KR20120101445A - 이소프레노이드 경로로부터 화학 및 제약 제품의 생산을 위한 미생물 조작 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포에서의 탁사디엔 신타제 효소 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소의 재조합 발현 및 테르페노이드의 생산에 관한 것이다.

Description

이소프레노이드 경로로부터 화학 및 제약 제품의 생산을 위한 미생물 조작 {MICROBIAL ENGINEERING FOR THE PRODUCTION OF CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL PRODUCTS FROM THE ISOPRENOID PATHWAY}

관련 출원

본원은 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 가출원 일련 번호 61/280,877 (발명의 명칭 "Microbial Engineering for the Production of Chemical and Pharmaceutical Products from Isoprenoid Pathway", 2009년 11월 10일 출원) 및 미국 가출원 일련 번호 61/388,543 (발명의 명칭 "Microbial Engineering for the Production of Chemical and Pharmaceutical Products from Isoprenoid Pathway", 2010년 9월 30일 출원)의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 유익을 주장한다.

정부 이익

본 발명은 인가 번호 (Grant Number) 1-R01-GM085323-01A1 하에 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)으로부터 일부 연구 비용을 지원받았다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 소유한다.

발명의 분야

본 발명은 미생물 조작을 통한 하나 이상의 테르페노이드의 생산에 관한 것이다.

탁솔 및 그의 구조적 유사체는 지난 10년간 도입된 가장 강력하고 상업적으로 성공한 항암제로서 인식되고 있다¹. 탁솔은 처음에 태평양 주목 나무의 껍질로부터 단리되었고², 초기 생산 방법은 1명의 환자를 위한 충분한 투여량을 공급하기 위해 2 내지 4그루의 완전히 성장한 나무의 희생을 필요로 하였다³. 탁솔의 구조적 복잡성 때문에, 35-51 단계를 필요로 하는 복잡한 화학 합성 경로가 필요하였고, 이때 가장 높은 수율은 0.4%이었다^{4 , 5, 6}. 그러나, 생합성 중간체 바카틴 III을 식물 공급원으로부터 먼저 단리하고, 탁솔로 후속적으로 전환하는 반-합성 경로가 고안되었다⁷. 상기 접근법 및 후속 식물 세포 배양-기반 생산 노력은 주목 나무의 수확 필요성을 감소시켰지만, 생산은 생산성 및 확장성, 및 보다 효능있는 약물의 검색에서 합성될 수 있는 탁솔 유도체의 수에 대한 제약^{9 , 10}이라는 제한이 수반되는 식물 기반 공정⁸에 계속 의존한다.

발명의 개요

최근의 대사공학 및 합성 생물학의 발전은 기술적으로 보다 처리가능한 미생물 숙주를 통한 복잡한 천연 생성물의 과다생산을 위한 새로운 가능성을 제공한다^{11 , 12}. 탁수스 (Taxus)에서 탁솔의 생합성 메카니즘의 규명에서 놀라운 발전이 있었지만^13-16, 상업적으로 관련되는 탁솔-생산 균주에 있어서, 상기 복잡한 생합성 기구의 미생물 숙주 내로의 전달을 목적으로 하는 시도가 실패하였다^{17 , 18}. 그러나, 다른 천연 생성물처럼, 대사 조작된 균주를 통한 미생물에 의한 생산은 항암 및 다른 제약 활성을 갖는 다양한 종류의 새로운 화합물을 합성하기 위한 매력적인 경제성 및 큰 잠재성을 제공한다^{19 , 20}.

탁솔 및 그의 유사체의 대사 경로는 이. 콜라이 (E. coli)에 천연인 상류 이소프레노이드 경로, 및 이종성 하류 테르페노이드 경로로 구성된다 (도 6). 상류 메발론산 (MVA) 또는 메틸에리트리톨 포스페이트 (MEP) 경로는 2개의 통상적인 빌딩 블록인 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)를 생산할 수 있고, 이로부터 탁솔 및 다른 이소프레노이드 화합물이 형성된다¹². 최근의 연구는 이종성 이소프레노이드, 예컨대 리코펜 및 아르테미신산의 생합성을 지지하기 위해 상기 상류 경로의 조작에 중점을 두었다^{21- 23}. 하류 탁사디엔 경로가 이. 콜라이에서 재구축되었지만, 현재까지 역가는 1.3 mg/L를 초과하지 않았다²⁴.

상기 합리적인 대사공학 접근법은 변형이 상가적, 즉 선형 거동을 보인다고 절대적으로 가정하면서 상류 (MVA 또는 MEP) 또는 하류 테르페노이드 경로에 집중하였다^{2 5 -27}. 상기 방법은 플럭스 (flux)의 중등도 증가를 유발할 수 있지만, 이것은 비-특이적 효과, 예컨대 중간체 대사산물의 독성, 발현에 사용된 벡터의 세포 효과, 및 주경로와 경쟁하고 플럭스의 방향을 요구되는 표적으로부터 전환할 수 있는 미지의 경로를 일반적으로 무시한다. 조합 접근법은 파라미터 공간을 적절하게 샘플링하고 상기 복잡한 비-선형 상호작용을 규명할 기회를 제공하기 때문에 상기 문제를 방지할 수 있다^{21 , 28, 29, 30}. 그러나, 이들은 많은 바람직한 천연 생성물에 대해 종종 이용가능하지 않은 고효율 스크리닝을 필요로 한다³¹. 경로 최적화 방법의 또 다른 부류는 관심있는 경로를 포함하는 이종성 유전자의 상이한 공급원의 조합 공간을 조사하였다³². 이 방법도 고효율 분석에 의존하기 때문에, 상기 방법은 일반적으로 개개의 경로 유전자의 최적 발현 수준의 결정 필요성을 무시하고, 따라서 최적의 경로를 구축할 때 덜 효과적인 것으로 입증되었다.

본 발명에서, 본 발명의 측면의 예로서, 본 발명자들은 상류의 IPP-형성 경로와 탁사디엔 합성의 하류 테르페노이드 경로 사이의 최적 균형에 초점을 맞추었다. 이것은 9-효소 경로를 2개의 모듈 (module) - 4-유전자의 상류의 천연 (MEP) 경로 모듈 및 탁사디엔으로의 2-유전자의 하류의 이종성 경로로 분류함으로써 달성된다 (도 1). 상기 기본적인 입체형태를 사용하여, 파라미터, 예컨대 세포 생리에 대한 플라스미드 카피수의 효과, 발현 카세트 내의 유전자 순서 및 프로모터 강도, 및 염색체 통합을 탁사디엔 생산에 대한 그의 효과에 대해 평가한다. 상기 모듈 및 다변량 (multivariable) 조합 접근법을 사용하여 본 발명자들은 고효율 스크리닝을 수행할 필요 없이 경로 플럭스에 영향을 주는 주요 파라미터를 효율적으로 샘플링할 수 있다. 각각의 경로 모듈에 대한 다중 프로모터 및 카피수에 걸친 다변수 (multivariate) 검색은 소규모 발효에서 탁사디엔을 300 mg/L로 생산하는, 전체적으로 최대치에서 대조군에 비해 탁사디엔 생산의 15,000배 증가를 보이는, 고도로 비-선형의 탁사디엔 플럭스 상황 (landscape)을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 이. 콜라이의 탁솔 생합성에서 P450계 산화 화학을 조작하였고, 본 발명자들의 조작된 균주는 선행 기술 준에 비해 탁사디엔-5α-올 생산을 2400배 개선한다. 상기 개선은 잘 확립된 미생물 시스템에 의한 수천 종의 가치있는 테르페노이드의 대규모 생산을 위한 잠재성을 보여준다.

본 발명의 측면은 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하는 세포에서 탁사디엔 신타제 (synthase) 효소 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 재조합 방식으로 발현시키는 것을 수반하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 그람-양성 세포, 예컨대 바실러스 (Bacillus) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 효모 세포, 예컨대 사카로미세스 (saccharomyces) 세포 또는 야로위아 (Yarrowia) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조류 세포 또는 식물 세포이다.

일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소는 탁수스 효소, 예컨대 탁수스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia) 효소이다. 일부 실시양태에서, GGPPS 효소는 탁수스 효소, 예컨대 탁수스 카나데니스 (Taxus canadenis) 효소이다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP 경로의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자는 하나 이상의 플라스미드로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자는 세포의 게놈 내로 통합된다.

일부 실시양태에서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 과다발현된다. 예를 들어, dxs, idi, ispD 및 ispF는 오페론 dxs-idi-idpDF에서 과다발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자가 함께 오페론에서 발현된다.

일부 실시양태에서, 세포는 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 또는 그의 촉매 활성 부분을 추가로 발현한다. 특정 실시양태에서, T5αOH 효소 또는 그의 촉매 활성 부분은 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합된다. 예를 들어, T5αOH 효소는 At24T5αOH-tTCPR일 수 있다.

탁사디엔 신타제 효소, GGPPS 효소 및 MEP 경로의 하나 이상의 성분의 발현은 탁사디엔의 생산을 최대화하기 위해 균형잡힐 수 있다. 본 발명과 연관된 방법은 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올을 생산하기 위해 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 10 mg L^-1의 탁사디엔이 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 250 mg L^-1의 탁사디엔이 생산된다. 일부 실시양태에서, 적어도 10 mg L^-1의 탁사디엔-5α-올이 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 50 mg L^-1의 탁사디엔-5α-올이 생산된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 탁사디엔 전환 백분율은 적어도 50%, 적어도 75% 또는 적어도 95%이다.

본 발명과 연관된 방법은 세포 배양액으로부터 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올은 기체 상으로부터 회수되고, 다른 실시양태에서, 유기 층이 세포 배양액에 첨가되고, 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올은 유기 층으로부터 회수된다.

본 발명의 측면은 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하고 탁사디엔 신타제 효소 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 재조합 방식으로 발현하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이 세포이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 그람-양성 세포, 예컨대 바실러스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 효모 세포, 예컨대 사카로미세스 세포 또는 야로위아 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조류 세포 또는 식물 세포이다.

일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소는 탁수스 효소, 예컨대 탁수스 브레비폴리아 효소이다. 일부 실시양태에서, GGPPS 효소는 탁수스 효소, 예컨대 탁수스 카나데니스 효소이다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP 경로의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자는 하나 이상의 플라스미드로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자는 세포의 게놈 내로 통합된다.

일부 실시양태에서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시양태에서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 과다발현된다. 예를 들어, dxs, idi, ispD 및 ispF가 오페론 dxs-idi-idpDF에서 과다발현된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자는 오페론에서 함께 발현된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제 효소, GGPPS 효소 및 MEP 경로의 하나 이상의 성분의 발현은 탁사디엔의 생산을 최대화하기 위해 균형잡힌다.

일부 실시양태에서, 세포는 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 또는 그의 촉매 활성 부분을 추가로 발현한다. 특정 실시양태에서, T5αOH 효소 또는 그의 촉매 활성 부분은 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합된다. 예를 들어, T5αOH 효소는 At24T5αOH-tTCPR일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 탁사디엔 및/또는 탁사디엔-5α-올을 생산한다.

본 발명의 측면은 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하는 세포를 생성하거나 얻고, 세포로부터 테르페노이드를 생산하고, 세포로부터 생산된 테르페노이드의 양을 대조군 세포에서 생산된 테르페노이드의 양과 비교하고, 대조군 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제1의 개선된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포를 선택하는 방법에 관한 것이고, 여기서 대조군 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제1의 개선된 세포는 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포이다.

일부 실시양태에서, 세포는 재조합 방식으로 테르페노이드 신타제 효소 및/또는 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 발현한다. 방법은 제2의 개선된 세포를 생산하기 위해 제1의 개선된 세포에서 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분, 테르페노이드 신타제 효소 및/또는 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소의 발현 수준을 변경하고, 제2의 개선된 세포로부터 생산된 테르페노이드의 양을 제1의 개선된 세포에서 생산된 테르페노이드의 양과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제1의 개선된 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제2의 개선된 세포가 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포이다. 일부 실시양태에서, 테르페노이드 신타제 효소는 탁사디엔 신타제 효소이다. 세포는 본 발명과 연관된 임의의 폴리펩티드를 재조합 방식으로 추가로 발현할 수 있다.

본 발명의 측면은 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합된 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 효소 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 시토크롬 P450 리덕타제 효소는 탁수스 시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)이다. 특정 실시양태에서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 및 TCPR은 링커, 예컨대 GSTGS (서열 50)에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 및/또는 TCPR은 막횡단 영역의 전부 또는 일부가 제거되도록 말단절단된다. 특정 실시양태에서, 탁사디엔 5α-히드록실라제의 8, 24, 또는 42개의 N-말단 아미노산이 말단절단된다. 특정 실시양태에서, TCPR의 74개의 아미노산이 말단절단된다. 일부 실시양태에서, 추가의 펩티드가 탁사디엔 5α-히드록실라제에 융합된다. 특정 실시양태에서, 추가의 펩티드는 소 17α 히드록실라제로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 MALLLAVF (서열 51)이다. 특정 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 At24T5αOH-tTCPR이다. 또한, 본 발명의 측면은 본 발명과 연관된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 본 발명과 연관된 임의의 폴리펩티드를 재조합 방식으로 발현하는 세포를 포괄한다.

본 발명의 측면은 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포에서 테르페노이드 생산을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하여, 세포에서 테르페노이드 생산을 증가시키기는 것을 포함한다. 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이 세포; 그람-양성 세포, 예컨대 바실러스 세포; 효모 세포, 예컨대 사카로미세스 세포 또는 야로위아 세포; 조류 세포; 식물 세포; 및 본원에서 기재되는 임의의 조작된 세포를 비롯한, 본원에서 기재되는 임의의 세포가 이 방법에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하는 단계는 상류 비-메발로네이트 이소프레노이드 경로를 하류 생성물 합성 경로와 균형잡히게 하고/하거나 인돌 경로를 변형하거나 조절하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하는 단계는 화학적 방법을 통해, 예컨대 흡수제 또는 스캐빈저를 사용함으로써 발효로부터 축적된 인돌을 제거하는 것을 포함하거나 추가로 포함한다.

세포(들)에 의해 또는 배양액에서 생산된 하나 이상의 테르페노이드는 모노테르페노이드, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 트리테르페노이드 또는 테트라테르페노이드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 테르페노이드는 탁사디엔 또는 임의의 탁솔 전구체이다.

본 발명의 측면은 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포에서 또는 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포의 배양액에서 인돌의 양 또는 농도를 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 인돌의 양 또는 농도를 2회 이상의 횟수로 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 측정된 인돌의 양 또는 농도는 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 방법을 안내하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 측정된 인돌의 양 또는 농도는 균주 구축을 안내하기 위해 사용된다.

본 발명의 이들 및 다른 측면, 및 그의 다양한 실시양태는 본 발명의 도면 및 상세한 설명을 참고로 하여 보다 자명해질 것이다.

