KR20190139202A - 터페노이드 산물의 미생물 생산을 위한 대사 조작 - Google Patents

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Abstract

다양한 양상 및 실시형태에서, 본 발명은 박테리아 균주, 및 터펜 및 터페노이드 산물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MEP 경로를 통해 개선된 탄소 유동을 가짐으로써, 탄소 공급원, 예컨대 글루코스에 의한 발효에 의해 터펜 및/또는 터페노이드 산물 수율을 증가시키는 박테리아 균주를 제공한다.

Description

터페노이드 산물의 미생물 생산을 위한 대사 조작
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/454,121호의 유익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열목록을 함유하며, 이는 본 명세서에 그의 전체가 참고로 편입된다. 2018년 2월 2일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 MAN-008PC_ST25.txt이고, 용량이 20,480 바이트이다.
식품 및 음료 산업뿐만 아니라 다른 산업, 예컨대 향수, 화장품 및 건강 관리 산업은 향미제 및 향료로서의 용도를 위해 포함하는 터펜 및/또는 터페노이드를 일상적으로 사용한다. 그러나, 인자, 예컨대: (i) 식물 원료의 이용 가능성 및 높은 가격; (ii) 식물에서 상대적으로 낮은 터펜 함량; 및 (iii) 산업적 규모에서 충분한 양의 터펜 산물을 생산하기 위한 지루하고 비효율적인 추출 공정은 모두 식물-독립적 시스템을 이용하는 터펜의 생합성에 대한 연구를 자극하였다. 결과적으로, 재생 가능한 자원, 예컨대 글루코스를 터페노이드 산물로 전환시키기 위해 미생물을 조작하는 기술을 개발하는 데 노력을 쏟았다. 전통적인 방법과의 비교에 의해, 미생물은 개발을 지속하기 위한 부지에 대한 필요없이 빠른 성장의 이점을 갖는다.
필수 아이소프레노이드 전구체인 아이소펜텐일 다이포스페이트(isopentenyl diphosphate: IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(dimethylallyl diphosphate: DMAPP)에 대한 2가지 주요 생합성 경로, 즉, 메발로네이트(mevalonate: MVA) 경로 및 메틸에리트리톨 포스페이트(methylerythritol phosphate: MEP) 경로가 있다. MVA 경로는 대부분의 진핵생물, 고세균 및 소수의 진정세균에서 발견된다. MEP 경로는 진정세균, 식물의 엽록소, 남세균, 조류 및 에피콤플렉산 기생충에서 발견된다. 이콜라이(E. coli) 및 다른 그램-음성 박테리아는 IPP 및 DMAPP 대사 전구체를 합성하기 위해 MEP 경로를 이용한다. MEP 경로는 MVA 경로에 걸쳐 이론적으로 더 양호한 화학량론적 수율을 제공하지만, 이콜라이에서 그리고 다른 박테리아에서 MEP 경로는 당해 경로를 통해 탄소 유동(carbon flux)을 제어하고/하거나 제한하는 다양한 고유 조절 메커니즘을 갖는다. 문헌[Zhao et al., Methylerythritol Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis, Annu Rev. Biochem. 2013; 82:497-530; Ajikumar PK, et al., Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science 2010; 330-70-74] 참조.
MEP 경로를 통해 그리고 재조합 하류 터펜 및 터페노이드 합성 경로를 통해 탄소 유동을 개선시키는 미생물 균주 및 방법은 박테리아 시스템에서 터펜 및 터페노이드의 산업적 규모 생산에 필요하다.
다양한 양상에서, 본 발명은 터펜 및 터페노이드 산물을 제조하기 위한 방법 및 박테리아 균주(예컨대 이콜라이)에 관한 것이다. 소정의 양상에서, 본 발명은 MEP 경로를 통해 개선된 탄소 유동을 가짐으로써, 탄소 공급원, 예컨대 글루코스에 의한 발효에 의해 터펜 및/또는 터페노이드 산물 수율을 증가시키는 박테리아 균주를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 MEP 경로를 통해 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 생산하고, 하류의 생합성 경로를 통해 IPP 및 DMAPP를 터펜 또는 터페노이드 산물로 전환시키는 박테리아 균주를 제공하는 단계를 포함한다. 탄소 공급원, 예컨대 글루코스와 함께 배양될 때에 박테리아 균주는 MEP 경로를 통해 해당과정(glycolysis)에 유입되는 탄소 중 1% 초과를 대사시키고, 다양한 실시형태에서, MEP 경로를 통해 해당과정에 유입되는 탄소 중 15% 초과("MEP 탄소"의 15% 초과)를 대사시킨다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 균주 성장 또는 생존력에 대한 실질적인 또는 측정 가능한 영향 없이, 박테리아 생산 균주, 예컨대 유비퀴논 생합성 경로에서 1종 이상의 경쟁 효소 또는 경로의 하향 발혈 또는 활성의 "조율"을 수반한다. 일부 실시형태에서, IspB 효소의 발현 또는 활성은 선택적으로 리보솜 결합 서열(RBS), 프로모터 또는 아미노산 서열에 대한 변형, 또는 IspB 오솔로그로의 대체에 의해 감소된다.
대안적으로, 또는 추가로, 본 발명은 선택적으로 isc 오페론의 발현을 변경시킴으로써, 및/또는 ryhB 소형 RNA의 결실에 의해 더 높은 활성의 Fe-S 효소 IspG 및/또는 IspH를 뒷받침하기 위해, Fe-S 클러스터의 이용 가능성 또는 활성을 증가시키는 것을 수반한다.
대안적으로, 또는 추가로, 일부 실시형태에서 본 발명은 유리한 돌연변이체 또는 오솔로그(들)의 과발현에 의해 그리고/또는 선택에 의해 IspG 및/또는 IspH의 활성을 조율하는 것을 수반한다. 이러한 돌연변이체 또는 오솔로그는 MEP 경로 아래로 탄소를 당김으로써 MEP 탄소를 증가시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 대사체학에 의해 평가되는 바와 같은 MEP 효소 상보화는 고 MEP 탄소를 야기하는 MEP 효소 상보화를 확인할 수 있고, 탄소는 MEcPP 중간체에 대한 경로 아래로 추가로 당겨진다.
소정의 실시형태에서, 박테리아 세포는 1종 이상의 터페노이드 화합물, 예컨대 특히 모노터페노이드, 세스퀴터페노이드 및 다이터페노이드를 생산한다. 이러한 터페노이드 화합물은 향수(예를 들어, 패쵸롤)에서, 향미제 산업(예를 들어, 누트카톤)에서, 감미제(예를 들어, 스테비올 글리코사이드) 또는 치료제(예를 들어, 탁솔)로서의 용도를 발견한다. 숙주 세포는 일반적으로 IPP 및 DMAPP 전구체로부터 터펜 또는 터페노이드를 생산하는 재조합체 하류 경로를 함유할 것이다.
회수된 터펜 또는 터페노이드는 제품(예를 들어, 소비자 또는 산업 제품)에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 제품은 향미제 제품, 향료 제품, 감미제, 화장품, 청소용품, 세정제 또는 비누 또는 해충 방제 제품일 수 있다. 본 발명의 실시형태에서 생산된 고수율은 터펜 또는 터페노이드 성분의 상당한 비용적 이점뿐만 아니라 지속 능력 및 품질 제어를 제공할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 상세하게 기재되는 바와 같이 MEP 탄소를 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 갖는 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이를 제공한다.
본 발명의 다른 양상 및 실시형태는 본 발명의 다음의 상세한 설명으로부터 명확할 것이다.
도 1은 MEP 경로를 통한 터페노이드 생산에 대한 개략도를 도시한 도면. 탄소 공급원으로서 글루코스를 취한 박테리아 세포를 나타낸다. 글루코스는 TCA 사이클을 통해 바이오매스로 전환되거나 또는 MEP 경로를 통해 목적으로 하는 터페노이드 산물로 이동된다. 글루코스는 세포 내로 유입되고, 중간체로서 글리세르알데하이드 3-인산염(GAP)에 의해 피루브산염(PYR)으로 전환된다. PYR 및 GAP는 조합되어 DOXP를 만드는데, 이는 MEP로 전환되고 FPP에 대한 경로에 (MEcPP를 통해) 수용된다. DOX 및 ME는 각각 DOXP 및 MEP의 탈인산화된 산물이다. DOX, ME 및 MEcPP는 세포 밖에서 발견된다. MEP 경로로 들어가는 유동이 많을수록, 더 많은 산물이 세포외에서 발견된다. 이들 부산물은 MEP 경로에서 병목 현상의 마커로서, 그리고 조작을 위한 표적을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 검정색 화살표는 터페노이드에 대해 효소-매개 생화학적 반응을 나타내고, 밝은 회색 화살표는 경쟁 부산물을 나타내며, 진한 회색 화살표는 세포 외부의 산물 수송을 나타내고, 백색 화살표는 단순함을 위해 압축된 경로를 나타낸다.
도 2는 예시적인 터페노이드 산물(산물 A)에 대한 MEP 경로를 통해 터페노이드 생산을 개선시키기 위한 이콜라이 균주 섀시(chassis)에 대한 유전자 변형을 도시한 도면.
도 3은 균주 G2로부터 균주 G4로 진행함에 있어서 산물 A 균주에 대한 변형을 도시한 도면(도 2 참조). 이들 변형은 MEP 생화학적 경로에서 탄소가 '하류'로 이동하는 것을 가능하게 하여, 중간 산물 풀을 DOXP(및 세포외 DOX)로부터 MEP(및 세포외 ME)로 밀어낸다. MEP 경로 중간체의 거대 풀의 세포외 축적은 탄소 유동을 경로 아래로 그리고 MEcPP로 밀어내도록 의도하는 설계 조작에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 도 3은 균주 G2로부터 G4까지 진행함에 있어서 DOX로부터 ME로의 40% 탄소 이동이 관찰되는 실험을 나타낸다.
도 4는 산물 B에 대한 MEP 경로를 통해 터페노이드 생산을 개선시키기 위한 이콜라이 균주 섀시에 대한 유전자 변형을 도시한 도면. 고-생산 클론에서 pgi 돌연변이체 변형이 동정되었다.
도 5는 ryhB 및 isc 오페론의 개선을 위한 증거를 제공하는 전사체 프로파일링 실험으로부터의 결과를 도시한 도면. ryhB의 발현은 상향조절되고, isc 오페론은 산물 A 또는 산물 B의 생산을 위한 하류의 터페노이드 경로의 설치에 반응하여 이콜라이에서 일반적으로 하향조절된다.
도 6은 ryhB 및 isc 오페론 변형의 조합된 효과를 도시한 도면. MEP 터페노이드 대사에서 철 및 철-황(Fe-S) 클러스터 생화학의 중요성을 고려하면, 생산 섀시에 대한 일련의 변형은 산물(산물 A)의 역가를 증가시키도록 수행되었다. 순차적 순서로, G2 산물 A 섀시는 ryhB가 결실되었고, 이어서, iscS의 야생형 프로모터는 구성적 프로모터 서열로 대체되며, 그리고 천연 iscR 유전자는 결실되었다. 각각의 변형에 의해, 산물 A의 역가는 증가된다.
도 7은 IspG 효소 조작을 도시한 도면. 야생형 이콜라이 IspG 유전자의 돌연변이 라이브러리는 구조적 모델에 대한 예측된 변화에 기반하여 설계되었다(도 7a). 라이브러리는 개선된 동역학, 단백질 안정성, 또는 균주 강건성에 대해 설계하였다. 각각의 별개 라이브러리에서 서열 내 별개의 위치에 특정 변이체를 도입하였다(도 7b). 대략 1000가지의 다양한 ispG 오솔로그에 대한 서열 정렬을 이용하여 9개의 총 조합 라이브러리를 설계하였다.
도 8은 산물 A를 생성하는 3가지 균주에서 야생형 유전자를 대체하기 위한 야생형 이콜라이 ispG 유전자의 돌연변이 라이브러리의 선별을 도시한 도면. 통합된 라이브러리의 예비 선별은 도입된 변이체의 20 내지 40%가 개선된 산물 역가를 제공하도록 야기하며, 터페노이드 산물에서 1.5배까지의 증가가 관찰되었다.
도 9는 1차 선별로부터 초래된 선례의 검증 결과 및 2차 재선별을 도시한 도면. G11 변이체는 산물 A와 B 둘 다에 대한 생산 섀시에 혼입되었다.
도 10은 선택된 돌연변이된 형태를 갖는 생산 균주에서 야생형 ispG 유전자를 보충할 때의 결과를 도시한 도면. 보충은 산물 역가의 20% 증가를 초래한다. 터페노이드 산물과 상관없이 개선의 완전한 번역은 MEP 경로를 통한 임의의 터페노이드의 고수준 생산을 뒷받침할 수 있는 '보편적 섀시'의 확률을 시사한다.
도 11은 터페노이드 산물의 생산을 개선시키는 천연 RBS 서열의 변형을 통한 ispB의 번역률 조율을 도시한 도면. 야생형(WT) ispB RBS(리보솜 결합 부위)의 다양한 돌연변이체는 단백질 번역을 조율하기 위해 천연 ispB RBS에 대해 도입되었다. 이들 RBS 변화는 터페노이드 생산에 영향을 미치며, 이 중 일부는 개선된 생산을 초래한다. 몇몇 히트는 1차 선별로부터 동정되어, 산물 A에 대해 1.7x 및 산물 B에 대해 2x의 개선을 갖는 균주를 제공한다. 가장 좌측 칼럼은 값을 1로 설정한 모체 대조군에 관한 것이다. 주요 히트를 반복하고, 검증하고 나서, 완전히 서열분석하고, 이어서, 각각의 산물 균주의 주된 세대에 옮겼다.
