CN102812129A

CN102812129A - 用于从类异戊二烯途径生产化学和医药产品的微生物工程

Info

Publication number: CN102812129A
Application number: CN2010800610106A
Authority: CN
Inventors: 帕拉伊·K·阿吉库马尔; 格里戈里·斯特凡诺普洛斯; 亨格·蓬·图
Original assignee: National University of Singapore; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: National University of Singapore; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CA2780415C; MY162232A; BR112012011073B8; CN102812129B; US8512988B2; KR101834020B1; BR112012011073B1; EP2499257A1; EP2594648B1; US10227597B2; US20140024089A1; BR112012011073A2; US9796980B2; WO2011060057A1; US20110189717A1; US9359624B2; US20170002366A1; US20180080035A1; JP2013510573A; CA2780415A1

Abstract

本发明涉及紫杉二烯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)在细胞中的重组表达以及萜类化合物的生产。

Description

用于从类异戊二烯途径生产化学和医药产品的微生物工程

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求以下权益：2009年11月10日提交的题为“用于从类异戊二烯途径生产化学和医药产品的微生物工程”的美国临时申请序列号61/280,877，和2010年9月30日提交的题为“用于从类异戊二烯途径生产化学和医药产品的微生物工程”的美国临时申请序列号61/388,543，这些申请的全部内容通过引用整体并入本文。

政府支持

本项工作的一部分内容是在国立卫生研究院的资助(资助号1-R01-GM085323-01A1)下完成的。政府对本发明拥具有某些权利。

技术领域

本发明涉及通过微生物工程生产一种或更多种萜类化合物(terpenoid)。

背景技术

紫杉醇及其结构类似物已被认为是在过去十年推出的最有效的和商业上最成功的抗癌药物¹。紫杉醇首先是从太平洋紫杉树的树皮分离出来的²，早期的生产方法需要砍伐两到四棵完全成熟的树才能提供给一个患者足够的剂量³。紫杉醇的结构复杂性需要复杂的化学合成路线，其需要35-51个步骤，最高产率为0.4％^4，5，6。然而，设计了半合成路线，其中首先从植物来源分离出生物合成的中间物巴卡亭III(baccatin III)，随后转化为紫杉醇⁷。虽然这种方法和随后基于植物细胞培养的生产尝试已减少了砍伐紫杉树的需要，但生产仍依赖于以植物为基础的过程⁸，并伴有生产力和规模可扩大性方面的限制，以及在寻找更有效药物过程中可合成的紫杉醇衍生物数量方面的限制^9，10。

发明概述

代谢工程和合成生物学的最新进展提供了通过技术上更适用的微生物宿主来过量生产复杂天然产物的可能性^11，2。尽管紫杉中紫杉醇生物合成机制的解释已取得令人振奋的进展^13-16，但商业上相关的紫杉醇生产菌株还没有过将该复杂生物合成机制转移到微生物宿主中的尝试^17，18。然而，与其他天然产物一样，通过代谢工程化菌株进行微生物生产为合成多样化的具有抗癌及其他医药活性的新化合物提供了有吸引力的经济因素和巨大的潜力^19，20。

紫杉醇及其类似物的代谢途径由大肠杆菌天然的上游类异戊二烯(isoprenoid)途径和异源性的下游萜类化合物途径组成(图6)。上游的甲羟戊酸(MVA)或甲基赤藓醇磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途径可产生两种用于形成紫杉醇和其他类异戊二烯化合物的常见构建块：异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)¹²。最近的研究强调了改造上述上游途径来支持异源性类异戊二烯(例如番茄红素和青蒿酸)的生物合成^21-23。下游紫杉二烯(taxadiene)途径已在大肠杆菌中重建，但是，迄今滴度未超过1.3mg/L²⁴。

上述推理性代谢工程方法着眼于上游(MVA或MEP)或下游萜类化合物途径，隐含地假设修饰是加和性的，即线性行为^25-27。虽然这种方法可产生通量的适度增长，但它通常忽略非特异性的影响，如中间代谢物的毒性，用于表达的载体的细胞影响，以及可能与主要途径竞争并使通量转移而偏离所需目标的隐藏的未知途径。组合性方法可避免这些问题，因为它们提供了对参数空间适当采样并阐明这些复杂的非线性相互作用的可能性^{21，28，29，30}。然而，它们需要高通量筛选，这通常对许多想要的自然产物而言是不可用的31。而另一类型的途径优化方法已探讨了包含目的途径的不同来源之异源基因的组合空间³²。这些方法仍依赖高通量的测定，它们通常忽略了确定各个途径基因的最佳表达水平的需要，并因此已证明在构建最佳途径方面不太有效。

在本项工作中，作为本发明方面的一个实例，我们以上游IPP形成途径与下游紫杉二烯合成的萜类化合物途径的最佳平衡为重点。这是通过将九个酶的途径划归为两个模块(四个基因的上游天然MEP途径模块，和两个基因的下游至紫杉二烯的异源途径)来实现的(图1)。利用该基本结构，评估了参数(例如质粒拷贝数对细胞生理学的影响、表达盒中的基因顺序和启动子强度以及染色体整合)对紫杉二烯生产的影响。这种模块化和多变量的组合方法使我们能够有效地对影响途径通量的主要参数进行采样而不需要高通量筛选。对每个途径模块的多种启动子和拷贝数进行的多变量检索显示出高度非线性的紫杉二烯通量概况，最高显示出紫杉二烯产量比对照增加15000倍，在小规模发酵时产生300mg/L的紫杉二烯产量。此外，我们已在大肠杆菌中设计了基于P450的氧化化学以用于紫杉醇生物合成，用我们的工程化菌株，紫杉二烯-5α-醇的产量比现有技术提高了2400倍。这些改进开启了通过已有的微生物系统大规模生产数以千计的高价值萜类化合物的可能性。

本发明的一些方面涉及这样的方法，其包括在过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的细胞中重组表达紫杉二烯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(geranylgeranl diphosphate synthase，GGPPS)的方法。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述细菌细胞是革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌(Bacillus)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞，如酵母属(Saccharomyces)细胞或耶氏酵母(Yarrowia)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是藻类细胞或植物细胞。

在一些实施方案中，所述紫杉二烯合酶是紫杉(Taxus)的酶，如短叶紫杉(Taxus brevifolia)的酶。在一些实施方案中，所述GGPPS酶是紫杉的酶，如加拿大紫杉(Taxus canadenis)的酶。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和/或编码GGPPS酶的基因和/或编码MEP途径中一种或更多种组分的基因是由一种或更多种质粒表达的。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和/或编码GGPPS酶的基因和/或编码MEP途径中一种或更多种组分的基因是整合入细胞基因组中的。

在一些实施方案中，所述非甲羟戊酸(MEP)途径中的一种或更多种组分选自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB。在某些实施方案中，dxs、idi、ispD和ispF被过表达。例如，dxs、idi、ispD和ispF可在操纵子dxs-idi-idpDF上过表达。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和编码GGPPS酶的基因在操纵子上一起表达。

在一些实施方案中，所述细胞还表达紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。在某些实施方案中，所述T5αOH酶或其催化活性部分与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分融合。例如，T5αOH酶可是At24T5αOH-tTCPR。

可以平衡紫杉二烯合酶、GGPPS酶和MEP途径中一种或更多种组分的表达，以使紫杉二烯的产量最大化。与本发明相关的方法还可包括培养细胞以产生紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。在一些实施方案中，至少产生10mg L^-1紫杉二烯。在某些实施方案中，至少产生250mg L^-1紫杉二烯。在一些实施方案中，至少产生10mg L^-1紫杉二烯-5α-醇。在某些实施方案中，至少产生50mg L^-1紫杉二烯-5α-醇。在一些实施方案中，紫杉二烯向紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷的转化率是至少50％，至少75％或至少95％。

与本发明相关的方法还可包括从细胞培养物中回收紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。在一些实施方案中，紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇是从气相回收的，而在另一些实施方案中，将有机层加至细胞培养物中，并从该有机层回收紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

本发明一些方面涉及过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分并重组表达紫杉二烯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述细菌细胞是革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌细胞。在一些实施方案中所述细胞是酵母细胞，如酵母属细胞或耶氏酵母属细胞。在一些实施方案中，所述细胞是藻类细胞或植物细胞。

在一些实施方案中，紫杉二烯合酶是紫杉酶，如短叶紫杉酶。在一些实施方案中，GGPPS酶是紫杉酶，如加拿大紫杉酶。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和/或编码GGPPS酶的基因和/或编码MEP途径的一种或更多种组分的基因是由一种或更多种质粒表达的。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和/或编码GGPPS酶的基因和/或编码MEP途径的一种或更多种组分的基因是整合入细胞基因组中的。

在一些实施方案中，所述非甲羟戊酸(MEP)途径的一种或更多种组分选自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB。在某些实施方案中，dxs、idi、ispD和ispF被过表达。例如，dxs、idi、ispD和ispF可在操纵子dxs-idi-idpDF上过表达。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因和编码GGPPS酶的基因是在操纵子上一起表达的。在一些实施方案中，可以平衡紫杉二烯合酶、GGPPS酶和MEP途径的一种或更多种组分的表达以使紫杉二烯的产量最大化。

在一些实施方案中，所述细胞还表达紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。在某些实施方案中，T5αOH酶或其催化活性部分与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分融合。例如，T5αOH酶可以是At24T5αOH-tTCPR。在一些实施方案中，所述细胞产生紫杉二烯和/或紫杉二烯-5α-醇。

本发明的一些方面涉及选择表现出提高的萜类化合物生产的细胞的方法，其包括产生或获得过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的细胞，从所述细胞产生萜类化合物，将所述细胞的萜类化合物产量与对照细胞的萜类化合物产量进行比较，以及选择第一改进细胞，其比对照细胞产生更高量的萜类化合物，其中比对照细胞产生更高量萜类化合物的第一改进细胞是表现出提高的萜类化合物生产的细胞。

在一些实施方案中，所述细胞重组表达萜合酶(terpenoid synthase)和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)。方法还可包括在第一改进细胞中改变非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分、萜合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)的表达水平，以产生第二改进细胞，且将第二改进细胞的萜类化合物产量与第一改进细胞的萜类化合物产量进行比较，其中比第一改进细胞产生更高量萜类化合物的第二改进的细胞是表现出提高的萜类化合物生产的细胞。在一些实施方案中，所述萜类化合物合酶是紫杉二烯合酶。所述细胞还可重组表达与本发明相关的任何多肽。

本发明的一些方面涉及分离的多肽，其包含与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分融合的紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。在一些实施方案中，所述细胞色素P450还原酶是紫杉的细胞色素P450还原酶(TCPR)。在某些实施方案中，紫杉二烯5α-羟化酶和TCPR通过接头连接，例如GSTGS(SEQ ID NO：50)。在一些实施方案中，紫杉二烯5α-羟化酶和/或TCPR被截短以去除全部或部分跨膜区。在某些实施方案中，紫杉二烯5α-羟化酶N-端的8、24或42个氨基酸被截短。在某些实施方案中，TCPR的74个氨基酸被截短。在一些实施方案中，还将其他肽与紫杉二烯5α-羟化酶融合。在某些实施方案中，所述其他肽来自牛17α羟化酶。在某些实施方案中，所述肽是MALLLAYF(SEQ ID NO：51)。在某些实施方案中，所述分离的多肽是At24T5αOH-tTCPR。本发明的方面还包括编码与本发明相关的任何多肽的核酸分子和重组表达与本发明相关的任何多肽的细胞。

本发明的一些方面涉及在产生一种或更多种萜类化合物的细胞中提高萜类化合物生产的方法。所述方法包括控制细胞中或细胞培养物中的吲哚积累，从而提高细胞中萜类化合物的生产。本文所述的任何细胞均可用于该方法，包括细菌细胞，如大肠杆菌细胞；革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌细胞；酵母细胞，如酵母属细胞或耶氏酵母属细胞；藻类细胞；植物细胞；以及本文所述的任何工程化细胞。

在一些实施方案中，控制细胞中或细胞培养物中吲哚积累的步骤包括使上游非甲羟戊酸类异戊二烯途径与下游产物合成途径相平衡和/或改变或调节吲哚途径。在另一些实施方案中，控制细胞中或细胞培养物中吲哚积累的步骤包括或还包括通过化学方法从发酵中除去积累的吲哚，例如用吸附剂或清除剂。

由细胞或在培养物中产生的一种或更多种萜类化合物可以是单萜、倍半萜、二萜、三萜或四萜。在某些实施方案中，所述萜类化合物是紫杉二烯或任何紫杉醇前体。

本发明方面涉及包括在产生一种或更多种萜类化合物的细胞中或在产生一种或更多种萜类化合物的细胞培养物中测量吲哚的量或浓度的方法。所述方法可包括两次或更多次测量吲哚的量或浓度。在一些实施方案中，测得的吲哚量或浓度用于指导生产一种或更多种萜类化合物的过程。在一些实施方案中，测得的吲哚量或浓度用于指导菌株构建。

参考附图和对本发明的详细说明，本发明的这些和其他方面及其各种实施方案将会更清楚。

附图说明

附图并不是按比例绘制。在附图中，多个图中相同的或几乎相同的组分由相似的数字代表。为了清楚起见，没有在每幅附图中标出每个组分。在附图中：

图1.多变量模块化类异戊二烯途径工程揭示了在萜类化合物积累中的强非线性反应。为了增加通过上游MEP途径的通量，我们以报道的瓶颈酶促步骤(dxs，idi，ispD和ispF)为靶标来通过操纵子(dxs-idi-ispDF)进行过表达。²⁸为了从通用类异戊二烯前体(IPP和DMAPP)向紫杉醇生物合成输送过量的通量，构建了下游基因GGPP合酶(G)和紫杉二烯合酶(T)¹⁶的合成操纵子。上游类异戊二烯和下游紫杉二烯合成途径置于诱导型启动子的控制下以控制其相对基因表达。(a)两个模块的示意图，天然上游MEP类异戊二烯途径(左)和合成的紫杉二烯途径(右)。在大肠杆菌中的生物合成网络中，MEP类异戊二烯途径是由来自糖酵解的前体甘油醛-3磷酸(G3P)与丙酮酸(PYR)的缩合开始的。紫杉醇途径分支从通用类异戊二烯前体IPP和DMAPP开始，首先形成“直链”前体牻牛儿基牻牛儿基二磷酸，接着是“环状”紫杉二烯——确定的和关键的紫杉醇中间体。环烯烃紫杉二烯经过多轮的立体特异性氧化，酰化，与侧链组分苯酰化，最终形成紫杉醇。(b)用于对来自上游和下游途径工程化细胞的萜类化合物积累的非线性反应的多变量模块化类异戊二烯途径工程策略的示意图。上游和下游途径的表达通过改变启动子强度(Trc，T5和T7)或用不同质粒提高拷贝数来调节。上游和下游途径表达的变化产生不同的紫杉二烯最高积累。

图2.通过调节上游和下游模块途径的表达来优化紫杉二烯生产。(a)紫杉二烯积累对上游途径强度增加而下游途径恒定值的反应。(b)下游途径对上游途径强度恒定增加的依赖性。观察到的多个紫杉二烯反应局部最大值取决于上游或下游途径表达强度的增加。(c)来自改造成具有高上游途径过表达(20-100)和两种不同下游表达(～30和～60)的工程化菌株(17-24)的紫杉二烯反应，以鉴定具有平衡表达的紫杉二烯反应。用来自低拷贝质粒(P5和P10)的强启动T7TG操纵子控制下的下游途径表达来调节这些表达。需要注意的是，从不同质粒用不同启动子表达上游和下游两个途径可导致质粒带来的代谢负担。(d)用增加来自染色体的启动子强度和两个不同的下游表达(～30和～60)来调节上游途径，以鉴定具有减少的毒副作用(菌株25-32)的错过的搜索空间。(e)紫杉二烯产生菌株的遗传细节。对应于不同菌株及其相应基因型的数字，E：大肠杆菌K12mG1655ΔrecAΔendA，EDE3：大肠杆菌K12mG1655ΔrecAΔendA，在染色体中具有T7RNA聚合酶DE3构建体，MEP：dxs-idi-ispDF操纵子，GT：GPPS-TS操纵子，TG：TS-GPPS操纵子，Ch1：染色体中一个拷贝，Trc：Trc启动子，T5：T5启动子，T7：T7启动子，p5、p10、p20：～5(SC101)，～10(p15)和～20(pBR322)个拷贝的质粒。

图3.代谢物与紫杉二烯生产呈负相关。(a)检测到代谢物的质谱与图2的菌株构建体中紫杉二烯生产呈负相关。观察到的代谢物特征峰是233，207，178，117，89和62。(b)图3a类异戊二烯副产物与紫杉二烯的相关性。选择菌株26-29和30-32(均有染色体整合的上游途径表达)来进行一致性比较。在菌株26-29和30-32中，通过将启动子由Trc分别变为T5和T7来提高上游表达。这两组菌株仅在下游途径的表达上有不同，其中第二组(30-32)的表达水平是第一组的两倍。对第一组，菌种26实现了最佳平衡，其使用Trc启动子来表达上游途径，而且也显示了最低的代谢物积累。对菌株30-32，菌株31显示了最低的代谢物积累和最高的紫杉二烯产量。这些数据证实了未知代谢物与紫杉二烯生产之间观察到的负相关。

