MEP途径通量
产生其中组合改变ispG的活性位点的一系列文库，并且通过用突变形式替换野生型ispG基因来在体内测试。ispG工程化可以改善酶的动力学、稳定性和稳健性，以减轻Fe-S簇生物化学对通过MEP途径的通量的影响。使用～1000种不同的ispG直系同源物的序列比对来设计9个活性位点组合文库，以靶向底物和铁-硫簇结合位点(图7A，图7B)。
图8示出了用于增加两种背景菌株中倍半萜产物滴度的ispG组合文库的初步筛选的结果。在37℃下在96DWP中实施筛选48小时。使用具有总计～30种变体的两种菌株背景(有或没有ispH过表达)观察到相似的性能，显示出萜类化合物产物滴度的1.2至1.45x提高。
重新筛选了先导物变体，结果在图9中示出。两种ispG变体相对于进行工程化以增加Fe-S蛋白的可用性的菌株产生～1.2x萜烯产物滴度提高。先导物变体G11具有以下突变：L205V、A210S、G212T和A213I。
将先导物变体整合到先导物萜类化合物生产菌株中，并且产物滴度在图10中示出。ispG Lib6 G11的整合在两种菌株中产生1.2x产量提高。
实施例3：ispB翻译工程化
ispB基因编码十异戊二烯基二磷酸合酶，其控制泛醌的合成，并且因此直接与FPP合酶竞争IPP和DMAPP前体。通过修饰ispB RBS序列并调低mRNA的翻译以减少细胞中ispB酶的量可以将碳通量朝向重组萜类化合物途径转移。
如图11所示，从ispB RBS文库的初步筛选鉴定若干潜在命中，其产生萜烯/萜类化合物产量的1.7倍提高。如图12所示验证先导物命中。鉴定产生萜类化合物产量的1.5倍提高的两个独特命中，其具有以下SD序列：CGTGCT和CGTGCC。
实施例4：MEP途径补充
如图13所示，dxr本身或与ispD、ispE和ispF组合的过表达使产量降低多达2倍。添加ispG-ispH使产量恢复到原始水平。
如图14所示，代谢组学分析显示，没有ispE的dxr过表达导致细胞外ME和细胞内CDP-ME积累。过表达ispE将代谢物池从ME和CDP-ME转移至MEcPP。在此实施例中，菌株在37℃下在96孔板中生长48小时。在终点，测量细胞培养物的OD600，然后分成两个样品；第一个用乙酸乙酯提取以分析并定量产物A，而第二个进行离心以沉淀细胞，并且分析上清液的细胞外MEP代谢物，同时进一步处理细胞沉淀以提取细胞内MEP代谢物。通过气相色谱法和质谱法(GC/MS)分析含萜类化合物产物的有机相样品，同时通过液相色谱法和质谱法(LC/MS)分离并分析细胞外和细胞内代谢物样品。LC/MS检测器是三重四极杆仪器，其允许针对真实标准准确定量MEP代谢物。以摩尔浓度表示所得的代谢物浓度，以关注通过MEP途径到所需产物的碳分子的流量。
如图15所示，具有dxr或dxr-ispE的MEP补充的产物A G5菌株的代谢组学分析进一步显示，所得的菌株中增加的MEP通量潜力转化为更多潜在的产物A滴度。将这些菌株培养物的测量的产物和MEP代谢物浓度转换为摩尔浓度，并且计算产物A的每种MEP代谢物的碳当量；即，一个MEcPP分子含有5个碳，因此每个转化为1个异戊烯基二磷酸(IPP，也具有5个碳)或1/3分子的倍半萜产物A分子(具有15个碳)。通过这种方式，可以计算当碳成功向下游拉动通过MEcPP时由此菌株产生的产物A的潜在总量。在MEP基因之间的表达平衡时，可以产生多达12x更多的产物A。
Claims (53)
1.一种用于生产萜烯或萜类化合物产物的方法，其包括：
提供一种细菌菌株，其通过上游甲基赤藓糖醇途径(MEP)产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将所述IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物；以及
培养所述细菌菌株以产生所述萜烯或萜类化合物产物，其中大于1％的进入糖酵解的碳变成MEP碳。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌菌株是选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属或假单胞菌属的细菌。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌物种选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌菌株是大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其中MEP碳由以下组成：
D-甘油醛3-磷酸；
丙酮酸；
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸；
1-脱氧-D-木酮糖；
2-C-甲基-D-赤藓糖醇-5-磷酸；
2-C-甲基-D-赤藓糖醇；
4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇；
2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇；
2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸；
1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸；
异戊烯基二磷酸；
二甲基烯丙基二磷酸；
香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)或香叶基法呢基二磷酸(FGPP)；
香叶基磷酸、法呢基磷酸、香叶基香叶基磷酸或香叶基法呢基磷酸；
香叶醇、法呢醇、香叶基香叶醇或香叶基法呢醇；
萜烯和萜类化合物产物；
角鲨烯；
十一异戊二烯基二磷酸(UPP)、十一异戊二烯基磷酸；
十异戊二烯基二磷酸(OPP)、4-羟基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、2-十异戊二烯基苯酚、3-十异戊二烯基苯-1，2-二醇、2-甲氧基-6-十异戊二烯基-2-甲氧基-1，4-苯醌醇、6-甲氧基-3-甲基十异戊二烯基-1，4-苯醌醇、3-去甲基泛醇-8、泛醇-8、泛醌；
2-羧基-1，4-萘醌醇、去甲基甲基萘醌-8、甲基萘醌-8、甲基萘醌；
异戊烯醇、戊烯醇、异戊烯基磷酸和二甲基烯丙基磷酸；以及