첨부 도면은 일정 비율에 맞춰 그린 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 각종 도면에 도시된 각각의 동일하거나 거의 동일한 성분은 같은 수치로 제시된다. 명료함을 위해, 모든 성분이 모든 도면에 표시되지는 않을 수 있다. 도면에서:
도 1. 다변수 -모듈 이소프레노이드 경로 조작은 테르페노이드 축적에서 강한 비선형 반응을 보여준다. 상류 MEP 경로를 통한 플럭스를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 오페론 (dxs-idi-ispDF)에 의한 과다발현을 위한 보고된 병목 (bottleneck) 효소 단계 (dxs, idi, ispD 및 ispF)를 표적으로 하였다²⁸. 과다 플럭스를 보편적인 이소프레노이드 전구체인 IPP 및 DMAPP로부터 탁솔 생합성을 향해 보내기 위해, 하류 유전자 GGPP 신타제 (G) 및 탁사디엔 신타제 (T)¹⁶의 합성 오페론을 구축하였다. 상류 이소프레노이드 및 하류 합성 탁사디엔 경로를 그의 상대적인 유전자 발현을 제어하기 위해 유도가능 프로모터의 제어 하에 배치하였다. (a) 2개의 모듈, 즉 천연 상류 MEP 이소프레노이드 경로 (좌측) 및 합성 탁사디엔 경로 (우측)의 모식도. 이. 콜라이 생합성 네트워크에서, MEP 이소프레노이드 경로는 해당작용으로부터의 전구체 글리세르알데히드-3 포스페이트 (G3P) 및 피루베이트 (PYR)의 축합에 의해 개시된다. 탁솔 경로 분기는 먼저 "선형" 전구체 게라닐게라닐 디포스페이트, 이어서 탁솔에 대한 절대적인 핵심 중간체인 "시클릭" 탁사디엔을 형성하기 위해 보편적인 이소프레노이드 전구체 IPP 및 DMAPP로부터 출발한다. 시클릭 올레핀 탁사디엔은 궁극적으로 탁솔을 형성하기 위한 다중 회차의 입체특이적 산화, 아실화, 측쇄 조립과 함께 벤조일화를 겪는다. (b) 상류 및 하류 경로 조작된 세포로부터 테르페노이드 축적에서 비-선형 반응을 조사하기 위한 다변수-모듈 이소프레노이드 경로 조작 접근법의 모식도. 상류 및 하류 경로의 발현은 프로모터 강도 (Trc, T5 및 T7)를 변경하거나 또는 상이한 플라스미드를 사용하여 카피수를 증가시킴으로써 조정된다. 상류 및 하류 경로 발현을 변경하면, 탁사디엔 축적의 최대치가 변경된다.
도 2. 상류 및 하류 모듈 경로의 발현을 조절함으로써 탁사디엔 생산의 최적화. (a) 하류 경로의 일정한 값에서 상류 경로 강도의 증가에 대한 탁사디엔 축적의 반응. (b) 상류 경로 강도의 일정한 증가에 대한 하류 경로의 의존성. 탁사디엔 반응에서 관찰된 다중 국소 최대치는 상류 또는 하류의 경로 발현 강도의 증가에 의존한다. (c) 발현이 균형잡힌 상태에서 탁사디엔 반응을 확인하기 위해 높은 상류 경로 과다발현 (20-100), 2개의 상이한 하류 발현 (~30 및 ~60)으로 조작된 균주로부터의 탁사디엔 반응 (17-24). 강력한 프로모터 T7TG 오페론 하에 저카피 플라스미드 (p5 및 p10)로부터 하류 경로의 발현을 사용하여 이들 발현을 조정하였다. 상이한 프로모터를 갖는 상이한 플라스미드로부터 발현된 상류 및 하류 경로는 모두 플라스미드에 의한 대사 부하 (metabolic burden)를 부과할 수 있음을 주목한다. (d) 감소된 독성 효과를 갖는 상실된 검색 공간을 확인하기 위해 2개의 상이한 하류 발현 (~30 및 ~60)으로 염색체로부터 프로모터 강도를 증가시키면서 상류 경로를 조정함 (균주 25-32). (e) 탁사디엔 생산 균주의 유전자에 대한 상세한 내용. 상이한 균주에 상응하는 숫자 및 그의 상응하는 유전자형, E - 이. 콜라이 K12mG1655 ΔrecAΔendA, EDE3 - 염색체 내에 T7 RNA 폴리머라제 DE3 구축물을 갖는 이. 콜라이 K12mG1655 ΔrecAΔendA, MEP - dxs-idi-ispDF 오페론, GT - GPPS-TS 오페론, TG - TS-GPPS 오페론, Ch1 - 염색체 내의 1 카피, Trc - Trc 프로모터, T5 - T5 프로모터, T7 - T7 프로모터, p5, p10, p20 - ~5 (SC101), ~10 (p15), 및 ~20 (pBR322) 카피 플라스미드.
도 3. 대사산물은 탁사디엔 생산과 역비례 관계를 보인다. (a) 도 2의 균주 구축물에서 탁사디엔 생산과 역비례 관계를 보이는, 검출된 대사산물의 질량 스펙트럼. 대사산물의 관찰된 특징적인 피크는 233, 207, 178, 117, 89 및 62이다. (b) 도 3a의 이소프레노이드 부산물과 탁사디엔의 상관성. 모두 염색체에 통합된 상류 경로 발현을 갖는 균주 26-29 및 30-32를 일관된 비교를 위해 선택하였다. 균주 26-29 및 30-32에서, 상류 발현은 프로모터를 각각 Trc로부터 T5 및 T7로 변경함으로써 증가하였다. 2 세트의 균주는 제2 세트 (30-32)가 제1 세트에 비해 2배의 발현 수준을 갖는 하류 경로의 발현에서만 상이하다. 제1 세트에서, 최적 균형화는 상류 경로 발현을 위해 Trc 프로모터를 이용하고 또한 최저 대사산물 축적을 보이는 균주 26으로 달성된다. 균주 30-32에서, 균주 31은 대사산물의 최저 축적 및 탁사디엔의 가장 많은 생산을 보인다. 데이터는 미지의 대사산물과 탁사디엔 생산 사이에 관찰된 역비례 연관성을 보여준다.
도 4. 조작된 균주의 상류 및 하류 경로 전사 유전자 발현 수준 및 세포 생리학의 변화. 상류 (DXS) 및 하류 (TS) 경로의 오페론 내의 제1 유전자의 상대적인 발현은 qPCR에 의해 정량한다. 유사한 발현 프로파일이 오페론의 하류 내의 유전자에서 관찰되었다. 상응하는 균주 숫자가 그래프에 제시된다. (a) 2개의 상이한 하류 발현 하에 프로모터 및 플라스미드를 사용하여 조정된 상이한 상류 발현으로부터 정량된 상대적인 전사체 수준 DXS 유전자 발현. (b) 상이한 상류 발현 하에 p5T7 및 p10T7 플라스미드를 사용하여 조정된 2개의 상이한 하류 발현으로부터 정량된 상대적인 전사체 수준 TS 유전자 발현. 본 발명자들의 유전자 발현 분석은 플라스미드 카피수 (5, 10 및 20) 및 프로모터 강도 (Trc, T5 및 T7)가 증가함에 따라 상류 및 하류 경로의 발현이 조정될 수 있다는 가설을 직접 지지하였다. (c) 조작된 균주 25-29의 세포 성장. 성장 표현형은 이소프레노이드 대사의 활성화 (균주 26), 재조합 단백질 발현 (균주 25) 및 플라스미드에 의한 대사 부하 (대조군 대 조작된 균주)에 의해 영향받았다. 그리고, (d) 균주 17, 22, 25-32의 성장 표현형. 흑색선은 탁사디엔을 생산하는 조작된 균주이고, 회색선은 프로모터 및 다중 클로닝 부위가 있는 빈 플라스미드를 보유하는, 하류 발현이 없는 대조군 균주이다. 성장은 테르페노이드 대사의 활성화, 플라스미드에 의한 대사 부하 및 재조합 단백질 발현과 연관성이 있다.
도 5. 이. 콜라이에서 탁솔 p450 산화 화학의 조작. (a) 탁사디엔의 탁사디엔 5α-올, 이의 탁솔로의 전환의 모식도. (b) 탁사디엔 5α-올 히드록실라제 (T5αOH) 및 탁수스 시토크롬 p450 리덕타제 (TCPR)로부터의 1 성분 키메라 단백질의 막횡단 조작 및 구축. 1 및 2는 각각 42개 및 74개 아미노산의 TM 영역을 갖는 것으로 확인된 T5αOH 및 TCPR의 전장 단백질을 나타내고, 3은 5개 잔기의 GSTGS 링커 펩티드를 사용하여 74 AA 말단절단된 TCPR (tTCPR)과의 번역에 의한 융합을 통해 3가지의 상이한 TM 조작된 T5αOH 구축물 (8개 잔기의 합성 펩티드 (A)를 8, 24 및 42 AA 말단절단된 T5αOH에 융합함으로써 구축된 At8T5αOH, At24T5αOH 및 At42T5αOH)로부터 생성된 키메라 효소이다. (c) 탁사디엔 생산 균주 18 내로 형질전환된 At8T5αOH-tTCPR, At24T5αOH-tTCPR 및 At42T5αOH-tTCPR 구축물의 기능적 활성. (d) 탁사디엔-5α-올 축적의 시간 경로 프로파일 및 1 L 생물반응기에서 발효된 균주 18-At24T5αOH-tTCPR의 성장 프로파일.
도 6. 이. 콜라이에서 탁솔 생산을 위한 생합성 방식. 2개의 모듈, 즉 천연 상류 이소프레노이드 경로 (좌측) 및 합성 탁솔 경로 (우측)의 모식도. 이. 콜라이 생합성 네트워크에서, MEP 이소프레노이드 경로의 분기는 해당작용 (I-V)의 전구체 글리세르알데히드-3 포스페이트 (G3P) 및 피루베이트 (PYR)로부터 시작한다. 탁솔 경로 분기는 이. 콜라이 이소프레노이드 전구체 IPP 및 DMAPP로부터 "선형" 전구체 게라닐게라닐 디포스페이트 (VIII), "시클릭" 탁사디엔 (IX), "산화된" 탁사디엔 5α-올 (X)로 시작하고, 초기 전구체 바카틴 III에 대한 다중 회차의 입체특이적 산화, 아실화, 벤조일화 및 에폭시화 (XII) 및 마지막으로 탁솔로의 측쇄 조립 (XIII)으로 이어진다. DXP - 1-데옥시-D-크실룰로스-5-포스페이트, MEP - 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트, CDP - ME-4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨, CDP-MEP - 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트, ME-cPP - 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-시클로디포스페이트, IPP - 이소펜테닐 디포스페이트, DMAPP - 디메틸알릴 디포스페이트. 유전자는 G3P 및 PYR로부터 탁솔로의 생합성 경로를 포함하였다. DXS - 1-데옥시-D-크실룰로스-5-포스페이트 신타제, ispC - 1-데옥시-D-크실룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제, IspD - 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 신타제, IspE - 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제, IspF - 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-시클로디포스페이트 신타제, IspG - 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 신타제, IspH - 4-히드록시-3-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 리덕타제, IDI - 이소펜테닐-디포스페이트 이소머라제, GGPPS - 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제, 탁사디엔 신타제, 탁소이드 5α-히드록실라제, 탁소이드-5α-O-아세틸트랜스퍼라제, 탁소이드 13α-히드록실라제, 탁소이드 10β-히드록실라제, 탁소이드 2α-히드록실라제, 탁소이드 2-O-벤조일 트랜스퍼라제, 탁소이드 7β-히드록실라제, 탁소이드 10-O-아세틸트랜스퍼라제, 탁소이드 1β-히드록실라제^*, 탁소이드 9α-히드록실라제, 탁소이드 9-케토-옥시다제^*, 탁소이드 C4,C20-β-에폭시다제^*, 페닐알라닌 아미노뮤타제, 측쇄 CoA-리가제^*, 탁소이드 13 O-페닐프로파노일트랜스퍼라제, 탁소이드 2'-히드록실라제^*, 탁소이드 3'-N-벤조일트랜스퍼라제^{216 , 219}. * 표시된 유전자는 앞으로 확인되거나 특성화되어야 한다.
도 7. 모듈 경로 발현 검색으로부터 탁사디엔 생산의 개선 배수. (a) 균주 1에 비해 도 2a, b, 및 c로부터 관찰된 모든 최대치로부터 탁사디엔 반응의 개선 배수. 2개의 최고 최대치 사이의 2.5배 차이 (균주 17 및 26) 및 최저치와의 23배 차이 (균주 26 및 10)는 최적 반응의 상실이 역가를 유의하게 저하시킴을 나타낸다.
도 8. 대사산물. (a) 대사산물 축적에 대한 탁사디엔의 상관성. 조작된 균주로부터의 대사산물 축적은 기하급수적인 방식으로 탁사디엔 생산에 반비례 관계이다. 이러한 관련성에 대한 연관성 계수는 0.92로 결정되었다. (b) 탁사디엔 및 대사산물 축적의 변화를 보여주는 균주 26-28로부터의 대표적인 GC-프로파일. 크로마토그램 1 및 2 내의 숫자는 각각 대사산물 및 탁사디엔 피크에 상응한다. (c) 각각 대사산물 (1) 및 탁사디엔 (2)의 GC-MS 프로파일. 대사산물의 관찰된 특징적인 피크는 233, 207, 178, 117, 89 및 62이다. 탁사-4(20),11,12-디엔 특징적 이온 m/z 272 (P⁺), 257 (P⁺-CH₃), 229 (P⁺-C₃H₇); 121, 122, 123 (C-고리 단편 클러스터)⁶⁰. 별표로 표시된 피크는 내부 표준물 카리오필렌이다.
도 9. 균주 26에서 조작된 인공 키메라 효소로부터의 GC -MS 프로파일 및 탁사 디엔/ 탁사디엔 -5α-올 생산. (a) 균주 26에 전달되고 5일 동안 발효된 3개의 구축물 (A-At8T5αOH-tTCPR, t24T5αOH-tTCPR 및 At42T5αOH-tTCPR)로부터의 헥산:에테르 (8:2) 추출물의 GC 프로파일. 피크 내의 1, 2 및 3 표지는 각각 탁사디엔, 탁사디엔-5α-올 및 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산 (OCT)에 상응한다. (b) 3개의 균주로부터 정량된 탁사-4(20),11,12-디엔-5α-올 및 OCT의 생산. (c) 및 (d) 탁사-4(20),11,12-디엔-5α-올 및 OCT의 GC-MS 프로파일 및 단편화에 상응하는 피크를 신뢰가능한 표준물 및 이전의 보고와 비교하였다^{42 , 47}. GC-MS 분석은 상기 질량 스펙트럼을 특징적인 이온 m/z 288(P⁺), 273 (P⁺-H₂O), 255 (P⁺-H₂O-CH₃)를 갖는 신뢰가능한 탁사-4(20),11,12-디엔-5α-올로 확증해 주었다.
도 10은 테르페노이드 생합성 경로 및 상기 경로에 의해 생산된 천연 생성물을 도시하는 모식도를 보여준다.
도 11은 탁사디엔 생산을 증폭하기 위한 상류 경로의 조정을 도시하는 모식도를 보여준다.
도 12는 탁사디엔 생산을 증폭하기 위한 하류 경로의 조정을 도시하는 모식도를 보여준다.
도 13은 새로 확인된 경로 전환이 하류 합성 경로의 특징이 아님을 나타내는 모식도를 보여준다.
도 14. 경로 강도는 전사 유전자 발현 수준과 상관성이 있다. (a) 31개의 임의의 단위에서 상류 경로 강도 및 하류 강도가 증가하는, idi, ispD 및 ispF 유전자의 상대적인 발현, 및 (b) 61개의 임의의 단위에서 상류 경로 강도 및 하류 강도가 증가하는, idi, ispD 및 ispF 유전자의 상대적인 발현. 예상된 바와 같이, 유전자 발현은 상류 경로 강도가 증가함에 따라 증가하였다. 상응하는 균주 숫자는 막대 그래프에 나타낸다. 상대적인 발현은 하우스키핑 rrsA 유전자의 발현을 이용하여 정량하였다. 데이터는 4개의 동일 실험에 대한 평균 +/- SD이다.
도 15. 탁사디엔 생산 및 성장에 대한 대사산물 부산물 인돌 축적의 영향. (a) 탁사디엔과 인돌 사이의 역비례 연관성. 모두 염색체에 통합된 상류 경로 발현을 갖는 균주 26 내지 28 및 30 내지 32를 일관된 비교를 위해 선택하였다. 2 세트의 균주는 제2 세트 (30 내지 32)가 제1 세트에 비해 2배의 발현 수준을 갖는 하류 경로의 발현에서만 상이하다. 균주 26 내지 28 및 30 내지 32에서, 상류 발현은 각각 Trc로부터의 프로모터를 T5 및 T7로 변경함으로써 증가하였다. 제1 세트에서, 최적 균형화는 상류 경로 발현을 위해 Trc 프로모터를 이용하고 또한 최저 인돌 축적을 보이는 균주 26으로 달성된다. 균주 30 내지 32에서, 균주 31은 인돌의 최저 축적 및 탁사디엔의 최고 생산을 보인다. 개선 배수는 두 세트에서 각각 균주 25 및 29에 대한 것이다. (b) 고생산 균주 26에서 탁사디엔 생산에 대한 외부에서 도입된 인돌의 효과. 상이한 농도의 인돌을 0.5% 효모 추출물이 존재하는 최소 배지에서 배양된 세포 배양액 내로 도입하였다. 탁사디엔 생산은 인돌 농도가 50 mg/L로부터 100 mg/L로 증가하면서 유의하게 감소하였다. (c) 조작된 이. 콜라이 균주에서 세포 성장에 대한 외부에서 도입된 인돌의 효과. 데이터는 3개의 동일 실험에 대한 평균 +/- SD이다. 하류 경로가 결여되고 상이한 강도의 상류 경로가 존재하는 균주 (1, 2, 6, 21, 40 및 100)를 선택하였다. 탁사디엔 고생산체인 균주 26이 가장 강한 억제를 보인다.
도 16. 인돌로 확인된 미지의 대사산물. (a) 및 (c) 세포 배양액으로부터 헥산을 사용하여 추출된 미지의 대사산물의 기체 크로마토그램 및 질량 스펙트럼. (b) 및 (d)는 헥산에 용해된 순수한 인돌의 기체 크로마토그램 및 질량 스펙트럼에 상응한다. 화학물질의 종류를 확인하는 것에 추가로, 대사산물을 헥산 추출을 사용하여 발효액으로부터 추출하고, 용리액으로서 헥산:에틸아세테이트 (8:2)를 사용하여 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물의 순도는 TLC 및 GC-MS에 의해 확인되었다. ¹HNMR 및 ¹³CNMR 스펙트럼에 의해 대사산물의 화학물질 종류가 인돌로 확인되었다. (e) 세포 배양액으로부터 추출된 인돌의 ¹HNMR 스펙트럼 (CDC13, 400 MHz) δ: 6.56 (d, 1H, Ar C-H), 7.16 (m, 3H, Ar C-H), 7.38 (d, 1H, Ar C-H), 7.66 (d, 1H, Ar C-H), 8.05 (b, 1H, 인돌 NH). (f) ¹³CNMR δ: 135.7, 127.8, 124.2, 122, 120.7, 119.8, 111, 102.6. (g)는 순수한 인돌의 ¹HNMR 스펙트럼이다.
도 17. 1L-생물반응기에서 조작된 균주의 유가식 배양. 균주 22, 17 및 26에서 제어된 pH 및 산소 조건 하에 최소 배지 및 0.5% 효모 추출물이 존재하는 1 L-생물반응기 용기에서의 유가식 생물반응기 배양의 5일 동안 탁사디엔 축적 (a), 세포 성장 (b), 아세트산 축적 (c) 및 총 기질 (글리세롤) 첨가 (d)의 시간 추이. 글리세롤이 발효기에서 약 0.5 내지 1 g/L로 고갈된 후, 3 g/L의 글리세롤을 발효 동안 생물반응기 내에 도입하였다. 데이터는 2개의 반복 시험 생물반응기의 평균이다.