도 12는 ispB RBS의 1차 선별에서 관찰된 개선을 확인하는, 복제에 의한 2차 선별을 통해 검증된 4가지 돌연변이체 균주를 도시한 도면.
도 13은 MEP 유전자의 과발현이 산물 역가의 하락을 야기한다는 것을 도시한 도면. G5 모체 수준 이상으로 MEP 유전자의 발현 수준 증가는 생성된 터페노이드 산물 A의 대략 50% 미만을 초래하며, 더 강한 발현(+++)은 더 약간 발현(+) 이상으로 감소를 악화시킨다. 대조적으로, dxr을 발현시키는 오페론에 대한 ispG 및 ispH 유전자의 첨가는 모체 수준에 대한 산물 역가의 회복을 가능하게 하는데, 이는 이 경로에서 유전자 발현의 조심스런 균형화가 높은 터페노이드 산물 역가를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
도 14는 역가가 하락한다고 해도, 더 많은 탄소가 MEP 경로로 들어간다는 것을 도시한 도면. MEP 경로 상보화는 산물 A 역가가 유전자 발현 변화에 대한 반응에서 동일하게 하락하거나 또는 머무른다는 것을 나타내었지만, 중간체 MEP 경로 대사물질은 농도가 상당히 더 증가되었다. MEP 탄소 대사물질은 실제 표준에 대한 액체 크로마토그래피 및 질량 스펙분석법을 통해 정량화되었고, 대조군 G5 균주에 비해 보충된 균주에서 상당히 증가하는 것으로 발견되었다. 얻어진 대사물질 농도는 MEP 경로를 통해 탄소 분자의 목적으로 하는 산물까지의 유동에 중점을 두기 위해 몰농도로 표현한다. 대다수의 MEP 중간체는 세포 외부에서 발견되며, DOX, ME 및 MEcPP가 대다수를 나타내고; 주요 세포내 산물은 상보체화된 균주에서 증가된 축적이 관찰된 CDP-ME이다. dxr 과발현은 산물 A 역가가 2x만큼 하락하도록 야기하였지만, MEP 경로에 유입되고 중간체로서 축적되는 탄소의 양은 6x까지 되고; 즉, 더 많은 탄소가 MEP 경로에 유입되지만, 그 중 소수는 빠져나간다. 게다가, G5 모체는 대부분 DOX(일부 MEcPP)를 축적하였지만, dxr(DOXP를 MEP로 전환)의 증가는 탄소를 경로 아래로 이동시켜, 더 많은 탄소가 ME 및 MEcPP로서 세포외로 풀링한다. dxr 상부에서 ispE 발현의 증가는 MEP 경로에서 탄소의 양을 G5 모체 이상으로 거의 10x까지 추가로 증가시키며, 해당 탄소의 거의 모두를 MEcPP로 이동시켰다. 흥미롭게도, dxr에 추가로 ispG 및 ispH를 과발현시키는 것은, 산물 역가가 앞의 예에서 2배가 되지만, dxr만을 과발현시키는 것과 매우 유사한 중간체 프로파일을 제공한다.
도 15는 도 14에서 MEP 경로에 축적하는 모든 탄소가 최종 산물로 성공적으로 전환된 경우에 생산된 산물 A의 총량을 도시한 도면. 데이터는 MEP 경로 유전자를 발현시키는(다양한 발현 수준은 +로부터 +++까지 증가) 동일한 플라스미드 골격에 대해 빈 플라스미드로 보완된 G5 균주의 생산 잠재력을 나타낸다. MEP 경로(도 14에서와 같이 정량화)에서 탄소의 총량을 산물 A 동등물로 전환시키는 것은 경로를 통한 탄소 유동이 상보성에 따라 증가하며, 거의 9x 초과의 산물 A 잠재력이 이들 균주에서 가능하게 만들어진다는 것을 나타낸다.
다양한 양상에서, 본 발명은 박테리아 균주 및 터펜 및 터페노이드 산물의 제조 방법에 관한 것이다. 소정의 양상에서, 본 발명은 MEP 경로를 통해 개선된 탄소 유동을 가지며, 이에 의해 탄소 공급원, 예컨대 글루코스에 의한 발효에 의해 터펜 및/또는 터페노이드 산물 수율을 증가시키는 박테리아 균주를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 상기 방법은 MEP 경로를 통해 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 생산하고, 하류의 생합성 경로를 통해 IPP 및 DMAPP를 터펜 또는 터페노이드 산물로 전환시키는 박테리아 균주를 생산하는 단계를 포함한다. 탄소 공급원, 예컨대 글루코스와 함께 배양시킬 때 박테리아 균주는 MEP 경로를 통해 해당과정에 유입되는 1% 초과의 탄소(1% 초과의 "MEP 탄소")를 대사시킨다. 일부 실시형태에서, 해당과정에 유입되는 탄소의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 17%, 또는 적어도 약 20%는 MEP 탄소가 된다. 또 다른 실시형태에서, 해당과정에 유입되는 탄소의 적어도 약 22% 또는 적어도 약 25% 또는 적어도 약 27%는 MEP 탄소가 된다. 탄소 공급원으로서 글루코스에 의해, MEP 경로에 유입되는 탄소에 대한 이론적 최대값은 이콜라이에서 약 30%이다. 일부 실시형태에서, 균주는 MEP 탄소의 이런 이론적 최대 수율을 실질적으로 충족시키는데, 이는 균주가 최대 이론적 수율의 적어도 약 80%를 제공한다는 것을 의미한다. 문헌에서 보고된 MEP 탄소의 이전의 수율은 1% 미만이다. 문헌[Zhou K, Zou R, Stephanopoulos G, Too H-P (2012) Metabolite Profiling Identified Methylerythritol Cyclodiphosphate Efflux as a Limiting Step in Microbial Isoprenoid Production. PLoS ONE 7(11): e47513. doi:10.1371/journal.pone.0047513] 참조.
다양한 실시형태에서, 미생물 균주는 에스케리키아 종(Escherichia spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.), 로도박터 종(Rhodobacter spp.), 자이모모나스 종(Zymomonas spp.) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp)으로부터 선택된 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 박테리아 종은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 이콜라이이다.
숙주 박테리아 세포는 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 생산하는 MEP 경로를 발현시킨다. 글루코스는 세포 내로 유입되고, 중간체로서 글리세르알데하이드-3-포스페이트(G3P 또는 GAP)에 의해 피루브산염(PYR)으로 전환된다. G3P과 PYR은 조합되어 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트(DOXP)를 만드는데, 이는 2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트(MEP)로 전환되고, IPP 및 DMAPP에 대한 경로에 수용된다. DOX, ME 및 MEcPP는 세포 밖에서 발견된다. MEP 경로로 들어가는 유동이 많을수록, 더 많은 이들 산물이 세포외에서 발견된다. 도 1 참조.
MEP(2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트) 경로는 또한 MEP/DOXP(2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트/1-데옥시-D-자일룰로스 5-포스페이트) 경로 또는 비-메발로네이트 경로 또는 메발론산-독립적 경로로 불린다. 경로는 전형적으로 다음의 효소의 작용을 수반한다: 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제(Dxs), 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 환원이성질화효소(Dxr, 또는 IspC), 4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 신타제(IspD), 4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제(IspE), 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로다이포스페이트 신타제(IspF), 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-뷰텐일 4-다이포스페이트 신타제(IspG), 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-뷰텐일 4-다이포스페이트 환원효소(IspH) 및 아이소펜텐일 다이포스페이트 아이소머라제(Idi). MEP 경로, 및 MEP 경로를 구성하는 유전자 및 효소는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제8,512,988호에 기재되어 있다. 따라서, MEP 경로를 구성하는 유전자는 dxs, dxr(또는 ispC), ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi 및 ispA를 포함한다.
IPP 및 DMAPP(MEP 경로의 산물)는 향미제, 향료, 화장품 및 식품 부문에서 특정 효용을 갖는 모노터페노이드, 세스퀴터페노이드, 다이터페노이드 및 트라이터페노이드를 포함하는 터펜 및 터페노이드의 전구체이다. 터펜 및 터페노이드의 합성은 프레닐 트랜스퍼라제 효소(예를 들어, GPPS, FPPS 또는 GGPPS)의 작용을 통한 IPP 및 DMAPP 전구체의 게라닐 다이포스페이트(geranyl diphosphate: GPP), 파네실 다이포스페이트(farnesyl diphosphate: FPP), 또는 게라닐게라닐 다이포스페이트(geranylgeranyl diphosphate: GGPP)로의 전환을 통해 진행한다. 이러한 효소는 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,927,241호, WO 2016/073740 및 WO 2016/029153에 기재되어 있고, 이들은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "MEP 탄소"는 MEP 경로의 유입물, 중간체, 대사물질 또는 산물로서 존재하는 총 탄소를 지칭한다. 대사물질은 유도체, 예컨대 분해 산물 및 인산화 및 탈인산화의 산물을 포함한다. MEP 탄소는 터페노이드 합성 경로를 포함하는 하류 경로의 산물 및 중간체를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, MEP 탄소는 MEP 경로의 다음의 유입물, 중간체 및 대사물질을 포함한다: D-글리세르알데하이드 3-포스페이트, 피루브산염, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트, 1-데옥시-D-자일룰로스, 2-C-메틸-D-에리트리톨-5-포스페이트, 2-C-메틸-D-에리트리톨, 4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨, 2-포스포-4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로다이포스페이트, 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-뷰텐일 4-다이포스페이트, 아이소펜텐일 다이포스페이트 및 다이메틸알릴 다이포스페이트. MEP 탄소는 세포에 의해 발현된 하류의 터페노이드 합성 경로에서 중간체 및 중요한 대사물질을 추가로 포함한다. 사용된 경로 및 효소에 기반하여 식별은 다를 것이지만, 이러한 산물은 게라닐 다이포스페이트(GPP), 파네실 다이포스페이트(FPP), 게라닐게라닐 다이포스페이트(GGPP), 또는 게라닐파네실 다이포스페이트(FGPP); 그들의 모노포스포릴화된 형태 게라닐 포스페이트, 파네실 포스페이트, 게라닐게라닐 포스페이트 또는 게라닐파네실 포스페이트; 그들의 알코올 게라니올, 파네솔, 게라닐게라니올 또는 게라닐파네솔뿐만 아니라 하류의 터펜 및 터페노이드 산물을 포함한다. MEP 탄소는 FPP로부터 유래된 화합물 또는 스쿠알렌, 운데카프레닐 다이포스페이트(UPP), 운데카프레닐 포스페이트, 옥타프레닐 다이포스페이트(OPP), 4-하이드록시벤조에이트, 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 2-옥타프레닐페놀, 3-옥타프레닐벤젠-1,2-다이올, 2-메톡시-6-옥타프레닐-2-메톡시-1,4-벤조퀴놀, 6-메톡시-3-메틸옥타프레닐-1,4-벤조퀴놀, 3-데메틸유비퀴놀-8, 유비퀴놀-8, 유비퀴논, 2-카복시-1,4-나프토퀴놀, 데메틸메나퀴놀-8, 메나퀴놀-8 및 메나퀴논을 포함하는 FPP를 사용하는 경로를 추가로 포함한다. MEP 탄소는 아이소프레놀, 프레놀, 아이소펜텐일 포스페이트, 및 다이메틸알릴 포스페이트 대사물질을 추가로 포함한다. MEP 탄소는 프레닐화된 인돌을 비롯한 프레닐화된 대사물질 및 단백질을 추가로 포함한다. MEP 탄소(상기 중간체 및 대사물질)는 삼중 사중극자(QQQ) 질량 검출기를 통해 질량 분석기(MS), 예컨대 이중질량분석기(MS/MS)에 의해 정량화될 수 있다. 예시적인 시스템은 애질런트(Agilent) 6460 QQQ; 대안적으로, 정량적 비행시간(quantitative time-of-flight: QTOF), 비행시간(time-of-flight: TOF), 또는 이온 트랩 질량 검출기이다.
본 발명에 따라 생산될 수 있는 예시적인 터펜 또는 터페노이드 산물은 본 명세서에 참고로 편입된 미국 특허 제8,927,241호에 기재되어 있고, 알파-구아이엔, 알파-시넨살, 아모파다이엔, 아테미신산, 베타-비사볼렌, 베타-투욘, 캄퍼, 카르베올, 카르본, 시네올, 시트랄, 시트로넬랄, 쿠베볼, 게라니올, 리모넨, 멘톨, 멘톤, 미르센, 누트카톤, 누트카톨, 패출리, 피레리톤, 로툰돈, 로즈 옥사이드, 사비넨, 스테비올, 스테비올 글리코사이드(리바우디오사이드 D 또는 리바우디오사이드 M을 포함), 탁사다이엔, 티몰 및 발렌센을 포함한다. 이콜라이에서 경로를 재조합적으로 구성하기 위한 효소는 본 명세서에 참고로 편입된 미국 특허 제8,927,241호, WO 2016/073740 및 WO 2016/029153에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 미생물 균주는 플라스미드 상에 있거나 또는 박테리아 염색체 상에 통합된, 속도 제한적이며, 오페론 또는 모듈로부터 발현될 수 있는 dxs, ispD, ispF 및/또는 idi 유전자 중 하나 이상의 적어도 하나의 추가적인 복제물을 갖는다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 오페론/모듈로서 발현된 dxs 및 idi의 적어도 하나의 추가적인 복제물; 또는 오페론 또는 모듈로서 발현된 dxs, ispD, ispF 및 idi를 갖는다. 이들 실시형태에서, 균주는 야생형에 비해 MEP 경로를 통해 증가된 유동을 제공한다. 이하에 기재하는 바와 같은 MEP 경로의 상보화는 dxs, ispD, ispF 및/또는 idi 과발현에 추가될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 FPP와 경쟁하는 하나 이상의 경쟁 효소 또는 경로, 예컨대 유비퀴논 생합성 경로 또는 IspB 효소의 하향 발현 또는 활성의 "조율"을 수반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명은 Fe-S 효소인 IspG 및 IspH의 더 높은 활성을 뒷받침하기 위해, Fe-S 클러스터 단백질의 이용 가능성 또는 활성을 증가시키는 것을 수반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 일부 실시형태에서 본 발명은, 예를 들어, 탄소를 추가로 경로 아래로 당김으로써 MEP 탄소를 증가시키는 효과를 갖는 유리한 돌연변이체 또는 오솔로그의 선택에 의해, IspG 및/또는 IspH의 발현 또는 활성의 과발현 또는 조율을 수반한다. 대안적으로, 또는 추가로, 대사체학에 의해 평가되는 바와 같은 추가적인 MEP 효소 상보화는 고 MEP 탄소를 야기하는 MEP 효소 상보화를 동정할 수 있다. 이들 및 다른 실시형태를 이하에 상세하게 기재한다.