图4.工程化菌株中上游和下游途径的转录基因表达水平和细胞生理变化。通过qPCR定量上游(DXS)和下游(TS)途径操纵子中第一组基因的相对表达。操纵子下游途径的基因也观察到了类似的表达谱。图中显示了相应的菌株号。(a)在两种不同下游表达下，使用启动子和质粒调节不同上游表达，从而定量DXS基因表达的相对转录水平。(b)在不同的上游表达下，使用p5T7和p10T7质粒来调节两种不同的下游表达，从而定量TS基因表达的相对转录水平。我们的基因表达分析直接支持了该假说，随着质粒拷贝数(5，10和20)和启动子强度(Trc，T5和T7)的增加，可调节上游和下游途径的表达。(c)工程化菌株25-29的细胞生长。类异戊二烯代谢的活化(菌株26)、重组蛋白质的表达(菌株25)和质粒带来的代谢负担(对照与工程化菌株相比)影响了生长表型。以及(d)菌株17、22、25-32的生长表型。黑色线是生产紫杉二烯的工程化菌株，而灰色线是没有下游表达的对照菌株，携带具有启动子和多克隆位点的空质粒。生长与萜类化合物代谢的活化、质粒带来的代谢负担以及重组蛋白质的表达相关。

图5.大肠杆菌中紫杉醇p450氧化化学的改造。(a)紫杉二烯转化至紫杉二烯5α-醇至紫杉醇的示意图。(b)跨膜工程和来自紫杉二烯5α-醇羟化酶(T5αOH)和紫杉细胞色素p450还原酶(TCPR)的单组分嵌合蛋白质的构建。1和2表示T5αOH和TCPR的全长蛋白，其鉴定为分别具有42和74个氨基酸的TM区。3-嵌合体酶，其产生自三种不同TM改造的T5αOH构建体，(通过将8残基合成肽(A)融合至8、24和42个氨基酸截短的T5αOH而构建的At8T5αOH、At24T5αOH和At42T5αOH)通过用5残基的GSTGS接头肽而与74AA截短的TCPR(tTCPR)进行翻译融合。(c)转化到紫杉二烯生产菌株18中的At8T5αOH-tTCPR、At24T5αOH-tTCPR和At42T5αOH-tTCPR构建体的功能活性。(d)在1L生物反应器发酵的菌株18-At24T5aOH-tTCPR的紫杉二烯5α-醇积累时间过程谱和生长谱。

图6.在大肠杆菌中生产紫杉醇的生物合成方案。两个模块的原理图，天然的上游类异戊二烯途径(左)和合成的紫杉醇途径(右)。在大肠杆菌生物合成网络中，MEP类异戊二烯途径的分支起始自来自糖酵解(I-V)的前体甘油醛三磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)。紫杉醇途径的分支从大肠杆菌类异戊二烯前体IPP和DMAPP开始，至“直链”前体牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(VIII)，“环状”紫杉二烯(IX)，“氧化的”紫杉二烯5α-醇(X)，至多轮的立体特异性氧化，酰化，苯甲酰化，和早期前体巴卡亭III(XII)的环氧化作用，并最终与侧链组装成紫杉醇(XIII)。DXP：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，MEP：2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，CDP-ME：4-二磷酸胞苷-2C甲基-D-赤藓糖醇，CDP-MEP：4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸，ME-cPP：2C-甲基-D-赤藓糖醇-2，4-环二磷酸，IPP：异戊烯基二磷酸，DMAPP：二甲基烯丙基二磷酸。从G3P和PYR至紫杉醇的生物合成途径中涉及的基因。DXS：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，ispC：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，IspD：4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶，IspE：4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶，IspF：2C-甲基-D-赤藓糖醇-2，4-环二磷酸合酶，IspG：1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶，IspH：4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IDI：异戊烯基二磷酸异构酶，GGPPS：牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，紫杉二烯合酶，紫杉烷5α-羟化酶，紫杉烷5α-O-乙酰转移酶，紫杉烷13α-羟化酶，紫杉烷10β-羟化酶，紫杉烷2α-羟化酶，紫杉烷2-O-苯甲酰基转移酶，紫杉烷7β-羟化酶，紫杉烷10-O-乙酰转移酶，紫杉烷1β-羟化酶＊，紫杉烷9α-羟化酶，紫杉烷9-酮-氧化酶＊，紫杉烷C4，C20-β-环氧化酶＊，苯丙氨酸氨基变位酶，侧链CoA-连接酶＊，紫杉烷13-O-苯基丙酰基转移酶，紫杉烷2′-羟化酶＊，紫杉烷3′-N-苯酰基转移酶。^216，219＊标记的基因尚未被鉴定或表征。

图7.来自模块途径表达搜索的紫杉二烯生产的改善倍数。(a)与菌株1相比，在图2a，b和c中所有观察到的紫杉二烯反应最大值的改善倍数。两个最高的最大值(菌株17和26)之间相差2.5倍，而与最低值相差23倍(菌株26和10)，表明最佳反应的缺失导致滴度显著降低。

图8.代谢物(a)紫杉二烯与代谢物积累之间的相关性。来自基因工程化菌株的代谢物积累与紫杉二烯生产是以指数的方式成反比的。该相关性的相关系数为0.92。(b)来自菌株26-28的代表性GC谱，证明紫杉二烯和代谢物积累的变化。色谱图中的数字1和2分别对应于代谢物和紫杉二烯峰。(c)代谢物(1)和紫杉二烯(2)各自的GC-MS谱。观察到的代谢物特征峰是233、207、178、117、89和62。紫杉-4(20)，11，12-二烯的特征离子m/z 272(P⁺)，257(P⁺-CH₃)，229(P⁺-C₃H₇)；121，122，123(C-环片段簇)。⁶⁰星号标记的峰是内标物石竹烯。

图9.菌株26中改造的人工嵌合体酶的GC-MS谱和紫杉二烯/紫杉二烯-5α-醇生产。(a)三个构建体(A-At8T5αOH-tTCPR，t24T5αOH-tTCPR和At42T5αOH-tTCPR)转化至菌株26并发酵5天的己烷∶乙醚(8∶2)提取物的GC谱。峰中的1、2和3号标记分别对应于紫杉二烯，紫杉二烯-5α-醇和5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷(OCT)。(b)在三种菌株中定量的紫杉-4(20)，11，12-二烯-5α-醇和OCT的产量。(c)和(d)紫杉-4(20)，11，12-二烯-5α-醇和OCT的GC-MS谱，并且就对应于片段化的峰与可信标准品和之前报告的^42，47进行比较比较。GC-MS分析证实了质朴身份是紫杉-4(20)，11，12-二烯-5α-醇，其特征离子m/z 288(P⁺)，273(P⁺-H₂O)，255(P⁺-H₂O-CH₃)。

图10展现了描述萜类化合物生物合成途径和由该途径产生的天然产物的示意图。

图11展现了描述为扩大紫杉二烯生产而调节上游途径的示意图。

图12展现了描述为扩大紫杉二烯生产而调节下游途径的示意图。

图13展现了表明新发现的途径分支不是下游合成途径之特征的示意图。

图14.途径强度与转录基因表达水平相关。(c)使用逐渐增加的上游途径强度和31任意单位(arbitrary unit)的下游强度，idi、ispD和ispF基因的相对表达，和(d)使用逐渐增加的上游途径强度和61任意单位的下游强度，idi，ispD和ispF基因的相对表达。正如预期的，基因表达随着上游途径强度的增加而增加。条形图中显示了相应的菌株号。用看家基因rrsA的表达来定量相对表达。数据是四次重复的平均值+/-SD。

图15.代谢副产物吲哚的积累对紫杉二烯生产和生长的影响。(a)紫杉二烯和吲哚之间的负相关。选择菌株26-28以及30-32(均有染色体整合的上游途径表达)来进行一致性比较。这两组菌株仅在下游途径的表达上有不同，其中第二组(30-32)的表达水平是第一组的两倍。在菌株26-28和30-32中，通过将启动子由Trc分别变为T5和T7来增加上游表达。对第一组，菌种26达到最佳平衡，其使用Trc启动子来表达上游途径，而且也显示了最低的吲哚积累。对菌株30-32，菌株31显示了最低的吲哚积累和最高的紫杉二烯生产。对于这两组菌株，改善倍数是分别相对于菌株25和29而言的。(b)对于高产菌株26，外部加入吲哚对紫杉二烯生产的影响。不同浓度的吲哚被加入到在含有0.5％酵母提取物的基本培养基中培养的细胞培养物中。随着吲哚浓度从50mg/L增加至100mg/L，紫杉二烯的生产显著减少。(c)对大肠杆菌工程化菌株，外部加入吲哚对细胞生长的影响。数据是三次重复的平均值+/-SD。选择缺少下游途径和有不同强度上游途径(1，2，6，21，40和100)的菌株。菌株26(高紫杉二烯产生菌)显示了最强的抑制作用。

图16.未知代谢物被鉴定为吲哚。(A)和(a)用己烷从细胞培养物中提取的未知代谢物的气相色谱和质谱。(B)和(b)对应于溶解于己烷的纯吲哚的气相色谱和质谱。另外，为确认化学身份，用己烷从发酵液中提取代谢物，并使用正己烷∶乙酸乙酯(8∶2)作为洗脱剂的硅胶柱层析法纯化。用TLC和GC-MS证实该化合物的纯度。¹HNMR和¹³CNMR谱证实了该代谢物的化学身份是吲哚。(c)从细胞培养物中提取的吲哚的¹HNMR谱(CDCl3，400MHz)δ：6.56(d，1H，Ar C-H)，7.16(m，3H，Ar C-H)，7.38(d，1H，Ar C-H)，7.66(d，1H，Ar C-H)，8.05(b，1H，吲哚NH)。(d)¹³CNMRδ：135.7，127.8，124.2，122，120.7，119.8，111，102.6。(e)是纯吲哚的¹HNMR谱。

图17.1L生物反应器中工程化菌株的补料分批培养。对于菌株22、17和26，在控制pH值和氧气条件的1L生物反应器中，用基本培养基和0.5％酵母提取物进行补料分批生物反应器培养5天，紫杉二烯积累(a)，细胞生长(b)，乙酸积累(c)和总底物(甘油)添加(d)的时间进程。在发酵过程中，发酵罐中的甘油消耗至～0.5-1g/L之后向生物反应器中加入3g/L的甘油。数据是生物反应器两次重复的平均值。

发明详述

紫杉醇是强效的抗癌药物，其最先作为天然产物从短叶紫杉太平洋紫杉树中分离出来。然而，通过传统方法从植物提取物中可靠且具有成本效益地生产紫杉醇或紫杉醇类似物是有限的。在这里，我们报告一种代谢途径工程的多变量模块化方法，将紫杉二烯产量在大肠杆菌工程菌中扩大～15000倍。紫杉二烯(第一个确定的紫杉醇中间体)是非甲羟戊酸途径的生物合成产物，该途径在大肠杆菌中包括两个模块：形成异戊烯基焦磷酸(IPP)的天然上游途径，和异源性的下游萜类化合物形成途径。系统性多变量搜索鉴定出了最大限度地平衡两个途径模块以尽量减少抑制性中间体的积累和通量转向至副产物的条件。我们还设计了在紫杉醇生物合成中紫杉二烯之后的下一步，基于P450的氧化步骤，其获得了＞98％的底物转化，并提出了在大肠杆菌中生产任何功能性紫杉醇中间体的第一个实例。该模块化途径工程方法不仅突出了多步骤途径的复杂性，也使小规模发酵中高滴度紫杉二烯和紫杉二烯-5α-醇(分别为～300mg/L和60mg/L)的积累成为可能，从而为微生物生产紫杉醇及其衍生物的潜力提供了示范。

本发明的应用不仅限于其在如下描述或附图中所描述的构建细节和组分的排列。本发明能用于其他实施方案，并能以各种方式实施或进行。此外，本文所用的用语和术语目的是描述而不应被视为限制。本文使用的“包括”、“包含”或“有”“含有”、“涉及”及其变体是指包含其后所列项目及其等同方案以及其他项目。

本文展示了萜类化合物如紫杉二烯的微生物生产。当以令人满意的水平表达时，微生物路线大幅减少了这种化合物的生产成本。此外，它们利用廉价、丰富并可再生的原料(如糖和其他碳水化合物)，并可作为合成众多可有远优于原始化合物之特性的衍生物的来源。使用微生物路线生产类异戊二烯途径化合物的成本竞争力的关键因素是增强这一途径，以便使这些分子过量生产。本文所述的方法是增强或扩大大肠杆菌(E.coli)中通向萜类化合物的通量。具体地，提供了增强通向合成以下化合物的代谢通量的方法：异戊烯基焦磷酸(IPP)(生产类异戊二烯化合物的关键中间体)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)、牻牛儿基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)和法呢基牻牛儿基二磷酸(FGPP)、紫杉醇(泰素)、银杏内酯、牻牛儿醇、法呢醇、牻牛儿基牻牛儿醇、沉香醇、异戊二烯、单萜如薄荷醇、类胡萝卜素如番茄红素、聚类异戊二烯如聚异戊二烯或天然橡胶、二萜如eleutherobin以及倍半萜如青蒿素。

本发明的一些方面涉及萜类化合物的生产。本文所用的萜类化合物(也称为类异戊二烯)是衍生自五碳异戊二烯单元的有机化学品。萜类化合物的一些非限定性实施例(根据它们所含的异戊二烯单元的数目分类)包括：半萜(1个异戊二烯单元)、单萜(2个异戊二烯单元)、倍半萜(3个异戊二烯单元)、二萜(4个异戊二烯单元)、二倍半萜(5个异戊二烯单元)、三萜(6个异戊二烯单元)、四萜(8个异戊二烯单元)和具有更大数目异戊二烯单元的多萜。在一些实施方案中，产生的萜类化合物是紫杉二烯。在一些实施方案中，产生的萜类化合物是香茅醇、荜澄茄醇(cubebol)、诺卡酮、桉树脑(cineol)、柠檬烯、eleutherobin、匍枝珊瑚醇(Sarcodictyin)、伪蕨素(Pseudopterosin)、银杏内酯、甜菊苷、甜叶菊苷A(Rebaudioside A)、香紫苏醇、labdenediol、左旋海松二烯、sandracopimaradiene或isopemaradiene。

本文描述了通过控制参与上游途径和下游途径的基因或蛋白质表达而优化细胞中萜类化合物生产的方法和组合物。上游途径涉及生产异戊基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，其可通过两种不同的代谢途径实现：甲羟戊酸(MVA)途径和MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸)途径，也被称为MEP/DOXP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸)途径、非甲羟戊酸途径或甲羟戊酸非依赖途径。

下游途径是合成途径，导致萜类化合物生产，并涉及萜类化合物合酶(也被称为萜环化酶)和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)的重组基因表达。在一些实施方案中，萜类化合物合酶是二萜合酶。二萜合酶的若干非限定性实施例包括蓖麻烯(casbene)合酶、紫杉二烯合酶、左旋海松二烯合酶、冷杉二烯(abietadiene)合酶、异海松二烯合酶、ent-焦磷酸古巴酯(ent-copalyl diphosphate)合酶、syn-stemar-13-ene合酶、syn-stemod-13(17)-ene合酶、syn-pimara-7，15-diene合酶、ent-隐海松二烯合酶、ent-cassa-12，15-diene合酶、ent-pimara-8(14)，15-diene合酶、ent-kaur-15-ene合酶、ent-kaur-16-ene合酶、aphidicolan-16β-ol合酶、phyllocladan-16α-ol合酶、fusicocca-2，10(14)-diene合酶，以及terpentetriene环化酶。

出人意料地，如在实施例部分所示，通过如本文所述操作上游和下游途径而对萜类化合物合成的优化并不是简单的线性或加和过程。相反，通过复杂的组合分析，通过平衡上游和下游途径的组分而完成了优化。出人意料地，如图1和2所示，紫杉二烯的积累对上游MEP和下游合成紫杉二烯途径的相对强度表现出强非线性依赖性。

本发明的一些方面涉及控制MEP途径中基因和蛋白质的表达以优化萜类化合物如紫杉二烯的生产。优化的萜类化合物生产是指在采用优化策略后产生了比没有此种策略时量更高的萜类化合物。应该认识到，本文所述的方法和组合物包括MEP途径中的任何基因和/或蛋白质。在一些实施方案中，MEP途径中的基因是下列之一：dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA或ispB。MEP途径中的一个或更多个基因和/或蛋白质的表达可被上调和/或下调。在某些实施方案中，MEP途径中一个或更多个基因和/或蛋白质的上调可与MEP途径中一个或更多个基因和/或蛋白质的下调相结合。