异戊二烯化的代谢物和蛋白质，包括异戊二烯化的吲哚。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述萜烯或萜类化合物产物包括至少一种选自以下的化合物：松香二烯、松香酸、α-愈创木烯、α-甜橙醛、紫穗槐二烯、青蒿酸、β-红没药烯、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、雷公藤红素、二十五烧醇、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、葫芦烷、毛喉素、Gascardic Acid、香叶醇、Haslene、左旋海松酸、柠檬烯、羽扇豆醇、薄荷醇、薄荷酮、罗汉果苷、诺卡酮、诺卡醇、蛇孢假壳素A、广藿香、胡椒酮、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙M、莎草薁酮、桧烯、甜菊醇、甜菊醇糖苷、紫杉烯、百里酚、熊果酸和瓦伦烯。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中下调泛醌生物合成途径。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述菌株具有降低的IspB表达或活性。
9.如权利要求8所述的方法，其中通过修饰的核糖体结合序列(RBS)降低IspB表达。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述ispB基因的Shine-Dalgarno(SD)序列是CGTGCT或CGTGCC或其在CGTGCT或CGTGCC中具有一个或两个核苷酸变化的修饰。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述菌株具有改变的ispB启动子或ispB RNA降解速率。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述菌株编码具有增加的降解速率的IspB蛋白。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述菌株包含具有一个或多个氨基酸变化以降低酶活性的IspB蛋白；或在所述细菌菌株中具有降低活性的IspB直系同源物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述菌株具有isc操纵子的诱导型或组成型表达。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述iscR基因全部或部分缺失或任选地通过对所述RBS的修饰而失活。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中用诱导型或组成型启动子替换所述iscR基因。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述菌株包含ryhB缺失或失活。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述菌株任选地通过补充包含dxr的重组基因或操纵子来过表达Dxr。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述菌株具有相对于野生型大肠杆菌Dxr具有增加的活性的经修饰的Dxr酶或Dxr直系同源物，其中所述直系同源物任选地是流产布鲁氏菌DRL(SEQ ID NO：8)或其衍生物。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述菌株任选地通过补充表达IspE的重组基因或操纵子来过表达IspE、经修饰的IspE和/或IspE直系同源物。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述菌株任选地通过补充表达IspG和/或IspH的重组基因或操纵子来过表达IspG和/或IspH。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述菌株具有相对于野生型大肠杆菌IspG和/或IspH具有增加的活性的经修饰的IspG和/或IspH酶或直系同源物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述IspG酶在选自以下的位置处含有一个或多个突变：V30、S32、T34、N35、R37、V59、V61、S62、V63、L83、V84、C104、L105、P131、I132、I134、A138、K143、F176、K177、V178、V180、A182、L205、I207、A210、G212、A213、L236、V238、A241、A242、D243、R259、S262、R263、I265、N266、F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289、S301、I302、I303、V306。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述IspG在选自以下的多个位置处具有修饰：
(1)V30、S32、T34、N35、R37；或
(2)V59、V61、S62、V63、L83、V84；或
(3)C104、L105、S301、I302、I303、V306；或
(4)P131、I132、I134、A138、K143；或
(5)F176、K177、V178、V180、A182；或
(6)L205、I207、A210、G212、A213；或
(7)L236、V238、A241、A242、D243；或
(8)R259、S262、R263、I265、N266；或
(9)F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述IspG酶具有以下突变中的一个、两个、三个或全部：L205V、A210S、G212T和A213I。
26.如权利要求18至25中任一项所述的方法，其中一种或多种重组MEP基因由质粒表达或整合到细菌基因组中。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子或模块。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述菌株包含支持增加的萜烯或萜类化合物滴度或增加的MEP碳的pgi突变。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述菌株包含萜类化合物合酶，其具有一种或多种修饰以改善酶动力学、产物分布、稳定性和温度耐受性中的一种或多种。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述菌株在好氧、微氧或厌氧条件下用C1、C2、C3、C4、C5和/或C6碳源培养；所述碳源任选地是葡萄糖或甘油。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述细菌菌株在22℃与37℃之间的温度下培养。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述培养物为至少约100L。