다양한 실시형태에서, 미생물 균주는, 예를 들어, 배양물에서 광학 밀도(O.D.), 최대 O.D. 및/또는 성장률에 의해 결정하여, 탄소 공급원으로서 글루코스에 의한 균주 성장 및 생존도에 대한 실질적인 영향 없이 MEP 탄소의 실질적인 증가를 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 필수 유전자 또는 경로에 대한 변형에도 불구하고, 미생물 균주는 최대 O.D.의 약 20% 초과의 하락을 나타내지 않거나, 또는 일부 실시형태에서, 최대 O.D.의 약 15% 초과, 또는 약 10% 초과, 또는 약 5% 초과의 하락을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 균주는, 예를 들어, 성장률 또는 최대 O.D를 측정함으로써 결정되는 바와 같은 균주 성장 또는 생존도에 대해 측정 가능한 영향을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, IPP 및 FPP 기질을 이용하는 유비퀴논 생합성 경로는, 예를 들어, IspB의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써, 하향조절된다. ispB 유전자는 유비퀴논의 합성을 제어하고, 따라서 IPP 및 DMAPP 전구체에 대해 FPP 신타제와 직접적으로 경쟁하는 옥타프레닐 다이포스페이트 신타제를 암호화한다. IspB는 이콜라이에서 필수 유전자이다. 문헌[Kainou T, et al., Dimer formation of octaprenyl-diphosphate Synthase ( IspB ) is essential for chain length determination of ubiquinone, J. Biol . Chem . 276(11):7867-7883 (2001)] 참조. 그러나, ispB RBS 서열을 변형시키고 mRNA의 번역을 낮춤으로써 세포내 IspB 효소 양을 감소시키는 것은 균주의 성장 및 생존도에 대한 실질적인 또는 측정 가능한 영향 없이, 터페노이드 재조합 경로쪽으로 탄소 유동을 이동시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, IspB 활성 또는 발현은 모 균주의 약 80% 이하, 또는 모 균주의 약 70% 이하, 또는 모 균주의 약 50% 이하, 또는 모 균주의 약 40% 이하 또는 모 균주의 약 25% 이하로 감소된다.
샤인-달가노(Shine-Dalgarno: SD) 서열은 박테리아에서 리보솜 결합 부위이고, 일반적으로 개시 코돈 AUG 상류에 대략 8개 염기로 위치된다. RNA 서열은 개시 코돈과 함께 리보솜을 정렬시킴으로써 단백질 합성을 개시하도록 전령 RNA(mRNA)에 리보솜 보충을 돕는다. 일부 실시형태에서, ispB 유전자에서 6-염기 SD 서열은 CGTGCT 또는 CGTGCC이거나, 또는 CGTGCT 또는 CGTGCC로부터 1 또는 2개의 뉴클레오타이드 변화를 갖는 이들의 변형이다. 이러한 실시형태에서, IspB 번역은 저하되어, 이콜라이 성장 및 생존도에 대한 실질적인 또는 측정 가능한 영향 없이, 터페노이드 생합성에 대한 증가된 탄소 유동을 허용한다.
일부 실시형태에서, IspB의 발현 또는 활성은 ispB 유전자 발현을 변경시킴으로써, 즉, 전사를 감소시키기 위한 프로모터 영역을 변형시킴으로써, 또는 ispB RNA 또는 암호화된 단백질의 분해 속도를 향상시킴으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, ispB 효소의 활성은 ispB 아미노산 서열의 돌연변이 또는 박테리아 균주에서 활성이 감소된 ispB 오솔로그의 선택에 의해 감소된다. 이콜라이로부터의 야생형 IspB 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열번호 3으로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 기질 결합 부위 및/또는 활성 부위에 대한 하나 이상의 치환을 포함하는 단백질의 활성을 감소시키기 위해 IspB 아미노산 서열(서열번호 3)로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 (오솔로그이든 또는 돌연변이체 서열이든) 서열번호 3과 약 50% 내지 약 99% 서열 동일성, 또는 서열번호 3에 대해 약 60% 내지 약 99% 서열 동일성, 또는 서열번호 3에 대해 약 70% 내지 약 99% 서열 동일성, 또는 서열번호 3에 대해 약 80% 내지 약 99% 서열 동일성, 또는 서열번호 3에 대해 약 90% 내지 약 99% 서열 동일성, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 95% 내지 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 이러한 돌연변이체 및 오솔로그는 문헌[Kainou T, et al., Dimer formation of octaprenyl - diphosphate Synthase ( IspB ) is essential for chain length determination of ubiquinone, J. Biol . Chem. 276(11):7867-7883 (2001); 또는 Han, et al., Crystal structures of ligand -bound octaprenyl pyrophosphate synthase from Escherichia coli reveal the catalytic and chain-length determining mechanisms Proteins 2015 Jan;83(1):37-45]에 의해 알려질 수 있다.
일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 균주에서 MEP 탄소의 양을 잠재적으로 개선시키기 위해 Fe-S 효소, 예컨대 IspG 및/또는 IspH의 향상된 생물학을 뒷받침한다. MEP 경로에서 IspG 및 IspH 효소는 철-황 클러스터 효소인데, 이는 그들이 작용하는 그들의 활성 부위에서 Fe-S 이온의 특별한 배열을 필요로 하며, 그들의 화학작용을 한다는 것을 의미한다. 이들 Fe-S 클러스터는 수명에 중요하며, 산소 및 산소화에 대해 믿을 수 없게 민감한데, 이는 그들을 비활성화시킨다. 혐기성 또는 호기성 성장 조건하에서, iscR은 Fe-S 클러스터 생물발생 경로에 대한 유전자를 암호화하는 오페론 iscRSUA의 전사를 나타낸다. iscR에 의한 isc 오페론의 억제는 배지에서 Fe-S 클러스터에 대한 요구에 반응하는데, isc 오페론의 전사를 억제할 수 있도록 iscR이 Fe-S 기에 결합하여야 하기 때문이다. 혐기생활 하에서, Fe-S 기에 대한 요구는 호기생활 하에서 더 낮으며, 따라서, 오페론의 억제는 호기생활 하에서보다 더 강하다. iscR은 iscRSUA 오페론의 전사를 억제하기 위해 프로모터 서열과 중복되는 2개의 DNA-결합 부위를 인식하고 이에 결합한다. 단백질이 이들 부위에 결합될 때, RNA 중합효소는 프로모터 영역을 개시 부위에 결합할 수 없을 가능성이 있다.
일부 실시형태에서, isc 오페론은 강한, 중간 또는 약한 박테리아 프로모터 중 하나를 이용하여 터펜 또는 터페노이드 생산을 위해 사용되는 조건 하에 발현된다. 프로모터의 강도는 변화될 수 있고 터페노이드 산물을 개선시키도록 조율될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 강한 구성적 프로모터이다.
isc 오페론(즉, iscR)의 프로모터 및 제1 유전자가 결실되고 그것을 구성적 또는 유도성 프로모터로 대체하여 오페론에 남아있는 유전자의 발현을 유도할 때, 철-황 클러스터 효소 성능의 개선이 얻어진다. 따라서, 일부 실시형태에서, 박테리아 균주(예를 들어, 이콜라이)는 iscSUA의 유도성 또는 구성적 과발현과 함께 iscR 결실을 함유한다. 이콜라이에 대한 유도성 및 구성적 프로모터는 공지되어 있고, 오페론의 발현을 조율하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있다. 다양한 실시형태에서, iscR 유전자는 완전히 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 RBS 또는 개시 코돈에 대한 하나 이상의 돌연변이에 의해 비활성화된다. 일부 실시형태에서, iscR 유전자는 아미노산 돌연변이에 의해 비활성화된다. 다양한 실시형태에서, Fe-S 효소 조절에 대한 변형은 이콜라이에서 터페노이드 생산을 위해 종종 사용되는 호기성 또는 미호기성(microaerobic) 조건하에서를 비롯하여, 균주의 성장 또는 생존도에 대해 실질적인 또는 측정 가능한 영향 없이 MEP 탄소를 증가시킨다. isc 오페론은 문헌[Santos JA, What a difference a cluster makes: The multifaceted roles of IscR in gene regulation and DNA recognition, Biochim. Biophys. Acta 1854(9):1102-12 (2015)]에서 추가로 검토된다.
일부 실시형태에서, 이콜라이는 ryhB 결실 또는 비활성화를 함유한다. RyhB는 TCA 주기 및 호기성 호흡 사슬의 효소를 포함하는 철-함유 단백질의 발현을 하향조절함으로써 저-철 조건 하에 철 소비를 감소시키는 작용을 하는 소형 RNA이다. 추가로, ryhB는 시데로포어 엔테로박틴의 합성을 촉진시킨다. RyhB는 길이가 대략 90개의 nt인 소형 RNA이다. RyhB는 iscR과 iscS 오픈 리딩 프레임 사이에서 다시트론성 iscRSUA mRNA의 절단을 촉진시킨다. IscR-암호화 5' 단편은 안정하게 남아있는 한편, iscSUA 3' 단편은 분해되는 것으로 나타난다. 문헌[Mandin et al., (2016) A regulatory circuit composed of a transcription factor, IscR, and a regulatory RNA, RyhB, controls Fe-S cluster delivery, mBio 7(5):e00966-16] 참조. 다양한 실시형태에서, ryhB의 결실 또는 비활성화(예를 들어, 뉴클레오타이드 돌연변이에 의함)는 균주의 선별 또는 터페노이드의 생산을 위해 사용되는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건하에서를 포함하는 균주 성장 또는 생존도에 대한 실질적인 또는 측정 가능한 영향 없이, MEP 탄소를 증가시킨다.
일부 실시형태에서, MEP 효소 발현 또는 활성은 플라스미드 상에 있든 또는 게놈 내로 통합되든, 예를 들어, 추가적인 효소 복제물과의 상보성에 의해 탄소를 추가로 경로 아래로 이동시키도록 변경되거나 또는 균형화된다. 도 13에 나타낸 바와 같이, MEP 유전자의 과발현은 산물 역가의 하락을 야기할 수 있다. 예를 들어, G5 모체 수준 이상으로 MEP 유전자의 발현 수준 증가는 생성되는 터페노이드 산물 A의 대략 50% 미만을 초래하며, 더 강한 발현(+++)은 더 약한 발현 이상(+)으로 감소를 악화시킨다. 대조적으로, dxr을 발현시키는 오페론에 대한 ispG 및 ispH 유전자의 첨가는 산물 역가의 모체 수준으로의 회복을 가능하게 하는데, 이는 이 경로에서 유전자 발현의 조심스러운 균형화가 높은 터페노이드 산물 역가를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
산물 A 역가는 하락되거나 또는 MEP 상보화와 동일하게 정체되지만, 중간체 MEP 경로 대사물질은 농도가 상당히 더 증가되었다. 대다수의 MEP 중간체는 세포 외에서 관찰되며, DOX, ME, 및 MEcPP가 대부분이고; 주요 세포내 산물은 상보화된 균주에서 관찰되는 증가된 축적이 있는 CDP-ME이다. dxr 과발현은 산물 A 역가가 2배만큼 하락하도록 야기하며, MEP 경로로 유입되고 중간체로서 축적되는 탄소의 양은 6배까지가 되었는데, 즉, 더 많은 탄소가 MEP 경로로 유입되지만, 그 중 소량이 배출된다. 게다가, G5 모체는 대부분 DOX(및 일부 MEcPP)를 축적하며, dxr(DOXP를 MEP로 전환)의 증가는 탄소를 경로 아래로 이동시켜, ME 및 MEcPP로서 세포외로 더 많은 탄소 풀링을 초래한다. dxr 상부에서 ispE 발현의 증가는 G5 모체의 거의 10배 이상으로 MEP 경로에서 탄소의 양을 추가로 증가시키며, 거의 모든 해당 탄소를 MEcPP에 대해 하류로 이동시켰다. 흥미롭게도, dxr에 추가로 ispG 및 ispH를 과발현시키는 것은, 산물 역가가 이전의 예에서 2배가 되긴 하지만, dxr만을 과발현시키는 것과 매우 유사한 중간 프로파일을 제공한다.
일부 실시형태에서, 박테리아 균주는, 선택적으로 ispD, ispE 및 ispF의 하나 이상의 과발현과 함께 dxr 또는 이의 상동체 또는 오솔로그 및 ispG 및/또는 ispH의 과발현을 함유한다. 유전자는 개개로 또는 오페론에서 과발현될 수 있다. 추가적인 복제물은 플라스미드로부터 발현되거나 또는 게놈 내로 통합될 수 있다. dxr의 과발현은 DOXP를 ME 및 MEcPP로 밀어내고 하류의 병목 지역을 밀어낸다. 도 1 참조. 일부 실시형태에서, dxr 및 ispE(또는 이의 상동체, 오솔로그, 또는 유도체)는 과발현되는데, 이는 DOXP를 주로 MEcPP로 밀어낸다. 도 14 참조. MEcPP에 대한 병목 지역으로 이동 시, MEP 경로 잠재력의 3배가 관찰될 수 있다(도 15).