应该认识到，基因和/或蛋白质可单独调节或联合调节。例如，dxs的表达可被单独上调或下调，或者与ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispC的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispD的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispE的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispF的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispG的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispH的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、idi、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。idi的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、ispA和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispA的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispB中的一个或多个的表达结合上调或下调。ispB的表达可单独上调或下调，或者与dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispA中的一个或多个的表达结合上调或下调。在一些实施方案中，dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi中的一个或多个基因和/或蛋白质的表达被上调，而ispA和/或ispB的基因和/或蛋白质表达被下调。

MEP途径中基因的表达可在模块化方法中调节。本文所用的通过模块化方法进行调节是指多个基因的共同调节。例如，在一些实施方案中，MEP途径中的多个基因在连续的DNA区域(例如作为操纵子)上重组表达。应该理解，表达这种模块的细胞也可重组或内源性表达MEP途径中的一个或更多个其他基因。

MEP途径中基因模块的非限定性实施例是包括基因dxs、idi、ispD和ispF的模块，其在实施例部分有介绍，并在本文被称为dxs-idi-ispDF。应该理解，与本发明的方面相一致地，MEP途径中的基因模块可以任何顺序包含MEP途径中的任何基因。

也可调节合成的下游萜类化合物合成途径中的基因和蛋白质表达，以优化萜类化合物的生产。合成的下游萜类化合物合成途径涉及萜合酶和GGPPS酶的重组表达。如上所述，任何萜合酶均可根据要产生的下游产物而与GGPPS一起表达。例如，紫杉二烯合酶用于生产紫杉二烯。紫杉二烯合酶和GGPPS酶的重组表达可被独立调节或共同调节。在一些实施方案中，这两种酶以模块化的方式被共同调节。例如这两种酶可在操纵子中以任意顺序表达(GGPPS-TS，被称为“GT”，或TS-GGPPS，被称为“TG”)。

对基因和/或蛋白质表达的操作(包括如dxs-idi-ispDF操纵子和TS-GGPPS操纵子的模块)可通过本领域普通技术人员已知的方法实现。例如，基因或操纵子的表达可通过选择有不同强度的启动子(如诱导型启动子)来调节。启动子的几个非限定性实施例包括Trc、T5和T7。此外，基因或操纵子的表达可通过操作基因或操纵子在细胞中的拷贝数来调节。例如，在某些实施方案中，相对于仅过表达合成的下游途径的菌株，在其染色体上额外包含Trc启动子控制下的操纵子dxs-idi-ispDF拷贝的菌株产生更多量的紫杉二烯。在一些实施方案中，基因或操纵子的表达可通过操作模块内基因的顺序来调节。例如，在某些实施方案中，将下游合成操纵子的基因顺序由GT改变为TG导致紫杉二烯生产提高了2-3倍。在一些实施方案中，基因或操纵子的表达通过将一个或更多个基因或操纵子整合到染色体上来调节。例如，在某些实施例中，将上游dxs-idi-ispDF操纵子整合到细胞染色体上导致紫杉二烯生产提高。

应该理解，本发明相关基因可从多种来源获得。在一些实施方案中，MEP途径中的基因是细菌基因，例如大肠杆菌基因。在一些实施方案中，编码GGPPS的基因是植物基因。例如，编码GGPPS的基因可来自紫杉属(Taxus)物种，如加拿大紫杉(T.canadenis)。在一些实施方案中，编码紫杉二烯合酶的基因是植物基因。例如，编码紫杉二烯合酶的基因可来自紫杉属物种如短叶紫杉(T.brevifolia)。加拿大紫杉GGPPS和短叶紫杉二烯合酶的代表性GenBank登记号以AF081514和U48796提供，其序列通过参考整体并入本文。

本领域普通技术人员会意识到，本发明相关方法中使用的同源基因可从其他物种获得，并可通过同源性检索来鉴定，例如通过由国家生物技术信息中心(NCBI)互联网网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的蛋白质BLAST搜索。本发明相关的基因和/或操纵子可从来自任何来源的包含给定基因的DNA中克隆出来，例如通过PCR扩增和/或限制性酶切。在一些实施方案中，本发明相关的基因和/或操纵子是合成的。任何获得发明相关的基因和/或操纵子的方法都是与本发明相容的。

在一些实施方案中，萜类化合物生产的进一步优化是通过基因在细胞中重组表达之前对它进行修饰而完成的。在一些实施方案中，GGPPS酶具有以下突变中的一个或更多个：A162V、G140C、L182M、F218Y、D160G、C184S、K367R、A151T、M185I、D264Y、E368D、C184R、L331I、G262V、R365S、A114D、S239C、G295D、I276V、K343N、P183S、I172T、D267G、I149V、T234I、E153D和T259A。在一些实施方案中，GGPPS酶在S239残基和/或G295残基含有突变。在某些实施方案中，GGPPS酶含有S239C和/或G295D突变。

在一些实施方案中，基因在细胞中重组表达之前的修饰包括针对细菌细胞中的表达进行密码子优化。多种物种的密码子使用可访问密码子使用数据库(www.kazusa.or.jp/codon/)。密码子优化(包括鉴定多种生物的最佳密码子，以及实现密码子优化的方法)是本领域普通技术人员熟知的，而且可使用标准方法来完成。

在一些实施方案中，基因在细胞中重组表达之前的修饰包括基因在细胞中重组表达之前对其产生一个或更多个突变。例如，突变可包括单个核苷酸或多个核苷酸的替换或缺失。在一些实施方案中，基因中一个或更多个核苷酸的突变会导致从该基因产生的蛋白质的突变，例如一个或更多个氨基酸的替换或缺失。

在一些实施方案中，用已针对萜类化合物生产进行了优化的细胞可以是有利的。例如，在一些实施方案中，使用过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的细胞，来至少部分增强异戊基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，它们是GGPPS的底物。在一些实施方案中，通过增加非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的拷贝数来实现非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的过表达。例如，MEP途径中限速步骤组分如(dxs、ispD、ispF、idi)的拷贝数可被扩增，例如通过额外的附加体表达来实现。

在一些实施方案中，构建蛋白质(如酶)中特定突变包括“推理性设计(rational design)”。如本文所用的“推理性设计”是指将酶或相关酶的知识(例如它的三维结构，它的活性位点，它的底物和/或酶与底物之间的相互作用)整合入特定突变的设计中。基于推理性的设计方法，可在酶中产生突变，之后可针对与对照水平相比的萜类化合物产量增加进行筛选。在一些实施方案中，可根据同源性建模来推理性设计突变。本文所用的“同源性建模”是指对一个蛋白质从其氨基酸序列和相关同源蛋白质的三维结构来构建原子分辨率模型的过程。

在一些实施方案中，可在基因(如编码酶的基因)中制造随机突变，而且从这些突变中可筛选与对照水平相比萜类化合物生产提高的突变。例如，对MEP途径组分或其他途径组分中导致萜类化合物生产提高之突变的筛选可通过随机诱变筛选或通过已知突变的筛选来进行。在一些实施方案中，可使用基因组片段的鸟枪克隆来确定导致萜类化合物生产提高的基因组区域，这通过在具有这些片段的细胞或生物中筛选萜类化合物生产的提高来实现。在一些情况下，可在同一细胞或生物中组合一个或更多个突变。

在一些实施方案中，可通过对与本发明相关酶在同一途径中起作用的酶进行操作来提高细胞中萜类化合物在的生产。例如，在一些实施方案中，提高作用于靶标酶(如本发明相关酶)上游的酶或其他因子的表达可以是有利的。这可通过使用任何标准方法来过表达该上游因子来实现。

蛋白质表达的优化也可通过选择合适的启动子和核糖体结合位点来实现。在一些实施方案中，这可包括选择高拷贝数的质粒，或者低或中等拷贝数的质粒。也可以靶向转录终止的步骤来调节基因表达，这通过引入或消除诸如茎环的结构来实现。

本发明的一些方面涉及重组基因在细胞中的表达。本发明包括重组表达本发明相关基因的任何类型的细胞，包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如埃希氏菌(Escherichia spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)、Zymonas spp.、醋酸菌(Acetobacter spp.)、柠檬酸菌(Citrobacter spp.)、Synechocystis spp.、根瘤菌(Rhizobium spp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、黄单胞菌(Xanthomonas spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)、产碱杆菌(Alcaligenes spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、固氮菌(Azotobacter spp.)、丛毛单胞菌(Comamonas spp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌(Gluconobacter spp.)、雷尔氏菌(Ralstoniaspp.)、硫杆菌(Acidithiobacillus spp.)、Microlunatus spp.、地杆菌(Geobacter spp.)、地芽孢杆菌(Geobacillus spp.)、节杆菌(Arthrobacterspp.)、黄杆菌(Flavobacterium spp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)、糖多孢菌(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌(Thermus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas spp)、色杆菌(Chromobacterium spp)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp)、糖多孢菌(Saccharopolyspora spp)、农杆菌(Agrobacterium spp)和泛菌(Pantoea spp)。细菌细胞可是革兰氏阴性细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞，或革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌种。在另一些实施方案中，所述细胞是真菌细胞，例如酵母细胞，如酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、Paffia spp.、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、念珠菌(Candida spp.)、蓝状菌(Talaromyces spp.)、酒香酵母(Brettanomycesspp.)、管囊酵母(Pachysolen spp.)、德巴利酵母(Debaryomyces spp.)、耶氏酵母(Yarrowia spp.)和工业上的多倍体酵母菌株。优选地，所述酵母菌株是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株或耶氏酵母菌株。真菌的其他实例包括曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Pennicilium spp.)、镰孢菌(Fusariumspp.)、根霉(Rhizopus spp.)、顶孢霉(Acremonium spp.)、脉孢霉(Neurospora spp.)、粪壳菌(Sordaria spp.)、稻瘟病菌(Magnaporthespp.)、异水霉(Allomyces spp.)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢霉(Botrytisspp.)和木霉(Trichoderma spp)。在另一些实施方案中，所述细胞是藻类细胞，或植物细胞。应该理解，与本发明相容的一些细胞可表达一种或更多种本发明相关基因的内源性拷贝，以及重组拷贝。在一些实施方案中，若细胞有一种或更多种本发明相关基因的内源性拷贝，那么该方法将不一定需要增加该内源性表达基因的重组拷贝。在一些实施方案中，细胞可内源性表达来自本文所述途径的一种或更多种酶，而且可重组表达来自本文所述途径的一种或更多种其他酶，以高效的生产萜类化合物。

本发明的另一些方面还涉及筛选显示出优化的萜类化合物生产的细菌细胞或菌株。如上所述，本发明相关的方法包括产生过表达MEP途径中一种或更多种基因的细胞。可测量培养该细胞所得的萜类化合物生产并与对照细胞比较，其中选择相对于对照细胞表现出更高萜类化合物生产量的细胞作为第一改进细胞。该细胞可通过萜合酶和GGPPS酶的重组表达来进一步修饰。接着可操作非甲羟戊酸(MEP)途径的一种或更多种组分、萜合酶和/或GGPPS酶在细胞内的表达水平，并可再次测量萜类化合物的生产，从而选择第二改进细胞，其产生比第一改进细胞更大量的萜类化合物。在一些实施方案中，所述萜合酶是紫杉二烯合酶。

本发明的另一些方面还涉及鉴定和(通过GC-MS)表征大肠杆菌细胞细胞之前未知的代谢物(图3和6)。可通过由过表达、下调或突变异戊二烯途径基因的方法对微生物途径进行遗传操作，来控制新鉴定的代谢物(吲哚)的积累水平。在工程化菌株中，代谢物吲哚作为直接变量与紫杉二烯的产量呈负相关(图3，6和15)。在细菌系统(特别是在细胞中，如大肠杆菌细胞)或其他细胞中，为改善流向萜类化合物生物合成的流量而对吲哚积累的进一步控制可通过平衡上游非甲羟戊酸异戊二烯途径与下游产物合成途径或者通过修饰或调节吲哚途径来实现。这样，本领域技术人员可减少或控制吲哚的积累，从而减少吲哚对紫杉二烯和其他衍生自所述途径的萜类化合物(例如单萜、倍半萜(包括紫穗槐二烯(amorphadiene))、二萜(包括左旋海松二烯)、三萜和四萜)生产的抑制作用。减少或控制吲哚积累的其他方法包括通过化学方法如用吸收剂、清除剂等将累积的吲哚从发酵中除去。

在另一些实施方案中，提供了包括在产生一种或更多种萜类化合物的细胞中或在产生一种或更多种萜类化合物的细胞培养物中测量吲哚的量或浓度的方法。只要合适，吲哚的量或浓度可用本领域已知的方法和本文所述的方法测量一次，或两次或更多次。这种方法可用于指导一种或更多种萜类化合物的生产方法，例如工艺改进。这种方法可用于指导菌株构建，例如菌株改进。

对实现这一平衡之方法的鉴定导致与野生型细菌细胞相比，用异源性紫杉二烯生物合成途径表达的萜类化合物(如紫杉二烯)过量生产提高了15000倍。通过修改的发酵方法进一步提高了生产，其产生的浓度约2g/L，比任何之前报道的紫杉二烯生产高1500倍。如本文所示，通过对大肠杆菌中非甲羟戊酸异戊二烯途径的遗传改造，现在可控制这种代谢物的积累，在细菌大肠杆菌细胞中它调节朝向异戊二烯生物合成的通量。本文还显示，将紫杉二烯生产进一步引导至紫杉醇的下一个关键前体——紫杉二烯-5α-醇，这通过对紫杉醇生物合成的氧化化学进行改造来实现。实施例5显示了首次将合成途径从紫杉二烯延伸至紫杉二烯-5α-醇。与大多数其他萜类化合物类似，紫杉醇生物合成遵照如下统一方式的“两阶段”的生物合成过程，(i)“环化酶阶段”，异戊二烯基前体(IPP和DMAPP)与GGPP线性偶联，接着分子环化并重排以形成紫杉二烯前体(图6，VIII-IX)^57， ⁵⁸。形成前体之后，(ii)“氧化阶段”，接着被7个细胞色素P450加氧酶及其氧化还原伴侣一起使环烯烃紫杉二烯的核心结构官能化，通过酰基和芳酰基CoA依赖性转移酶用两个乙酸基和苯甲酸基修饰，通过酮氧化酶用酮基团修饰，以及通过环氧酶用环氧基团修饰，形成后一中间体巴卡亭III，紫杉醇C13侧链结合于其上(图6，X-XIII)¹⁵。虽然预测了早期氧化阶段反应的大体顺序，但一些羟基化、酰化和苯甲酰反应的确切时间/顺序是不确定的。但明确的是，早期的分支起始自细胞色素p450介导的紫杉二烯核心C5位置的羟基化反应，接着是下游的羟基化反应，其使用细胞色素p450酶的同源家族，彼此之间有高度推定相似性(＞70％)，但与其他植物p450的相似之处十分有限(＜30％)^41，59。此外，结构和功能的多样性和可能的进化分析提示，紫杉二烯-5α-醇的基因可是亲本基因，由此进化出紫杉醇生物合成途径中的其他羟化酶基因，反映了羟基化作用的顺序¹⁵。

本发明的另一些方面涉及嵌合体P450酶。由于细菌平台固有的局限性，例如缺少电子传递机制、细胞色素P450还原酶和由于缺乏内质网而导致的P450酶膜信号模块的翻译不兼容性，植物细胞色素P450的功能性表达一直被认为具有挑战性。

在一些实施方案中，通过N-端跨膜工程和/或通过与CPR氧化还原伴侣融合翻译而产生嵌合酶，对本发明方法相关的紫杉二烯-5α-羟化酶进行了优化。在一些实施方案中，CPR氧化还原伴侣是紫杉的细胞色素P450还原酶(TCPR；图5b)。在某些实施方案中，细胞色素P450紫杉二烯-5α-羟化酶(T5αOH)从东北紫杉(Taxus cuspidate)获得(GenBank登录号AY289209，其序列通过参考并入本文)。在一些实施方案中，NADPH：细胞色素P450还原酶(TCPR)从东北紫杉获得(GenBank登录号AY571340，其序列通过参考并入本文)。

紫杉二烯5α-羟化酶和TCPR可通过如GSTGS(SEQ ID NO：50)的接头连接在一起。在一些实施方案中，紫杉二烯5α-羟化酶和/或TCPR被截短以除去一个或两个蛋白质的全部或部分跨膜区。例如，在一些实施方案中的紫杉二烯5α-羟化酶被截短以除去8、24或42个N端氨基酸。在一些实施方案中，TCPR的N端74个氨基酸被截去。也可将额外的肽与紫杉二烯5α-羟化酶融合。例如，来自牛17α羟化酶的一个或更多个氨基酸可添加到紫杉二烯5α-羟化酶。在某些实施方案中，肽MALLLAVF(SEQ ID NO：51)被添加到紫杉二烯5α-羟化酶。含有融合至TCPR的紫杉二烯5α-羟化酶的非限定性实例是At24T5αOH-tTCPR。

在一些实施方案中，该嵌合酶能进行第一个氧化步骤，有超过10％的紫杉二烯转化成紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷。例如，紫杉二烯至紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷的转化率可是至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少有70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，约99％或约100％。