발명의 상세한 설명

탁솔은 탁수스 브레비폴리아 태평양 주목 나무로부터 처음으로 천연 생성물로서 단리된 강력한 항암제이다. 그러나, 식물 추출물로부터 전통적인 생산 경로에 의한 신뢰가능하고 비용 효율적인 탁솔 또는 탁솔 유사체의 생산은 제한된다. 여기서, 본 발명자들은 조작된 에스케리키아 콜라이에서 탁사디엔의 생산을 약 15000배 증폭하기 위한, 대사 경로 조작에 대한 다변수-모듈 방법을 보고한다. 제1의 중요한 탁솔 중간체인 탁사디엔은 2개의 모듈, 즉 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 형성하는 천연 상류 경로 및 이종성 하류 테르페노이드-형성 경로를 포함하는 이. 콜라이 내의 비-메발로네이트 경로의 생합성 생성물이다. 체계적인 다변수 검색은 억제성 중간체의 축적 및 부생성물로의 플럭스 전환을 최소화하기 위해 2개의 경로 모듈을 최적으로 균형을 유지하는 조건을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 탁솔 생합성에서 탁사디엔 후의 다음 단계, 즉 P450계 산화 단계를 조작하여, > 98% 기질 전환을 유도하고 이. 콜라이에서 임의의 관능화된 탁솔 중간체의 생체내 생산의 제1 예를 제시한다. 모듈 경로 조작 접근법은 다단계 경로의 복잡성을 강조할 뿐만 아니라, 소규모 발효에서 높은 탁사디엔 및 탁사디엔-5α-올 역가 (각각 약 300 mg/L 및 60 mg/L)의 축적을 허용하여, 탁솔 및 그의 유도체의 미생물 생산의 잠재성을 예시한다.

본 발명은 그의 적용에서 다음 설명에 제시되거나 또는 도면에서 예시된 성분의 제조 및 배열로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태로 실시되거나 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어법 및 용어는 설명을 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "포함하는", "망라하는" 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 그의 변형은 이후에 나열되는 대상 및 그의 동등물 및 추가의 대상을 포함하는 것을 의미한다.

테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 미생물에 의한 생산이 본원에서 예시된다. 만족스러운 수준에서 발현될 때, 미생물 경로는 상기 화합물의 생산 비용을 크게 감소시킨다. 추가로, 이 경로는 값싸고, 풍부하며, 재생가능한 공급 원료 (예컨대, 당 및 다른 탄수화물)를 이용하고, 원래의 화합물보다 훨씬 우수한 특성을 보일 수 있는 많은 유도체의 합성을 위한 공급원일 수 있다. 미생물 경로를 이용하는 이소프레노이드 경로의 화합물의 비용-경쟁적 생산의 핵심 요소는 이들 분자의 과다생산을 허용하기 위한 상기 경로의 증폭이다. 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이)에서 테르페노이드 생산을 향한 플럭스를 향상시키거나 증폭하는 방법이 본원에서 기재된다. 구체적으로, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) (이소프레노이드 화합물의 생산을 위한 핵심 중간체), 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP), 게라닐 디포스페이트 (GPP), 파르네실 디포스페이트 (FPP), 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP), 및 파르네실 게라닐 디포스페이트 (FGPP), 파클리탁셀 (탁솔), 깅콜리드, 게라니올, 파르네솔, 게라닐게라니올, 리날로올, 이소프렌, 모노테르페노이드, 예컨대 멘톨, 카로테노이드, 예컨대 리코펜, 폴리이소프레노이드, 예컨대 폴리이소프렌 또는 천연 고무, 디테르페노이드, 예컨대 엘류테로빈, 및 세스퀴테르페노이드, 예컨대 아르테미시닌의 합성으로 대사 플럭스를 증폭하는 방법이 제공된다.

본 발명의 측면은 테르페노이드의 생산에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이소프레노이드로도 언급되는 테르페노이드는 5탄소 이소프렌 단위로부터 유래되는 유기 화학물질이다. 이들이 함유하는 이소프렌 단위의 수를 기초로 하여 분류된 테르페노이드의 몇몇 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 헤미테르페노이드 (1 이소프렌 단위), 모노테르페노이드 (2 이소프렌 단위), 세스퀴테르페노이드 (3 이소프렌 단위), 디테르페노이드 (4 이소프렌 단위), 세스테르테르페노이드 (5 이소프렌 단위), 트리테르페노이드 (6 이소프렌 단위), 테트라테르페노이드 (8 이소프렌 단위), 및 더 큰 수의 이소프렌 단위를 갖는 폴리테르페노이드. 일부 실시양태에서, 생산되는 테르페노이드는 탁사디엔이다. 일부 실시양태에서, 생산되는 테르페노이드는 시트로넬롤, 쿠베볼, 누트카톤, 시네올, 리모넨, 엘류테로빈, 사르코딕티인, 슈돕테로신, 깅콜리드, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 스클라레올, 랍덴디올, 레보피마라디엔, 산드라코피마라디엔 또는 이소페마라디엔이다.

상류 경로 및 하류 경로에 참여하는 유전자 또는 단백질의 발현을 제어함으로써 세포에서 테르페노이드의 생산을 최적화하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 기재된다. 상류 경로는 2가지의 상이한 대사 경로, 즉 메발론산 (MVA) 경로 및 MEP (2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트) 경로, 즉 MEP/DOXP (2-C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트/1-데옥시-D-크실룰로스 5-포스페이트) 경로로도 또한 불리는 경로, 비-메발로네이트 경로 또는 메발론산-독립적 경로에 의해 달성될 수 있는 이소펜틸 피로포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)의 생산을 수반한다.

하류 경로는 테르페노이드의 생산을 유도하고 테르페노이드 신타제 (테르펜 시클라제로도 불림) 효소, 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소의 재조합 유전자 발현을 수반하는 합성 경로이다. 일부 실시양태에서, 테르페노이드 신타제 효소는 디테르페노이드 신타제 효소이다. 디테르페노이드 신타제 효소의 몇몇 비제한적인 예는 카스벤 신타제, 탁사디엔 신타제, 레보피마라디엔 신타제, 아비에타디엔 신타제, 이소피마라디엔 신타제, ent-코팔릴 디포스페이트 신타제, syn-스테마르-13-엔 신타제, syn-스테모드-13(17)-엔 신타제, syn-피마라-7,15-디엔 신타제, ent-산다라코피마라디엔 신타제, ent-카사-12,15-디엔 신타제, ent-피마라-8(14),15-디엔 신타제, ent-카우르-15-엔 신타제, ent-카우르-16-엔 신타제, 아피디콜란-16β-올 신타제, 필로클라단-16α-올 신타제, 푸시코카-2,10(14)-디엔 신타제, 및 테르펜테트리엔 시클라제를 포함한다.

놀랍게도, 실시예 섹션에서 입증되는 바와 같이, 본원에서 기재되는 상류 및 하류 경로의 조작에 의한 테르페노이드 합성의 최적화는 단순한 선형 또는 부가 과정이 아니다. 대신에, 복잡한 조합 분석을 통해, 최적화는 상류 및 하류 경로의 성분의 균형화에 의해 달성되었다. 예기치 않게, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 탁사디엔 축적은 상류 MEP 및 하류 합성 탁사디엔 경로의 상대적인 강도에 대한 강한 비-선형 의존성을 보였다.

본 발명의 측면은 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 최적화된 생산을 위한, MEP 경로의 유전자 및 단백질의 발현의 제어에 관한 것이다. 테르페노이드의 최적화된 생산은 최적화된 전략의 부재시에 달성되는 것보다 최적화 전략을 따라 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 것을 의미한다. MEP 경로 내의 임의의 유전자 및/또는 단백질이 본원에서 기재되는 방법 및 조성물에 포함됨을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, MEP 경로 내의 유전자는 다음 중의 하나이다: dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 또는 ispB. MEP 경로 내의 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 상향조절 및/또는 하향조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, MEP 경로 내의 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 상향조절은 MEP 경로 내의 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 하향조절과 조합될 수 있다.

유전자 및/또는 단백질은 단독으로 또는 조합되어 조절될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, dxs의 발현은 단독으로 또는 ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispC의 발현은 단독으로 또는 dxs, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispD의 발현은 dxs, ispC, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispE의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispF의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispG의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispH, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispH의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, idi, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. idi의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, ispA 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispA의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi 및 ispB 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. ispB의 발현은 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi 및 ispA 중의 하나 이상의 발현의 상향조절 또는 하향조절과 조합되어 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, 및 idi 중의 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 상향조절되고, ispA 및/또는 ispB의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 하향조절된다.

MEP 경로 내의 유전자의 발현은 모듈 방법에서 조절될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 모듈 방법에 의한 조절은 다중 유전자를 함께 조절하는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MEP 경로 내의 다중 유전자는 DNA의 연속적인 영역, 예컨대 오페론에서 재조합 방식으로 발현된다. 또한, 상기 모듈을 발현하는 세포는 MEP 경로 내의 하나 이상의 다른 유전자를 재조합 방식으로 또는 내인성으로 발현할 수 있음이 이해되어야 한다.

MEP 경로 내의 유전자의 모듈의 비제한적인 예는 실시예 섹션에서 제시되고 본원에서 dxs-idi-ispDF로 언급되는 유전자 dxs, idi, ispD 및 ispF를 함유하는 모듈이다. 본 발명의 측면과 일치하는 MEP 경로 내의 유전자의 모듈은 MEP 경로 내의 임의의 유전자를 임의의 순서로 함유할 수 있음이 이해되어야 한다.

또한, 하류 합성 테르페노이드 합성 경로 내의 유전자 및 단백질의 발현은 테르페노이드 생산을 최적화하기 위해 조절될 수 있다. 합성 하류 테르페노이드 합성 경로는 테르페노이드 신타제 효소 및 GGPPS 효소의 재조합 발현을 수반한다. 상기 논의된 바와 같은 임의의 테르페노이드 신타제 효소는 생산되는 하류 생성물에 따라 GGPPS와 함께 발현될 수 있다. 예를 들어, 탁사디엔 신타제는 탁사디엔의 생산을 위해 사용된다. 탁사디엔 신타제 효소 및 GGPPS 효소의 재조합 발현은 독립적으로 또는 함께 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 효소는 모듈 방식으로 함께 조절된다. 예를 들어, 2개의 효소는 오페론에서 임의의 순서로 발현될 수 있다 ("GT"로 언급되는 GGPPS-TS, 또는 "TG"로 언급되는 TS-GGPPS).

모듈, 예컨대 dxs-idi-ispDF 오페론, 및 TS-GGPPS 오페론을 비롯한 유전자 및/또는 단백질의 발현의 조정은 당업계에 공지된 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 오페론의 발현은 프로모터, 예컨대 상이한 강도를 갖는 유도가능 프로모터의 선택을 통해 조절될 수 있다. 프로모터의 몇몇 비제한적인 예는 Trc, T5 및 T7을 포함한다. 추가로, 유전자 또는 오페론의 발현은 세포에서 유전자 또는 오페론의 카피수 조작을 통해 조절될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, Trc 프로모터 제어 하에 그의 염색체 상에 추가의 카피의 dxs-idi-ispDF 오페론을 함유하는 균주는 단지 합성 하류 경로만을 과다발현하는 균주에 비해 증가된 양의 탁사디엔을 생산한다. 일부 실시양태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 모듈 내의 유전자의 순서의 조정을 통해 조절될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 하류 합성 오페론에서 유전자의 순서를 GT로부터 TG로 변경하면, 탁사디엔 생산이 2-3배 증가한다. 일부 실시양태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 하나 이상의 유전자 또는 오페론의 염색체 내로의 통합을 통해 조절된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 상류 dxs-idi-ispDF 오페론의 세포의 염색체 내로의 통합은 탁사디엔 생산을 증가시킨다.

본 발명과 연관된 유전자를 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있음을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, MEP 경로 내의 유전자는 박테리아 유전자, 예컨대 에스케리키아 콜라이 유전자이다. 일부 실시양태에서, GGPPS 효소를 코딩하는 유전자는 식물 유전자이다. 예를 들어, GGPPS를 코딩하는 유전자는 탁수스, 예컨대 탁수스 카나덴시스 (T. canadensis)의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 신타제를 코딩하는 유전자는 식물 유전자이다. 예를 들어, 탁사디엔 신타제를 코딩하는 유전자는 탁수스의 종, 예컨대 탁수스 브레비폴리아 (T. brevifolia)로부터 유래될 수 있다. 티. 카나덴시스 GGPPS 및 티. 브레비폴리아 탁사디엔 신타제에 대한 대표적인 진뱅크(GenBank) 기탁 번호는 AF081514 및 U48796이고, 그 서열은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.