이콜라이로부터의 야생형 Dxr 아미노산 서열은 서열번호 4로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 야생형 dxr 활성은 하나 이상의 추가적인 유전자 복제물로 상보화되는데, 이는 야생형 효소를 암호화할 수 있거나, 또는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 및 결실로부터 독립적으로 선택된 1 내지 10가지의 변형)을 갖는 비천연 또는 변형 효소를 암호화하여 효소 활성 또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 이콜라이 효소보다 더 높은 활성을 갖는 dxr 오솔로그로 상보화된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 이콜라이 Dxr에 대해 낮은 서열 상동성을 갖는 Dxr-유사 효소인 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) DRL 효소(서열번호 8)를 발현시킨다. 문헌[
Figure pct00001
, J., et al., 2012. Crystal structure of brucella abortus deoxyxylulose -5-phosphate reductoisomerase -like ( DRL ) enzyme involved in isoprenoid biosynthesis. Journal of Biological Chemistry, 287(19), pp.15803-15809]. 일부 실시형태에서, DRL 효소는 박테리아 숙주 세포에서 활성 및/또는 발현을 위해 효소의 특성을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 및 결실로부터 독립적으로 선택된 1 내지 10개의 변형)을 갖는다.
예를 들어, 다양한 실시형태에서, 박테리아 균주는 서열번호 4 또는 8과 50% 이상의 서열 동일성, 또는 서열번호 4 또는 8의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성, 또는 적어도 약 70% 서열 동일성, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 Dxr 효소를 과발현시키거나 또는 이것으로 상보화된다. 일부 실시형태에서, Dxr 효소는 기질 결합 부위 및/또는 활성 부위 중 하나 이상에 대한 치환을 포함하는, 단백질의 활성을 변경시키기 위해 Dxr 또는 DRL 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 4 또는 8)에 대해 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 이러한 돌연변이체는 문헌[Yajima S, et al., Structure of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in a quaternary complex with a magnesium ion, NADPH and the antimalarial drug fosmidomycin, Acta Cryst. F63, 466-470 (2007) 및 Perez-Gil, et al., Crystal structure of brucella abortus deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase-like (DRL) enzyme involved in isoprenoid biosynthesis, Journal of Biological Chemistry, 287(19): 15803-15809 (2012)]을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 효소 구조에 의해 알려질 수 있다.
일부 실시형태에서, 야생형 IspE 활성은 야생형 효소를 암호화할 수 있는 하나 이상의 추가적인 유전자 복제물로 상보화되거나, 또는 효소 활성 또는 안정성을 증가시키기 위해 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 및 결실로부터 독립적으로 선택된 1 내지 10개의 변형)을 갖는 변형된 효소를 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 이콜라이 또는 천연 박테리아 효소보다 더 큰 활성을 갖는 IspE 오솔로그에 의해 상보화된다. 이콜라이 IspE 아미노산 서열은 서열번호 7로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 ispE 또는 이의 유도체, 상동체 또는 오솔로그의 적어도 하나의 추가적인 유전자 복제물을 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 추가적인 IspE 효소는 이콜라이 IspE이거나 또는 효소의 증가된 활성 및/또는 안정성을 제공할 수 있는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 및 결실로부터 독립적으로 선택된 1 내지 10개의 변형)을 포함한다.
예를 들어, 다양한 실시형태에서, 박테리아 균주는 서열번호 7과 50% 이상의 서열 동일성 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성, 또는 적어도 약 70% 서열 동일성, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 IspE 효소를 과발현시키거나 또는 이것으로 상보화된다.
일부 실시형태에서, 균주는 IspG 및/또는 IspH에 의한 상보화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 유전자는 천연 유전자와 동일하거나 또는 활성을 증가시키도록 변형될 수 있거나, 또는 천연 박테리아(예를 들어, 이콜라이) 효소보다 더 높은 활성을 갖는 IspG 또는 IspH 오솔로그일 수 있다. 예를 들어, IspG에 대해, 아미노산 서열은 서열번호 5과 50% 이상의 서열 동일성, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성, 또는 적어도 약 70% 서열 동일성, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 97% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 기질 결합 부위 또는 활성 부위 중 하나 이상에 대한 치환을 포함하는, 단백질의 활성을 변경시키기 위해 IspG 아미노산 서열(서열번호 5)로 만들어진다. 이콜라이 또는 다른 IspG에 대한 변형은 상동성 모델의 구성에 의해 알려질 수 있다. 예를 들어, 이콜라이 IspG 상동성 모델의 구성을 위한 적합한 상동체는 문헌[Lee M, et al. Biosynthesis of isoprenoids: crystal structure of the [4Fe-4S] cluster protein IspG. J Mol Biol. 2010 Dec 10;404(4):600-10]에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, IspG 효소는 V30, S32, T34, N35, R37, V59, V61, S62, V63, L83, V84, C104, L105, P131, I132, I134, A138, K143, F176, K177, V178, V180, A182, L205, I207, A210, G212, A213, L236, V238, A241, A242, D243, R259, S262, R263, I265, N266, F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289, S301, I302, I303, V306으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시형태에서, 변형은, (1) V30, S32, T34, N35, R37; 또는 (2) V59, V61, S62, V63, L83, V84; 또는 (3) C104, L105, S301, I302, I303, V306; 또는 (4) P131, I132, I134, A138, K143; 또는 (5) F176, K177, V178, V180, A182; 또는 (6) L205, I207, A210, G212, A213; 또는 (7) L236, V238, A241, A242, D243; 또는 (8) R259, S262, R263, I265, N266; 또는 (9) F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289로부터 선택된 복수의 위치에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, IspG 효소는 다음의 돌연변이 중 1, 2, 3 또는 모두를 갖는다: L205V, A210S, G212T 및 A213I.
추가로, IspH에 대해, 아미노산 서열은 서열번호 6과 50% 이상의 서열 동일성, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성, 또는 적어도 약 70% 서열 동일성, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 기질 결합 부위 또는 활성 부위 중 하나 이상에 대한 치환을 포함하는, 단백질의 활성을 변경시키기 위해 IspH 아미노산 서열(서열번호 6)로 만들어진다. IspH 효소에 대한 변형은 문헌[Grawert, T., et al. Structure of active IspH enzyme from Escherichia coli provides mechanistic insights into substrate reduction 2009 Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 48: 5756-5759]을 포함하는 이용 가능한 IspH 구조에 의해 알려질 수 있다.
이들 또는 다른 실시형태에서, pgi(글루코스-6-포스페이트 이성질화 효소) 활성 돌연변이체(예를 들어, 감소된 활성을 가짐)는 탄소 유동을 잠재적으로 변경시키도록 혼입되고, 산물 역가의 추가적인 개선을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, pgi는 부분적으로 결실되거나 또는 비활성화된다. 일부 실시형태에서, pgi는 산물 역가 또는 MEP 탄소에 대한 효소 활성을 변경하거나 또는 조율하기 위해 1 내지 약 30개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실(예를 들어, 약 1 내지 20, 또는 약 1 내지 10개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실)을 함유한다.
뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 유사성, 즉, 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 몇몇 당업계에 공지된 알고리즘, 예컨대, 카를린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)의 수학 알고리즘에 의해(Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), 해멀린(hmmalign)에 의해(HMMER 패키지, http://hmmer.wustl.edu/) 또는 클러스탈(CLUSTAL) 알고리즘에 의해(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) 수행될 수 있다. 서열 동일성(서열 매칭)의 등급은, 예를 들어, BLAST, BLAT 또는 BlastZ(또는 BlastX)를 이용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘이 문헌[Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 편입된다. BLAST 폴리뉴클레오타이드 검색은 BLASTN 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다.
BLAST 단백질 검색은 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭핑된 정렬을 얻기 위해, 갭핑된 BLAST는 문헌[Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용된다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수가 사용된다. 서열 매칭 분석은 셔플-라간(Shuffle-LAGAN)(Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:154-162) 또는 마르코브 랜덤장(Markov random field)과 같은 확립된 상동성 맵핑 기법에 의해 보충될 수 있다.
"상보적 치환"은, 예를 들어, 수반된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성에 기반하여 만들어질 수 있다. 20종의 천연 유래 아미노산은 다음의 6개의 표준 아미노산 그룹으로 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "상보성 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹의 동일한 그룹 내에 열거된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다. 예를 들어, Asp의 Glu에 의한 교환은 이렇게 변형된 폴리펩타이드에서 하나의 음전하를 보유한다. 추가로, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 방해하는 그들의 능력에 기반하여 서로 치환될 수 있다. 상기 6개 그룹 내에서 일부 바람직한 상보성 치환은 다음의 하위 그룹 내의 교환이다: (i) Ala, Val, Leu 및 Ile; (ii) Ser 및 Thr; (ii) Asn 및 Gin; (iv) Lys 및 Arg; 및 (v) Tyr 및 Phe.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "비-상보성 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 상이한 그룹에 열거된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다.
본 명세서에 기재된 효소의 변형은 보존적 및/또는 비보존적 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서 "합리적 설계"는 효소에서 특정 돌연변이를 작제하는 데 수반된다. 합리적 설계는 효소 또는 관련된 효소의 지식, 예컨대 그의 반응 열역학 및 역학, 그의 3차원 구조, 그의 활성 부위(들), 그의 기질(들) 및/또는 효소와 기질 사이의 상호작용을 구체적 돌연변이 설계에 편입시키는 것을 지칭한다. 합리적 설계 접근에 기반하여, 돌연변이는 효소에서 생성될 수 있는데, 이는 대조군 수준에 비해 터펜 또는 터페노이드의 증가된 생성을 위해 선별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 상동체 모델에 기반하여 합리적으로 설계될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "상동체 모델링"은 단백질의 아미노산 서열로부터 하나의 단백질의 원자 해상도 모델 및 관련된 상동성 단백질의 3차원 구조를 구성하는 과정을 지칭한다.
소정의 실시형태에서, 박테리아 세포는 하나 이상의 터펜 또는 터페노이드 화합물을 생산한다. 또한 아이소프레노이드로서 지칭되는 터페노이드는 5-탄소 아이소프렌 단위(C5)로부터 유래된 유기 화학이다. 그들이 함유하는 아이소프렌 유닛 수에 기반하여 분류되는 터페노이드의 몇몇 비제한적 예는 헤미터페노이드(1개의 아이소프렌 단위), 모노터페노이드(2개의 아이소프렌 단위), 세스퀴터페노이드(3개의 아이소프렌 단위), 다이터페노이드(4개의 아이소프렌 단위), 세스터터페노이드(5개의 아이소프렌 단위), 트라이터페노이드(6개의 아이소프렌 단위), 테트라터페노이드(8개의 아이소프렌 단위) 및 더 다수의 아이소프렌 단위를 갖는 폴리터페노이드를 포함한다. 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 모노터페노이드, 세스퀴터페노이드, 다이터페노이드, 세스터페노이드 또는 트라이터페노이드로부터 선택되는 터페노이드를 생산한다. 터페노이드는 식품 및 음료 산업뿐만 아니라 향수, 화장품 및 건강관리 산업에서를 포함하는 수많은 상업적 적용분야를 제공하는 다양한 부류의 분자를 나타낸다. 예로서, 터페노이드 화합물은 향수(예를 들어, 패쵸롤)에서, 향미제 산업(예를 들어, 누트카톤)에서, 감미제(예를 들어, 스테비올) 또는 치료제(예를 들어, 탁솔)로서의 용도를 발견하며, 다수는 식물로부터 통상적으로 추출된다. 그럼에도 불구하고, 터페노이드 분자는 천연에서 ppm 수준으로 발견되며, 따라서 상업적 적용에 충분한 양을 얻기 위해 대규모 수확을 필요로 한다.
숙주 세포는 일반적으로 IPP 및 DMAPP 전구체로부터 터페노이드를 생성하는 재조합 하류의 경로를 함유할 것이다. 터펜, 예컨대 모노터펜(C10), 세스퀴터펜(C15), 다이터펜(C20), 세스터터펜(C25) 및 트라이터펜(C30)은 터펜(터페노이드) 신타제로 불리는 효소의 매우 큰 그룹 작용을 통해 각각 프레닐 다이포스페이트 기질, 게라닐 다이포스페이트(GPP), 파네실 다이포스페이트(FPP) 게라닐게라닐 다이포스페이트(GGPP), 게라닐파네실 다이포스페이트(FGPP) 및 FPP로부터 유래된다. 반응 산물이 다양한 모노터펜, 세스퀴터펜, 다이터펜, 세스터터펜 및 트라이터펜 탄소 골격 산물에 대해 고리화되기 때문에 이들 효소는 종종 터펜 사이클라제로서 지칭된다. 다수의 얻어진 탄소 골격은 유도체의 다수 패밀리가 생기게 하기 위해 사이토크롬 P450 효소에 의한 하위서열 산소화를 겪는다.
다이터펜 및 세스퀴터펜 스캐폴드 상에서 작동하는 예시적인 사이토크롬 P450 효소는 본 명세서에 참고로 편입된 WO 2016/073740 및 WO 2016/029153에 기재되어 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 박테리아 균주에서 용도를 발견한 사이토크롬 P450 환원효소 단백질은 WO 2016/029153뿐만 아니라 WO 2016/073740에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서 본 발명의 산물은 하나 이상의 산소화된 터페노이드이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "산소화된 터페노이드"는 하나 이상의 산소화 사건을 갖고, 대응하는 알코올, 알데하이드, 카복실산 및/또는 케톤을 생성하는 터펜 스캐폴드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 박테리아 세포는 아비에타다이엔, 아비에트산, 알파-시넨살, 아르테미신산, 베타-투욘, 캄퍼, 카르베올, 카르본, 셀라스트롤, 세로플라스톨, 시네올, 시트랄, 시트로넬랄, 쿠베볼, 쿠쿠르비탄, 포스콜린, 가스카딘산, 게라니올, 하슬렌, 레보피마르산, 리모넨, 루페올, 멘톨, 멘톤, 모그로사이드, 누트카톤, 누트카톨, 오피오볼린 A, 파촐리, 피페리톤, 레바우디오사이드 D(RebD), 레바우디오사이드 M(RebM), 사비넨, 스테비올, 스테비올 글리코사이드, 탁사다이엔, 티몰 및 우르솔산으로부터 선택된 적어도 하나의 터페노이드를 생산한다.