在某些实施方案中，所述嵌合酶是At245αOH-tTCPR，发现其能够进行第一个氧化步骤，将超过98％的紫杉二烯转化至紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷(OCT；图9a)。对紫杉二烯-5α-醇生产步骤的改造是生产紫杉醇的关键，并在之前酵母中构建这一途径的尝试中发现是限速步骤。本文开发的工程构建体显示，在体内超过98％的紫杉二烯发生转化，比以前在酵母中异源性表达改善了2400倍。因此，除了合成显著更大量的关键紫杉醇中间体之外，本研究还提供了通过类似的P450化学来合成途径中后续代谢物的基础。

本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，因此术语多肽可用于指全长多肽，也可用于指全长多肽的一个片段。在本文中用于多肽、蛋白质或其片段时，“分离的”是指从其天然环境中分离出来，并以足以满足其鉴定或使用的量存在。当涉及蛋白质或多肽时，“分离的”是指，例如：(i)通过克隆表达而选择性产生的或(ii)通过色谱或电泳纯化的。分离的蛋白质或多肽可以是(但不一定是)基本纯的。术语“基本纯”是指在实际和与其预期用途相适应的程度上，蛋白质或多肽中基本上不含有可见于其生产中、自然界中或体内系统中的其他物质。基本纯的多肽可天然获得或使用本文所述的方法产生，并可用本领域熟知的技术纯化。因为分离的蛋白质在制备中可与其他组分混合，因此蛋白质可仅占制剂重量的一小部分。所述蛋白质仍然是分离的，其中它已从活系统中可与之相关的物质中分离，即从其他蛋白质中分离出来。

本发明还包括编码任何本文所述多肽的核酸，含有任何本文所述的核酸和/或多肽的文库，和含有任何本文所述的核酸和/或多肽的组合物。

在一些实施方案中，一个或更多个本发明相关的基因在重组表达载体中表达。本文所用的“载体”可是大量核酸中的任何一种，其中可通过限制性酶切和连接来插入所需的一个或更多个序列，以便在不同的遗传环境中运送或在宿主细胞中表达。载体通常是由DNA组成，但RNA载体也是可用的。载体包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。

克隆载体能自主复制或整合在宿主细胞基因组中，其还以一个或更多个限制性内切酶位点为特征，可以在该位点以确定的方式切割载体并可将期望的DNA序列连接到载体中，从而新的重组质粒保留了它在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，期望序列的复制可随着质粒在宿主细胞(如细菌宿主)中的拷贝数增加而多次发生，或仅在宿主通过有丝分裂繁殖前在每个宿主中发生一次。在噬菌体的情况下，复制可在裂解期过程中主动发生或在溶原期过程中被动发生。

表达载体是这样的载体，可通过限制性酶切和连接将期望的DNA序列插入其中，以使其与调控序列有效连接中并可表达为RNA转录本。载体还可包含适合用于鉴定细胞是否已被载体转化或转染的一种或更多种标记序列。标记包括如编码提高或降低其对抗生素或其他化合物之抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码可通过本领域已知标准方法检测活性的酶的基因(例如β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)，以及对转化或转染细胞、宿主、菌落或菌斑的表型有可见影响的基因(例如绿色荧光蛋白)。优选的载体是那些能够自主复制和表达与其有效连接的DNA片段中所存在的结构基因之产物的载体。

本文所用的编码序列和调控序列在以这种方式连接时被称为是“有效”连接，即使得编码序列的表达或转录处于调控序列的影响或控制之下。若想要将编码序列翻译成功能性蛋白质，则两个DNA序列在这种情况下被称为有效连接，即对5′调控序列中启动子的诱导引起编码序列的转录，并且两个DNA序列之间的连接性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录本被翻译成蛋白质的能力。因此，如果启动子区能实现DNA序列的转录，使得由此产生的转录本可翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区是与编码序列有效连接的。

当编码本发明任何酶的核酸分子在细胞中表达时，多种转录控制序列(例如启动子/增强子序列)可用于指导其表达。启动子可是天然的启动子，即基因的启动子在其内源环境中，这提供了基因表达的正常调节。在一些实施方案中，启动子可是组成型的，即启动子持续转录其相关基因而不受调节。也可用多种条件启动子，例如由分子的存在与否控制的启动子。

基因表达所需调控序列的确切性质在物种或细胞类型之间可能会有所不同，但一般按需要应包括，分别涉及转录和翻译起始的5′非转录和5′非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等等。尤其是，这种5′非转录调控序列将包括启动子区域，其包括控制对有效连接的基因进行转录控制的启动子序列。调控序列也可包括增强子序列或所需的上游激活子序列。本发明载体可任选地包括5′前导或信号序列。合适载体的选择和设计是在本领域普通技术人员的能力和判断范围内的。

包含所有必需表达元件的表达载体是市售的，而且是本领域技术人员熟知的。例如见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过将外源性DNA(RNA)导入细胞而对细胞进行遗传工程。该外源性DNA(RNA)被置于转录元件的有效控制下，以允许外源性DNA在宿主细胞中表达。实施例部分阐明了用大肠杆菌来异源表达本发明的相关基因，以生产萜类化合物如紫杉二烯。生产萜类化合物的新方法也可在其他细菌细胞、真菌(包括酵母细胞)、植物细胞等中表达。

可用本领域的标准方法和技术将编码本发明相关酶的核酸分子引入细胞中。例如，核酸分子可通过标准方案引入，如转化(包括化学转化和电穿孔)、转染、粒子轰击等。编码本发明酶的核酸分子的表达也可通过将该核酸分子整合入基因组中来实现。

在一些实施方案中，本发明相关的一个或更多个基因在细菌细胞中重组表达。本发明的细菌细胞可培养在任何类型(丰富或基本)和任何组成的培养基中。本领域普通技术人员将可以理解，常规优化将允许使用多种类型的培养基。选定的培养基可补充多种额外组分。补充组分的一些非限定性实例包括葡萄糖、抗生素、用于基因诱导的IPTG、ATCC微量矿物质补充剂和乙醇酸。同样，培养基的其他方面和本发明细胞的生长条件可通过常规实验来优化。例如，pH和温度是可优化因素的非限定性实例。在一些实施方案中，如培养基选择、培养基补充和温度等因素可影响萜类化合物如紫杉二烯的生产水平。在一些实施方案中，可优化补充性组分的浓度和量。在一些实施方案中，优化了用一种或更多种补充性组分来补充培养基的频率和在收获萜类化合物如紫杉二烯之前培养基的培养时间。

根据本发明的一些方面，高滴度的萜类化合物如紫杉二烯通过本发明相关基因在细胞中的重组表达而产生。本文所用的“高滴度”是指毫克每升(mg L^-1)级的滴度。给定产物产生的滴度将受多种因素影响，包括培养基的选择。在一些实施方案中，总的紫杉二烯滴度至少是1mg L^-1。在一些实施方案中，总的紫杉二烯滴度至少是10mg L^-1。在一些实施方案中，总的紫杉二烯滴度至少是250mg L^-1。例如、总的紫杉二烯滴度可至少是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或超过900mg L^-1，包括任何中间值。在一些实施方案中、总的紫杉二烯滴度可至少是1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或超过5.0g L^-1，包括任何中间值。

在一些实施方案中，总的紫杉二烯5α-醇滴度至少是1mg L^-1。在一些实施方案中，总的紫杉二烯5α-醇滴度至少是10mg L^-1。在一些实施方案中，总的紫杉二烯5α-醇滴度至少是50mg L^-1。例如，总的紫杉二烯5α-醇滴度至少是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或超过70mg L^-1，包括任何中间值。

用于本发明相关细胞生长的液体培养物可储于任何本领域已知和使用的培养容器中。在一些实施方案中，通气反应容器(如搅拌反应釜)中的大规模生产可用于产生大量的萜类化合物如紫杉二烯，其可从细胞培养物中回收。在一些实施方案中，萜类化合物是从细胞培养物的气相中回收的，例如通过向细胞培养物中加入有机层如十二烷并从有机层中回收萜类化合物。

通过本文所述方法产生的萜类化合物如紫杉二烯有广泛的应用，包括药物如紫杉醇(泰素)、青蒿素、银杏内酯、eleutherobin和伪蕨素(pseudopterosin)，以及许多其他潜在的药物化合物。其他应用包括用于香料和化妆品的化合物，如香叶醇、法尼醇、牻牛儿基牻牛儿醇、芳樟醇、柠檬烯、蒎烯、桉油素和异戊二烯。其他应用包括用作生物燃料的化合物，如5、10和15个碳原子长度的醇。需要指出的是，上述化合物目前是由多种植物提取而产生的。植物提取为基础的方法是冗长的，产量极低，并且能够这样获得的实际分子是有限的，即它们不容易生产可比原来化合物有更优越性能的衍生物。

实施例

方法

菌株、质粒、寡核苷酸和基因

大肠杆菌K12MG1655菌株是用于所有紫杉二烯菌株构建的宿主菌。大肠杆菌K12MG1655Δ(recA，endA)和大肠杆菌K12MG1655Δ(recA，endA)ED3菌株由MIT(Cambridge，MA)的Kristala Prather教授实验室提供。本研究所有质粒构建的细节如表2所示。本研究中使用的所有寡核苷酸示于表3。

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)⁵⁰、紫杉二烯合酶(TS)⁵¹、细胞色素P450紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)和紫杉NADPH：细胞色素P450还原酶(TCPR)⁴⁶序列来自加拿大紫杉、短叶紫杉、东北紫杉(GenBank登记号：AF081514、U48796、AY289209和AY571340)。基因是用Kodumal等报道的质粒和方案⁵²(补充附录1)自行合成的，以引入大肠杆菌翻译密码子并除去用于克隆目的的限制性酶切位点。去除了对应于GGPPS和TS的N端98和60个氨基酸的核苷酸(质体转运肽)，并插入翻译插入序列Met。¹⁷

MEP途径的构建(dxs-idi-idpDF操纵子)

通过用引物dxs(s)、dxs(a)、idi(s)、idi(a)、ispDF(s)和ispDFI(a)从大肠杆菌K12MG1655的基因组中克隆各个基因，首先在带有T7启动子的pET21C+质粒上构建了dxs-idi-idpDF操纵子(p20T7MEP)。⁵³用引物dxsidiispDFNcoI(s)和dxsidiispDFKpnI(a)，将dxs-idi-ispDF操纵子亚克隆到pTrcHis2B质粒(Invitrogen)经NcoI和KpnI消化得到的pTrcMEP质粒(p20TrcMEP)。p20TrcMEP质粒用MluI和PmeI酶切并克隆入经MluI和PmeI消化的pACYC184-melA(P2A)质粒，来构建p10TrcMEP质粒。pTrcMEP质粒用BstZ17I和ScaI消化并克隆到经PvuII消化的pCL1920质粒中来构建p5TrcMEP质粒。为了构建p20T5MEP质粒，首先用引物dxsidiispDFNcoI(s)和dxsidiispDFXhoI(a)将dxs-idi-idpDF操纵子克隆到带有T5启动子的pQE质粒中(pQE-MEP)。用引物T5AgeI(s)和T5NheI(a)从pQEMEP质粒扩增带有T5启动子的操纵子DNA片段。该DNA片段用AgeI/NheI消化并克隆到经SGrAI/NheI酶消化的p20T7MEP质粒中。

紫杉二烯途径的构建(GT和TG操纵子)

通过用引物GGPPSNcoI(s)、GGPPSEcoRI(a)、TSEcoRI(s)、TSsalI(a)、TSNcoI(s)、TSEcoRI(a)、GGPPSEcoRI(s)和GGPPSSalI(a)将GGPS和TS的PCR片段克隆入pTrcHIS2B质粒的NocI-EcoRI和EcoRI-SalI位点来产生p20TrcGT和p20TrcTG，以构建下游紫杉二烯途径(GT和TG操纵子)。为构建p20T5GT，操纵子首先用引物GGPPSNcoI(s)和TSXhoI(a)扩增，并克隆入用NcoI/XhoI消化的带有T5启动子的pQE质粒中。然后将序列用XbaI和XhoI消化并克隆到用引物pTrcSal(s)和pTrcXba(a)扩增的pTrc质粒骨架中。通过将来自p20TrcTG的经NcoI/SalI消化的TG操纵子亚克隆到经NcoI/SalI消化的pACYC-DUET1质粒来构建p10T7TG。通过将BspEI/XbaI消化的片段克隆至用引物pCLBspEI(s)和pCLXbaI(a)从pCL1920质粒扩增的经XbaI/BspEI消化的DNA来构建p5T7TG。

MEP途径质粒的染色体整合的构建

为构建用于扩增整合序列的带有FRP-Km-FRP盒的质粒，p20T7MEP和p20T5MEP用XhoI/ScaI消化。用引物KmFRPXhoI(s)和KmFRPScaI(a)，从带有来自pkD13质粒的FRP序列的Km盒扩增FRP-Km-FRP盒。扩增的DNA用XhoI/ScaI消化并克隆入XhoI/ScaI消化的p20T7MEP和p20T5MEP质粒(p20T7MEPKmFRP和p20T5MEPKmFRP)。同样，p20TrcMEP质粒用SacI/ScaI消化，而用引物KmFRPSacI(s)和KmFRPScaI(a)扩增的DNA被消化，并克隆到p20TrcMEP质粒中(p20TrcMEPKm-FRP)。

MEP途径盒(LacIq-MEP-FRP-Km-FRP)盒的染色体整合

将在启动子T7、T5和Trc下构建的MEP途径定位于染色体中的带有Kan标记的ara操纵子区域。用引物IntT7T5(s)、IntTrc(s)和Int(a)，从p20T7MEPKmFRP、p20T5MEPKmFRP和p20TrcMEPKm-FRP扩增PCR片段，然后电穿孔入E.coli MG1655recA-end-和E.coli MG1655recA-end-EDE3细胞中，以通过λRed整合技术来进行染色体整合。⁵⁴确认了位点特异性定位，在基因成功整合后通过FLP重组酶的作用去除Km标记。

紫杉二烯5α-醇途径的构建

用PredictProtein软件(www.predictprotein.org)确定紫杉二烯5α-醇羟化酶(T5αOH)和紫杉细胞色素P450还原酶(TCPR)的跨膜区(TM)⁵⁵。为进行跨膜工程，对紫杉二烯5α-醇羟化酶(T5αOH)N端跨膜区的8、24和42个氨基酸残基和TCPR中74个氨基酸的区域进行选择性截短。紫杉二烯5α-醇羟化酶(T5αOH)N端8、24和42个氨基酸残基的去除、替换了一个氨基酸的牛17a羟化酶N端8个肽残基MALLLAVF(SEQ IDNO：51)与N端截短的T5αOH序列⁴⁴以及GSTGS肽接头的整合是用引物CYP17At8AANdeI(s)、CYP17At24AANdeI(s)、CYP 17At42AANdeI(s)和CYPLinkBamHI(a)完成的。用这些引物扩增每个修饰的DNA，NdeI/BamHI消化并克隆入NdeI/BamHI消化的pACYC DUET1质粒，以构建p10At8T5αOH、p10At24T5αOH和p10At42T5αOH质粒。用引物CPRBamHI(s)和CPRSalI(a)扩增74个氨基酸截短的TCPR(tTCPR)序列。扩增的tTCPR序列和质粒p10At8T5αOH、p10At24T5αOH和p10At42T5αOH用BamHI/SalI消化并克隆以构建质粒p10At8T5αOH-tTCPR、p10At24T5αOH-tTCPR和p10At42T5αOH-tTCPR。

用于筛选紫杉二烯和紫杉二烯-5α-醇分析的培养物培养

将之前改造的携带具有上游(MEP)、下游紫杉二烯途径和紫杉二烯5α-醇之合适质粒的大肠杆菌菌株的单个转化体在Luria-Bertani(LB)培养基中(补充适当的抗生素，100mg/mL羧苄青霉素、34mg/mL氯霉素、25mg/L卡那霉素或50mg/mL大观霉素)以30℃培养18h。对于用于筛选工程化菌株的小规模培养，用这些预接种物接种新鲜的2mL丰富培养基(5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，15g/L葡萄糖，10g/L NaCl，100mM HEPs，3mL/L消泡剂B，pH 7.6，100ug/mL羧苄青霉素和34ug/mL氯霉素)，其起始的A₆₀₀为0.1。将培养物以适当的抗生素和用于基因诱导的100mM IPTG在22℃下维持5天。

紫杉二烯5α-醇生产菌株的生物反应器实验。

按照制造商的指示组装3-L Bioflo生物反应器(New Brunswick)。在一升含有1％甘油(V/V)的丰富培养基中接种以相同浓度培养在LB培养基(含有抗生素(100mg/mL羧苄青霉素，34mg/mL氯霉素))中的菌株26At24T5αOH-tTCPR的8h培养物(A₆₀₀～2.2)50mL。带有液-液双相发酵的1L生物反应器使用20％V/V十二烷。用0.5v/v/m的过滤空气提供氧气，并调整搅拌以保持溶氧水平高于50％。用10％NaOH将培养物的pH控制在7.0。发酵罐中培养物的温度控制在30℃，直到细胞生长到用波长600nm(OD₆₀₀)测量的吸光度为约0.8。发酵罐的温度降低到22℃，用0.1mM IPTG诱导细胞。无菌地加入十二烷至培养基体积的20％(V/V)。在发酵过程中甘油和醋酸积累的浓度用恒定的时间间隔来监测。在发酵过程中当甘油浓度低于0.5g/L时，向生物反应器中引入甘油(3g/L)。