당업자가 인식하듯이, 본 발명과 연관된 방법에 사용하기 위한 상동성 유전자는 다른 종으로부터 얻을 수 있고, 상동성 검색에 의해, 예를 들어 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) 웹 사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 단백질 BLAST 검색을 통해 확인될 수 있다. 본 발명과 연관된 유전자 및/또는 오페론은 주어진 유전자를 함유하는 임의의 DNA 공급원으로부터의 DNA로부터 예를 들어 PCR 증폭 및/또는 제한 소화에 의해 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 유전자 및/또는 오페론은 합성된 것이다. 본 발명과 연관된 유전자 및/또는 오페론을 얻는 임의의 수단이 본 발명에 적합하다.

일부 실시양태에서, 추가의 테르페노이드 생산 최적화는 세포에서 재조합 방식으로 발현되기 전에 유전자를 변형함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, GGPPS 효소는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다: A162V, G140C, L182M, F218Y, D160G, C184S, K367R, A151T, M185I, D264Y, E368D, C184R, L331I, G262V, R365S, A114D, S239C, G295D, I276V, K343N, P183S, I172T, D267G, I149V, T234I, E153D 및 T259A. 일부 실시양태에서, GGPPS 효소는 잔기 S239 및/또는 잔기 G295에 돌연변이를 갖는다. 특정 실시양태에서, GGPPS 효소는 돌연변이 S239C 및/또는 G295D를 갖는다.

일부 실시양태에서, 세포에서 재조합 방식으로 발현되기 전에 유전자를 변형하는 것은 박테리아 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화를 수반한다. 다양한 유기체에 대한 코돈 사용빈도는 코돈 사용빈도 데이터베이스 (www.kazusa.or.jp/codon/)에서 알 수 있다. 다양한 유기체에 대한 최적 코돈의 확인을 포함하는 코돈 최적화, 및 코돈 최적화를 달성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 표준 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포에서 재조합 방식으로 발현되기 전에 유전자를 변형하는 것은 세포에서 재조합 방식으로 발현되기 전에 하나 이상의 돌연변이를 유전자에 만드는 것을 수반한다. 예를 들어, 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 또는 다중 뉴클레오티드의 치환 또는 결실을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이는 유전자로부터 생산되는 단백질의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 야기한다.

일부 실시양태에서, 테르페노이드의 생산을 위해 최적화된 세포를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하는 세포가 GGPPS의 기질인 이소펜틸 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 증폭하기 위해 적어도 부분적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분의 과다발현은 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분의 카피수를 증가시킴으로써 달성된다. 예를 들어, MEP 경로 내의 속도 제한 단계의 성분, 예컨대 (dxs, ispD, ispF, idi)의 카피수는 예를 들어 추가의 에피솜 발현에 의해 증폭될 수 있다.

일부 실시양태에서, "합리적인 설계"는 단백질, 예컨대 효소 내에 특정 돌연변이를 도입할 때 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "합리적인 설계"는 효소, 또는 관련 효소에 대한 지식, 예컨대 그의 3차원 구조, 그의 활성 부위(들), 그의 기질(들) 및/또는 효소와 기질 사이의 상호작용을 특정 돌연변이의 설계 내로 포함시키는 것을 의미한다. 합리적인 설계 접근법을 기초로 하여, 돌연변이가 효소에 생성될 수 있고, 이어서 대조군 수준에 비해 테르페노이드의 증가된 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 상동성 모델링 (modeling)을 기초로 하여 합리적으로 설계될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 모델링"은 그의 아미노산 서열 및 관련된 상동성 단백질의 3차원 구조로부터 하나의 단백질의 원자 분해 모델 (atomic resolution model)을 구축하는 과정을 의미한다.

일부 실시양태에서, 무작위 돌연변이가 유전자, 예컨대 효소를 코딩하는 유전자에서 이루어질 수 있고, 상기 돌연변이는 대조군 수준에 비해 테르페노이드의 증가된 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, MEP 경로의 성분, 또는 테르페노이드의 향상된 생산을 유도하는 다른 경로의 성분 내의 돌연변이에 대한 스크리닝은 무작위 돌연변이 유발 스크리닝, 또는 기지의 돌연변이의 스크리닝을 통해 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 테르페노이드의 증가된 생산을 위해 게놈 단편을 갖는 세포 또는 유기체의 스크리닝을 통해 테르페노이드의 생산을 증가시키는 게놈 영역을 확인하기 위해 게놈 단편의 샷건 클로닝 (shotgun cloning)이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이가 동일한 세포 또는 유기체에서 조합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포에서 테르페노이드의 생산은 본 발명과 연관된 효소와 동일한 경로에서 작용하는 효소의 조작을 통해 증가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적 효소, 예컨대 본 발명과 연관된 효소의 상류에서 작용하는 효소 또는 다른 인자의 발현을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 이것은 임의의 표준 방법을 사용하여 상류 인자를 과다발현시킴으로써 달성될 수 있다.

또한, 단백질 발현의 최적화는 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 고 카피수 플라스미드, 또는 저 또는 중간 카피수 플라스미드의 선택을 포함할 수 있다. 또한, 전사 종료 단계가 스템-루프와 같은 구조의 도입 또는 제거를 통한 유전자 발현의 조절을 위해 표적화될 수 있다.

본 발명의 측면은 세포에서 재조합 유전자의 발현에 관한 것이다. 본 발명은 원핵 및 진핵 세포를 비롯하여 본 발명과 연관된 유전자를 재조합 방식으로 발현하는 임의의 종류의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 종, 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종, 자이모나스 (Zymonas) 종, 아세토박터 (Acetobacter) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 리조비움 (Rhizobium) 종, 클로스트리디움 (Clostridium) 종, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 크산토모나스 (Xanthomonas) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 바실러스 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 아에로모나스 (Aeromonas) 종, 아조토박터 (Azotobacter) 종, 코마모나스 (Comamonas) 종, 미코박테리움 (Mycobacterium) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 글루코노박터 (Gluconobacter) 종, 랄스토니아 (Ralstonia) 종, 아시디티오바실러스 (Acidithiobacillus) 종, 미크로루나투스 (Microlunatus) 종, 게오박터 (Geobacter) 종, 게오바실러스 (Geobacillus) 종, 아르트로박터 (Arthrobacter) 종, 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora) 종, 테르무스 (Thermus) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 크로모박테리움 (Chromobacterium) 종, 시노리조비움 (Sinorhizobium) 종, 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora) 종, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 종 및 판토에아 (Pantoea) 종 박테리아 세포이다. 세포는 그람-음성 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이) 세포, 또는 그람-양성 세포, 예컨대 바실러스의 종일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 예를 들어, 사카로미세스 종, 스키조사카로미세스 (Schizosaccharomyces) 종, 피치아 (Pichia) 종, 파피아 (Paffia) 종, 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 종, 칸디다 (Candida) 종, 탈라로미세스 (Talaromyces) 종, 브레타노미세스 (Brettanomyces) 종, 파키솔렌 (Pachysolen) 종, 데바리오미세스 (Debaryomyces) 종, 야로위아 종, 및 산업적 다배수체 효모 균주이다. 바람직하게는 효모 균주는 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 균주 또는 야로위아 종 균주이다. 진균의 다른 예는 아스페르길루스 (Aspergillus) 종, 페니실리움 (Pennicilium) 종, 푸사리움 (Fusarium) 종, 리조푸스 (Rhizopus) 종, 아크레모니움 (Acremonium) 종, 뉴로스포라 (Neurospora) 종, 소르다리아 (Sordaria) 종, 마그나포르테 (Magnaporthe) 종, 알로미세스 (Allomyces) 종, 우스틸라고 (Ustilago) 종, 보트리티스 (Botrytis) 종, 및 트리코데르마 (Trichoderma) 종을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는 조류 세포, 또는 식물 세포이다. 본 발명에 적합한 일부 세포는 하나 이상의 본 발명과 연관된 유전자의 내인성 카피 및 재조합 카피를 발현할 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 세포가 하나 이상의 본 발명과 연관된 유전자의 내인성 카피를 갖는다면, 방법은 내인성으로 발현되는 유전자(들)의 재조합 카피의 부가를 반드시 필요로 하지는 않을 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에서 기재되는 경로로부터 하나 이상의 효소를 내인성으로 발현할 수 있고, 테르페노이드의 효율적인 생산을 위해 본원에서 기재되는 경로로부터 하나 이상의 다른 효소를 재조합 방식으로 발현할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 최적화된 테르페노이드 생산을 보이는 박테리아 세포 또는 균주의 스크리닝에 관한 것이다. 상기한 바와 같이, 본 발명과 연관된 방법은 MEP 경로 내의 하나 이상의 유전자를 과다발현하는 세포의 생성을 수반한다. 상기 세포의 배양액으로부터 테르페노이드 생산을 측정하고, 대조군 세포와 비교하고, 여기서 대조군 세포에 비해 더 많은 양의 테르페노이드 생산을 보이는 세포가 제1의 개선된 세포로서 선택된다. 세포는 테르페노이드 신타제 효소 및 GGPPS 효소의 재조합 발현에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이어서, 세포에서 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분, 테르페노이드 신타제 효소 및/또는 GGPPS 효소의 발현 수준이 조작될 수 있고, 테르페노이드 생산을 다시 측정하여 제1의 개선된 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제2의 개선된 세포를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 테르페노이드 신타제 효소는 탁사디엔 신타제 효소이다.

본 발명의 추가의 측면은 박테리아 이. 콜라이 세포에서 이전에 알려지지 않은 대사산물의 확인 및 특성결정 (GC-MS를 통한)에 관한 것이다 (도 3 및 6). 새로이 확인된 대사산물인 인돌의 축적 수준은 이소프레노이드 경로 유전자의 과다발현, 하향조절 또는 돌연변이에 의해 미생물 경로를 유전자에 의해 조작함으로써 제어될 수 있다. 대사체 인돌은 조작된 균주에서 탁사디엔 생산에 대한 직접 변수로서 반상관관계 (anticorrelation)를 보인다 (도 3, 6 및 15). 박테리아 시스템 (구체적으로 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포에서) 또는 다른 세포에서 플럭스를 테르페노이드 생합성을 향해 개선하기 위해 인돌의 축적을 추가로 제어하는 것은 상류의 비-메발로네이트 이소프레노이드 경로를 하류 생성물 합성 경로와 균형을 이루게 하거나 또는 인돌 경로의 변형 또는 조절에 의해 달성될 수 있다. 이때, 당업자는 인돌의 축적을 감소시키거나 제어할 수 있고, 이에 의해 탁사디엔, 및 설명된 경로로부터 유래된 다른 테르페노이드, 예컨대 모노테르페노이드, 세스퀴테르페노이드 (아모르파디엔 포함), 디테르페노이드 (레보피마라디엔 포함), 트리테르펜, 및 테트라테르펜의 생산에 대한 인돌의 억제성 효과를 감소시킬 수 있다. 인돌의 축적을 감소시키거나 제어하기 위한 다른 방법은 화학적 방법을 통해, 예컨대 흡수제, 스캐빈저 등을 사용함으로써 발효로부터 축적된 인돌을 제거하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포에서 또는 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포의 배양액에서 인돌의 양 또는 농도를 측정하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 인돌의 양 또는 농도는 당업계에 공지되고 본원에서 기재되는 방법을 사용하여 1회, 또는 2회 또는 그 초과의 적절한 횟수로 측정될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 공정 개선에서 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 공정을 안내하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 균주 개선을 위해 균주 구축을 안내하기 위해 사용될 수 있다.

상기 균형화를 달성하기 위한 수단의 확인을 통해 야생형 박테리아 세포에 비해 이종성 탁사디엔 생합성 경로로 발현되는 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 과다생산이 15000배 개선되었다. 생산은 임의의 이전에 보고된 탁사디엔 생산에 비해 1500배 더 높은 약 2 g/L의 농도를 생성하는 변형된 발효 방법을 통해 추가로 증가되었다. 본원에서 증명되는 바와 같이, 이. 콜라이에서 비-메발로네이트 이소프레노이드 경로를 유전자에 의해 조작함으로써, 상기 대사산물의 축적은 박테리아 이. 콜라이 세포에서 플럭스를 이소프레노이드 생합성 쪽으로 조절하도록 제어될 수 있다. 또한, 탁사디엔 생산을 탁솔로의 다음 중요한 전구체인 탁사디엔-5α-올로 추가로 유도하는 것이 본원에서 예시되고, 이것은 탁솔 생합성을 위한 산화 화학의 조작을 통해 달성된다. 실시예 5는 탁사디엔으로부터 탁사디엔-5α-올로의 합성 경로의 제1의 성공적인 연장을 제시한다. 대다수의 다른 테르페노이드와 유사하게, 탁솔 생합성은 "2기" 생합성 과정의 통합된 방식, 즉 (i) GGPP에 대한 프레닐 전구체 (IPP 및 DMAPP)의 선형 커플링의 "시클라제 기", 이어서, 중요한 전구체 탁사디엔에 대한 분자 고리화 및 재배열을 따른다 (도 6, VIII-IX)^57,58. 중요한 전구체 다음에, (ii) 시클릭 올레핀 탁사디엔 코어 구조가, 아실 및 아로일 CoA-의존성 트랜스퍼라제에 의한 2개의 아세테이트 기 및 벤조에이트 기, 케토-옥시다제에 의한 케토 기, 및 에폭시다제에 의한 에폭시드 기로 장식된 그의 레독스 파트너 (redox partner)와 함께 7개의 시토크롬 P450 옥시게나제에 의해 관능화되는 "산화기"는 C13 측쇄가 탁솔을 위해 그에 대해 부착되는 후기 중간체 바카틴 III을 생성한다 (도 6, X-XIII)¹⁵. 초기 산화기 반응의 대략적인 순차적인 순서는 예측되지만, 몇몇 히드록실화, 아실화 및 벤조일화 반응의 정확한 타이밍/순서는 불활실하다. 그러나, 초기 분기가 C5 위치에서 탁사디엔 코어의 시토크롬 p450 매개 히드록실화로부터 출발하여, 서로 높은 추정된 유사성 (> 70%)을 갖지만 다른 식물 p450에는 제한된 유사성 (< 30%)을 갖는 시토크롬 p450 효소의 상동성 패밀리를 사용한 하류의 히드록실화로 이어짐은 분명하다^{41 ,59}. 추가로, 가능한 진화 분석에 의한 구조적 및 기능적 다양성은 탁사디엔-5α-올 유전자가, 탁솔 생합성 경로 내의 다른 히드록실라제 유전자가 그로부터 진화되는 모 서열일 수 있음을 내포하고, 이는 히드록실화의 순서를 반영한다¹⁵.

본 발명의 추가의 측면은 키메라 P450 효소에 관한 것이다. 식물 시토크롬 P450의 기능적 발현은 박테리아 플랫폼의 고유한 제한, 예컨대 전자 전달전자 전달 기구, 시토크롬 P450 리덕타제의 부재, 및 소포체 결여에 의한 P450 효소의 막 신호 모듈의 번역 부적합성에 의해 문제가 되는 것으로 간주되었다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법과 연관된 탁사디엔-5α-히드록실라제는 N-말단 막횡단 조작 및/또는 CPR 레독스 파트너와의 번역 융합을 통한 키메라 효소의 생성을 통해 최적화된다. 일부 실시양태에서, CPR 레독스 파트너는 탁수스 시토크롬 P450 리덕타제이다 (TCPR; 도 5b). 특정 실시양태에서, 시토크롬 P450 탁사디엔-5α-히드록실라제 (T5αOH)는 탁수스 쿠스피데이트 (Taxus cuspidate) (진뱅크 기탁 번호 AY289209, 그 서열은 본원에 참고로 포함됨)로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, NADPH:시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)는 탁수스 쿠스피데이트 (진뱅크 기탁 번호 AY571340, 그 서열은 본원에 참고로 포함됨)로부터 얻어진다.