일부 실시형태에서, 터페노이드 신타제 효소는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 편입된 WO 2016/029153 및 WO 2016/073740에 개시된 바와 같은 효소의 역학, 안정성, 산물 프로파일 및/또는 온도 내성을 향상시키기 위해 상향 조정된다.
다른 실시형태에서, 박테리아 세포는 발렌센 및/또는 누트카톤을 생산한다. 이러한 실시형태에서, 박테리아 세포는 파네실 다이포스페이트 신타제, 발렌센 신타제 및 발렌센 옥시다제를 추가로 포함하는 생합성 경로를 발현시킬 수 있다. 파네실 다이포스페이트 신타제(FPPS)는 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)로부터 파네실 다이포스페이트를 생산한다. 예시적인 파네실 다이포스페이트 신타제는 사카로마이세스 세레비시애(NCBI 수탁번호 P08524) 및 이콜라이 ispA의 ERG20이다. 발렌센 신타제는 세스퀴터펜 스캐폴드를 생성하고, 예를 들어, 본 명세서 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제2012/0107893호, 미국 특허 제2012/0246767호 및 미국 특허 제7,273,735호에 기재되어 있다. 발렌센 및/또는 누트카톤를 포함하는 터페노이드 산물의 생산을 위한 유전자 및 숙주 세포는 본 명세서에 참고로 편입된 WO 2016/029153에 기재되어 있다.
실시형태에서, 박테리아 세포는 스테비올 또는 스테비올 글리코사이드(예를 들어, RebD 또는 RebM)를 생산한다. 스테비올은 2개의 P450 효소, 카우렌 옥시다제(KO) 및 카우레노산 하이드록실라제(KAH)의 작용에 의해 카우렌으로부터 생성된다. 스테비올의 생성 후에, 다양한 스테비올 글리코사이드 산물은 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있는 일련의 글리코실화 반응을 통해 생성될 수 있다. 스테비올 및 스테비올 글리코사이드의 생성을 위한 경로 및 효소는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제2013/0171328호, 미국 특허 제2012/0107893호, WO 2012/075030, WO 2014/122328에 개시되어 있다. WO 2016/073740은 RebM의 생성을 위해 효소 및 박테리아 숙주 세포를 추가로 개시한다.
터펜 또는 터페노이드 화합물의 생산을 위한 다른 생합성 경로는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제8,927,241호에 개시되어 있다.
박테리아 숙주 세포는 터페노이드 산물을 생산하기 위해, 향상된 MEP 경로 유동을 이용하여 배양된다. 일부 실시형태에서, 탄소 기질, 예컨대 C1, C2, C3, C4, C5 및/또는 C6 탄소 기질은 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산을 위해 사용된다. 예시적인 실시형태에서, 탄소 공급원은 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 자일로스 및/또는 글리세롤이다. 배양물 조건은 일반적으로 호기성, 미호기성 및 호기성으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 22℃ 내지 37℃의 온도에서 배양될 수 있다. 박테리아, 예컨대 이콜라이에서 상업적 생합성은 과발현 및/또는 외래 효소(예를 들어, 식물로부터 유래된 효소)가 안정한 온도에 의해 제한될 수 있지만, 재조합 효소(터페노이드 신타제를 포함)는 배양물이 더 고온에서 유지되도록 조작되어, 더 고수율 및 더 높은 전반적 생산성을 야기할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양은 약 22℃ 이상, 약 23℃ 이상, 약 24℃ 이상, 약 25℃ 이상, 약 26℃ 이상, 약 27℃ 이상, 약 28℃ 이상, 약 29℃ 이상, 약 30℃ 이상, 약 31℃ 이상, 약 32℃ 이상, 약 33℃ 이상, 약 34℃ 이상, 약 35℃ 이상, 약 36℃ 이상, 또는 약 37℃에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 추가로 상업적 규모로 상업적 생산에 적합하다. 일부 실시형태에서, 배양물의 크기는 적어도 약 100ℓ, 적어도 약 200ℓ, 적어도 약 500ℓ, 적어도 약 1,000ℓ 또는 적어도 약 10,000ℓ이다. 실시형태에서, 배양은 회분 배양, 연속 배양, 또는 준연속 배양으로 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 세포 배양물로부터 또는 세포 용해물로부터 터펜 또는 터페노이드 산물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 적어도 약 100㎎/ℓ, 또는 적어도 약 200㎎/ℓ, 또는 적어도 약 500㎎/ℓ, 또는 적어도 약 1 g/ℓ, 또는 적어도 약 2 g/ℓ 또는 적어도 약 5 g/ℓ, 또는 적어도 약 10 g/ℓ, 또는 적어도 약 20 g/ℓ, 또는 적어도 약 30 g/ℓ 또는 적어도 약 40 g/ℓ의 터펜 또는 터페노이드 산물을 생산한다.
일부 실시형태에서, 인돌 생성물(프레닐화된 인돌을 포함)은 터페노이드 생성을 위한 대용 마커로서 사용되고/그리고 배양물에서 인돌의 축적은 생산을 증가하도록 제어된다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 배양물에서 인돌의 축적은 약 100㎎/ℓ 미만, 또는 약 75㎎/ℓ 미만, 또는 약 50㎎/ℓ 미만, 또는 약 25㎎/ℓ 미만, 또는 약 10㎎/ℓ 이하이다. 인돌의 축적은 미국 특허 제8,927,241호(본 명세서에서 참고로 편입됨)에 기재된 다변량 모듈 접근을 이용하여 단백질 발현 및 활성의 균형화에 의해 제어될 수 있고/있거나 화학적 수단에 의해 제어된다.
터펜 및 터페노이드의 효율적인 생산을 위한 다른 마커는 배양물 배지에서 DOX 또는 ME의 축적을 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 박테리아 균주는 약 5g/ℓ 미만, 또는 약 4g/ℓ 미만, 또는 약 3g/ℓ 미만, 또는 약 2g/ℓ 미만, 또는 약 1g/ℓ 미만, 또는 약 500㎎/ℓ 미만, 또는 약 100㎎/ℓ 미만으로 배양물에서 축적되는 이들 화학적 종 미만으로 축적된다.
MEP 경로 유전자의 조작뿐만 아니라 상류 및 하류 경로의 조작에 의한 터펜 또는 터페노이드 생산의 최적화는 단순한 선형 또는 첨가 공정이 되는 것으로 예상되지 않는다. 오히려, 조합 분석을 통해, 최적화는 MEP 경로뿐만 아니라 상류 및 하류의 경로 성분의 균형화를 통해 달성된다. 배양물에서 인돌(프레닐화된 인돌을 포함) 축적 및 MEP 대사물질 축적(예를 들어, DOX, ME, MEcPP 및/또는 파네솔)은 이 공정을 안내하기 위한 대용 마커로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 MEP 탄소를 개선시키기 위해 본 명세서에 기재된 추가적인 MEP 경로 상보화에 의해, (플라스미드 상의 또는 게놈에 통합된) 오페론/모듈로서 발현된 dxs 및 idi의 적어도 하나의 추가적인 복제물; 또는 오페론 또는 모듈로서 발현된 dxs, ispD, ispF 및 idi를 갖는다. 예를 들어, 박테리아 균주는 MEP 탄소를 증가시키고/시키거나 터펜 또는 터페노이드 역가를 개선시키도록 조율된 이들 유전자의 발현에 의해, 선택적으로 ispE 및/또는 idi의 추가적인 복제물과 함께 dxr, 및 ispG 및/또는 ispH의 추가적인 복제물을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 박테리아 균주는 MEP 탄소를 증가시키고/시키거나 터펜 또는 터페노이드 역가를 개선시키도록 조율된 이들 유전자의 발현에 의해, 선택적으로 idi의 추가적인 복제물과 함께 적어도 dxr, ispE, ispG 및 ispH의 추가적인 복제물을 갖는다.
유전자 모듈을 포함하는 유전자 및/또는 단백질 발현의 조작은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 오페론의 발현은 상이한 강도(예를 들어, 강함, 중간 또는 약함)로 유도성 또는 구성적 프로모터와 같은 프로모터의 선택을 통해 조절될 수 있다. 상이한 길이의 프로모터의 몇몇 비제한 예는 Trc, T5 및 T7을 포함한다. 추가적으로, 유전자 또는 오페론의 발현은 세포에서 유전자 또는 오페론의 복제수 조작을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 모듈 내에서 유전자 순서 조작을 통해 조절될 수 있으며, 여기서 처음 전사된 유전자는 일반적으로 더 고수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 하나 이상의 유전자 또는 오페론의 염색체 내로의 통합을 통해 조절된다.
단백질 발현의 최적화는 또한 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 일부 실시형태에서, 이는 높은 복제수 플라스미드 또는 단일-, 저- 또는 중간-복제수 플라스미드의 선택을 포함할 수 있다. 전사 종결 단계는 또한 줄기-루프와 같은 구조의 도입 또는 제거를 통한 유전자 발현의 조절을 위해 표적화될 수 있다.
발현을 위한 모든 필요한 요소를 함유하는 발현 벡터는 상업적으로 입수 가능하며, 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조. 세포는 이종성 DNA 세포 내로의 도입에 의해 유전자 조작된다. 이종성 DNA는 숙주 세포 내 이종성 DNA의 발현을 허용하도록 전사 요소의 작동 가능한 제어하에 놓인다.
일부 실시형태에서, 유전자 상보성과 대조적으로 내인성 유전자는 편집된다. 편집은 내인성 프로모터, 리보솜 결합 서열 또는 다른 발현 제어 서열을 변형시킬 수 있고/있거나 일부 실시형태에서 유전자 조절에서 트랜스-작용성 및/또는 시스-작용성 인자를 변형시킨다. 게놈 편집은 CRISPR/Cas 게놈 편집 기법, 또는 아연 핑거 뉴클레아제 및 TALEN을 사용하는 유사한 기법을 이용하여 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자는 상동성 재조합에 의해 대체된다.
일부 실시형태에서, 유전자는 유전자 복제수를 적어도 부분적으로 제어함으로써 과발현된다. 유전자 복제수는 다양한 복제수를 갖는 플라스미드를 이용하여 편리하게 제어될 수 있지만, 유전자 복제 및 염색체 통합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 안정한 탠덤 유전자 중복을 위한 과정은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제2011/0236927호에 기재되어 있다.
터펜 또는 터페노이드 산물은 목적으로 하는 산물을 유기상 또는 소수성상으로 분할하는 것을 포함하는, 임의의 적합한 과정에 의해 회수될 수 있다. 대안적으로, 수성상이 회수될 수 있고/있거나 추가적인 가공을 위해 전체 세포 바이오매스가 회수될 수 있다. 목적으로 하는 산물의 생산은, 예를 들어, 기체 크로마토그래피(예를 들어, GC-MS)에 의해 결정되고/되거나 정량화될 수 있다. 목적으로 하는 산물은 회분식 또는 연속적 생물반응기 시스템에서 생산될 수 있다. 산물의 생산, 산물의 회수 및/또는 분석은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제2012/0246767호에 기재된 바와 같이 행해질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 산물 오일은 유기 용매, 예컨대 알칸, 예컨대 헵탄 또는 도데칸을 이용하여 수성 반응 배지로부터 추출된 다음에, 분별증류된다. 다른 실시형태에서, 산물 오일은 소수성 상, 예컨대 식물성 오일을 이용하여 수성 반응 배지로부터 추출된 다음에 유기 용매 추출 및 분별 증류된다. 분획의 터펜 및 터페노이드 성분은 GC/MS에 의해 정량적으로 측정된 다음 목적으로 하는 산물 프로파일을 생성하도록 분획을 배합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 회수된 터펜 또는 터페노이드는 제품(예를 들어, 소비재 또는 산업적 제품)에 혼입된다. 예를 들어, 제품은 향미제 제품, 향료 제품, 감미제, 화장품, 청소용품, 세정제 또는 비누 또는 해충 방제 제품일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 회수된 산물은 누트카톤을 포함하고, 산물은 음료, 츄잉검, 사탕 또는 향미 첨가물로부터 선택된 향미제 제품이거나, 또는 제품은 방충제 또는 살충제이다. 일부 실시형태에서, 산화된 산물은 감미제로서 제공되거나 또는 성분, 향미제, 음료 또는 식품 제품 내로 혼입되는 스테비올 또는 스테비올 글리코사이드(예를 들어, RebM)이다.