用带有确定补料培养基的补料分批培养来进一步优化发酵，所述补料培养基含有0.5％酵母提取物和20％(V/V)十二烷(13.3g/L KH₂PO₄，4g/L(NH₄)₂HPO₄，1.7g/L柠檬酸，0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/LNa₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L柠檬酸铁(III)，0.0045g/L硫胺素，1.3g/L MgSO₄，10g/L甘油，5g/L酵母提取物，pH 7.0)。相同的培养基组合物用于菌株17和26的发酵，其含有适当的抗生素(菌株17：100ug/mL羧苄青霉素和50ug/mL大观霉素；菌株26：50ug/mL大观霉素)。

对于紫杉二烯-5α-醇生产菌株，菌株26-At24T5αOH-tTCPR在含有50ug/mL大观霉素和34ug/mL氯霉素的LB培养基中培养，将50mL 8h培养物(OD～2.2)接种至一升含有1％甘油(V/V)的复合培养基中。用0.5(vvm)的过滤空气提供氧气，并调整搅拌以保持溶氧水平高于30％。用10％NaOH将培养物的pH控制在7.0。发酵罐中培养物的温度控制在30℃，直到细胞生长到用波长600nm(OD₆₀₀)测量的吸光度为约0.8。发酵罐的温度降低到22℃，用0.1mM IPTG对途径进行诱导。无菌地加入十二烷至培养基体积的20％(V/V)。在发酵过程中，甘油和醋酸积累的浓度用恒定的时间间隔来监测。在发酵过程中当甘油浓度低于0.5-1g/L时，向生物反应器中引入3g/L的甘油。

紫杉二烯和紫杉二烯-5α-醇的GC-MS分析

为分析小规模培养物中的紫杉二烯积累，将1.5mL的培养物用1mL己烷振荡30min。将混合物离心以分离有机层。对生物反应器，用正己烷将1uL的十二烷层稀释至200uL。用GC-MS(Varian saturn 3800GC连接至Varian 2000MS)分析1uL的己烷层。将样品注入到HP5ms柱中(30m×250uM×0.25uM厚度)(Agilent Technologies USA)。流速为1.0ml/min的氦气(超纯)用作载气。炉温首先在50℃保持恒定1min，然后以10℃/min递增上升到220℃，最后在此温度下保持10min。注入器和传输线温度分别设置在200℃和250℃。

对于紫杉二烯和紫杉二烯5α-醇，生物或合成来源的标准化合物尚未投放市场。因此，我们在2L生物反应器中对产生紫杉二烯的大肠杆菌进行发酵以提取纯的物质。用己烷通过溶剂萃取来提取紫杉二烯，随后经多轮硅胶柱层析来获得纯的物质，用于构建GC-MS分析的标准曲线。我们已将纯紫杉二烯的GC和MS谱与文献报道进行了比较，以确认该化合物的真实性⁶⁰。为检测纯度，我们进行了紫杉二烯的1HNMR。由于紫杉二烯-5α-醇积累的水平非常低，我们用紫杉二烯作为定量该分子生产的手段，以及来自以前报告的真实质谱断裂特征。⁴²

用于工程化菌株的转录分析的qPCR测量

通过对从适当菌株分离出的mRNA进行qPCR来检测每个基因的转录基因表达水平。为防止降解，在细胞裂解前用RNAprotect细菌试剂(Qiagen)来稳定RNA。随后，用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)与基于核酸酶的基因组DNA污染物去除相结合来提取总RNA。用iScriptcDNA合成试剂盒(Biorad)来扩增cDNA。用iQ SYBR Green Supermix(Biorad)在Bio-Rad iCycler上进行qPCR。将表达恒定的rrsA基因的表达水平用于对qPCR值进行归一化⁵⁶。表3有用于qPCR的引物。对于每对引物，用大肠杆菌的mRNA为模板构建标准曲线。

实施例1：紫杉二烯积累显示出对上游MEP和下游合成紫杉二烯途径的相对强度有强非线性依赖性。

图1b描绘了将启动子和基因拷贝数相结合以通过紫杉二烯合成的上游和下游途径来调节相对通量(或强度)的多种方法。为解决MEP途径的瓶颈，以及将其与下游紫杉二烯途径达到最佳平衡，共构建了16种菌株。图2a，b总结了这些菌株中每一种的紫杉二烯积累结果，其中图2a强调了在下游途径是恒定值时紫杉二烯积累对上游途径的依赖性，而图2b是上游途径的强度恒定时对下游途径的依赖性(从报道的启动子强度和质粒拷贝数来计算上游和下游途径的表达^33-36，也见表1)。显然，有关上游和下游途径二者的表达均有最大值。对恒定的下游途径表达(图2a)，随着上游途径的表达从非常低水平增加，紫杉二烯产量首先由于整个途径的前体供应增加而增加。然而，经过一个中间值后，下游途径的能力无法满足上游途径的进一步增加。该途径的不平衡导致中间体(如下)的积累，其可抑制细胞或简单地将通量转移至竞争途径，最终导致紫杉二烯积累的减少。

对恒定的上游途径表达(图2b)，同样观察到有关下游途径表达水平的最大值。这是由于下游途径的低水平表达对紫杉二烯生产的初始限制，因此是紫杉二烯生产的限速途径。在下游途径高水平表达时，我们同样看到高拷贝数对细胞生理上的负面影响，因此下游途径表达存在最大值。这些结果表明，紫杉二烯积累的显著变化可从上游和下游途径表达水平在狭窄窗口内改变而获得。例如，在其染色体上含有Trc启动子控制下上游途径之额外拷贝的菌株(菌株8，图2a)比仅过表达合成的下游途径的菌株(菌株1，图2a)产生了多2000倍的紫杉二烯。此外，将下游合成操纵子中的基因顺序从GT(GPPS-TS)变为TG(TS-GPPS)引起2-3倍的增加(菌株1-4与5、8、11和14相比)。观察到的结果显示，紫杉二烯过量生产的关键是充足的下游途径能力以及上游前体途径与下游合成的紫杉二烯途径之间的小心平衡。总之，这些工程化菌株证明，如果同时搜索内源性上游和合成下游途径的广泛表达水平，则MEP途径通量可以是显著的。

实施例2：上游和下游途径的染色体整合和微调，以进一步增强紫杉二烯生产。

为提供充足的下游途径强度，同时尽可能减少质粒带来的代谢负担37，设计了新的两组菌株，每组4个菌株(菌株25-28和29-32)，其中下游途径置于强启动子(T7)的控制下，而分别保持相对低的5和10个拷贝数。可以看出(图2c)，在高下游强度时保持紫杉二烯的最大值(菌株21-24)，而在低下游途径强度时获得单调响应(菌株17-20，图2c)。这一观察促使我们构建了额外的两组菌株，每组4个菌株，其保持了与之前相同的下游途径强度水平，但表达非常低水平的上游途径(菌株25-28和29-32株，图2d)。此外，后一组菌株上游途径的操纵子是染色体整合的。可以看出，不仅恢复了紫杉二烯最大值(尽管上游途径水平非常低)，而且得到了更大的紫杉二烯最大值(300mg/L)。我们认为，这种显著增加可归因于减少了细胞的代谢负担。这是通过以下来实现的：1)通过将途径整合到染色体中而消除质粒依赖性和2)在上游和下游途径表达之间达到良好平衡。

32种重组构建体使我们能充分研究模块化途径的表达空间并将紫杉二烯产量提高了约15000倍。这是迄今为止报告的来自大肠杆菌MEP异戊二烯途径的遥遥领先的最高萜类化合物生产(图3a)。此外，观察到的萜类化合物生产的改善倍数显著高于那些已报道的组合代谢工程方法，该方法搜索了包含多达十亿种异戊二烯途径组合变体的广泛基因空间。³⁰这表明，比起多来源的组合基因优化，途径优化更依赖于途径模块的精细平衡。图1的表型谱中显示的多个最大值强调了用足够分辨率来检测表达空间以确定最佳整体途径性能区域的重要性。图7描绘了来自模块化途径表达搜索的紫杉二烯生产的改善倍数。

实施例3：代谢物与紫杉二烯产量呈负相关以及代谢物的鉴定。

对先前工程化菌株的代谢组分析鉴定出了与途径表达水平和紫杉二烯生产强烈相关的代谢副产物(图3和图8)。虽然该代谢物的化学身份是未知的，但我们推测它是异戊二烯副产物，引起途径分流并已作为直接变量与工程菌的紫杉二烯生产负相关(图3和图8)。我们最佳菌株的关键属性是减少该代谢物积累引起更高紫杉二烯生产的精细平衡。该平衡可通过从染色体或不同的质粒拷贝数、使用不同的启动子的不同水平来调节，获得显著不同的紫杉二烯积累。

随后，通过GC-MS、¹H和¹³C核磁共振(NMR)谱研究，在气相色谱-质谱(GC-MS)谱图中相应峰被确定为吲哚(图16)。我们发现当吲哚水平高于～100mg/L时，菌株26的紫杉二烯合成受到外源性吲哚的严重抑制(图15b)。进一步提高吲哚浓度还抑制细胞生长，其抑制水平是高度菌株依赖性的(图15c)。虽然吲哚与异戊二烯途径相互作用的生化机理目前尚不清楚，但在图15中的结果提示，吲哚和异戊二烯途径的萜类化合物之间可能对细胞生长有协同作用。菌株26看来有缓解吲哚的作用，但并不清楚具体机制，这要我们接下来进一步研究。

实施例4：工程化菌株的培养。

为了研究工程化菌株在受控条件下的紫杉二烯生产潜力，在1L生物反应器中对三个最高紫杉二烯积累菌株(菌株22，～60mg/L；菌株17，～125mg/L；菌株26，～300mg/L)进行补料分批培养(图17)。在用20％(V/V)十二烷覆盖层进行液-液两相发酵的情况下进行补料分批培养的研究。引入有机溶剂以防止分泌的紫杉二烯像初步研究中那样从发酵培养基中吹脱(air stripping)出来。在甘油供给受控的确定培养基中，菌株22、17和26的紫杉二烯生产力分别提高到174±5mg/L(SD)、210±7mg/L(SD)、1020±80mg/L(SD)(图17a)。此外，紫杉二烯的生产明显影响了生长表型、乙酸积累和甘油消耗(图17b-17d)。

图17c显示，乙酸最初在所有菌株中积累，而～60小时后乙酸在菌株17和26中减少，而在菌种22中继续增加。这种现象凸现出高MEP通量菌株(26和17)和低MEP通量菌株(22)之间中央碳代谢的差异。此外，该观察结果再次证明了作为精细平衡的功能性菌株之特征的良好生理机能。由于用于发酵的高起始甘油浓度和相应的高甘油途径流量，最初所有菌株均产生作为溢出代谢产物的乙酸。该流量也足以供应MEP途径，以及细胞内的其他代谢途径。

在～48小时，初始甘油耗尽，培养切换至补料分批培养模式，在此期间，维持低但恒定的甘油水平。这导致低的总甘油通量，这对于有高MEP通量(菌株26和17)的菌株而言，其大部分被分流至MEP途径而最大限度地减少溢出代谢。因此乙酸生产减少或甚至完全消除。对于乙酸浓度的下降，可能是在一定程度上发生了乙酸的同化作用，虽然这没有从流量分析角度进一步研究。一定程度的蒸发和由于甘油补料所致的稀释进一步促进了观察到的乙酸浓度下降。相比之下，对低MEP通量的菌株(菌株22)而言，流量分流至MEP途径并不明显，因此甘油通量仍供应了所有必要的碳源和能量需求。溢出代谢继续发生，引起乙酸分泌。

显然，菌株26的高生产力和更强的生长使得紫杉二烯的积累非常高。通过优化生物反应器中的条件、平衡培养基中的营养以及优化碳源运送来进一步改善应该是可能的。

实施例5：上游和下游途径表达水平和细胞生长揭示了潜在的复杂性。

为更详细地了解改造后的途径表达平衡，我们将从图2c和d的最高紫杉二烯生产菌株和邻近菌株(菌株17、22和25-32)的dxs(上游途径)和TS(下游途径)的转录基因表达水平进行定量(图4a，b)。像我们推测的一样，上游途径的表达从天然启动子Trc、T5、T7和10拷贝和20拷贝质粒随着启动子强度和MEP载体的拷贝数单调递增，如DXS表达中所见(图4a)。因此我们发现，dxs表达水平与上游途径强度的相关性很好。对上游途径的其他基因idi、ispD和ispF也发现类似的相关性(图14a，b)。在下游基因表达中，将途径从5拷贝质粒转移到10拷贝质粒(25-28系列和29-32系列)后，定量了～2倍的改善(图4b)。

尽管启动子和拷贝数效应影响基因表达，但对其他途径表达的次级效应也很突出。图4a显示，对于相同的dxs表达盒，通过将TS质粒的拷贝数从5增加至10，dxs的表达增加。有趣的是，与10拷贝TS质粒相比，5拷贝TS质粒(菌株25-28系列)含有显著更高的紫杉二烯生产(图2d)和更少的生长(图4c，d)。不包含紫杉二烯异源性途径的对照质粒为2倍的生长密度，提示菌株25-28系列中的生长抑制直接与紫杉二烯代谢途径和紫杉二烯及其直接中间体的累积相关(图4c)。然而，紫杉二烯表达菌株与空白对照质粒相比，菌株29-32系列仅表现出生长量的中等增加(图4d)。在质粒为基础的上游表达载体(菌株17和22)中也可以看到生长、紫杉二烯生产和表达水平之间的这种互作。与20拷贝的更低紫杉二烯生产菌株(菌株22)相比，10拷贝的高紫杉二烯生产菌株(菌株17)的生长抑制要高得多。因此，产物毒性和碳转移到异源性途径很可能阻碍生长而不是质粒维持。

也出人意料的是，上游表达载体对下游表达产生明显的影响。如果途径之间没有串扰，图4b将有两条直线。然而，对不同的MEP表达载体，TS表达观察到了～3倍的变化。这很可能是由于四个上游和两个下游基因的过表达对从宿主代谢中得到的资源(原材料和能量)的明显竞争。³⁸与对照菌株25c相比，菌株25观察到了4倍的生长抑制，提示与天然途径的过表达相比，合成的紫杉二烯途径的高过表达诱导毒性，改变了生长表型(图4c)。然而，在我们的情况下，随着上游表达增加，下游表达无意中减少至理想水平，以平衡上游和下游途径，最大限度地减少了生长抑制(菌株26)。

在蛋白过表达的极端情况下，由于四个蛋白质的高水平合成(菌株28和32)，T7启动子驱动的MEP途径导致严重的生长抑制。由T7启动的TS基因表达没有出现对自身的重大影响。T7诱导表达蛋白质的高速率合成(图4ab)可导致蛋白质合成机制的下调，包括来自早期生长相的看家基因组分，损害细胞生长并降低生物质的增加^39，40。我们推测，我们观察到的复杂生长表型是以下方面的累积效应：(1)异戊二烯/紫杉二烯代谢活化所诱导的毒性，和(2)高重组蛋白质表达的影响。总之，我们的多变量模块化途径工程方法在萜类化合物代谢以及它与途径表达和细胞生理的相关性方面产生了意想不到的多样性。对用于次级代谢产物生产的微生物的理性设计将需要对途径表达有超出启动子强度和拷贝数之线性/非依赖性了解的理解。然而，本文所用的简单的多变量的方法可引入必要的多样性以(1)寻找高产菌株，和(2)提供对代谢途径工程中占主导地位但尚不了解的更高阶效应进行系统性研究的前景。

实施例6：在大肠杆菌中改造基于紫杉醇P450的氧化化学。

紫杉醇生物合成中的核心特征是在紫杉烷核心结构多个位点的氧化作用，反应被认为是由细胞色素P450依赖性的单加氧酶介导的。⁴¹途径中专门的环化步骤完成后，母体烯烃(紫杉烷-4(5)，11(12)-二烯)接着由细胞色素P450酶在C5位氧化，代表到紫杉醇路线的8个(紫杉烷核心的)氧化步骤中的第一步(图6)。⁴²因此，对紫杉醇生产工程微生物的关键步骤是在体内发生基于P450的氧化。第一个氧化步骤是由细胞色素P450(紫杉二烯5α-羟化酶)催化的，它是一种不常见的单加氧酶，催化二萜前体紫杉二烯中的羟化反应和双键迁移(图5a)。我们报道了首次成功地将合成途径从紫杉二烯延伸至紫杉二烯-5α-醇，并展示了首次在大肠杆菌体内生产任何功能性紫杉醇中间体的实例。