탁사디엔 5α-히드록실라제 및 TCPR은 링커, 예컨대 GSTGS (서열 50)에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 및/또는 TCPR은 하나 또는 두 단백질의 막횡단 영역의 전부 또는 일부가 제거되도록 말단절단된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 탁사디엔 5α-히드록실라제는 8, 24, 또는 42개의 N-말단 아미노산이 제거되도록 말단절단된다. 일부 실시양태에서, TCPR의 N-말단 74개 아미노산이 말단절단된다. 또한, 추가의 펩티드가 탁사디엔 5α-히드록실라제에 융합될 수 있다. 예를 들어, 소 17α 히드록실라제로부터의 하나 이상의 아미노산이 탁사디엔 5α-히드록실라제에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩티드 MALLLAVF (서열 51)가 탁사디엔 5α-히드록실라제에 부가된다. TCPR에 융합된 탁사디엔 5α-히드록실라제를 포함하는 폴리펩티드의 비제한적인 예는 At24T5αOH-tTCPR이다.

일부 실시양태에서, 키메라 효소는 탁사디엔의 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 전환이 10% 초과인 제1 산화 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 탁사디엔 전환 백분율은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 약 99% 또는 약 100%일 수 있다.

특정 실시양태에서, 키메라 효소는 탁사디엔의 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산 (OCT; 도 9a)으로의 전환이 98% 초과인 제1 산화 단계를 수행할 수 있는 것으로 밝혀진 At245αOH-tTCPR이다. 탁사디엔-5α-올 생산 단계의 조작은 탁솔의 생산에 중요하고, 효모에서 상기 경로를 구축하기 위한 이전의 노력을 제한하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 개발된 조작된 구축물은 효모에서의 이전의 이종성 발현보다 2400배 개선된, 생체 내에서의 탁사디엔의 98% 초과의 전환을 입증하였다. 따라서, 유의하게 더 많은 양의 중요한 탁솔 중간체의 합성 이외에, 본 연구는 또한 유사한 P450 화학에 의해 경로에서 후속적인 대사산물의 합성을 위한 기초를 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 따라서 용어 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드를 의미하기 위해 사용될 수 있고, 또한 전장 폴리펩티드의 단편을 의미하기 위해 사용될 수도 있다. 폴리펩티드, 단백질, 또는 그의 단편에 대해 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 분리되고 그의 확인 또는 사용을 허용할 정도로 충분한 양으로 존재함을 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, 단리된은 예를 들어 (i) 발현 클로닝에 의해 선택적으로 생산되거나 또는 (ii) 크로마토그래피 또는 전기영동에 의해 정제됨을 의미한다. 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 실질적으로 순수할 수 있지만, 실질적으로 순수할 필요는 없다. 용어 "실질적으로 순수한"은 생산, 천연, 또는 생체내 시스템에서 발견될 수 있는 다른 물질이 그의 의도된 용도에 대해 실용적이고 적절한 정도로 단백질 또는 폴리펩티드에 본질적으로 존재하지 않음을 의미한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 천연적으로 얻거나 본원에서 기재되는 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 당업계에 공지된 기술로 정제될 수 있다. 단리된 단백질은 제제에서 다른 성분과 혼합될 수 있기 때문에, 단백질은 제제의 작은 중량 백분율만을 구성할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 단백질은 단백질이 생체 시스템에서 회합될 수 있는 물질로부터 분리, 즉 다른 단백질로부터 단리된다는 점에서 단리된다.

본 발명은 또한 본원에서 기재되는 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 본원에서 기재되는 임의의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 함유하는 라이브러리, 및 본원에서 기재되는 임의의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 하나 이상의 유전자는 재조합 발현 벡터에서 발현된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 상이한 유전적 환경 사이의 수송을 위해 또는 숙주 세포에서 발현을 위해 요구되는 서열(들)이 제한 및 라이게이션에 의해 그 내부로 삽입될 수 있는 임의의 많은 핵산일 수 있다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 이용가능하다. 벡터는 플라스미드, 포스미드 (fosmid), 파지미드, 바이러스 게놈 및 인공 염색체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

클로닝 벡터는 자율적으로 복제할 수 있거나 숙주 세포 내의 게놈 내로 통합되고, 벡터가 결정가능한 방식으로 절단될 수 있고 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제하는 그의 능력을 유지하도록 요구되는 DNA 서열이 그 내부로 라이게이션될 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가의 특징으로 한다. 플라스미드의 경우에, 요구되는 서열의 복제는 숙주 세포, 예컨대 숙주 박테리아 내에서 플라스미드의 카피수가 증가하면서 다수회 발생하거나 또는 숙주가 유사분열에 의해 복제하기 전에 숙주당 단지 1회 발생할 수 있다. 파지의 경우에, 복제는 용해기 동안 활발하게 발생하거나 잠복기 동안 수동적으로 발생할 수 있다.

발현 벡터는 요구되는 DNA 서열이 조절 서열에 작동가능하게 연결되고 RNA 전사체로서 발현될 수 있도록 제한 및 라이게이션에 의해 그 내부로 삽입될 수 있는 것이다. 벡터는 벡터로 형질전환 또는 형질감염되거나 되지 않은 세포의 확인에 사용하기 적합한 하나 이상의 마커 서열을 추가로 함유할 수 있다. 마커는 예를 들어 항생제 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 감수성을 증가시키거나 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 그 활성이 당업계에 공지된 표준 분석에 의해 검출가능한 효소 (예를 들어, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제)를 코딩하는 유전자, 및 형질전환된 또는 형질감염된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 가시적으로 영향을 주는 유전자 (예를 들어, 녹색 형광 단백질)를 포함한다. 바람직한 벡터는 작동가능하게 연결된 DNA 세그먼트 내에 존재하는 구조 유전자 생성물의 자율 복제 및 발현이 가능한 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 코딩 서열 및 조절 서열은 코딩 서열의 발현 또는 전사를 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 두기 위한 방식으로 공유 연결될 때 "작동가능하게" 연결된 것으로 언급된다. 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역되는 것이 요구될 경우, 2개의 DNA 서열은 5' 조절 서열 내의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 유발하고 2개의 DNA 서열 사이의 연결 특성이 (1) 프레임 쉬프트 (frame-shift) 돌연변이의 도입 유발, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력 저해, 또는 (3) 상응하는 RNA 전사체의 단백질로 번역되는 능력의 저해를 야기하지 않을 경우 작동가능하게 연결된 것으로 언급된다. 따라서, 프로모터 영역은 생성되는 전사체가 요구되는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사를 실행할 수 있다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.

청구된 발명의 임의의 효소를 코딩하는 핵산 분자가 세포에서 발현될 때, 다양한 전사 제어 서열 (예를 들어, 프로모터/인핸서 서열)이 그의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 프로모터는 천연 프로모터, 즉, 유전자 발현의 정상적인 조절을 제공하는 그의 내인성 배경 내의 유전자의 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적일 수 있는데, 즉, 프로모터는 비조절되어, 그의 회합된 유전자의 연속적인 전사를 허용한다. 다양한 조건부 프로모터, 예컨대 분자의 존재 또는 부재에의 제어되는 프로모터도 사용될 수 있다.

유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종 또는 세포 종류에 따라 상이할 수 있지만, 일반적으로 필요한 경우, 각각 전사 및 번역의 개시에 수반되는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캐핑 (capping) 서열, CAAT 서열 등을 포함할 것이다. 특히, 상기 5' 비-전사 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 또한, 조절 서열은 필요한 경우 인핸서 서열 또는 상류 활성화제 서열도 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 임의로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및 설계는 당업자의 능력 및 판단 내에 있다.

발현에 필요한 모든 요소를 함유하는 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하고 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 세포는 세포 내로 이종성 DNA (RNA)를 도입함으로써 유전적으로 조작된다. 이종성 DNA (RNA)는 숙주 세포에서 이종성 DNA의 발현을 허용하는 전사 요소의 작동가능한 제어 하에 배치된다. 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 생산을 위한 본 발명과 연관된 유전자의 이종성 발현은 이. 콜라이를 사용하여 실시예 섹션에서 예시된다. 또한, 테르페노이드 생산을 위한 신규한 방법도 다른 박테리아 세포, 진균 (효모 세포 포함), 식물 세포 등에서 발현될 수 있다.

본 발명과 연관된 효소를 코딩하는 핵산 분자는 당업계의 표준 방법 및 기법을 사용하여 세포 또는 세포들 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 프로토콜, 예컨대 형질전환, 예를 들어 화학적 형질전환 및 전기천공, 형질도입, 입자 폭격 (particle bombardment) 등에 의해 도입될 수 있다. 청구된 발명의 효소를 코딩하는 핵산 분자의 발현은 핵산 분자를 게놈 내로 통합시킴으로써 달성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 하나 이상의 유전자는 박테리아 세포에서 재조합 방식으로 발현된다. 본 발명에 따른 박테리아 세포는 임의의 종류 (풍부 또는 최소)의 배지 및 임의의 조성물에서 배양될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 통상적인 최적화는 다양한 종류의 배지의 사용을 가능하게 한다. 선택된 배지는 다양한 추가의 성분으로 보충될 수 있다. 보충 성분의 일부의 비제한적인 예는 글루코스, 항생제, 유전자 유도를 위한 IPTG, ATCC 미량 미네랄 보충물 (Trace Mineral Supplement), 및 글리콜레이트를 포함한다. 유사하게, 본 발명의 세포의 배지, 및 성장 조건의 다른 측면은 통상적인 실험을 통해 최적화될 수 있다. 예를 들어, pH 및 온도는 최적화될 수 있는 인자의 비제한적인 예이다. 일부 실시양태에서, 배지의 선택, 배지 보충물, 및 온도와 같은 인자가 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 생산 수준에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충 성분의 농도 및 양이 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지를 하나 이상의 보충 성분으로 보충하는 빈도, 및 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔의 수거 전에 배지가 배양되는 시간이 최적화된다.

본 발명의 측면에 따르면, 고역가의 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔은 세포에서 본 발명과 연관된 유전자의 재조합 발현을 통해 생산된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "고역가"는 밀리그램/리터 (mg L^-1) 규모의 역가를 의미한다. 제시된 생성물에 대해 생성되는 역가는 배지의 선택을 비롯한 여러 인자에 의해 영향받을 것이다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 역가는 적어도 1 mg L^-1이다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 역가는 적어도 10 mg L^-1이다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 역가는 적어도 250 mg L^-1이다. 예를 들어, 총 탁사디엔 역가는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900 mg L^-1 또는 900 mg L^-1 초과일 수 있고, 임의의 중간값을 포함한다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 역가는 적어도 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 g L^-1 또는 5.0 g L^-1 초과일 수 있고, 임의의 중간값을 포함한다.

일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 5α-올 역가는 적어도 1 mg L^-1이다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 5α-올 역가는 적어도 10 mg L^-1이다. 일부 실시양태에서, 총 탁사디엔 5α-올 역가는 적어도 50 mg L^-1이다. 예를 들어, 총 탁사디엔 5α-올 역가는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 mg L^-1 또는 70 mg L^-1 초과일 수 있고, 임의의 중간값을 포함한다.

본 발명과 연관된 세포를 성장시키기 위해 사용되는 액체 배양액은 당업계에 공지되고 사용되는 임의의 배양 용기에 수용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폭기 반응 용기, 예컨대 교반 탱크 반응기에서의 대규모 생산은 세포 배양액으로부터 회수될 수 있는 다량의 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 테르페노이드는 예를 들어 유기 층, 예컨대 도데칸을 세포 배양액에 첨가하고 테르페노이드를 유기 층으로부터 회수함으로써 세포 배양액의 기체 상으로부터 회수된다.

본원에서 기재되는 방법을 통해 생산된 테르페노이드, 예컨대 탁사디엔은 제약물질, 예컨대 파클리탁셀 (탁솔), 아르테미시닌, 깅콜리드, 엘류테로빈 및 슈돕테로신, 및 많은 다른 잠재적인 제약 화합물을 비롯하여 광범한 적용례를 갖는다. 추가의 적용례는 향신료 및 화장품에 사용되는 화합물, 예컨대 게라니올, 파르네솔, 게라닐게라니올, 리날로올, 리모넨, 페넨, 시네올 및 이소프렌을 포함한다. 추가의 적용례는 바이오연료로서 사용하기 위한 화합물, 예컨대 5, 10, 및 15개 탄소 원자 길이의 알콜을 포함한다. 상기 화합물은 현재 다양한 식물의 추출물로서 생산됨을 주목한다. 식물 추출물-기반 방법은 지루하고, 소량을 생산하고, 그에 의해 얻어질 수 있는 실제 분자에 대해 제한되고, 즉, 이 방법은 원래의 화합물보다 훨씬 우수한 특성을 보유할 수 있는 유도체의 용이한 생산을 허용하지 않는다.

실시예

방법

균주, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드 및 유전자

이. 콜라이 K12 MG1655 균주를 모든 탁사디엔 균주 구축의 숙주 균주로서 사용하였다. 이. 콜라이 K12MG1655Δ(recA,endA) 및 이. 콜라이 K12MG1655Δ(recA,endA)ED3 균주는 MIT (미국 매사추세츠주 캠브리지)의 크리스탈라 프라더 (Kristala Prather) 교수의 실험실에서 제공받았다. 연구를 위해 구축된 모든 플라스미드의 상세한 내용은 표 2에 제시된다. 본 연구에서 사용한 모든 올리고뉴클레오티드를 표 3에 제시한다.

게라닐게라닐 피로포스페이트 신타제 (GGPPS)⁵⁰, 탁사디엔 신타제 (TS)⁵¹, 시토크롬 P450 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5 α OH) 및 탁수스 NADPH:시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)⁴⁶의 서열은 탁수스 카나덴시스, 탁수스 브레비폴리아, 탁수스 쿠스피데이트 (진뱅크 기탁 코드: AF081514, U48796, AY289209 및 AY571340)로부터 얻었다. 유전자는 이. 콜라이 번역 코돈을 도입하고 클로닝을 위한 제한 부위의 제거를 위해 문헌 [Kodumal et al.⁵² (Supplementary details Appendix 1)]에 보고된 플라스미드 및 프로토콜를 사용하여 맞춤 합성하였다. GGPPS 및 TS (색소체 수송 펩티드)의 98개 및 60개 N-말단 아미노산에 상응하는 뉴클레오티드를 제거하고, 번역 삽입 서열 Met를 삽입하였다¹⁷.

MEP 경로 ( dxs - idi - idpDF 오페론 )의 구축.

dxs-idi-ispDF 오페론은 T7 프로모터가 있는 pET21C+ 플라스미드 (p20T7MEP) 하에 프라이머 dxs(s), dxs(a), idi(s), idi(a), ispDF(s) 및 ispDFI(a)를 사용하여 이. 콜라이 K12 MG1655의 게놈으로부터 각각의 유전자를 클로닝함으로써 초기에 구축하였다^{5 3}. 프라이머 dxsidiispDFNcoI (s) 및 dxsidiispDFKpnI(a)를 사용하여, dxs-idi-ispDF 오페론을 NcoI 및 KpnI로 소화된 pTrcHis2B (인비트로젠 (Invitrogen)) 플라스미드 내로 서브클로닝하여 pTrcMEP 플라스미드 (p20TrcMEP)를 생성하였다. p20TrcMEP 플라스미드를 MluI 및 PmeI로 소화시키고, MluI 및 PmeI로 소화된 pACYC184-melA(P2A) 플라스미드 내로 클로닝하여 p10TrcMEP 플라스미드를 구축하였다. pTrcMEP 플라스미드를 BstZ17I 및 ScaI로 소화시키고, PvuII 소화된 pCL1920 플라스미드 내로 클로닝하여 p5TrcMEP 플라스미드를 구축하였다. p20T5MEP 플라스미드를 구축하기 위해, 초기에 dxs-idi-ispDF 오페론을 프라이머 dxsidiispDFNcoI(s) 및 dxsidiispDFXhoI(a)를 사용하여 T5 프로모터가 있는 pQE 플라스미드 (pQE-MEP) 내로 클로닝하였다. T5 프로모터가 있는 오페론 DNA의 분획을 pQEMEP 플라스미드로부터의 프라이머 T5AgeI(s) 및 T5NheI(a)를 사용하여 증폭하였다. DNA 단편을 AgeI/NheI로 소화시키고, SGrAI/NheI 효소로 소화된 p20T7MEP 플라스미드 내로 클로닝하였다.