본 발명은 추가로 본 명세서에서 생성된 터펜 또는 터페노이드를 혼입시킴으로써 제품, 예컨대 식품, 음료, 결착제(예를 들어, 전분, 섬유질, 고무진, 지방 및 지방 모방체 및 유화제), 약제학적 제품, 담배 제품, 기능 식품 제품, 구강위생 제품 및 화장품을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시형태에서 생성된 이러한 종의 더 높은 수율은 상당한 비용 이점뿐만 아니라 지속 가능성을 제공할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 MEP 탄소를 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 갖는 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 박테리아 세포는 MEP 경로를 통해 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 생산하고, 하류의 생합성 경로를 통해 IPP 및 DMAPP를 터펜 또는 터페노이드 산물로 전환시킨다. 하류의 생합성 경로는 일반적으로 재조합 경로이고, 프레닐 트랜스퍼라제, 터펜 신타제, 및 선택적으로 1종 이상의 사이토크롬 P450 효소 및 사이토크롬 P450 환원효소(예를 들어, 각각 상기 기재한 바와 같음)를 포함할 수 있다. 추가로, MEP 탄소를 개선시키기 위해, 이콜라이는 다음의 유전자 변형 중 하나 이상을 갖는다:
(1) 선택적으로 RBS의 변형에 의한, 그리고 선택적으로 ispB 유전자에서 6-염기 SD 서열이 CGTGCT 또는 CGTGCC로, 또는 CGTGCT 또는 CGTGCC로부터 1 또는 2개의 뉴클레오타이드를 갖는 이의 변형으로 변화되는 경우 IspB의 감소된 발현 또는 활성;
(2) 터펜 또는 터페노이드 생산을 위해 사용되는 조건 하에 isc 오페론(예를 들어, iscSUA)에 남아있는 유전자의 발현을 유도하기 위한 iscR 유전자, 및 구성적 또는 유도성 프로모터의 모두 또는 부분의 결실 또는 비활성화;
(3) ryhB 결실 또는 비활성화;
(4) DOX 및/또는 ME가 약 2g/ℓ 또는 약 1g/ℓ 초과로 축적되지 않도록 MEP 효소 발현 또는 활성이 변경되거나 또는 균형화됨;
(5) dxr 유전자(선택적으로 ispD, ispE 및/또는 ispF에 의함) 및 ispG 및/또는 ispH 유전자를 포함하는 MEP 경로 상보화, 여기서, IspG 또는 IspH는 선택적으로 효소 활성을 증가시키도록 변형됨; 그리고 IspG 선택적으로 V30, S32, T34, N35, R37, V59, V61, S62, V63, L83, V84, C104, L105, P131, I132, I134, A138, K143, F176, K177, V178, V180, A182, L205, I207, A210, G212, A213, L236, V238, A241, A242, D243, R259, S262, R263, I265, N266, F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289, S301, I302, I303, V306로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이; 및 선택적으로 (1) V30, S32, T34, N35, R37; 또는 (2) V59, V61, S62, V63, L83, V84; 또는 (3) C104, L105, S301, I302, I303, V306; 또는 (4) P131, I132, I134, A138, K143; 또는 (5) F176, K177, V178, V180, A182; 또는 (6) L205, I207, A210, G212, A213; 또는 (7) L236, V238, A241, A242, D243; 또는 (8) R259, S262, R263, I265, N266; 또는 (9) F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289로부터 선택된 복수의 위치에서 변형; 그리고 선택적으로 L205V, A210S, G212T 및 A213I 중 1, 2, 3가지 또는 모두를 가짐; 및
(6) 증가된 터페노이드 역가 또는 MEP 탄소의 증가를 뒷받침하는 pgi(글루코스-6-포스페이트 이성질화 효소)의 돌연변이.
일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 (플라스미드 상의 또는 게놈 내로 통합된) 오페론 또는 모듈로서 발현된 dxs 및 idi의 적어도 하나의 추가적인 복제물; 또는 오페론 또는 모듈로서 발현된 dxs, ispD, ispF 및 idi를 갖는다. 추가로, 박테리아 균주는 MEP 탄소를 증가시키고/시키거나 터펜 또는 터페노이드 역가를 개선시키도록 조율된 이들 유전자의 발현에 의한 dxr, ispE, 및 ispG 및/또는 ispH의 추가적인 복제물을 가질 수 있다.
다양한 실시형태에서, 박테리아 균주는 상기 (1) 내지 (6)에 의해 정의된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 모두 6개의 변형을 포함한다.
본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같이 유전자는 재조합 유전자와의 상보성에 의해 과발현될 수 있거나, 또는 내인성 유전자는 발현을 변경시키도록 변형될 수 있다.
박테리아 균주는 에스케리키아 종, 바실러스 종, 코리네박테리움 종, 로도박터 종, 자이모모나스 종, 비브리오 종 및 슈도모나스 종으로부터 선택된 박테리아이다. 예를 들어, 박테리아 균주는 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 로도박터 캡슐라투스, 로도박터 스파에로이데스, 자이모모나스 모빌리스, 비브리오 나트리에겐스 또는 슈도모나스 푸티다로부터 선택된 종이다. 일부 실시형태에서, 박테리아 균주는 이콜라이이다.
본 발명의 양상 및 실시형태는 다음의 실시예를 참고로 하여 이하에 추가로 입증한다.
실시예
실시예 1: Fe-S 단백질의 증가된 이용 가능성은 DOX로부터 ME까지 축적을 이동시킨다
도 3에 나타낸 바와 같이, G2(도 2에 기재된 바와 같음)는 3.45g/ℓ의 터페노이드 산물과 동등한 중요한 세포외 대사물질(DOX+ME+MEcPP)을 생산한다. 이는 Fe-S 단백질을 증가시키기 위해 변형을 함유하지 않는 균주에서 주로 DOX의 7g/ℓ와 비교한다. G4는 터페노이드 산물의 56% 더 높은 축적을 가졌다. 유전자 변형은 isc 오페론의 과발현과 함께 ΔryhB, ΔiscR을 포함한다.
다른 터페노이드 산물(산물 B)을 생성하도록 조작되고, 그리고 3.26g/ℓ의 터페노이드 산물과 동등한 DOX+ME+MEcPP를 나타내는 이콜라이 균주에 대해 유사한 결과를 얻었다. 추가적인 변형은 1.4x 개선, 및 ispB 번역의 조율을 야기하는, pgi에 대한 변형을 포함한다. 도 4 참조.
도 5에 나타낸 바와 같이, 전사체 서열분석 및 조작된 산물 균주를 야생형 이콜라이에 비교하는 분석은 산물 균주의 변성된 표현형에서 ryhB 및 isc 오페론의 연루에 대한 강한 증거를 생성하였다. 이전의 유전자는 본 발명자들의 조작된 균주에서 강하게 상향조절되는 한편, iscR 조절 유전자는 매우 강하게 하향 조절된다.
도 6에 나타낸 바와 같이, ryhB의 결실을 통한 순차적 변형, iscSUA에 대해 구성적 과발현에 대한 전환, 및 iscR의 결실은 산물 역가가 꾸준히 증가되는 균주를 초래한다.
실시예 2: MEP 경로 유동을 개선시키기 위한 ispG 조작
ispG의 활성 부위가 조합적으로 변하는 일련의 라이브러리를 생성하고, 야생형 ispG 유전자를 돌연변이된 형태로 대체함으로써 생체내에서 시험하였다. MEP 경로를 통한 유동에 대한 Fe-S 클러스터 생화학의 영향을 완화시키기 위해 ispG 조작은 효소의 동역학, 안정성 및 강건성을 개선시킬 수 있다. 대략 1000개의 다양한 ispG 오솔로그의 서열 정렬을 이용하여 기질 및 철-황 클러스터 결합 부위를 표적화하기 위해 9개의 활성 부위 조합 라이브러리를 설계하였다(도 7a, 도 7b).
도 8은 두 배경 균주에서 증가된 세스퀴터펜 산물 역가에 대한 ispG 조합 라이브러리의 1차 선별 결과를 나타낸다. 37℃에서 48시간 동안 96 DWP에서 선별을 수행한다. 터페노이드 산물 역가에서 1.2 내지 1.45x 개선을 나타내는 총 대략 30개의 변이체에 의해 균주 배경(ispH 과발현이 있거나 또는 없음)을 둘 다 사용하여 유사한 수행을 보았다.
도 9에 나타낸 결과에 의해 주요 변이체를 재선별하였다. 두 ispG 변이체는 Fe-S 단백질의 증가된 이용 가능성을 위해 조작된 균주 이상으로 터펜 산물 역가에서 대략 1.2x 개선을 제공하였다. 주요 변이체인 G11은 다음의 돌연변이를 갖는다: L205V, A210S, G212T 및 A213I.
주요 변이체는 주요 터페노이드 생성 균주에 통합하고, 산물 역가를 도 10에 나타낸다. ispG Lib6 G11의 통합은 균주 둘 다에서 생산의 1.2x 개선을 야기하였다.
실시예 3: ispB 번역 조작
ispB 유전자는 유비퀴논의 합성을 제어하고 따라서 IPP 및 DMAPP 전구체에 대해 FPP 신타제와 직접적으로 경쟁하는 옥타프레닐 다이포스페이트 신타제를 암호화한다. ispB RBS 서열의 변형 및 mRNA의 번역 낮춤에 의해 세포 내 ispB 효소의 양을 감소시키는 것은 탄소 유동을 재조합 터페노이드 경로쪽으로 이동시킬 수 있었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 몇몇 잠재적 히트를 ispB RBS 라이브러리의 1차 선별로부터 동정하여 터펜/터페노이드 생산에서 1.7배까지의 개선을 수득하였다. 주요 히트를 도 12에 나타낸 바와 같이 검증하였다. 터페노이드 생산에서 다음의 SD 서열: CGTGCT 및 CGTGCC을 갖는, 1.5배 개선을 수득한 2가지 독특한 히트를 동정하였다.
실시예 4: MEP 경로 상보화
도 13에 나타낸 바와 같이, dxr 단독의 또는 ispD, ispE 및ispF와 조합한 과발현은 생산을 2배까지 감소시킨다. ispG-ispH의 첨가는 생산을 본래의 수준으로 되돌린다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 대사체학 분석은 ispE가 없는 dxr의 과발현이 세포외 ME 및 세포내 CDP-ME의 축적을 야기한다는 것을 나타낸다. 과발현된 ispE는 대사물질 풀을 ME 및 CDP-ME로부터 MEcPP로 이동시킨다. 본 실시예에서, 균주는 37℃에서 48시간 동안 96-웰 플레이트에서 성장한다. 종말점에서, 세포 배양물을 OD600에 대해 측정하고, 이어서, 2개의 샘플로 분할하고; 첫 번째는 에틸 아세테이트로 추출하여 산물 A를 분석하고 정량화하는 한편, 두 번째는 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 나서, 상청액을 세포외 MEP 대사물질에 대해 분석한 한편, 세포 펠릿은 세포내 MEP 대사물질을 추출하기 위해 추가로 가공한다. 터페노이드 산물-함유 유기상 샘플은 기체 크로마토그래피 및 질량분석법(GC/MS)을 통해 분석하는 한편, 세포외 및 세포내 대사물질 샘플을 분리하고 나서, 액체 크로마토그래피 및 질량분석법(LC/MS)을 통해 분석하였다. LC/MS 검출기는 삼중-사중극자 기기이며, 진정한 표준에 대한 MEP 대사물질의 정확한 정량화를 가능하게 한다. 목적으로 하는 산물에 대한 MEP 경로를 통한 탄소 분자의 유동에 중점을 두기 위해 얻어진 대사물질 농도를 몰농도로 표현한다.
도 15에 나타낸 바와 같이, dxr 또는 dxr-ispE와의 MEP 상보화에 의한 산물 A G5 균주의 대사체학 분석은 얻어진 균주에서 증가된 MEP 유동 잠재력이 더 잠재적인 산물 A 역가로 번역된다는 것을 추가로 나타낸다. 이들 균주 배양물에 대해 측정된 산물 및 MEP 대사물질 농도를 몰농도로 전환하고, 산물 A에 관한 각각의 MEP 대사물질의 탄소 동등물을 계산하고; 즉, 하나의 MEcPP 분자는 5개의 탄소를 함유하며, 따라서 각각의 하나는 아이소펜텐일 다이포스페이트의 1개 분자(IPP, 마찬가지로 5개의 탄소를 가짐), 또는 세스퀴터펜 산물 A 분자(15개 탄소를 가짐)의 1/3로 번역된다. 이런 방법에서, 이 균주에 의해 생산되는 총 산물 A의 잠재력을 (탄소가 MEcPP를 통해 하류로 성공적으로 당겨질 때) 계산할 수 있다. MEP 유전자 사이의 균형화된 발현에 의해, 12x 초과까지의 산물 A를 초래한다.