在一般情况下，由于细菌平台固有的局限性(例如缺少电子传递机制、细胞色素P450还原酶和由于缺乏内质网而导致的P450酶膜信号模块的翻译不兼容性)，植物细胞色素P450的功能性表达具有挑战性。⁴³最近，通过跨膜(TM)工程以及P450和CPR还原酶的嵌合酶的产生，一些植物P450已在大肠杆菌中表达，用于功能性模块的生物合成。^22，44然而，每一种植物细胞色素p450的跨膜信号序列和从其还原酶对应物的电子转移特性都是独特的。⁴⁵我们的初步研究主要着眼于通过N-端跨膜工程和通过与来自紫杉物种的CPR氧化还原伴侣(紫杉细胞色素P450还原酶(TCPR))翻译融合以产生嵌合酶来对密码子优化的合成紫杉二烯5α-羟化酶进行表达优化(图5b)^42，44，46。产生的嵌合酶之一是At24T5αOH-tTCPR，在第一个氧化步骤中有很高效率，有超过98％的紫杉二烯转换为紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷(OCT)(图9a)。

与其他P450嵌合体相比，At24T5αOH-tTCPR获得了2倍的紫杉二烯-5α-醇生产(21mg/L)。此外，At8T5αOH-tTCPR和At24T5αOH-tTCPR的更弱活性导致了最近表征的副产物(紫杉二烯发生复杂的结构重排成环醚5(12)-氧-3(11)环紫杉烷(OCT))的积累(图9)⁴⁷。副产物累积的量与所需的产物紫杉二烯-5α-醇大致相等。OCT的形成是之前没有的紫杉细胞色素P450反应序列(包括氧化和后续环化)介导的⁴⁷。因此，很可能通过紫杉二烯5α-羟化酶的蛋白质工程，在环化前终止反应将防止这些不良副产物的积累，并可实现将通量引导至紫杉二烯-5α-醇。

相对于亲本菌株26的紫杉二烯生产(～300mg/L)，菌株26-At24T5αOH-tTCPR的生产力显著降低，先前描述的未表征代谢物的积累随之增加。未观察到紫杉二烯的积累。显然，引入带有At24T5αOH-tTCPR构建体的额外中等拷贝质粒(10拷贝，p10T7)破坏了菌株26中上游和下游途径精心设计的平衡。在生物反应器中进行小规模发酵以定量菌株26-At24T5αOH-tTCPR产生的醇。紫杉二烯-5α-醇的时间过程谱(图5d)表明醇生产高达58±3mg/L，带有等量的OCT副产物产生。观察到的醇生产比之前酿酒酵母中的生产高～2400倍¹⁷。紫杉二烯-5α-醇生产的进一步提高很可能是通过途径优化和蛋白质工程实现的。

途径优化的多变量模块化方法已取得了关键紫杉醇前体的极高产菌株。此外，重组构建体在转移通量至其他复杂药物化合物的合成上同样有效，例如由相同途径工程产生的单萜、倍半萜和二萜(香叶醇，芳樟醇，紫穗槐二烯和左旋海松二烯)(结果未公开)。因此，我们的途径工程开辟了生物合成天然产物的新途径，尤其是微生物来源的萜类化合物，用作化学品或来自可再生资源的燃料。通过着眼于通用的萜类化合物前体IPP和DMAPP，可以首先确定关键途径模块，然后调节表达以使途径模块的达到最佳平衡，使前体无缝转换并且中间体积累尽可能少。这种做法看来比大遗传空间的组合检索更有效，也并不依赖于高通量筛选。

MEP途径在能量上是平衡的，从而整体上将葡萄糖或甘油转换至异戊二烯更有效。然而，在过去的10年里，在大肠杆菌中改造MEP途径以提高用于类胡萝卜素^28，47、倍半萜²³和二萜⁶¹过表达的关键前体IPP和DMAPP之供应的许多尝试取得的成功十分有限。这种低效率归因于与大肠杆菌中MEP途径表达特异性相关的调节作用是未知的。²³在这里，我们提供的证据表明，这种限制与由于途径表达不是最佳而导致的代谢物吲哚的积累有关，这抑制了异戊二烯途径的活性。紫杉二烯过量生产(在吲哚形成抑制的条件下)确定了MEP途径是对异戊二烯家族的药物和化学产品的生物合成的非常有效的路线。人们只需要像我们的多变量模块化途径工程方法提出的那样仔细地平衡模块化途径。

对于成功的紫杉醇微生物生产，紫杉二烯核心的以P450为基础的氧化化学修饰作用是必要的⁴¹。在紫杉醇生物合成途径的19个不同酶促步骤中，细胞色素P450单加氧酶贡献了大约一半的步骤。特征性的是，这些基因彼此之间显示了不寻常的高序列相似性(＞70％)，但与其他植物P450之间显示了低相似性(＜30％)¹⁴。由于紫杉醇单加氧酶之间的明显的相似性，因此表达合适的活性以用于特异性的P450氧化化学特别有挑战。通过TM工程和用氧化还原伴侣(TCPR)构建人工嵌合酶，紫杉醇细胞色素P450(紫杉二烯5α-羟化酶)在大肠杆菌中功能性表达，并显示在体内有效地将紫杉二烯转换成相应的醇产物。先前的体外研究已描述了由天然紫杉二烯5α-羟化酶将紫杉二烯转换为紫杉二烯-5α-醇的机制，但并未在体内讨论过同样的转换⁴²。该氧化和重排反应涉及氢从紫杉二烯的C20位抽离以形成烯丙基自由基中间体，接着在C5位发生部位和立体特异性的氧插入以形成醇衍生物(图5a)。在紫杉细胞中观察到的中等丰度的酶以及低kcat值提示，相对于紫杉醇途径中下游氧化和酰化作用，紫杉醇生物合成的5α-羟基化步骤速度是慢的⁴¹。因此，对该步骤的改造对紫杉醇合成是关键的，尤其是紫杉醇P450在原核宿主如大肠杆菌中进行功能性改造的情况下。此外，该步骤在酵母中构建途径的前期努力是限制性步骤。¹⁷本研究中的工程构建体显示了紫杉二烯在体内＞98％的转化率，产物积累达～60mg/L，比先前在酵母中的异源表达改善了2400倍。因此本研究不仅成功合成明显更高量的关键紫杉醇中间体，而且也提供了通过类似的P450化学对途径中后续代谢物进行合成的基础。

此前对紫杉醇构效关系的研究已表明，通过去除或添加一些功能性基团进行的改变不会实质性改变紫杉醇的活性^1，48。然而，由于通过化学合成引入改变的能力有限，因此该研究是受限制的。紫杉醇合成的微生物路径的可用性将大幅扩大了可被检测的化学修饰的空间，从而增加了鉴定更有效的候选药物的可能性。这为药物开发提供了激动人心的新机遇，尤其是考虑到这些候选药物也将与高效的生产路线相关。

在过去的几十年中，与任何其他天然产物候选药物相比，紫杉醇已在科学界和广大市民中催生了更多的兴趣¹⁰。由于将紫杉醇或紫杉醇类似物用作癌症化学治疗的大幅增长，预计会出现重大的供应危机，这需要新的生产途径，如在微生物中改造生物合成机制8。虽然紫杉物种一些能生产天然紫杉醇的内生真菌已被分离，但这些微生物系统尚未证实适合可持续性地生产该药物⁴⁹。本文报道的结果揭示了对来自微生物的紫杉醇或紫杉醇前体的革命性步骤，这通过消除专门前体途径中的瓶颈来实现。此外，合成途径的装配提供了通过途径的选择性改造来改变紫杉二烯结构而提供了改造紫杉醇类似物的的新可能性。这些发展为紫杉醇或合适的紫杉醇前体生产提供了成本效益乐观的微生物路线。

表1.上游和下游途径的表达排序，以任意单位(a.u.)计。MEP途径和GGPP合酶/紫杉二烯合酶途径的表达水平用启动子强度和拷贝数的公布值来估计。启动子强度计算是Trc＝1，T5＝1.96，T7＝4.97，以Brosius等和Brunner等为基础^33，34。基因拷贝数通过所用不同质粒的公布复制起点的拷贝数来分配，整合的情况为1个拷贝^35-37。共表达由启动子强度和基因拷贝数的乘积计算。MEP途径的天然表达任意指定一个值，并改变GGPP合酶和紫杉二烯的操纵子顺序来实现紫杉二烯合酶表达的20％³⁵。这些对共表达的估计用于指导改造尝试。E：大肠杆菌K12MG1655，带有两个缺失ΔrecAΔendA；EDE3：K12MG1655ΔrecAΔendA，带有整合的T7RNA聚合酶(DE3)；MEP：dxs-idi-ispDF操纵子；GT：GPPS-TS操纵子；TG：TS-GPPS操纵子；Ch1：染色体中一个拷贝；Trc：trc启动子；T5：T5启动子；T7：T7启动子；p5：～5拷贝的质粒(pSC101)；p10：10拷贝的质粒(p15A)；P20：～20拷贝的质粒(pBR322)。

表2.本研究构建的所有质粒详情

表3.用于质粒克隆、MEP途径的染色体运送和qPCR测量的引物详情。

表4.蛋白质和密码子优化的核苷酸序列。

GGPP合酶

MFDFNEYMKSKAVAVDAALDKAIPLEYPEKIHESMRYSLLAGGKRVRPALCIAACE

LVGGSQDLAMPTACAMEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDFRRGKPTNHKVFGEDTAVL

AGDALLSFAFEHIAVATSKTVPSDRTLRVISELGKTIGSQGLVGGQVVDITSEGDANV

DLKTLEWIHIHKTAVLLECSVVSGGILGGATEDEIARIRRYARCVGLLFQVVDDILDV

TKSSEELGKTAGKDLLTDKATYPKLMGLEKAKEFAAELATRAKEELSSFDQIKAAPL

LGLADYIAFRQN(SEQ ID NO：42)

ATGTTTGATTTCAATGAATATATGAAAAGTAAGGCTGTTGCGGTAGACGCGGCTC

TGGATAAAGCGATTCCGCTGGAATATCCCGAGAAGATTCACGAATCGATGCGCT

ACTCCCTGTTAGCAGGAGGGAAACGCGTTCGTCCGGCATTATGCATCGCGGCCTG

TGAACTCGTCGGCGGTTCACAGGACTTAGCAATGCCAACTGCTTGCGCAATGGA

AATGATTCACACAATGAGCCTGATTCATGATGATTTGCCTTGCATGGACAACGAT

GACTTTCGGCGCGGTAAACCTACTAATCATAAGGTTTTTGGCGAAGATACTGCAG

TGCTGGCGGGCGATGCGCTGCTGTCGTTTGCCTTCGAACATATCGCCGTCGCGAC

CTCGAAAACCGTCCCGTCGGACCGTACGCTTCGCGTGATTTCCGAGCTGGGAAAG

ACCATCGGCTCTCAAGGACTCGTGGGTGGTCAGGTAGTTGATATCACGTCTGAGG

GTGACGCGAACGTGGACCTGAAAACCCTGGAGTGGATCCATATTCACAAAACGG

CCGTGCTGCTGGAATGTAGCGTGGTGTCAGGGGGGATCTTGGGGGGCGCCACGG

AGGATGAAATCGCGCGTATTCGTCGTTATGCCCGCTGTGTTGGACTGTTATTTCA

GGTGGTGGATGACATCCTGGATGTCACAAAATCCAGCGAAGAGCTTGGCAAGAC

CGCGGGCAAAGACCTTCTGACGGATAAGGCTACATACCCGAAATTGATGGGCTT

GGAGAAAGCCAAGGAGTTCGCAGCTGAACTTGCCACGCGGGCGAAGGAAGAAC

TCTCTTCTTTCGATCAAATCAAAGCCGCGCCACTGCTGGGCCTCGCCGATTACAT

TGCGTTTCGTCAGAAC(SEQ ID NO：43)

紫杉二烯合酶

MSSSTGTSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTYQERADE

LVVKIKDMFNALGDGDISPSAYDTAWVARLATISSDGSEKPRFPQALNWVFNNQLQ

DGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVIALSVWKTGHSQVQQGAEFIAENLRLLNEEDELSP

DFQIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLSTTREARLTDVSAAADNIPANMLNALEGL

EEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCFTFLNNLLDKFGGCVPCM

YSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIKGALDYVYRHWSERGIGWGRDSLVPDLNTT

ALGLRTLRMHGYNVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLFRASDLAFPD

ERAMDDARKFAEPYLREALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRLEARSYIDSYD

DNYVWQRKTLYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADI

NFTRHRVAEVYFSSATFEPEYSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGV

KRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEEVNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNC

YVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILLMGELVKDDVVEKVHYPSN

MFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAIKHICRVVDR

ALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYIDPI

QV(SEQ ID NO：44)

ATGTCTAGCTCTACGGGTACGTCTAAAGTCGTGAGTGAAACCTCATCGACGATCG

TGGACGATATTCCACGCTTGTCGGCGAACTATCATGGAGATCTGTGGCATCATAA

CGTCATTCAGACATTGGAAACCCCGTTTCGCGAAAGTAGCACCTACCAGGAACG

GGCAGATGAATTAGTCGTGAAAATCAAAGATATGTTTAATGCATTAGGAGATGG

AGACATCTCGCCCAGCGCATATGATACGGCGTGGGTGGCTCGGTTGGCCACGATT

AGCTCCGATGGCAGTGAAAAGCCGCGTTTCCCGCAGGCGCTGAACTGGGTGTTT

AATAATCAATTGCAGGATGGCAGCTGGGGCATTGAATCTCACTTTAGCCTCTGTG

ACCGGTTACTCAACACGACAAACTCCGTAATTGCGTTGTCAGTTTGGAAAACGGG

CCATAGCCAGGTTCAACAGGGCGCGGAATTTATCGCTGAAAATCTGCGCCTGCTG

AACGAGGAGGACGAACTGTCACCCGATTTTCAGATTATTTTTCCGGCTTTACTCC

AGAAAGCCAAAGCCTTAGGCATCAACCTGCCATATGATCTGCCGTTCATCAAGTA

TCTGTCTACTACCCGCGAAGCCCGTCTCACTGACGTCTCTGCGGCGGCGGACAAT

ATTCCAGCGAACATGCTGAACGCACTGGAAGGGCTGGAAGAGGTTATCGACTGG

AATAAAATCATGCGCTTCCAAAGCAAGGACGGTAGCTTCTTAAGCAGCCCAGCA

TCTACTGCTTGTGTTCTGATGAATACCGGAGACGAAAAGTGCTTTACGTTTCTGA

ACAATCTGCTGGACAAATTTGGGGGTTGTGTTCCTTGTATGTATTCCATTGATCTG

TTGGAACGTCTGTCGCTGGTCGATAACATTGAACACTTAGGTATCGGCCGCCACT

TCAAACAAGAAATCAAGGGGGCGTTGGATTATGTATACCGTCATTGGAGCGAGC

GTGGTATTGGTTGGGGGCGCGATAGCTTGGTACCTGATCTGAACACCACTGCTTT

GGGACTGCGCACTCTTCGTATGCACGGATACAACGTTAGTTCCGATGTCCTCAAT

AATTTCAAGGACGAGAACGGCCGTTTTTTCAGCTCGGCCGGTCAGACGCATGTTG

AACTGCGGTCCGTAGTCAATCTCTTTCGCGCTAGTGATCTGGCCTTCCCCGACGA

GCGCGCTATGGACGATGCACGGAAGTTTGCCGAGCCGTATCTCCGCGAAGCCCT

GGCCACCAAAATTTCAACCAACACCAAGCTTTTCAAAGAAATTGAGTATGTAGT

AGAGTATCCGTGGCATATGTCTATTCCGCGCCTGGAAGCCCGCTCGTATATCGAT

TCTTACGATGACAATTATGTGTGGCAACGCAAAACACTGTACCGTATGCCCAGCC

TGTCAAATAGTAAGTGTCTGGAGCTGGCGAAACTGGATTTCAACATTGTGCAATC

CCTGCACCAAGAAGAGCTGAAATTACTGACTCGCTGGTGGAAGGAATCCGGCAT

GGCAGACATCAATTTTACGCGTCACCGTGTTGCAGAGGTGTACTTCTCCTCGGCG

ACCTTTGAGCCGGAGTATTCGGCCACACGTATTGCATTTACCAAGATTGGCTGCC

TTCAGGTGCTTTTTGACGATATGGCGGATATTTTTGCGACACTTGATGAGCTTAA

ATCATTTACCGAAGGCGTGAAGCGTTGGGATACCTCTCTGTTGCATGAAATCCCC

GAATGTATGCAGACCTGCTTCAAAGTTTGGTTCAAACTGATGGAAGAAGTGAAC

AACGACGTCGTGAAAGTTCAGGGTCGTGATATGTTAGCACACATCCGCAAGCCG

TGGGAACTCTATTTCAATTGCTATGTGCAGGAGCGTGAATGGTTAGAAGCGGGCT

ACATTCCTACCTTCGAAGAGTACTTAAAAACCTATGCCATTTCCGTCGGTTTAGG

CCCGTGCACTCTGCAGCCTATCTTGCTGATGGGTGAGCTGGTAAAGGATGATGTG

GTGGAAAAAGTTCACTACCCGTCGAATATGTTTGAACTGGTAAGTCTGAGTTGGC

GTCTGACAAACGACACCAAAACGTACCAGGCAGAAAAGGCACGTGGGCAACAG

GCAAGCGGTATCGCGTGTTATATGAAGGATAATCCGGGCGCTACTGAGGAAGAT

GCCATTAAGCATATCTGCCGTGTTGTGGATCGCGCTCTTAAAGAAGCGTCATTCG

AATATTTTAAACCTAGTAATGATATTCCGATGGGTTGTAAGTCATTCATTTTCAAT

CTTCGCCTGTGCGTGCAAATTTTTTACAAATTTATTGACGGCTACGGAATCGCCA

ACGAAGAAATCAAAGACTATATTCGTAAAGTTTACATCGATCCAATCCAGGTC

(SEQ ID NO：45)