탁사디엔 경로 ( GT 및 TG 오페론 )의 구축.

하류 탁사디엔 경로 (GT 및 TG 오페론)는 프라이머 GGPPSNcoI(s), GGPPSEcoRI(a), TSEcoRI(s), TSsalI(a), TSNcoI(s), TSEcoRI(a), GGPPSEcoRI(s) 및 GGPPSSalI(a)를 사용하여 GGPS 및 TS의 PCR 단편을 pTrcHIS2B 플라스미드의 NocI - EcoRI 및 EcoRI - SalI 부위 내로 클로닝하여 p20TrcGT 및 p20TrcTG를 생성함으로써 구축하였다. p20T5GT를 구축하기 위해, 초기에 오페론을 프라이머 GGPPSNcoI(s) 및 TSXhoI(a)로 증폭하고, NcoI/XhoI로 소화된 T5 프로모터 하의 pQE 플라스미드 내로 클로닝하였다. 추가의 서열을 XbaI 및 XhoI로 소화시키고, 프라이머 pTrcSal(s) 및 pTrcXba(a)를 사용하여 증폭된 pTrc 플라스미드 백본 내로 클로닝하였다. p10T7TG는 p20TrcTG로부터 NcoI/SalI 소화된 TG 오페론을 NcoI/SalI 소화된 pACYC-DUET1 플라스미드 내로 서블클로닝함으로써 구축하였다. p5T7TG는 BspEI/XbaI 소화된 단편을 pCLBspEI(s) 및 pCLXbaI(a) 프라이머를 사용하여 pCL1920 플라스미드로부터 증폭된 XbaI/BspEI 소화된 DNA 내로 클로닝함으로써 구축하였다.

염색체 통합 MEP 경로 플라스미드의 구축

통합용 서열을 증폭하기 위한 FRP-Km-FRP 카세트를 갖는 플라스미드를 구축하기 위해, p20T7MEP 및 p20T5MEP를 XhoI/ScaI로 소화시켰다. FRP-Km-FRP 카세트를 프라이머 KmFRPXhoI(s) 및 KmFRPScaI(a)를 사용하여 pkD13 플라스미드로부터의 FRP 서열을 갖는 Km 카세트로부터 증폭하였다. 증폭된 DNA를 XhoI/ScaI로 소화시키고, XhoI/ScaI 소화된 p20T7MEP 및 p20T5MEP 플라스미드 (p20T7MEPKmFRP 및 p20T5MEPKmFRP) 내로 클로닝하였다. 유사하게, p20TrcMEP 플라스미드를 SacI/ScaI로 소화시키고, 프라이머 KmFRPSacI(s) 및 KmFRPScaI(a)를 사용하여 증폭된 DNA를 소화시키고, p20TrcMEP 플라스미드 내로 클로닝하였다 (p20TrcMEPKm-FRP).

MEP 경로 카세트 ( LacIq - MEP - FRP - Km - FRP )의 염색체 통합

프로모터 T7, T5 및 Trc 하에 구축된 MEP 경로는 Kan 마커를 갖는 염색체 내의 ara 오페론 영역에 편재하였다. PCR 단편을 프라이머 IntT7T5(s), IntTrc(s) 및 Int(a)를 사용하여 p20T7MEPKmFRP, p20T5MEPKmFRP 및 p20TrcMEPKm-FRP로부터 증폭한 후, λ 레드(Red) 재조합 기법을 통한 염색체 통합을 위해 이. 콜라이 MG1655 recA-end- 및 이. 콜라이 MG1655 recA-end-EDE3 세포 내로 전기천공하였다⁵⁴. 부위 특이적 편재가 확인되었고, Km 마커는 성공적인 유전자 통합 후에 FLP 재조합효소의 작용을 통해 제거하였다.

탁사디엔 5α-올 경로의 구축

탁사디엔 5α-올 히드록실라제 (T5αOH) 및 탁수스 시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)의 막횡단 영역 (TM)은 프리딕트프로테인(PredictProtein) 소프트웨어 (www.predictprotein.org)를 사용하여 확인하였다⁵⁵. 막횡단 조작을 위해, 탁사디엔 5α-올 히드록실라제 (T5αOH)의 N-말단 막횡단 영역 상의 8, 24 및 42개 아미노산 잔기 및 TCPR 내의 74개 아미노산 영역에서 선택적인 말단절단을 수행하였다. 탁사디엔 5α-올 히드록실라제 (T5αOH)의 8, 24 및 42개 잔기 N-말단 아미노산의 제거, 1개의 아미노산 치환된 소 17α 히드록실라제 N-말단 8개 잔기 펩티드 MALLLAVF (서열 51)의 N-말단 말단절단된 T5αOH 서열⁴⁴ 및 GSTGS 펩티드 링커로의 통합은 프라이머 CYP17At8AANdeI(s), CYP17At24AANdeI(s), CYP17At42AANdeI(s) 및 CYPLinkBamHI(a)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머를 사용하여 각각의 변형된 DNA를 증폭하고, NdeI/BamHI로 소화시키고, NdeI/BamHI 소화된 pACYC DUET1 플라스미드 내로 클로닝하여 p10At8T5αOH, p10At24T5αOH 및 p10At42T5αOH 플라스미드를 구축하였다. 74개 아미노산 말단절단된 TCPR (tTCPR) 서열을 프라이머 CPRBamHI(s) 및 CPRSalI(a)를 사용하여 증폭하였다. 증폭된 tTCPR 서열 및 플라스미드 p10At8T5αOH, p10At24T5αOH 및 p10At42T5αOH를 BamHI/SalI으로 소화시키고, 클로닝하여 플라스미드 p10At8T5αOH-tTCPR, p10At24T5αOH-tTCPR 및 p10At42T5αOH-tTCPR을 구축하였다.

탁사디엔을 스크리닝하기 위한 배양 성장 및 탁사디엔 -5α-올 분석

상류 (MEP), 하류 탁사디엔 경로 및 탁사디엔 5α-올이 존재하는 적절한 플라스미드를 보유하는 예비-조작된 이. 콜라이 균주의 단일 형질전환체를 루리아-베르타니 (Luria-Bertani (LB)) 배지 (적절한 항생제, 100 mg/mL 카르베니실린, 34 mg/mL 클로람페니콜, 25 mg/L 카나마이신 또는 50 mg/L 스펙티노마이신으로 보충됨)에서 30℃에서 18h 동안 배양하였다. 조작된 균주를 스크리닝하기 위한 소규모 배양을 위해, 상기 예비접종액을 사용하여 0.1의 출발 A₆₀₀에서 신선한 2-mL 풍부 배지 (5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 트립톤, 15 g/L 글루코스, 10 g/L NaCl, 100 mM HEPS, 3 mL/L 소포제 (Antifoam) B, pH 7.6, 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 34 ㎍/mL 클로람페니콜)를 시딩하였다. 배양액을 5일 동안 22℃에서 적절한 항생제 및 유전자 유도를 위한 100 mM IPTG와 함께 유지하였다.

탁사디엔 5α-올 생산 균주에 대한 생물반응기 실험.

3-L 바이오플로(Bioflo) 생물반응기 (뉴 브런스윅 (New Brunswick))를 제조사의 지시에 따라 조립하였다. 1% 글리세롤 (v/v)이 존재하는 1리터의 풍부 배지에 동일한 농도의 항생제 (100 mg/mL 카르베니실린, 34 mg/mL 클로람페니콜)를 함유하는 LB 배지에서 성장한 균주 26-At24T5αOH-tTCPR의 50 mL의 8h 배양액 (약 2.2의 A₆₀₀)을 접종하였다. 20% v/v 도데칸을 사용한 2상 액체-액체 발효가 실시되는 1 L-생물반응기. 산소를 0.5 v/v/m으로 여과된 공기로서 공급하고, 50% 초과의 용존산소 수준을 유지하기 위해 교반을 조정하였다. 배양액의 pH는 10% NaOH를 사용하여 7.0으로 제어하였다. 발효기 내의 배양액의 온도는 세포가 600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도 (OD600)가 약 0.8이 되도록 성장할 때까지 30℃에서 제어되었다. 발효기의 온도를 22℃로 감소시키고, 세포를 0.1 mM IPTG로 유도하였다. 도데칸을 무균 상태로 배지 부피의 20% (v/v)로 첨가하였다. 발효 과정 동안, 글리세롤의 농도 및 아세테이트 축적을 일정한 시간 간격으로 모니터링하였다. 발효 동안, 글리세롤 농도가 0.5 g/L 미만으로 고갈됨에 따라, 글리세롤 (3 g/L)을 생물반응기 내로 도입하였다.

0.5% 효모 추출물 및 20% (v/v) 도데칸을 함유하는 한정 공급 배지 (13.3 g/L KH₂PO₄, 4 g/L (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/L 시트르산, 0.0084 g/L EDTA, 0.0025 g/L CoCl₂, 0.015 g/L MnCl₂, 0.0015 g/L CuCl₂, 0.003 g/L H₃BO₃, 0.0025 g/L Na₂MoO₄, 0.008 g/L Zn(CH₃COO)₂, 0.06 g/L Fe(III) 시트레이트, 0.0045 g/L 티아민, 1.3 g/L MgSO₄, 10 g/L 글리세롤, 5 g/L 효모 추출물, pH 7.0)를 사용한 유가식 배양을 사용하여 발효를 추가로 최적화하였다. 동일한 배지 조성물을 적절한 항생제 (균주 17: 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 50 ㎍/mL 스펙티노마이신; 균주 26: 50 ㎍/mL 스펙티노마이신)와 함께 균주 17 및 26의 발효를 위해 사용하였다.

탁사디엔-5α-올 생산 균주에 대해, 1% 글리세롤 (v/v)이 존재하는 1리터의 복합 배지에 50 ㎍/mL 스펙티노마이신 및 34 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에서 성장한 균주 26-At24T5αOH-tTCPR의 50 mL의 8h 배양액 (약 2.2의 OD)을 접종하였다. 산소를 0.5 (vvm)으로 여과된 공기로서 공급하고, 30% 초과의 용존산소 수준을 유지하기 위해 교반을 조정하였다. 배양액의 pH는 10% NaOH를 사용하여 7.0으로 제어하였다. 발효기 내의 배양액의 온도는 세포가 600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도 (OD600)가 약 0.8이 되도록 성장할 때까지 30℃에서 제어된다. 발효기의 온도를 22℃로 감소시키고, 경로를 0.1 mM IPTG로 유도하였다. 도데칸을 무균 상태로 배지 부피의 20% (v/v)로 첨가하였다. 발효 과정 동안, 글리세롤의 농도 및 아세테이트 축적을 일정한 시간 간격으로 모니터링하였다. 발효 동안, 글리세롤 농도가 0.5-1 g/L로 고갈됨에 따라, 3 g/L의 글리세롤을 생물반응기 내로 도입하였다.

탁사디엔 및 탁사디엔 -5α-올의 GC - MS 분석

소규모 배양으로부터 탁사디엔 축적의 분석을 위해, 1.5 mL의 배양액을 30 min 동안 1 mL 헥산과 함께 볼텍싱하였다. 혼합물을 원심분리하여 유기 층을 분리하였다. 생물반응기에 대해, 1 ㎕의 도데칸 층을 헥산을 사용하여 200 ㎕로 희석하였다. 1 ㎕의 헥산 층을 GC-MS (배리안(Varian) 2000 MS에 연결된 배리안 새턴(Varian saturn) 3800 GC)로 분석하였다. 샘플을 HP5ms 칼럼 (30 m x 250 uM x 0.25 uM 두께) (애질런트 테크놀로지스 유에스에이 (Agilent Technologies USA)) 내로 주입하였다. 헬륨 (초순도)을 1.0 ml/min의 유속으로 담체 기체로서 사용하였다. 오븐 온도는 먼저 50℃에서 1 min 동안 유지한 후, 10℃/min의 증분으로 220℃로 증가시키고, 마지막으로 이 온도에서 10 min 동안 유지하였다. 주입기 및 수송관 온도는 각각 200℃ 및 250℃로 설정하였다.

탁사디엔 및 탁사디엔 5α-올에 대한 생물학적 또는 합성 공급원으로부터의 표준 화합물은 상업적으로 이용가능하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 순수한 물질을 추출하기 위해 2 L 생물반응기 내에서 탁사디엔 생산 이. 콜라이의 발효를 수행하였다. 탁사디엔은 헥산을 이용하는 용매 추출에 의해 추출한 후, GC-MS 분석을 위한 표준 곡선을 작성하기 위한 순수한 물질을 얻기 위해 다수 회차의 실리카 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 본 발명자들은 화합물의 신뢰성을 확인하기 위해 순수한 탁사디엔의 GC 및 MS 프로파일을 보고된 문헌과 비교하였다⁶⁰. 순도를 검사하기 위해, 본 발명자들은 탁사디엔의 1HNMR을 수행하였다. 탁사디엔-5α-올의 축적은 매우 낮기 때문에, 본 발명자들은 상기 분자의 생산 및 이전 보고서로부터의 신뢰가능한 질량 스펙트럼 단편화 특성을 정량하기 위한 척도로서 탁사디엔을 사용하였다⁴².

조작된 균주의 전사 분석을 위한 qPCR 측정

적절한 균주로부터 단리된 mRNA에 대한 qPCR에 의해 각각의 유전자의 전사 유전자 발현 수준을 검출하였다. 분해를 방지하기 위해, RNA프로텍트(RNAprotect) 박테리아 시약 (퀴아젠 (Qiagen))을 사용하여 세포 용해 전에 RNA를 안정화시켰다. 후속적으로, 총 RNA를 게놈 DNA 오염물의 뉴클레아제에 의한 제거와 조합하여 알엔이지(RNeasy) 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. cDNA를 아이스크립트(iScript) cDNA 합성 키트 (바이오라드 (Biorad))를 사용하여 증폭하였다. qPCR은 iQ SYBR 그린 수퍼믹스 (Green Supermix) (바이오라드)를 사용하여 바이오-라드 아이사이클러(Bio-Rad iCycler)에서 수행하였다. 가변적인 발현에 적용되지 않은 rrsA 유전자의 발현 수준을 qPCR 값의 정규화를 위해 사용하였다⁵⁶. 표 3은 qPCR을 위해 사용된 프라이머를 보여준다. 각각의 프라이머 쌍에 대해, 주형으로서 이. 콜라이의 mRNA를 사용하여 표준 곡선을 작성하였다.

실시예 1: 탁사디엔 축적은 상류 MEP 및 하류 합성 탁사디엔 경로의 상대적인 강도에 대한 강한 비-선형 의존성을 보인다.