서열목록
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Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Manus Bio, Inc. <120> METABOLIC ENGINEERING FOR MICROBIAL PRODUCTION OF TERPENOID PRODUCTS <130> WO/2018/144996 <140> PCT/US2018/016848 <141> 2018-02-05 <150> US 62/454,121 <151> 2017-02-03 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 323 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Asn Leu Glu Lys Ile Asn Glu Leu Thr Ala Gln Asp Met Ala Gly 1 5 10 15 Val Asn Ala Ala Ile Leu Glu Gln Leu Asn Ser Asp Val Gln Leu Ile 20 25 30 Asn Gln Leu Gly Tyr Tyr Ile Val Ser Gly Gly Gly Lys Arg Ile Arg 35 40 45 Pro Met Ile Ala Val Leu Ala Ala Arg Ala Val Gly Tyr Glu Gly Asn 50 55 60 Ala His Val Thr Ile Ala Ala Leu Ile Glu Phe Ile His Thr Ala Thr 65 70 75 80 Leu Leu His Asp Asp Val Val Asp Glu Ser Asp Met Arg Arg Gly Lys 85 90 95 Ala Thr Ala Asn Ala Ala Phe Gly Asn Ala Ala Ser Val Leu Val Gly 100 105 110 Asp Phe Ile Tyr Thr Arg Ala Phe Gln Met Met Thr Ser Leu Gly Ser 115 120 125 Leu Lys Val Leu Glu Val Met Ser Glu Ala Val Asn Val Ile Ala Glu 130 135 140 Gly Glu Val Leu Gln Leu Met Asn Val Asn Asp Pro Asp Ile Thr Glu 145 150 155 160 Glu Asn Tyr Met Arg Val Ile Tyr Ser Lys Thr Ala Arg Leu Phe Glu 165 170 175 Ala Ala Ala Gln Cys Ser Gly Ile Leu Ala Gly Cys Thr Pro Glu Glu 180 185 190 Glu Lys Gly Leu Gln Asp Tyr Gly Arg Tyr Leu Gly Thr Ala Phe Gln 195 200 205 Leu Ile Asp Asp Leu Leu Asp Tyr Asn Ala Asp Gly Glu Gln Leu Gly 210 215 220 Lys Asn Val Gly Asp Asp Leu Asn Glu Gly Lys Pro Thr Leu Pro Leu 225 230 235 240 Leu His Ala Met His His Gly Thr Pro Glu Gln Ala Gln Met Ile Arg 245 250 255 Thr Ala Ile Glu Gln Gly Asn Gly Arg His Leu Leu Glu Pro Val Leu 260 265 270 Glu Ala Met Asn Ala Cys Gly Ser Leu Glu Trp Thr Arg Gln Arg Ala 275 280 285 Glu Glu Glu Ala Asp Lys Ala Ile Ala Ala Leu Gln Val Leu Pro Asp 290 295 300 Thr Pro Trp Arg Glu Ala Leu Ile Gly Leu Ala His Ile Ala Val Gln 305 310 315 320 Arg Asp Arg <210> 4 <211> 398 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Lys Gln Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Cys Ser 1 5 10 15 Thr Leu Asp Val Val Arg His Asn Pro Glu His Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 Leu Val Ala Gly Lys Asn Val Thr Arg Met Val Glu Gln Cys Leu Glu 35 40 45 Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Val Met Asp Asp Glu Ala Ser Ala Lys Leu 50 55 60 Leu Lys Thr Met Leu Gln Gln Gln Gly Ser Arg Thr Glu Val Leu Ser 65 70 75 80 Gly Gln Gln Ala Ala Cys Asp Met Ala Ala Leu Glu Asp Val Asp Gln 85 90 95 Val Met Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Pro Thr Leu Ala 100 105 110 Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu 115 120 125 Val Thr Cys Gly Arg Leu Phe Met Asp Ala Val Lys Gln Ser Lys Ala 130 135 140 Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu 145 150 155 160 Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn 165 170 175 Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu 180 185 190 Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg 195 200 205 His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr 210 215 220 Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn 225 230 235 240 Ala Ser Ala Ser Gln Met Glu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val Ile 245 250 255 His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly 260 265 270 Glu Pro Asp Met Arg Thr Pro Ile Ala His Thr Met Ala Trp Pro Asn 275 280 285 Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala 290 295 300 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu 305 310 315 320 Ala Met Glu Ala Phe Glu Gln Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn 325 330 335 Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg 340 345 350 Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp 355 360 365 Met Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn 370 375 380 Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser 385 390 395 <210> 5 <211> 372 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met His Asn Gln Ala Pro Ile Gln Arg Arg Lys Ser Thr Arg Ile Tyr 1 5 10 15 Val Gly Asn Val Pro Ile Gly Asp Gly Ala Pro Ile Ala Val Gln Ser 20 25 30 Met Thr Asn Thr Arg Thr Thr Asp Val Glu Ala Thr Val Asn Gln Ile 35 40 45 Lys Ala Leu Glu Arg Val Gly Ala Asp Ile Val Arg Val Ser Val Pro 50 55 60 Thr Met Asp Ala Ala Glu Ala Phe Lys Leu Ile Lys Gln Gln Val Asn 65 70 75 80 Val Pro Leu Val Ala Asp Ile His Phe Asp Tyr Arg Ile Ala Leu Lys 85 90 95 Val Ala Glu Tyr Gly Val Asp Cys Leu Arg Ile Asn Pro Gly Asn Ile 100 105 110 Gly Asn Glu Glu Arg Ile Arg Met Val Val Asp Cys Ala Arg Asp Lys 115 120 125 Asn Ile Pro Ile Arg Ile Gly Val Asn Ala Gly Ser Leu Glu Lys Asp 130 135 140 Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Glu Pro Thr Pro Gln Ala Leu Leu Glu Ser 145 150 155 160 Ala Met Arg His Val Asp His Leu Asp Arg Leu Asn Phe Asp Gln Phe 165 170 175 Lys Val Ser Val Lys Ala Ser Asp Val Phe Leu Ala Val Glu Ser Tyr 180 185 190 Arg Leu Leu Ala Lys Gln Ile Asp Gln Pro Leu His Leu Gly Ile Thr 195 200 205 Glu Ala Gly Gly Ala Arg Ser Gly Ala Val Lys Ser Ala Ile Gly Leu 210 215 220 Gly Leu Leu Leu Ser Glu Gly Ile Gly Asp Thr Leu Arg Val Ser Leu 225 230 235 240 Ala Ala Asp Pro Val Glu Glu Ile Lys Val Gly Phe Asp Ile Leu Lys 245 250 255 Ser Leu Arg Ile Arg Ser Arg Gly Ile Asn Phe Ile Ala Cys Pro Thr 260 265 270 Cys Ser Arg Gln Glu Phe Asp Val Ile Gly Thr Val Asn Ala Leu Glu 275 280 285 Gln Arg Leu Glu Asp Ile Ile Thr Pro Met Asp Val Ser Ile Ile Gly 290 295 300 Cys Val Val Asn Gly Pro Gly Glu Ala Leu Val Ser Thr Leu Gly Val 305 310 315 320 Thr Gly Gly Asn Lys Lys Ser Gly Leu Tyr Glu Asp Gly Val Arg Lys 325 330 335 Asp Arg Leu Asp Asn Asn Asp Met Ile Asp Gln Leu Glu Ala Arg Ile 340 345 350 Arg Ala Lys Ala Ser Gln Leu Asp Glu Ala Arg Arg Ile Asp Val Gln 355 360 365 Gln Val Glu Lys 370 <210> 6 <211> 316 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Gln Ile Leu Leu Ala Asn Pro Arg Gly Phe Cys Ala Gly Val Asp 1 5 10 15 Arg Ala Ile Ser Ile Val Glu Asn Ala Leu Ala Ile Tyr Gly Ala Pro 20 25 30 Ile Tyr Val Arg His Glu Val Val His Asn Arg Tyr Val Val Asp Ser 35 40 45 Leu Arg Glu Arg Gly Ala Ile Phe Ile Glu Gln Ile Ser Glu Val Pro 50 55 60 Asp Gly Ala Ile Leu Ile Phe Ser Ala His Gly Val Ser Gln Ala Val 65 70 75 80 Arg Asn Glu Ala Lys Ser Arg Asp Leu Thr Val Phe Asp Ala Thr Cys 85 90 95 Pro Leu Val Thr Lys Val His Met Glu Val Ala Arg Ala Ser Arg Arg 100 105 110 Gly Glu Glu Ser Ile Leu Ile Gly His Ala Gly His Pro Glu Val Glu 115 120 125 Gly Thr Met Gly Gln Tyr Ser Asn Pro Glu Gly Gly Met Tyr Leu Val 130 135 140 Glu Ser Pro Asp Asp Val Trp Lys Leu Thr Val Lys Asn Glu Glu Lys 145 150 155 160 Leu Ser Phe Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Val Asp Asp Thr Ser Asp 165 170 175 Val Ile Asp Ala Leu Arg Lys Arg Phe Pro Lys Ile Val Gly Pro Arg 180 185 190 Lys Asp Asp Ile Cys Tyr Ala Thr Thr Asn Arg Gln Glu Ala Val Arg 195 200 205 Ala Leu Ala Glu Gln Ala Glu Val Val Leu Val Val Gly Ser Lys Asn 210 215 220 Ser Ser Asn Ser Asn Arg Leu Ala Glu Leu Ala Gln Arg Met Gly Lys 225 230 235 240 Arg Ala Phe Leu Ile Asp Asp Ala Lys Asp Ile Gln Glu Glu Trp Val 245 250 255 Lys Glu Val Lys Cys Val Gly Val Thr Ala Gly Ala Ser Ala Pro Asp 260 265 270 Ile Leu Val Gln Asn Val Val Ala Arg Leu Gln Gln Leu Gly Gly Gly 275 280 285 Glu Ala Ile Pro Leu Glu Gly Arg Glu Glu Asn Ile Val Phe Glu Val 290 295 300 Pro Lys Glu Leu Arg Val Asp Ile Arg Glu Val Asp 305 310 315 <210> 7 <211> 438 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 7 Met Thr Thr Asn Val Ala Leu Val Gly Leu Ala Arg Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Gly Lys Pro Ile Arg Ile Gly Leu Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Glu Met Gly Thr Asp Ile Val Thr Gln Val Ala Arg Met Gln Gly Ile 35 40 45 Glu Val Gly Ala Leu Ser Ala Arg Arg Leu Pro Asn Thr Phe Lys Ala 50 55 60 Ile Arg Thr Ala Tyr Gly Asp Glu Glu Asn Ala Arg Glu Ala Thr Thr 65 70 75 80 Glu Ser Ala Met Thr Arg Ala Ile Glu Ala Gly Lys Ile Ala Val Thr 85 90 95 Asp Asp Asn Asp Leu Ile Leu Ser Asn Pro Leu Ile Asp Val Ile Ile 100 105 110 Asp Ala Thr Gly Ile Pro Glu Val Gly Ala Glu Thr Gly Ile Ala Ala 115 120 125 Ile Arg Asn Gly Lys His Leu Val Met Met Asn Val Glu Ala Asp Val 130 135 140 Thr Ile Gly Pro Tyr Leu Lys Ala Gln Ala Asp Lys Gln Gly Val Ile 145 150 155 160 Tyr Ser Leu Gly Ala Gly Asp Glu Pro Ser Ser Cys Met Glu Leu Ile 165 170 175 Glu Phe Val Ser Ala Leu Gly Tyr Glu Val Val Ser Ala Gly Lys Gly 180 185 190 Lys Asn Asn Pro Leu Asn Phe Asp Ala Thr Pro Asp Asp Tyr Arg Gln 195 200 205 Glu Ala Asp Arg Arg Asn Met Asn Val Arg Leu Leu Val Glu Phe Ile 210 215 220 Asp Gly Ser Lys Thr Met Val Glu Met Ala Ala Ile Ala Asn Ala Thr 225 230 235 240 Gly Leu Val Pro Asp Ile Ala Gly Met His Gly Pro Arg Ala Ser Ile 245 250 255 Asp Gln Leu Ser His Thr Leu Ile Pro Gln Ala Glu Gly Gly Val Leu 260 265 270 Ser Lys Ser Gly Val Val Asp Tyr Ser Ile Gly Lys Gly Val Ser Pro 275 280 285 Gly Val Phe Val Val Ala Lys Met Asp His Pro Arg Leu Asn Glu Arg 290 295 300 Leu Glu Asp Leu Lys Ile Gly Lys Gly Pro Tyr Phe Thr Phe His Arg 305 310 315 320 Pro Tyr His Leu Thr Ser Leu Glu Val Pro Leu Thr Val Ala Arg Val 325 330 335 Val Leu His Gly Lys Thr Asp Met Val Pro Leu Pro Lys Pro Val Ala 340 345 350 Glu Val Cys Ala Val Ala Lys Lys Asp Met Gln Pro Gly Glu His Leu 355 360 365 Asp Ala Ile Gly Gln Tyr Cys Tyr Arg Ser Trp Ile Met Thr Val Pro 370 375 380 Glu Ala Arg Ala Ala Lys Ala Ile Pro Cys Gly Leu Leu Gln Asn Gly 385 390 395 400 Thr Val Ile Ala Pro Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ile Thr Tyr Ala Asn 405 410 415 Ala Ala Pro Gln Pro Gly Ser Arg Ile Ala Glu Leu Arg Ala Leu Gln 420 425 430 Asp Ala Met Leu Gly Gln 435 <210> 8 <211> 283 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Met Arg Thr Gln Trp Pro Ser Pro Ala Lys Leu Asn Leu Phe Leu Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Gly Gln Arg Ala Asp Gly Tyr His Thr Leu Gln Thr Leu Phe 20 25 30 Gln Phe Leu Asp Tyr Gly Asp Thr Ile Ser Ile Glu Leu Arg Asp Asp 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Leu Leu Thr Pro Val Glu Gly Val Glu His Glu Asp 50 55 60 Asn Leu Ile Val Arg Ala Ala Arg Leu Leu Met Lys Thr Ala Ala Asp 65 70 75 80 Ser Gly Arg Leu Pro Thr Gly Ser Gly Ala Asn Ile Ser Ile Asp Lys 85 90 95 Arg Leu Pro Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser Asn Ala Ala 100 105 110 Thr Val Leu Val Ala Leu Asn His Leu Trp Gln Cys Gly Leu Ser Met 115 120 125 Asp Glu Leu Ala Glu Met Gly Leu Thr Leu Gly Ala Asp Val Pro Val 130 135 140 Phe Val Arg Gly His Ala Ala Phe Ala Glu Gly Val Gly Glu Ile Leu 145 150 155 160 Thr Pro Val Asp Pro Pro Glu Lys Trp Tyr Leu Val Ala His Pro Gly 165 170 175 Val Ser Ile Pro Thr Pro Val Ile Phe Lys Asp Pro Glu Leu Pro Arg 180 185 190 Asn Thr Pro Lys Arg Ser Ile Glu Thr Leu Leu Lys Cys Glu Phe Ser 195 200 205 Asn Asp Cys Glu Val Ile Ala Arg Lys Arg Phe Arg Glu Val Asp Ala 210 215 220 Val Leu Ser Trp Leu Leu Glu Tyr Ala Pro Ser Arg Leu Thr Gly Thr 225 230 235 240 Gly Ala Cys Val Phe Ala Glu Phe Asp Thr Glu Ser Glu Ala Arg Gln 245 250 255 Val Leu Glu Gln Ala Pro Glu Trp Leu Asn Gly Phe Val Ala Lys Gly 260 265 270 Ala Asn Leu Ser Pro Leu His Arg Ala Met Leu 275 280