细胞色素P450紫杉二烯5a-羟化酶(T5αOH)

MDALYKSTVAKFNEVTQLDCSTESFSIALSAIAGILLLLLLFRSKRHSSLKLPPGKLGIP

FIGESFIFLRALRSNSLEQFFDERVKKFGLVFKTSLIGHPTVVLCGPAGNRLILSNEEKL

VQMSWPAQFMKLMGENSVATRRGEDHIVMRSALAGFFGPGALQSYIGKMNTEIQS

HINEKWKGKDEVNVLPLVRELVFNISAILFFNIYDKQEQDRLHKLLETILVGSFALPID

LPGFGFHRALQGRAKLNKIMLSLIKKRKEDLQSGSATATQDLLSVLLTFRDDKGTPL

TNDEILDNFSSLLHASYDTTTSPMALIFKLLSSNPECYQKVVQEQLEILSNKEEGEEIT

WKDLKAMKYTWQVAQETLRMFPPVFGTFRKAITDIQYDGYTIPKGWKLLWTTYST

HPKDLYFNEPEKFMPSRFDQEGKHVAPYTFLPFGGGQRSCVGWEFSKMEILLFVHHF

VKTFSSYTPVDPDEKISGDPLPPLPSKGFSIKLFPRP(SEQ ID NO：46)

ATGGATGCCCTCTATAAGTCTACCGTGGCGAAATTTAACGAAGTAACCCAGCTGG

ATTGCAGCACTGAGTCATTTAGCATCGCTTTGAGTGCAATTGCCGGGATCTTGCT

GTTGCTCCTGCTGTTTCGCTCGAAACGTCATAGTAGCCTGAAATTACCTCCGGGC

AAACTGGGCATTCCGTTTATCGGTGAGTCCTTTATTTTTTTGCGCGCGCTGCGCAG

CAATTCTCTGGAACAGTTCTTTGATGAACGTGTGAAGAAGTTCGGCCTGGTATTT

AAAACGTCCCTTATCGGTCACCCGACGGTTGTCCTGTGCGGGCCCGCAGGTAATC

GCCTCATCCTGAGCAACGAAGAAAAGCTGGTACAGATGTCCTGGCCGGCGCAGT

TTATGAAGCTGATGGGAGAGAACTCAGTTGCGACCCGCCGTGGTGAAGATCACA

TTGTTATGCGCTCCGCGTTGGCAGGCTTTTTCGGCCCGGGAGCTCTGCAATCCTAT

ATCGGCAAGATGAACACGGAAATCCAAAGCCATATTAATGAAAAGTGGAAAGG

GAAGGACGAGGTTAATGTCTTACCCCTGGTGCGGGAACTGGTTTTTAACATCAGC

GCTATTCTGTTCTTTAACATTTACGATAAGCAGGAACAAGACCGTCTGCACAAGT

TGTTAGAAACCATTCTGGTAGGCTCGTTTGCCTTACCAATTGATTTACCGGGTTTC

GGGTTTCACCGCGCTTTACAAGGTCGTGCAAAACTCAATAAAATCATGTTGTCGC

TTATTAAAAAACGTAAAGAGGACTTACAGTCGGGATCGGCCACCGCGACGCAGG

ACCTGTTGTCTGTGCTTCTGACTTTCCGTGATGATAAGGGCACCCCGTTAACCAA

TGACGAAATCCTGGACAACTTTAGCTCACTGCTTCACGCCTCTTACGACACCACG

ACTAGTCCAATGGCTCTGATTTTCAAATTACTGTCAAGTAACCCTGAATGCTATC

AGAAAGTCGTGCAAGAGCAACTCGAGATTCTGAGCAATAAGGAAGAAGGTGAA

GAAATTACCTGGAAAGATCTTAAGGCCATGAAATACACGTGGCAGGTTGCGCAG

GAGACACTTCGCATGTTTCCACCGGTGTTCGGGACCTTCCGCAAAGCGATCACGG

ATATTCAGTATGACGGATACACAATCCCGAAAGGTTGGAAACTGTTGTGGACTA

CCTATAGCACTCATCCTAAGGACCTTTACTTCAACGAACCGGAGAAATTTATGCC

TAGTCGTTTCGATCAGGAAGGCAAACATGTTGCGCCCTATACCTTCCTGCCCTTT

GGAGGCGGTCAGCGGAGTTGTGTGGGTTGGGAGTTCTCTAAGATGGAGATTCTC

CTCTTCGTGCATCATTTCGTGAAAACATTTTCGAGCTATACCCCGGTCGATCCCG

ATGAAAAAATTTCCGGCGATCCACTGCCGCCGTTACCGAGCAAAGGGTTTTCAAT

CAAACTGTTCCCTCGTCCG(SEQ ID NO：47)

紫杉NADPH：细胞色素P450还原酶(TCPR)

MQANSNTVEGASQGKSLLDISRLDHIFALLLNGKGGDLGAMTGSALILTENSQNLMI

LTTALAVLVACVFFFVWRRGGSDTQKPAVRPTPLVKEEDEEEEDDSAKKKVTIFFGT

QTGTAEGFAKALAEEAKARYEKAVFKVVDLDNYAADDEQYEEKLKKEKLAFFMLA

TYGDGEPTDNAARFYKWFLEGKEREPWLSDLTYGVFGLGNRQYEHFNKVAKAVDE

VLIEQGAKRLVPVGLGDDDQCIEDDFTAWREQVWPELDQLLRDEDDEPTSATPYTA

AIPEYRVEIYDSVVSVYEETHALKQNGQAVYDIHHPCRSNVAVRRELHTPLSDRSCIH

LEFDISDTGLIYETGDHVGVHTENSIETVEEAAKLLGYQLDTIFSVHGDKEDGTPLGG

SSLPPPFPGPCTLRTALARYADLLNPPRKAAFLALAAHASDPAEAERLKFLSSPAGKD

EYSQWVTASQRSLLEIMAEFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSSPRFAPSRIHVTC

ALVYGPSPTGRIHKGVCSNWMKNSLPSEETHDCSWAPVFVRQSNFKLPADSTTPIVM

VGPGTGFAPFRGFLQERAKLQEAGEKLGPAVLFFGCRNRQMDYIYEDELKGYVEKG

ILTNLIVAFSREGATKEYVQHKMLEKASDTWSLIAQGGYLYVCGDAKGMARDVHR

TLHTIVQEQESVDSSKAEFLVKKLQMDGRYLRDIW(SEQ ID NO：48)

ATGCAGGCGAATTCTAATACGGTTGAAGGCGCGAGCCAAGGCAAGTCTCTTCTG

GACATTAGTCGCCTCGACCATATCTTCGCCCTGCTGTTGAACGGGAAAGGCGGAG

ACCTTGGTGCGATGACCGGGTCGGCCTTAATTCTGACGGAAAATAGCCAGAACTT

GATGATTCTGACCACTGCGCTGGCCGTTCTGGTCGCTTGCGTTTTTTTTTTCGTTT

GGCGCCGTGGTGGAAGTGATACACAGAAGCCCGCCGTACGTCCCACACCTCTTG

TTAAAGAAGAGGACGAAGAAGAAGAAGATGATAGCGCCAAGAAAAAGGTCACA

ATATTTTTTGGCACCCAGACCGGCACCGCCGAAGGTTTCGCAAAGGCCTTAGCTG

AGGAAGCAAAGGCACGTTATGAAAAGGCGGTATTTAAAGTCGTGGATTTGGATA

ACTATGCAGCGGATGACGAACAGTACGAAGAGAAGTTGAAAAAGGAAAAGCTA

GCGTTCTTCATGCTCGCCACCTACGGTGACGGCGAACCGACTGATAATGCCGCTC

GCTTTTATAAATGGTTTCTCGAGGGTAAAGAGCGCGAGCCATGGTTGTCAGATCT

GACTTATGGCGTGTTTGGCTTAGGTAACCGTCAGTATGAACACTTTAACAAGGTC

GCGAAAGCGGTGGACGAAGTGCTCATTGAACAAGGCGCCAAACGTCTGGTACCG

GTAGGGCTTGGTGATGATGATCAGTGCATTGAGGACGACTTCACTGCCTGGAGA

GAACAAGTGTGGCCTGAGCTGGATCAGCTCTTACGTGATGAAGATGACGAGCCG

ACGTCTGCGACCCCGTACACGGCGGCTATTCCAGAATACCGGGTGGAAATCTAC

GACTCAGTAGTGTCGGTCTATGAGGAAACCCATGCGCTGAAACAAAATGGACAA

GCCGTATACGATATCCACCACCCGTGTCGCAGCAACGTGGCAGTACGTCGTGAG

CTGCATACCCCGCTGTCGGATCGTAGTTGTATTCATCTGGAATTCGATATTAGTG

ATACTGGGTTAATCTATGAGACGGGCGACCACGTTGGAGTTCATACCGAGAATTC

AATTGAAACCGTGGAAGAAGCAGCTAAACTGTTAGGTTACCAACTGGATACAAT

CTTCAGCGTGCATGGGGACAAGGAAGATGGAACACCATTGGGCGGGAGTAGCCT

GCCACCGCCGTTTCCGGGGCCCTGCACGCTGCGGACGGCGCTGGCACGTTACGC

GGACCTGCTGAACCCTCCGCGCAAAGCCGCCTTCCTGGCACTGGCCGCACACGC

GTCAGATCCGGCTGAAGCTGAACGCCTTAAATTTCTCAGTTCTCCAGCCGGAAAA

GACGAATACTCACAGTGGGTCACTGCGTCCCAACGCAGCCTCCTCGAGATTATGG

CCGAATTCCCCAGCGCGAAACCGCCGCTGGGAGTGTTTTTCGCCGCAATAGCGCC

GCGCTTGCAACCTAGGTATTATAGCATCTCCTCCTCCCCGCGTTTCGCGCCGTCTC

GTATCCATGTAACGTGCGCGCTGGTCTATGGTCCTAGCCCTACGGGGCGTATTCA

TAAAGGTGTGTGCAGCAACTGGATGAAGAATTCTTTGCCCTCCGAAGAAACCCA

CGATTGCAGCTGGGCACCGGTCTTTGTGCGCCAGTCAAACTTTAAACTGCCCGCC

GATTCGACGACGCCAATCGTGATGGTTGGACCTGGAACCGGCTTCGCTCCATTTC

GCGGCTTCCTTCAGGAACGCGCAAAACTGCAGGAAGCGGGCGAAAAATTGGGCC

CGGCAGTGCTGTTTTTTGGGTGCCGCAACCGCCAGATGGATTACATCTATGAAGA

TGAGCTTAAGGGTTACGTTGAAAAAGGTATTCTGACGAATCTGATCGTTGCATTT

TCACGAGAAGGCGCCACCAAAGAGTATGTTCAGCACAAGATGTTAGAGAAAGCC

TCCGACACGTGGTCTTTAATCGCCCAGGGTGGTTATCTGTATGTTTGCGGTGATG

CGAAGGGTATGGCCAGAGACGTACATCGCACCCTGCATACAATCGTTCAGGAAC

AAGAATCCGTAGACTCGTCAAAAGCGGAGTTTTTAGTCAAAAAGCTGCAAATGG

ATGGACGCTACTTACGGGATATTTGG(SEQ ID NO：49)

参考文献

1.Kingston，D.G.The shape of things to come：structural and synthetie studies of taxoland related compounds.Phytochemistry 68，1844-54(2007).

2.Wani，M.C.，Taylor，H.L.，Wall，M.E.，Coggon，P.&McPhail，A.T.Plant antitumoragents.VI.The isolation and structure of taxol，a novel antileukemic and antitumor agentfrom Taxus brevifolia.J Am Chem Soc 93，2325-7(1971).

3.Suffness M，W.M.Discovery and developement of taxol.(ed.(ed)，S.M.)(CRC Press，Boca Raton，1995).

4.Nicolaou，K.C.etal.Total synthesis of taxol.Nature 367，630-4(1994).

5.Holton，R.A.et al.First total synthesis of taxol.2.Completion of the C and D rings.Journal of the American Chemical Society 116，1599-1600(1994).

6.Walji，A.M.&MacMillan，D.W.C.Strategies to Bypass the Taxol Problem.Fnantioselective Cascade Catalysis，a New Approach forthe Efficient Construction ofMolecular Complexity.Synlett 18，1477-1489(2007).

7.Holton RA，B.R.，Boatman PD.Semisynthesis of taxol and taxotere(ed.M，S.)(CRCPress，Boca Raton，1995).

8.Frense，D.Taxanes：perspectives fof biotechnological production.Applied microbiologyand biotechnology 73，1233-1240(2007).

9.Roberrs，S.C.Production and engineering of terpenoids in plant cell culture.NatureChemical Biology 3，387-395(2007).

10.Goodman，J.&Walsh，V.The story of taxol：nature and politics inthe pursuit of ananti-cancer dmg(Cambridge University Press，Cambridge；New York，2001).

11.Tyo，K.E.，Alper，H.S.&Stephanopoulos，G.N.Expanding the metabolic engineeringtoolbox：more options to engineer cells.Trends Biotechnol 25，132-7(2007).

12.Ajikumar，P.K.et al.Terpenoids：opportunities for biosynthesis of natural product drugsusing engineered microorganisms.Mol Pharm 5，167-90(2008).

13.Jennewein，S.&Croteau，R.Taxol：biosynthesis，molecular genetics，andbiotechnological applications.Appl Microbiol Biotechnol 57，13-9(2001).

14.Jennewein，S.，Wildung，M.R.，Chau，M.，Walker，K.&Croteau，R.Random sequencingof an induced Taxus cell cDNA library for identification of clones involved in Taxolbiosynthesis.Proc Natl Acad Sci U S A 101，9149-54(2004).

15.Croteau，R.，Ketchum，R.E.B.，Long，R.M.，Kaspera，R.&Wildung，M.R.Taxolbiosynthesis and molecular genetics.Phytochemistry Reviews 5，75-97(2006).

16.Walker，K.&Croteau，R.Taxol biosynthetie genes.Phytochemistry 58，1-7(2001).

17.Dejong，J.M.et al.Genetie engineering of taxol biosynthetic genes in Saccharomycescerevisiae.Biotechnol Bioeng 93，212-24(2006).

18.Engels，B.，Dahm，P.&Jennewein，S.Metabolic engineering of taxadiene biosynthesisin yeast as a first step towards Taxol(Paclitaxel)production.Metabolic engineering 10，201-206(2008).

19.Chang，M.C.Y.&Keasling，J.D.Production of isoprenoid pharmaceuticals byengineered microbes.Nature chemical biology 2，674-681(2006).

20.Khosla，C.&Keasling，J.D.Metabolic engineering for drug discovery and development.Nat Rev Drug Discov 2，1019-25(2003).

21.Alper，H.，Miyaoku，K.&Stephanopoulos，G.Construction of lycopene-overproducingE.coli strains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets.NatBiotechnol 23，612-6(2005).

22.Chang，M.C.，Eachus，R.A.，Trieu，W.，Ro，D.K.&Keasling，J.D.EngineeringEscherichia colifor production of functionalized terpenoids using plant P450s.NatChem Biol 3，274-7(2007).

23.Martin，V.J.，Pitera，D.J.，Withers，S.T.，Newman，J.D.&Keasling，J.D.Engineeringa mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.Nat Biotechnol21，796-802(2003).

24.Huang，Q.，Roessner，C.A.，Croteau，R.&Scott，A.I.Engineering Escherichia coli forthe synthesis of taxadiene，a key intermediate in the biosynthesis of taxol.Bioorg MedChem 9，2237-42(2001).

25.Kim，S.W.&Keasling，J.D.Metabolic engineering of the nonmevalonate isopentenyldiphosphate synthesis pathway in Escherichia eoli enhances lycopenne production.Biotechnol Bioeng 72，408-15(2001).

26.Farmer，W.R.&Liao，J.C.Improving lycopene production in Escherichia coli byengineering metabolic control.Nature Biotechnology 18，533-537(2000).

27.Farmer，W.R.&Liao，J.C.Precursor balancing for metabolic engineering of lycopeneproduction in Escherichia coli.Biotechnology progress 17(2001).

28.Yuan，L.Z.，Rouviere，P.E.，Larossa，R.A.&Suh，W.Chromosomal promoterreplacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in E.coli.Metab Eng 8，79-90(2006).