도 1b는 탁사디엔 합성의 상류 및 하류 경로를 통한 상대적인 플럭스 (또는 강도)를 조정하기 위해 프로모터 및 유전자 카피수를 조합하는 다양한 방법을 보여준다. 총 16개의 균주를 MEP 경로의 병목현상을 해소하고, 이 경로를 하류 탁사디엔 경로와 최적으로 균형을 맞추기 위해 구축하였다. 도 2a,b는 각각의 상기 균주에서 탁사디엔 축적의 결과를 요약한 것으로, 도 2a는 하류 경로의 일정한 값에 대해 탁사디엔 축적의 상류 경로에 대한 의존성을 강조하고, 도 2b는 일정한 상류 경로 강도에 대해 하류 경로에 대한 의존성을 강조한다 (또한, 보고된 프로모터 강도 및 플라스미드 카피수로부터 상류 및 하류 경로 발현의 계산에 대해서는 표 1을 참조한다^{33 -36}). 분명하게, 상류 및 하류 경로 발현 모두에 대해 보이는 최대치가 존재한다. 일정한 하류 경로 발현에 대해 (도 2a), 상류 경로 발현이 매우 낮은 수준으로부터 증가함에 따라, 탁사디엔 생산은 초기에 전체 경로에 대한 전구체의 공급 증가 때문에 증가한다. 그러나, 중간값 이후에, 추가의 상류 경로 증가는 하류 경로의 용량에 의해 수용될 수 없다. 상기 경로 불균형은 세포에 대해 억제성이거나 또는 단순히 궁극적으로 탁사디엔 축적 감소를 야기하는 경쟁 경로로의 플럭스 전환을 나타낼 수 있는 중간체의 축적 (하기 참조)을 유발한다.

일정한 상류 경로 발현에 대해 (도 2b), 최대치는 하류 경로 발현 수준에 대해 유사하게 관찰된다. 이것은 하류 경로의 낮은 발현 수준에 의한 탁사디엔 생산의 초기 제한, 즉 탁사디엔 생산에 대한 속도 제한에 기인한다. 높은 수준의 하류 경로 발현에서, 본 발명자들은 세포 생리학에 대한 고카피수의 부정적인 효과를 볼 가능성이 있고, 따라서 최대치가 하류 경로 발현에 대해 존재한다. 이들 결과는 탁사디엔 축적의 극적인 변화를 상류 및 하류 경로에 대한 발현 수준의 좁은 범위 내의 변화로부터 얻을 수 있음을 입증한다. 예를 들어, Trc 프로모터 제어 하에 그의 염색체에 상류 경로의 추가의 카피를 함유하는 균주 (균주 8, 도 2a)는 합성 하류 경로만을 과다발현하는 것 (균주 1, 도 2a)보다 2000배 더 많은 탁사디엔을 생산하였다. 또한, 하류 합성 오페론 내의 유전자의 순서를 GT (GPPS-TS)로부터 TG (TS-GPPS)로 변경하면, 생산이 2-3배 증가하였다 (균주 5, 8, 11 및 14에 비해 균주 1-4). 관찰된 결과는 탁사디엔 과다생산의 핵심이 충분한 하류 경로 용량 및 상류 전구체 경로와 하류 합성 탁사디엔 경로 사이의 주의 깊은 균형화임을 보여준다. 전체적으로, 조작된 균주는 내인성 상류 및 합성 하류 경로에 대한 광범위한 발현 수준이 동시에 검색되면 MEP 경로 플럭스가 상당할 수 있음을 확립하였다.

실시예 2: 상류 및 하류 경로의 염색체 통합 및 미세 조정은 탁사디엔 생산을 추가로 향상시킨다.

플라스미드에 의한 대사 부하를 최소화하면서 충분한 하류 경로 강도를 제공하기 위해서³⁷, 5 및 10개의 상대적으로 낮은 카피수를 각각 유지하면서 하류 경로가 강력한 프로모터 (T7)의 제어 하에 위치하는 4개 균주의 2개의 새로운 세트를 각각 조작하였다 (균주 25-28 및 29-32). 탁사디엔 최대치를 높은 하류 강도에서 유지하면서 (균주 21-24), 단조 (monotonic) 반응이 낮은 하류 경로 강도 (균주 17-20, 도 2c)에서 얻어짐을 볼 수 있다 (도 2c). 이러한 관찰 때문에, 각각 이전과 동일한 수준의 하류 경로 강도를 유지하지만 매우 낮은 수준의 상류 경로를 발현하는 4개 균주의 2개의 추가의 세트 (균주 25-28 및 29-32, 도 2d)를 구축하였다. 추가로, 후자의 균주 세트의 상류 경로의 오페론을 염색체에 통합하였다. 매우 낮은 상류 경로 수준에도 불구하고 탁사디엔 최대치가 회복될 뿐만 아니라, 훨씬 더 많은 탁사디엔 최대치 (300 mg/L)가 얻어짐을 알 수 있다. 본 발명자들은 상기 유의한 증가가 세포의 대사 부하의 감소에 기인할 수 있다고 생각한다. 이것은 1) 염색체 내로의 경로 통합을 통한 플라스미드 의존성의 제거 및 2) 상류 및 하류 경로 발현 사이의 양호한 균형 획득에 의해 달성되었다.

32개의 재조합 구축물을 통해 본 발명자들은 모듈 경로 발현 공간을 적절하게 조사하고 탁사디엔 생산을 약 15000배 개선할 수 있었다. 이것은 보고된 이. 콜라이 MEP 이소프레노이드 경로로부터의 단연 가장 높은 테르페노이드 생산이다 (도 3a). 추가로, 테르페노이드 생산의 관찰된 개선 배수는 이소프레노이드 경로의 십억개의 조합 변형을 포함하는 광범한 유전자 공간을 검색하는 보고된 조합 대사공학 방법의 것보다 유의하게 더 높다³⁰. 이것은 경로 최적화가 다중 공급원의 조합 유전자 최적화보다 경로 모듈 발현의 양호한 균형화에 훨씬 더 의존함을 제시한다. 도 1의 표현형 상황에서 보인 다중 최대치는 최적 전체 경로 성능 영역을 확인하기 위해 충분한 분석으로 발현 공간을 조사하는 것의 중요성을 강조한다. 도 7은 모듈 경로 발현 검색으로부터 탁사디엔 생산의 개선 배수를 보여준다.

실시예 3: 대사산물은 탁사디엔 생산 및 대사산물의 확인과 역비례 관계를 보인다.

이전에 조작된 균주에 대한 대사 분석은 경로 발현 수준 및 탁사디엔 생산과 강한 상관성을 갖는, 지금까지는 미지인 대사산물 부산물을 확인해 주었다 (도 3 및 도 8). 대사산물의 화학적 종류는 미지의 상태이지만, 본 발명자들은 이를 경로 전환에 의해 생성된 이소프레노이드 부산물이고 조작된 균주로부터 탁사디엔 생산에 대한 직접 변수로서 반상관관계를 보인다고 가정하였다 (도 3 및 도 8). 본 발명자들의 최적 균주의 핵심적인 특징은 상기 대사산물의 축적을 완화하여 보다 많은 탁사디엔 생산을 유발하는 양호한 균형화이다. 상기 균형화는 유의하게 상이한 탁사디엔 축적을 보이면서 염색체, 또는 상이한 프로모터를 사용하는 상이한 카피수의 플라스미드로부터 상이한 수준에서 조정될 수 있다.

후속적으로, 기체 크로마토그래피-질량 분광분석 (GC-MS) 크로마토그램에서의 상응하는 피크는 GC-MS, ¹H 및 ¹³C 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 연구에서 인돌로 확인되었다 (도 16). 본 발명자들은 균주 26에 의한 탁사디엔 합성이 약 100 mg/L보다 높은 인돌 수준에서 외인성 인돌에 의해 크게 억제됨을 밝혀내었다 (도 15b). 또한, 인돌 농도를 추가로 증가시키면 세포 성장이 억제되었고, 억제 수준은 매우 균주 의존적이었다 (도 15c). 이소프레노이드 경로와 인돌 상호작용에 대한 생화학적 메카니즘은 현재 불분명하지만, 도 15의 결과는 세포 성장을 억제할 때 인돌 및 이소프레노이드 경로의 테르페노이드 화합물 사이의 가능한 상승 효과를 제시한다. 구체적인 메카니즘을 알지 못하지만, 균주 26은 인돌의 효과를 완화시키는 것으로 보이고, 본 발명자들은 추가의 연구를 추진하였다.

실시예 4: 조작된 균주의 배양.

조작된 균주에 대해 제어된 조건 하에서 탁사디엔 생산 잠재력을 조사하기 위해서, 3개의 가장 높은 탁사디엔 축적 균주 (균주 22로부터의 약 60 mg/L; 균주 17로부터의 약 125 mg/L; 균주 26로부터의 약 300 mg/L)의 유가식 배양을 1 L-생물반응기에서 수행하였다 (도 17). 유가식 배양 연구는 20% (v/v) 도데칸 오버레이 (overlay)를 사용하여 액체-액체 2-상 발효로서 수행되었다. 예비 발견에서 표시되는 바와 같이 발효 배지로부터 분비된 탁사디엔의 공기 탈기 (air stripping)를 방지하기 위해 유기 용매를 도입하였다. 글리세롤 공급을 제어하는 한정 배지에서, 탁사디엔 생산성은 균주 22, 17 및 26에 대해 각각 174 ± 5 mg/L (SD), 210 ± 7 mg/L (SD), 및 1020 ± 80 mg/L (SD)로 증가하였다 (도 17a). 추가로, 탁사디엔 생산은 성장 표현형, 아세테이트 축적 및 글리세롤 소비에 유의한 영향을 주었다 (도 17b-17d).

도 17c는 초기에는 아세테이트가 모든 균주에서 축적되지만, 약 60 hrs 후에는 아세테이트가 균주 17 및 26에서 감소하는 반면에, 균주 22에서는 계속 증가함을 보여준다. 상기 현상은 높은 MEP 플럭스 균주 (26 및 17)와 낮은 MEP 플럭스 균주 (22) 사이의 중심 탄소 대사의 차이를 강조한다. 추가로, 상기 관찰은 잘 균형잡힌 기능성 균주를 특성화하는 양호한 생리학의 또 다른 예이다. 과다 대사의 생성물로서의 아세트산은 상기 발효에 사용되는 높은 초기 글리세롤 농도 및 상응하는 높은 글리세롤 경로 플럭스 때문에 모든 균주에 의해 초기에 생산된다. 상기 플럭스는 세포에서 MEP 경로, 및 다른 대사 경로를 공급하기에 충분하다.

약 48 hrs에, 초기 글리세롤이 고갈되고, 배양은 유가식으로 전환되고, 이 동안 낮지만 일정한 글리세롤 수준이 유지된다. 이것은 높은 MEP 플럭스를 갖는 균주 (균주 26 및 17)에 대해 과다 대사를 최소화하면서 대부분 MEP 경로로 방향이 전환되는 낮은 총 글리세롤 플럭스를 야기한다. 그 결과, 아세트산 생산은 감소되거나 심지어 전히 제거된다. 아세트산 농도의 감소에 대해, 아세트산 동화가 어느 정도 발생했을 수 있지만, 이것은 플럭스 분석 관점으로부터 추가로 조사되지 않았다. 글리세롤 공급에 의한 일부 증발 및 희석이 관찰된 아세트산 농도 감소에 추가로 기여한다. 이와 대조적으로, 낮은 MEP 플럭스를 갖는 균주 (균주 22)에 대해, MEP 경로로의 플럭스 전환은 매우 유의하지 않기 때문에, 글리세롤 플럭스는 모든 필요한 탄소 및 에너지 필요량을 계속 공급하게 된다. 과다 대사는 계속 발생하여 아세테이트 분비를 야기한다.

분명하게, 균주 26의 높은 생산성 및 보다 강력한 성장은 매우 높은 탁사디엔 축적을 허용하였다. 추가의 개선은 생물반응기 내의 상태 최적화, 성장 배지 내의 영양물질의 균형화, 및 탄소 전달의 최적화를 통해 가능할 것이다.

실시예 5: 상류 및 하류 경로 발현 수준 및 세포 성장은 근본적인 복잡성을 보여준다.

경로 발현의 조작된 균형에 대한 보다 상세한 이해를 위해, 본 발명자들은 도 2c 및 d로부터의 최고의 탁사디엔 생산 균주 및 이웃하는 균주 (균주 17, 22 및 25-32)에 대해 dxs (상류 경로) 및 TS (하류 경로)의 전사 유전자 발현 수준을 정량하였다 (도 4a,b). 본 발명자들이 가정한 바와 같이, 상류 경로의 발현은 DXS 발현에서 관찰된 바와 같이 천연 프로모터, Trc, T5, T7, 및 10 카피 및 20 카피 플라스미드로부터의 MEP 벡터에 대한 프로모터 강도 및 카피수를 사용하여 단조 증가하였다 (도 4a). 따라서, 본 발명자들은 dxs 발현 수준이 상류 경로 강도와 큰 상관성이 있음을 밝혀내었다. 유사한 연관성이 상류 경로의 다른 유전자 idi, ispD 및 ispF에 대해 밝혀졌다 (도 14a, b). 하류 유전자 발현에서, 5 내지 10 카피 플라스미드 (25-28 시리즈 및 29-32 시리즈)로부터의 경로를 전달한 후에 약 2배 개선이 정량되었다 (도 4b).

프로모터 및 카피수 효과가 유전자 발현에 영향을 주지만, 다른 경로의 발현에 대한 2차 효과도 또한 현저하였다. 도 4a는 동일한 dxs 발현 카세트에 대해 TS 플라스미드의 카피수를 5로부터 10으로 증가시킴으로써 dxs 발현이 증가되었음을 보여준다. 흥미롭게도, 5 카피 TS 플라스미드 (균주 25-28 시리즈)가 10 카피 TS 플라스미드보다 실질적으로 더 높은 탁사디엔 수율 (도 2d) 및 더 작은 성장 (도 4c,d)을 나타내었다. 탁사디엔 이종성 경로를 함유하지 않은 대조군 플라스미드는 2배 더 높은 밀도로 성장하고, 이것은 균주 25-28 시리즈에서 성장 억제가 탁사디엔 대사 경로 및 탁사디엔 및 그의 직접적인 중간체의 축적에 직접 관련됨을 의미한다 (도 4c). 그러나, 균주 29-32 시리즈는 빈 (empty) 대조군 플라스미드를 상기 탁사디엔 발현 균주와 비교할 때 보통 정도로 증가된 성장율을 보였다 (도 4d). 성장, 탁사디엔 생산, 및 발현 수준 사이의 상기 상호작용은 플라스미드-기반 상류 발현 벡터에서 관찰될 수 있다 (균주 17 및 22). 성장 억제는 20 카피의 보다 낮은 탁사디엔 생산 균주 (균주 22)에 비해 10 카피의 높은 탁사디엔 생산 균주 (균주 17)에서 훨씬 더 컸다 (도 4d). 따라서, 생성물 독성 및 이종성 경로로의 탄소 전환은 플라스미드-유지보다 성장을 방해할 것으로 보인다.

또한, 하류 발현에 대한 상류 발현 벡터의 깊은 효과는 예상되지 않았다. 도 4b는 경로 사이에 혼선이 존재하지 않는다면 2개의 직선을 가질 것이다. 그러나, TS 발현의 약 3배 변화 배수가 상이한 MEP 발현 벡터에 대해 관찰되었다. 이것은 4개의 상류 및 2개의 하류 유전자 모두의 과다발현을 위해 숙주 대사로부터 빼낸 자원 (원료 물질 및 에너지)에 대한 유의한 경쟁에 의한 것으로 보인다³⁸. 대조군 균주 25c에 비해, 4배의 성장 억제가 균주 25에서 관찰되었고, 이것은 합성 탁사디엔 경로의 높은 과다발현이 천연 경로의 과다발현에 비해 성장 표현형을 변경하는 독성을 유발함을 나타내었다 (도 4c). 그러나, 상류 발현이 증가함에 따라, 하류 발현은 본 발명자들의 연구에서 상류 및 하류 경로를 균형잡히게 하여 성장 억제를 최소화하기 위해 바람직한 수준으로 감소되었다 (균주 26).