33.如权利要求31所述的方法，其还包括监测所述培养物中吲哚或异戊二烯化的吲哚的积累。
34.如权利要求32或33所述的方法，其包括监测所述培养物中DOX、ME或MEcPP的积累。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其还包括回收所述萜烯或萜类化合物产物。
36.如权利要求35所述的方法，其中从有机相、疏水相或水相中回收所述萜烯或萜类化合物产物。
37.一种用于制备工业或消费产品的方法，其包括将根据权利要求1至36中任一项所述的方法制备的萜烯或萜类化合物掺入所述工业或消费产品中。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述工业或消费产品是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述工业或消费产品是食品、饮料、纹理剂、药品、烟草产品、营养品、口腔卫生产品或化妆品。
40.一种具有增加MEP碳的一种或多种遗传修饰的细菌菌株，所述细菌菌株通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将所述IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物；所述遗传修饰选自：
(1)降低IspB的表达或活性的修饰；
(2)全部或部分iscR基因的缺失或失活，以及诱导型或组成型启动子以在用于萜烯或萜类化合物生产的条件下驱动isc操纵子中剩余基因表达；
(3)ryhB缺失或失活；
(4)改变或平衡MEP酶表达或活性，使得DOX和/或ME不积累高于约2g/L或高于约1g/L；
(5)MEP途径补充，其包含dxr基因，任选地具有ispD、ispE和/或ispF以及ispG和/或ispH基因；
(6)pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)中的突变，其支持增加的萜类化合物滴度或MEP碳。
41.如权利要求40所述的细菌菌株，其中所述菌株包含具有至少dxr基因和ispE基因的MEP途径补充。
42.如权利要求40或41所述的细菌菌株，其中所述dxr基因与SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：8具有至少50％的氨基酸序列同一性。
43.如权利要求40至42中任一项所述的细菌菌株，其中ispB RBS经修饰。
44.如权利要求43所述的细菌菌株，其中ispB Shine Dalgarno(SD)序列是CGTGCT或CGTGCC，或具有CGTGCT或CGTGCC的一个或两个核苷酸变化的SD序列。
45.如权利要求40至44中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株包含经修饰以增加酶活性的IspG或IspH酶的补充。
46.如权利要求45所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达在选自以下的位置处具有一个或多个突变的IspG酶：V30、S32、T34、N35、R37、V59、V61、S62、V63、L83、V84、C104、L105、P131、I132、I134、A138、K143、F176、K177、V178、V180、A182、L205、I207、A210、G212、A213、L236、V238、A241、A242、D243、R259、S262、R263、I265、N266、F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289、S301、I302、I303、V306。
47.如权利要求46所述的细菌菌株，其中所述IspG酶在选自以下的多个位置处具有修饰：
(1)V30、S32、T34、N35、R37；或
(2)V59、V61、S62、V63、L83、V84；或
(3)C104、L105、S301、I302、I303、V306；或
(4)P131、I132、I134、A138、K143；或
(5)F176、K177、V178、V180、A182；或
(6)L205、I207、A210、G212、A213；或
(7)L236、V238、A241、A242、D243；或
(8)R259、S262、R263、I265、N266；或
(9)F267、I268、A269、T272、S274、Q276、E277、F278、D289。
48.如权利要求47所述的细菌菌株，其中所述IspG酶具有选自以下的一个、两个、三个或全部修饰：L205V、A210S、G212T和A213I。
49.如权利要求40至48中任一项所述的细菌菌株，其中所述菌株是选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属或假单胞菌属的细菌。
50.如权利要求49所述的细菌菌株，其中所述细菌物种选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
51.如权利要求50所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株是大肠杆菌。
52.如权利要求40至51中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi的至少一个额外拷贝，其表达为操纵子或模块。
53.如权利要求40至52中任一项所述的细菌菌株，其中所述萜烯或萜类化合物产物包括至少一种选自以下的化合物：松香二烯、松香酸、α-愈创木烯、α-甜橙醛、紫穗槐二烯、青蒿酸、β-红没药烯、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、雷公藤红素、二十五烧醇、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、葫芦烷、毛喉素、Gascardic Acid、香叶醇、Haslene、左旋海松酸、柠檬烯、羽扇豆醇、薄荷醇、薄荷酮、罗汉果苷、诺卡酮、诺卡醇、蛇孢假壳素A、广藿香、胡椒酮、莎草薁酮、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙M、桧烯、甜菊醇、甜菊醇糖苷、紫杉烯、百里酚、熊果酸和瓦伦烯。
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