Claims (53)

  1. 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법으로서,
    상류의 메틸에리트리톨 경로(methylerythritol pathway: MEP)를 통해 아이소펜텐일 다이포스페이트(isopentenyl diphosphate: IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(dimethylallyl diphosphate: DMAPP)를 생산하고 하류의 생합성 경로를 통해 상기 IPP 및 DMAPP를 터펜 또는 터페노이드 산물로 전환시키는 박테리아 균주를 제공하는 단계; 및
    상기 박테리아 균주를 배양시켜 상기 터펜 또는 터페노이드 산물을 생산하는 단계를 포함하되, 해당과정(glycolysis)에 유입되는 탄소 중 1% 초과는 MEP 탄소가 되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 에스케리키아 종(Escherichia spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.), 로도박터 종(Rhodobacter spp.), 자이모모나스 종(Zymomonas spp.) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp)으로부터 선택된 박테리아인, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아 종은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택된, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 이콜라이(E. coli)인, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, MEP 탄소는,
    D-글리세르알데하이드 3-포스페이트;
    파이루베이트;
    1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트;
    1-데옥시-D-자일룰로스;
    2-C-메틸-D-에리트리톨-5-포스페이트;
    2-C-메틸-D-에리트리톨;
    4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨;
    2-포스포-4-다이포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨;
    2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로다이포스페이트;
    1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-뷰텐일 4-다이포스페이트;
    아이소펜텐일 다이포스페이트;
    다이메틸알릴 다이포스페이트;
    게라닐 다이포스페이트(GPP), 파네실 다이포스페이트(FPP), 게라닐게라닐 다이포스페이트(GGPP) 또는 게라닐파네실 다이포스페이트(FGPP);
    게라닐 포스페이트, 파네실 포스페이트, 게라닐게라닐 포스페이트 또는 게라닐파네실 포스페이트;
    게라니올, 파네솔, 게라닐게라니올 또는 게라닐파네솔;
    터펜 및 터페노이드 산물;
    스쿠알렌;
    운데카프레닐 다이포스페이트(UPP), 운데카프레닐 포스페이트;
    옥타프레닐 다이포스페이트(OPP), 4-하이드록시벤조에이트, 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 2-옥타프레닐페놀, 3-옥타프레닐벤젠-1,2-다이올, 2-메톡시-6-옥타프레닐-2-메톡시-1,4-벤조퀴놀, 6-메톡시-3-메틸옥타프레닐-1,4-벤조퀴놀, 3-데메틸유비퀴놀-8, 유비퀴놀-8, 유비퀴논;
    2-카복시-1,4-나프토퀴놀, 데메틸메나퀴놀-8, 메나퀴놀-8, 메나퀴논;
    아이소프레놀, 프레놀, 아이소펜텐일 포스페이트 및 다이메틸알릴 포스페이트; 및
    프레닐화된 인돌을 포함하는 프레닐화된 대사물질 및 단백질
    로 이루어진, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 터펜 또는 터페노이드 산물은 아비에타다이엔, 아비에트산, 알파-구아이엔, 알파-시넨살, 아모파다이엔, 아테미신산, 베타-비사볼렌, 베타-투욘, 캄퍼, 카르베올, 카르본, 셀라스트롤, 세로프라스톨, 시네올, 시트랄, 시트로넬랄, 쿠베볼, 쿠쿠르비탄, 포스콜린, 가스카딘산, 게라니올, 하슬렌, 레보피마르산, 리모넨, 루페올, 멘톨, 멘톤, 모그로사이드, 누트카톤, 누트카톨, 오피오볼린 A, 패출리, 피레리톤, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 M, 로툰돈, 사비넨, 스테비올, 스테비올 글리코사이드, 탁사다이엔, 티몰, 우르솔산 및 발렌센으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유비퀴논 생합성 경로는 하향조절되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 균주는 IspB의 발현 또는 활성이 감소된, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, IspB 발현은 변형된 리보솜 결합 서열(ribosome binding sequence: RBS)에 의해 감소되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 ispB 유전자의 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: SD) 서열은 CGTGCT 또는 CGTGCC이거나, 또는 CGTGCT 또는 CGTGCC에서 1 또는 2개의 뉴클레오타이드 변화를 갖는 이들의 변형인, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 균주는 변형된 ispB 프로모터 또는 ispB RNA 분해율을 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 균주는 증가된 분해율을 갖는 IspB 단백질을 암호화하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 균주는 효소 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 IspB 단백질; 또는 상기 박테리아 균주에서 감소된 활성을 갖는 IspB 오솔로그를 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 상기 isc 오페론의 유도성 또는 구성적 발현을 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 iscR 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 선택적으로 RBS로의 변형에 의해 비활성화되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 iscR 유전자는 유도성 또는 구성적 프로모터로 대체되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 ryhB 결실 또는 비활성화를 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 선택적으로 재조합 유전자 또는 dxr을 포함하는 오페론과의 상보성에 의해 Dxr을 과발현시키는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 균주는 야생형 이콜라이 Dxr에 대해 증가된 활성을 갖는 변형된 Dxr 효소 또는 Dxr 오솔로그를 갖되, 상기 오솔로그는 선택적으로 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) DRL(서열번호 8) 또는 이의 유도체인, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 균주는 선택적으로 재조합 유전자 또는 오페론 IspE를 발현시키는 오페론과의 상보성에 의해 IspE, 변형된 IspE, 및/또는 IspE 오솔로그를 과발현시키는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 선택적으로 재조합 유전자 또는 IspG 및/또는 IspH를 발현시키는 오페론과의 상보성에 의해 IspG 및/또는 IspH를 과발현시키는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 균주는 변형된 IspG 및/또는 IspH 효소 또는 상기 야생형 이콜라이 IspG 및/또는 IspH에 대해 증가된 활성을 갖는 오솔로그를 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 IspG 효소는 V30, S32, T34, N35, R37, V59, V61, S62, V63, L83, V84, C104, L105, P131, I132, I134, A138, K143, F176, K177, V178, V180, A182, L205, I207, A210, G212, A213, L236, V238, A241, A242, D243, R259, S262, R263, I265, N266, F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289, S301, I302, I303, V306으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 IspG는 하기로부터 선택된 복수의 위치에서 변형을 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법:
    (1) V30, S32, T34, N35, R37; 또는
    (2) V59, V61, S62, V63, L83, V84; 또는
    (3) C104, L105, S301, I302, I303, V306; 또는
    (4) P131, I132, I134, A138, K143; 또는
    (5) F176, K177, V178, V180, A182; 또는
    (6) L205, I207, A210, G212, A213; 또는
    (7) L236, V238, A241, A242, D243; 또는
    (8) R259, S262, R263, I265, N266; 또는
    (9) F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289.
  25. 제23항에 있어서, 상기 IspG 효소는 다음의 돌연변이 L205V, A210S, G212T 및 A213I 중 1, 2, 3가지 또는 모두를 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 재조합 MEP 유전자는 플라스미드로부터 발현되거나 또는 박테리아 게놈에 통합되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 오페론/모듈로서 발현되는 dxs 및 idi의 적어도 하나의 추가적인 복제물; 또는 오페론 또는 모듈로서 발현되는 dxs, ispD, ispF 및 idi을 갖는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 증가된 터펜 또는 터페노이드 역가 또는 증가된 MEP 탄소를 뒷받침하는 pgi 돌연변이를 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 효소 동역학, 산물 프로파일, 안정성 및 온도 내성 중 하나 이상을 개선시키기 위한 하나 이상의 변형을 갖는 터페노이드 신타제를 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 호기성, 미호기성(microaerobic) 또는 혐기성 조건하에서, 선택적으로 글루코스 또는 글리세롤인 C1, C2, C3, C4, C5 및/또는 C6 탄소 공급원과 함께 배양되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 22℃ 내지 37℃의 온도에서 배양되는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 배양물은 적어도 약 100ℓ인, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 배양물 중의 인돌 또는 프레닐화된 인돌의 축적을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 배양물에서 DOX, ME 또는 MEcPP의 축적을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 터펜 또는 터페노이드 산물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 터펜 또는 터페노이드 산물은 유기상, 소수성상, 또는 수성상으로부터 회수된, 터펜 또는 터페노이드 산물의 생산 방법.
  37. 산업적 제품 또는 소비재의 제조 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 터펜 또는 터페노이드를 상기 산업적 제품 또는 소비재에 혼입시키는 단계를 포함하는, 산업적 제품 또는 소비재의 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 산업적 제품 또는 소비재는 향미제 제품, 향료 제품, 감미제, 화장품, 청소 제품, 세정제 또는 비누 또는 해충 방제 제품인, 산업적 제품 또는 소비재의 제조 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 산업적 제품 또는 소비재는 식품, 음료, 결착제, 약제, 담배 제품, 기능 식품, 구강 위생 제품, 또는 화장품인, 산업적 제품 또는 소비재의 제조 방법.
  40. MEP 탄소를 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 갖는 박테리아 균주로서, 상기 박테리아 균주는 상기 MEP 경로를 통해 아이소펜텐일 다이포스페이트(IPP) 및 다이메틸알릴 다이포스페이트(DMAPP)를 생산하고, 하류의 생합성 경로를 통해 상기 IPP 및 DMAPP를 터펜 또는 터페노이드 산물로 전환시키며; 상기 유전자 변형은,
    (1) IspB의 발현 또는 활성을 감소시키는 변형;
    (2) 터펜 또는 터페노이드 생성을 위해 사용되는 조건하에서 상기 isc 오페론에 남아있는 유전자의 발현을 유도하기 위한 상기 iscR 유전자, 및 유도성 또는 구성적 프로모터의 모두 또는 부분의 결실 또는 비활성화;
    (3) ryhB 결실 또는 비활성화;
    (4) DOX 및/또는 ME가 약 2g/ℓ 초과 또는 약 1g/ℓ 초과로 축적되지 않도록 MEP 효소 발현 또는 활성이 변형되거나 또는 균형화됨;
    (5) 선택적으로 ispD, ispE 및/또는 ispF, 및 ispG 및/또는 ispH 유전자와 함께 dxr 유전자를 포함하는 MEP 경로 상보화;
    (6) 증가된 터페노이드 역가 또는 MEP 탄소를 뒷받침하는 pgi(글루코스-6-포스페이트 이성질화 효소)의 돌연변이
    로부터 선택되는, 박테리아 균주.
  41. 제40항에 있어서, 상기 균주는 적어도 dxr 유전자 및 ispE 유전자와의 MEP 경로 상보성을 포함하는, 박테리아 균주.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 dxr 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 8과 적어도 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 박테리아 균주.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ispB RBS는 변형된, 박테리아 균주.
  44. 제43항에 있어서, 상기 ispB 샤인 달가노(SD) 서열은 CGTGCT 또는 CGTGCC, 또는 CGTGCT 또는 CGTGCC로부터 1 또는 2개의 뉴클레오타이드 변화를 갖는 SD 서열인, 박테리아 균주.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 효소 활성을 증가시키도록 변형된 IspG 또는 IspH 효소와의 상보성을 포함하는, 박테리아 균주.
  46. 제45항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 V30, S32, T34, N35, R37, V59, V61, S62, V63, L83, V84, C104, L105, P131, I132, I134, A138, K143, F176, K177, V178, V180, A182, L205, I207, A210, G212, A213, L236, V238, A241, A242, D243, R259, S262, R263, I265, N266, F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289, S301, I302, I303, V306으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IspG 효소를 발현시키는, 박테리아 균주.
  47. 제46항에 있어서, 상기 IspG 효소는 하기로부터 선택된 복수의 위치에서 변형을 갖는, 박테리아 균주:
    (1) V30, S32, T34, N35, R37; 또는
    (2) V59, V61, S62, V63, L83, V84; 또는
    (3) C104, L105, S301, I302, I303, V306; 또는
    (4) P131, I132, I134, A138, K143; 또는
    (5) F176, K177, V178, V180, A182; 또는
    (6) L205, I207, A210, G212, A213; 또는
    (7) L236, V238, A241, A242, D243; 또는
    (8) R259, S262, R263, I265, N266; 또는
    (9) F267, I268, A269, T272, S274, Q276, E277, F278, D289.
  48. 제47항에 있어서, 상기 IspG 효소는 L205V, A210S, G212T 및 A213I로부터 선택된 1, 2, 3가지의 또는 모든 변형을 갖는, 박테리아 균주.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리키아 종, 바실러스 종, 로도박터 종, 자이모모나스 종 및 슈도모나스 종으로부터 선택된 박테리아인, 박테리아 균주.
  50. 제49항에 있어서, 상기 박테리아 종은 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 로도박터 캡슐라투스, 로도박터 스파에로이데스, 자이모모나스 모빌리스 또는 슈도모나스 푸티다로부터 선택된, 박테리아 균주.
  51. 제50항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 이콜라이인, 박테리아 균주.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 오페론/모듈로서 발현된 dxs 및 idi의 적어도 하나의 추가적인 복제물; 또는 오페론 또는 모듈로서 발현된 dxs, ispD, ispF 및 idi를 갖는, 박테리아 균주.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 터펜 또는 터페노이드 산물은 아비에타다이엔, 아비에트산, 알파-구아이엔, 알파-시넨살, 아모파다이엔, 아테미신산, 베타-비사볼렌, 베타-투욘, 캄퍼, 카르베올, 카르본, 셀라스트롤, 세로프라스톨, 시네올, 시트랄, 시트로넬랄, 쿠베볼, 쿠쿠르비탄, 포스콜린, 가스카딘산, 게라니올, 하슬렌, 레보피마르산, 리모넨, 루페올, 멘톨, 멘톤, 모그로사이드, 누트카톤, 누트카톨, 오피오볼린 A, 패출리, 피레리톤, 로툰돈, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 M, 사비넨, 스테비올, 스테비올 글리코사이드, 탁사다이엔, 티몰, 우르솔산 및 발렌센으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는, 박테리아 균주.
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