29.Jin，Y.S.&Stephanopoulos，G.Multi-dimensional gene target search for improvinglycopene biosynthesis in Escherichia coli.Metabolic Engineering 9，337-347(2007).

30.Wang，H.H.et al.Programming calls by multiplex genome engineering and acceleratedevolution.Nature(2009).

31.Klein-Marcuschamer，D.，Ajikumar，P.K.&Stephanopoulos，G.Engineering microbialcell factories for biosynthesis of isoprenoid molecules：beyond lycopene.Trends inBiotechnology 25，417-424(2007).

32.Sandmann，G.Combinatorial biosynthesis of carotenoids in a heterologous host：apowerful approach for the biosynthesis of novel structures.ChemBioChem 3(2002).

33.Brosius，J.，Erfle，M.&Storella，J.Spacing of the-10and-35 regiohs in the tacpromoter.Effect on its in vivo activity.J Biol Chem 260，3539-41(1985).

34.Brunner，M.&Bujard，H.Promoter recognition and promoter strength in the Escherichiacoli system.Embo J 6，3139-44(1987).

35.Nishizaki，T.，Tsuge，K.，Itaya，M.，Doi，N.&Yanagawa，H.Metabolie engineering ofcarotenoid biosynthesis in Escherichia coli by orderedgene assembly in Bacillus subtilis.Appl Environ Microbiol 73，1355-61(2007).

36.Sorensen，H.P.&Mortensen，K.K.Advanced genetic strategies for recombinant proteinexpression in Escherichia coli.J Biotechnol 115，113-28(2005).

37.Jones，K.L.，Kim，S.W.&Keasling，J.D.Low-copy plasmids can perform as well as orbetter than high-copy plasmids fbr metabolic engineering of bacteria.Metab Eng 2，328-38(2000).

38.Hoffmann，F.&Rinas，U.Stress induced by recombinant protein production inEscheriehia coli.Advances in Biochemical Engineering Biotechnology 89，73-92(2005).

39.Hoffmann，F.，Weber，J.&Rinas，U.Metabolie adaptation of Escherichia coli duringtemperature-induced recombinant protein oroduction：1.Readjustment of metabolieenzyme synthesis.Biotechnology and bioengineering 80(2002).

40.Chang，D.E.，Smalley，D.J.&Conway，T.Gene expression profiling of Escherichia coligrowth transitions：an expanded stringent response model.Molecular microbiology 45，289-306(2002).

41.Kaspera，R.&Croteau，R.Cytochrome P450 oxygenases of Taxol biosynthesis.Phytochemistry Reviews 5，433-444(2006).

42.Jennewein，S.，Long，R.M.，Williams，R.M.&Croteau，R.Cytochrome p450 taxadiene5alpha-hydroxylase，a mechanistically unusual monooxygenase catalyzing the firstoxygenation step of taxol biosynthesis.Chem Biol 11，379-87(2004).

43.Schuler，M.A.&Werck-Reichhart，D.F UNCTIONAL G ENOMICS OF P450 S.Annual Review of Plant Biology 54，629-667(2003).

44.Leonard，E.&Koffas，M.A.G.Engineering of artificial plant cytochrome P450enzymes for synthesis of isoflavones by Escherichia coli.Applied and EnvironmentalMicrobiology 73，7246(2007).

45.Nelson，D.R.Cytochrome P450 and the individuality of species.Archives ofBiochemistry and Biophysics 369，1-10(1999).

46.Jennewein，S.et al.Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductase withcytochrome P450 oxygenases involved in Taxol biosynthesis.Biotechnol Bioeng 89，588-98(2005).

47.Rontein，D.et al.CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement oftaxa-4(5)，11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane.J Biol Chem283，6067-75(2008).

48.Shigemori，H.&Kobayashi，J.Biological activity and chemistry of taxoids from theJapanese yew，Taxus cuspidata.J Nat Prod 67，245-56(2004).

49.Xu，F.，Tao，W.，Cheng，L.&Guo，L.Strain improvement and optimization of the mediaof taxol-producing fungus Fusarium maire.Biochemical Engineering Journal 31，67-73(2006).

50.Hefner，J.，Ketchum，R.E.&Croteau，R.Cloning and functional expression of a cDNAencoding geranylgeranyl diphosphate synthase from Taxus canadensis and assessment ofthe role of this prenyltransferase in cells induced for taxol production.Areh BiochemBiophys 360，62-74(1998).

51.Wildung，M.R.&Croteau，R.A cDNA clone for taxadiene synthase，the diterpenecyclase that catalyzes the committed step of taxol biosynthesis.J Biol Chem 271，9201-4(1996).

52.Kodumal，S.J.et al.Total synthesis of long DNA sequences：synthesis of a contiguous32-kb polyketide synthase gene cluster.Proceedings of the National Academy ofSciences 101，15573-15578(2004).

53.Tyo，K.E.J.，Ajikumar，P.K.&Stephanopoulos，G.Stabilized gene duplication enableslong-term selection-free heterologous pathway expression.Nature Biotechnology(2009).

54.Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.6640-6645(National Acad Sciences，2000).

55.Rost，B.，Yachdav，G.&Liu，J.The predictprotein server.Nucleic acids research 32，W321(2004).

56.Shalel-Levanon，S.，San，K.Y.&Bennett，G.N.Effect of ArcA and FNR on theexpression of genes related to the oxygen regulation and the glycolysis pathway inEscherichia coli under microaerobic arowth conditions.Biotechnology andbioengineering 92(2005).

57.Heinig，U.&Jennewein，S.Taxol：A complex diterpenoid natural product with anevolutionarily obscure origin.African Journal of Biotechnology 8，1370-1385(2009).

58.Walji，A.M.&MacMillan，D.W.C.Strategies to Bypass the Taxol Problem.Enantioselective Cascade Catalysis，a New Approach for the Efficient Construction ofMolecular Complexity.Synlett 18，1477-1489(2007).

59.Chau，M.，Jennewein，S.，Walker，K.&Croteau，R.Taxol biosynthesis：Molecularcloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 7beta-hydroxylase.ChemBiol 11，663-72(2004).

60.Williams，D.C.et al.Heterologous expression and characterization of a″Pseudomature″form of taxadiene synthase involved in paclitaxel(Taxol)biosynthesis and evaluation ofa potential intermediate and inhibitors of the multistep diterpene cyclization reaction.Arch Biochem Biophys 379，137-46(2000).

61.Morrone D.et al.Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineeringsystem in E.coli：comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathwayengineering.Appl Microbiol Biotechnol.85(6)：1893-906(2010)

在描述了本发明至少一个实施方案的许多方面之后，应该理解，各种改动、修改和改进将对于本领域技术人员而言是容易想到的。这样的改动、修改和改进旨在作为本公开内容的一部分，并在本发明的精神和范围内。因此，上述的说明和图示仅用于举例。本领域技术人员能够认识到(或是能够使用不超过常规实验的方法确定)等同于本文所述发明的具体实施方案。这种等同方案旨在包括在如下权利要求中。

本文公开的所有文献作为参考整体并入本文，以本文提到的特定目的。

Claims

1.一种方法，其包括：

在过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的细胞中重组表达紫杉二烯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)。

2.权利要求1的方法，其中所述细胞是细菌细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

4.权利要求2的方法，其中所述细胞是革兰氏阳性细胞。

5.权利要求4的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌(Bacillus)细胞。

6.权利要求1的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述酵母细胞是酵母属(Saccharomyces)细胞。

8.权利要求6的方法，其中所述酵母细胞是耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。

9.权利要求1的方法，其中所述细胞是藻类细胞。

10.权利要求1的方法，其中所述细胞是植物细胞。

11.权利要求1的方法，其中所述紫杉二烯合酶是紫杉属(Taxus)的酶。

12.权利要求11的方法，其中所述紫杉二烯合酶是短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的酶。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述GGPPS酶是紫杉属的酶。

14.权利要求13的方法，其中所述GGPPS酶是加拿大紫杉(Taxuscanadenis)的酶。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中编码所述紫杉二烯合酶的基因和/或编码所述GGPPS酶的基因和/或编码所述MEP途径中一种或更多种组分的基因是由一种或更多种质粒表达。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中编码所述紫杉二烯合酶的基因和/或编码所述GGPPS酶的基因和/或编码所述MEP途径中一种或更多种组分的基因整合到所述细胞的基因组中。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分选自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB。

18.权利要求17的方法，其中dxs、idi、ispD和ispF被过表达。

19.权利要求18的方法，其中dxs、idi、ispD和ispF在操纵子dxs-idi-idpDF上过表达。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中编码所述紫杉二烯合酶的基因和编码所述GGPPS酶的基因在操纵子上一起表达。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述细胞还表达紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。

22.权利要求21的方法，其中所述T5αOH酶或其催化活性部分与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分融合。

23.权利要求22的方法，其中所述T5αOH酶是At24T5αOH-tTCPR。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中使紫杉二烯合酶、GGPPS酶和MEP途径中一种或更多种组分的表达相平衡，以使紫杉二烯的产量最大化。

25.权利要求1-24中任一项的方法，还包括培养所述细胞。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述细胞产生紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

27.权利要求26的方法，其中产生至少10mg L^-1的紫杉二烯。

28.权利要求27的方法，其中产生至少250mg L^-1的紫杉二烯。

29.权利要求26的方法，其中产生至少10mg L^-1的紫杉二烯-5α-醇。

30.权利要求29的方法，其中产生至少50mg L^-1的紫杉二烯-5α-醇。

31.权利要求26、29或30的方法，其中紫杉二烯转化成紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷的百分比是至少50％。

32.权利要求31的方法，其中紫杉二烯转化成紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷的百分比是至少75％。

33.权利要求32的方法，其中紫杉二烯转化成紫杉二烯-5α-醇和副产物5(12)-氧-3(11)-环紫杉烷的百分比是至少95％。

34.权利要求25-33中任一项的方法，还包括从细胞培养物中回收紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

35.权利要求34的方法，其中从气相回收紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

36.权利要求34的方法，其中向细胞培养物添加有机层，并从所述有机层回收紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

37.细胞，其过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中的一种或更多种组分，并且重组表达紫杉二烯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)。

38.权利要求37的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。

39.权利要求38的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

40.权利要求38的细胞，其中所述细胞是革兰氏阳性细胞。

41.权利要求40的细胞，其中所述细胞是芽孢杆菌细胞。

42.权利要求37的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。

43.权利要求42的细胞，其中所述酵母细胞是酵母属细胞。

44.权利要求42的细胞，其中所述酵母细胞是耶氏酵母属细胞。

45.权利要求37的细胞，其中所述细胞是藻类细胞。

46.权利要求37的细胞，其中所述细胞是植物细胞。

47.权利要求37的细胞，其中所述紫杉二烯合酶是紫杉属的酶。

48.权利要求47的细胞，其中所述紫杉二烯合酶是短叶紫杉的酶。

49.权利要求37-48中任一项的细胞，其中所述GGPPS酶是紫杉属的酶。

50.权利要求49的细胞，其中所述GGPPS酶是加拿大紫杉的酶。

51.权利要求37-50中任一项的细胞，其中编码所述紫杉二烯合酶的基因和/或编码所述GGPPS酶的基因和/或编码所述MEP途径中一种或更多种组分的基因由一种或更多种质粒表达。

52.权利要求37-51中任一项的细胞，其中编码所述紫杉二烯合酶的基因和/或编码所述GGPPS酶的基因和/或编码所述MEP途径中一种或更多种组分的基因整合到所述细胞的基因组中。

53.权利要求37-52中任一项的细胞，其中所述非甲羟戊酸(MEP)途径中的一种或更多种组分选自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB。

54.权利要求53的细胞，其中dxs、idi、ispD和ispF被过表达。

55.权利要求54的细胞，其中dxs、idi、ispD和ispF在操纵子dxs-idi-idpDF上过表达。

56.权利要求37-55中任一项的细胞，其中编码紫杉二烯合酶的基因和编码GGPPS酶的基因在操纵子上一起表达。

57.权利要求37-56中任一项的细胞，其中所述细胞还表达紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。

58.权利要求57的细胞，其中所述T5αOH酶或其催化活性部分与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分融合。

59.权利要求58的细胞，其中所述T5αOH酶作为At24T5αOH-tTCPR表达。

60.权利要求37-59中任一项的细胞，其中使所述紫杉二烯合酶、GGPPS酶和MEP途径中一种或更多种组分的表达相平衡，以使紫杉二烯的产量最大化。

61.权利要求37-60中任一项的细胞，其中所述细胞产生紫杉二烯或紫杉二烯-5α-醇。

62.选择表现出增强的萜类化合物生产之细胞的方法，所述方法包括：

产生或获得过表达非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分的细胞，

从所述细胞产生萜类化合物，

将所述细胞的萜类化合物产量与对照细胞的萜类化合物产量进行比较，和

选择第一改进细胞，其比对照细胞产生更高量的萜类化合物，其中比对照细胞产生更高量萜类化合物的第一改进细胞就是表现出增强的萜类化合物生产的细胞。

63.权利要求62的方法，其中所述细胞重组表达萜合酶。

64.权利要求62或63的方法，其中所述细胞重组表达牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)。

65.权利要求62-64中任一项的方法，还包括

在第一改进细胞中改变非甲羟戊酸(MEP)途径中一种或更多种组分、萜合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)的表达水平，以产生第二改进细胞，和

将第二改进细胞的萜类化合物产量与第一改进细胞的萜类化合物产量进行比较，其中比第一改进细胞产生更高量萜类化合物的第二改进细胞就是表现出增强的萜类化合物生产的细胞。

66.权利要求62-65中任一项的方法，其中所述萜合酶是紫杉二烯合酶。

67.分离的多肽，其包含与细胞色素P450还原酶或其催化活性部分相融合的紫杉二烯5α-羟化酶(T5αOH)或其催化活性部分。

68.权利要求67的分离多肽，其中所述细胞色素P450还原酶是紫杉属细胞色素P450还原酶(TCPR)。

69.权利要求68的分离多肽，其中紫杉二烯5α-羟化酶和TCPR通过接头连接在一起。

70.权利要求69的分离多肽，其中所述接头是GSTGS(SEQ IDNO：50)。

71.权利要求67-70中任一项的分离多肽，其中紫杉二烯5α-羟化酶和/或TCPR被截短以去除全部或部分跨膜区。

72.权利要求71的分离多肽，其中紫杉二烯5α-羟化酶的8、24或42个N端氨基酸被截去。

73.权利要求71或72的分离多肽，其中TCPR的74个氨基酸被截去。

74.权利要求67-73中任一项的分离多肽，其中紫杉二烯5α-羟化酶与其他肽融合。

75.权利要求74的分离多肽，其中所述其他肽来自牛17α羟化酶。

76.权利要求75的分离多肽，其中所述肽是MALLLAVF(SEQ IDNO：51)。

77.权利要求67的分离多肽，其中所述分离多肽是At24T5αOH-tTCPR。

78.编码权利要求67-77中任一项所述多肽的核酸分子。

79.重组表达权利要求67-77中任一项所述多肽的细胞。

80.在产生一种或更多种萜类化合物的细胞中提高萜类化合物生产的方法，包括控制细胞中或细胞培养物中的吲哚积累，从而提高细胞中萜类化合物的生产。

81.权利要求80的方法，其中所述细胞是细菌细胞。

82.权利要求81的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

83.权利要求81的方法，其中所述细胞是革兰氏阳性细胞。

84.权利要求83的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌细胞。

85.权利要求80的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

86.权利要求85的方法，其中所述酵母细胞是酵母属细胞。

87.权利要求85的方法，其中所述酵母细胞是耶氏酵母属细胞。

88.权利要求80的方法，其中所述细胞是藻类细胞。

89.权利要求80的方法，其中所述细胞是植物细胞。

90.权利要求80的方法，其中所述细胞是权利要求37-61中任一项所述细胞。

91.权利要求80-90中任一项的方法，其中所述控制细胞中或细胞培养物中吲哚积累的步骤包括使上游非甲羟戊酸异戊二烯途径与下游产物合成途径相平衡和/或改变或调节吲哚途径。

92.权利要求80-91中任一项的方法，其中所述控制细胞中或细胞培养物中吲哚积累的步骤包括或者还包括通过化学方法从发酵物中除去积累的吲哚，任选地使用吸附剂或清除剂。

93.权利要求80-92中任一项的方法，其中所述一种或更多种萜类化合物是单萜、倍半萜、二萜、三萜或四萜。

94.权利要求93的方法，其中所述一种或更多种萜类化合物是紫杉二烯或任何紫杉醇前体。

95.一种方法，包括在产生一种或更多种萜类化合物的细胞中或在产生一种或更多种萜类化合物的细胞的培养物中测量吲哚的量或浓度。

96.权利要求95的方法，其中所述方法包括两次或更多次测量吲哚的量或浓度。

97.权利要求95或权利要求96的方法，其中所测得的吲哚量或浓度用于指导生产一种或更多种萜类化合物的方法。

98.权利要求95或权利要求96的方法，其中所测得的吲哚量或浓度用于指导菌株构建。

99.权利要求62-66中任一项的方法，其中所述细胞还重组表达权利要求67-77中任一项的多肽。