극도의 단백질 과다발현시에, T7 프로모터-유도 MEP 경로는 4개의 단백질의 높은 수준의 합성 때문에 극심한 성장 억제를 야기하였다 (균주 28 및 32). T7에 의한 TS 유전자의 발현은 그 자체로 급격한 효과를 갖는 것으로 보이지 않는다. T7 유도 발현에 의한 높은 비율의 단백질 합성 (도 4ab)은 초기 성장기로부터의 하우스키핑 유전자의 성분을 비롯한 단백질 합성 기구의 하향조절을 야기하여 세포 성장을 손상시키고 생물량의 증가를 저하시킬 수 있다^{39 ,40}. 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 관찰된 복잡한 성장 표현형은 (1) 이소프레노이드/탁사디엔 대사의 활성화에 의해 유도된 독성, 및 (2) 높은 재조합 단백질 발현의 효과의 누적 효과를 가정하였다. 전체적으로, 본 발명자들의 다변수-모듈 경로 조작 방법은 테르페노이드 대사의 예상치 않은 다양성 및 경로 발현 및 세포 생리에 대한 그의 연관성을 생성하였다. 2차 대사산물 생산을 위한 미생물의 합리적인 설계는 프로모터 강도 및 카피수의 선형/독립적인 이해를 넘어서는 경로 발현에 대한 이해를 필요로 할 것이다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같은 간단한 다변수 방법이 (1) 높은 생산체를 발견하고, (2) 대사 경로 조작에서 우세하지만 과소 평가된 고차 효과에 대한 체계적인 조사를 위한 상황을 제공하기 위해 필요한 다양성을 도입할 수 있다.

실시예 6: 이. 콜라이에서 탁솔 P450 계 산화 화학의 조작

탁솔의 생합성의 가장 중요한 특징은 시토크롬 P450-의존성 모노옥시게나제에 의해 매개되는 것으로 생각되는 반응인 탁산 코어 구조의 다중 위치에서의 산소화이다^{4 1}. 이 경로의 중요한 고리화 단계의 완료 후에, 모 올레핀인 탁사-4(5),11(12)-디엔은 이어서 시토크롬 P450 효소에 의해 C5 위치에서 히드록실화되고, 이는 탁솔로의 경로 상의 (탁산 코어에 대한) 8개의 산소화 단계 중의 1단계를 나타낸다 (도 6)⁴². 따라서, 탁솔-생산 미생물의 조작을 위한 핵심 단계는 생체내에서 P450계 산화 화학의 개발이다. 제1 산소화 단계는 디테르펜 전구체 탁사디엔 내의 이중 결합 이동과 함께 히드록실화 반응을 촉매하는 드문 모노옥시게나제인 시토크롬 P450, 탁사디엔 5α-히드록실라제에 의해 촉매된다 (도 5a). 본 발명자들은 탁사디엔으로부터 탁사디엔-5α-올로의 합성 경로의 성공적인 연장을 최초로 보고하고, 이. 콜라이에서 임의의 관능화된 탁솔 중간체의 생체내 생산의 최초의 예를 제시한다.

일반적으로, 식물 시토크롬 P450의 기능적 발현은 박테리아 플랫폼의 고유한 제한, 예컨대 전자 전달 기구, 시토크롬 P450 리덕타제의 부재, 및 소포체의 결여에 의한 P450 효소의 막 신호 모듈의 번역 부적합성에 의해 문제가 되고 있다⁴³. 최근에, 막횡단 (TM) 조작 및 P450 및 CPR 리덕타제의 키메라 효소의 생성을 통해, 일부 식물의 P450이 기능적 분자의 생합성을 위해 이. 콜라이에서 발현되었다^{22 ,44}. 또한, 모든 식물 시토크롬 p450은 그의 막횡단 신호 서열 및 그의 리덕타제 상응물로부터의 전자 전달 특성에서 특유하다⁴⁵. 본 발명자들의 초기 연구는 N-말단 막횡단 조작에 의한 코돈-최적화된 합성 탁사디엔 5α-히드록실라제 발현의 최적화 및 탁수스 종, 탁수스 시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)로부터의 CPR 레독스 파트너와의 번역 융합을 통한 키메라 효소의 생성에 초점을 맞추었다 (도 5b)^42,44,46. 생성된 키메라 효소 중의 하나인 At24T5αOH-tTCPR은 제1 산화 단계의 수행시에 매우 효율적이었는데, 탁사디엔의 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산 (OCT)로의 전환이 98% 초과였다 (도 9a).

다른 키메라 P450에 비해, At24T5αOH-tTCPR은 2배 더 높은 (21 mg/L) 탁사디엔-5α-올을 생성하였다. 또한, 보다 약한 활성의 At8T5αOH-tTCPR 및 At24T5αOH-tTCPR은 최근에 특성이 결정된 부산물인, 탁사디엔의 시클릭 에테르 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산 (OCT)으로의 복잡한 구조적 재배열체의 축적을 유도하였다 (도 9)⁴⁷. 부산물은 요구되는 생성물 탁사디엔-5α-올과 대략 동일한 양으로 축적되었다. OCT 형성은 산화 및 후속적인 고리화를 수반하는 전례 없는 탁수스 시토크롬 P450 반응 순서에 의해 매개되었다⁴⁷. 따라서, 탁사디엔 5α-히드록실라제의 단백질 조작에 의해, 고리화 전의 반응 종료는 상기 바람직하지 않은 부산물의 축적을 방지할 것이고, 플럭스의 탁사디엔-5α-올 쪽으로의 전환을 달성할 수 있을 것으로 보인다.

균주 26-At24T5αOH-tTCPR의 생산성은 모 균주 26 (약 300 mg/L)에 의한 탁사디엔 생산에 비해 유의하게 감소되었고, 이와 동시에 이전에 설명된 비특성화된 대사산물의 축적이 증가하였다. 탁사디엔 축적은 관찰되지 않았다. 명백하게, At24T5αOH-tTCPR 구축물을 보유하는 추가의 중간 카피수의 플라스미드 (10 카피, p10T7)의 도입은 균주 26의 상류 및 하류 경로의 조심스럽게 조작된 균형을 교란시켰다. 균주 26-At24T5αOH-tTCPR에 의한 알콜 생산을 정량하기 위해 생물반응기에서 소규모 발효를 수행하였다. 탁사디엔-5α-올 축적의 시간 경로 프로파일 (도 5d)은 58 ± 3 mg/L 이하의 알콜 생산 및 등량의 OCT 부산물의 생성을 나타낸다. 관찰된 알콜 생산은 에스. 세레비지애에서의 이전의 생산보다 약 2400배 더 높았다¹⁷. 경로 최적화 및 단백질 조작을 통해 탁사디엔-5α-올 생산의 추가의 증가가 가능할 것 같다.

경로 최적화의 다변수-모듈 접근법은 핵심 탁솔 전구체를 매우 다량 생산하는 균주를 생성하였다. 또한, 재조합 구축물은 동일한 경로로부터 조작된 다른 복잡한 제약 화합물, 예컨대 모노-, 세스퀴- 및 디-테르펜 (게라니올, 리날로올, 아모르파디엔 및 레보피마라디엔)의 합성 방향으로 플럭스를 돌릴 때 동등하게 효과적이었다 (미발표 결과). 따라서, 본 발명자들의 경로 조작은 특히 재생가능한 공급원으로부터의 화학물질 및 연료로서 사용하기 위한 미생물 유래 테르페노이드의 측면에서 천연 생성물을 생합성하기 위한 새로운 수단을 제시한다. 보편적인 테르페노이드 전구체인 IPP 및 DMAPP에 초점을 맞춤으로써, 먼저 핵심 경로 모듈을 규정하고, 이어서 발현을 조정하는 것, 예컨대 끊어짐 없이 이어지는 전구체 전환 및 최소 중간체 축적을 위한 경로 모듈의 균형을 최적화하는 것이 가능하였다. 상기 접근법은 큰 유전자 공간의 조합 검색보다 더 효과적으로 보이고, 고효율 스크리닝에 의존하지 않는다.

MEP-경로는 효과적으로 균형잡히고, 따라서 글루코스 또는 글리세롤의 이소프레노이드로의 전환시에 전반적으로 보다 효율적이다. 그러나, 지난 10년 동안, 카로테노이드^{28 ,47}, 세스퀴테르페노이드²³ 및 디테르페노이드⁶¹ 과다생산을 위한 중요한 전구체 IPP 및 DMAPP의 공급을 증가시키기 위해 이. 콜라이에서 MEP-경로를 조작하기 위한 많은 시도는 그 성공이 제한되었다. 이러한 비효율성은 이. 콜라이에서 MEP-경로의 발현과 특이적으로 연관된 미지의 조절 효과에 의한 것이었다²³. 여기서, 본 발명자들은 이소프레노이드 경로 활성을 억제하는, 경로의 비-최적 발현에 의한 대사체 인돌의 축적과 상관성이 있다는 증거를 제공한다. 탁사디엔 과다생산 (인돌 형성 억제의 조건 하에)은 이소프레노이드 패밀리의 제약 및 화학 생성물의 생합성을 위한 매우 효율적인 경로로서 MEP-경로를 확립하였다. 이것은 본 발명자들의 다변수-모듈 경로 조작 접근법에 의해 제시된 바와 같이 단순히 모듈 경로의 균형을 조심스럽게 맞추는 것을 필요로 한다.

탁솔의 성공적인 미생물 생산을 위해, P450계 산화 화학에 의한 탁사디엔 코어의 화학적 장식 (chemical decoration)의 입증이 필수적이다⁴¹. 시토크롬 P450 모노옥시게나제는 탁솔 생합성 경로에서 19개의 별개의 효소 단계의 약 1/2을 구성한다. 특징적으로, 상기 유전자는 서로 비통상적인 높은 서열 유사성 (> 70%)을 보이지만 다른 식물 P450과는 낮은 유사성 (< 30%)을 보인다¹⁴. 탁솔 모노옥시게나제 사이의 명백한 유사성 때문에, 특이적인 P450 산화 화학을 수행하기 위한 적절한 활성을 표현하는 것은 특히 문제가 되었다. 레독스 파트너 (TCPR)와의 인공 키메라 효소의 TM 조작 및 구축을 통해, 탁솔 시토크롬 P450, 탁사디엔 5α-히드록실라제는 이. 콜라이에서 기능적으로 발현되고, 생체내에서 탁사디엔을 상응하는 알콜 생성물로 효율적으로 전환하는 것으로 밝혀졌다. 이전의 시험관내 연구는 천연 탁사디엔 5α-히드록실라제 효소에 의한 탁사디엔의 탁사디엔-5α-올로의 전환 메카니즘을 설명하였지만, 생체내에서의 동일한 전환은 논의하지 않았다⁴². 상기 산소화 및 재배열 반응은 탁사디엔의 C20 위치로부터의 수소 추출에 의한 알릴 라디칼 중간체 형성, 이어서 C5 위치에서 위치 및 입체 특이적 삽입에 의한 알콜 유도체의 생성을 수반한다 (도 5a). 탁수스 세포에서 관찰된 효소의 보통의 풍부도, 및 낮은 k _cat 값은 탁솔 생합성의 5α-히드록실화 단계가 탁솔 경로의 하류 산소화 및 아실화에 비해 느림을 제시한다^{4 1}. 따라서, 상기 단계의 조작은 특히 원핵 숙주, 예컨대 이. 콜라이에서 탁솔 P450의 기능적 조작의 측면에서 탁솔 합성에 중요하다. 추가로, 상기 단계는 효모에서 경로를 구축하기 위한 이전의 노력의 제한 사항이었다¹⁷. 상기 연구에서 조작된 구축물은 약 60 mg/L의 생성물 축적과 함께 생체내에서 탁사디엔의 > 98% 전환을 보여 효모에서 이전의 이종성 발현보다 2400배의 개선을 나타내었다. 이 연구는 따라서 유의하게 더 많은 양의 중요한 탁솔 중간체의 합성에 성공했을 뿐만 아니라 유사한 P450 화학에 의한 경로에서 후속적인 대사산물의 합성을 위한 기초를 제공한다.

탁솔에 대한 구조-활성 관계에 대한 이전의 연구는 그의 관능기의 일부의 제거 또는 첨가에 의한 변경이 탁솔의 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 보여주었다^1,48. 그러나, 상기 연구는 화학적 합성에 의해 변화를 도입하는 제한된 능력 때문에 제한되었다. 탁솔 합성을 위한 미생물 경로의 이용가능성은 조사될 수 있는 화학적 변형 공간을 크게 확장하여 보다 효능있는 약물 후보를 확인할 확률을 증가시킬 것이다. 이것은 특히 상기 약물 후보가 효율적인 생산 경로와도 연관될 것임을 고려할 때 약물 개발을 위한 흥미로운 새로운 기회를 제공한다.

지난 수십년 동안, 탁솔은 임의의 다른 천연 생성물 약물 후보보다 과학계 및 일반 대중에게 보다 많은 관심을 끌었다¹⁰. 암 화학요법을 위한 탁솔 또는 탁솔 유사체의 예상된 용도 증가에 비추어 큰 공급 위기가 예측되고, 이것은 새로운 생산 경로, 예컨대 미생물에서 탁솔 생합성 기구의 조작을 필요로 한다⁸. 천연적으로 탁솔을 생산할 수 있는 탁수스 종의 몇몇 내생 진균이 단리되었지만, 상기 미생물 시스템은 약물의 지속적인 생산을 위한 적합성을 입증하여야 한다⁴⁹. 본원에서 보고된 결과는 중요한 전구체 경로에서 병목을 제거함으로써 미생물 유래 탁솔 또는 탁솔 전구체를 향한 파괴적인 단계를 보여준다. 또한, 합성 경로의 조합은 경로를 선택적으로 조작하여 탁산 구조를 변경함으로써 탁솔 유사체를 맞춤 생산할 새로운 가능성을 제시한다. 이러한 발전을 통해 탁솔 또는 적합한 탁솔 전구체의 비용 효과적인 생산을 위해 미생물 경로를 최적화할 수 있다.

<표 1> 임의의 단위 (a.u.)로 상류 및 하류 경로 발현의 평가. MEP 경로 및 GGPP 신타제/탁사디엔 신타제 경로 발현 수준은 프로모터 강도 및 카피수의 공개된 값을 사용하여 추정하였다. 프로모터 강도는 문헌 [Brosius et al.] 및 [Brunner et al.]^33,34를 기초로 하여 trc=1, T5=1.96, T7=4.97로서 계산되었다. 유전자 카피수는 사용된 상이한 플라스미드의 복제 기점에 대한 공개된 카피수가 지정되었고, 하나의 카피는 통합을 위해 사용되었다^{35 -37}. 총 발현은 프로모터 강도 및 유전자 카피수의 곱으로서 계산되었다. MEP 경로의 천연 발현에는 임의로 1의 값을 지정하고, GGPP 신타제 및 탁사디엔의 오페론 순서의 변경은 탁사디엔 신타제 발현에 20%의 영향을 주는 것으로 가정되었다³⁵. 이러한 총 발현 추정치는 조작 노력을 안내하였다. E - 2개의 결실 ΔrecAΔendA가 있는 이. 콜라이 K12 MG1655; EDE3 - T7 RNA 폴리머라제 (DE3)가 통합된 K12 MG1655 ΔrecAΔendA; MEP - dxs-idi-ispDF 오페론; GT - GPPS-TS 오페론; TG - TS-GPPS 오페론; Ch1 - 염색체 내의 1 카피; Trc - trc 프로모터; T5 - T5 프로모터; T7 - T7 프로모터; p5 - ~5 카피 플라스미드 (pSC101); p10 - ~10 카피 플라스미드 (p15A); 및 p20 - ~20 카피 플라스미드 (pBR322).

<표 2> 연구를 위해 구축된 모든 플라스미드의 상세 내역

<표 3> 플라스미드의 클로닝, MEP 경로의 염색체 전달 및 qPCR 측정에 사용된 프라이머의 상세 내역

<표 4> 단백질 및 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

참고문헌

본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 몇몇의 측면을 설명하였지만, 다양한 변경, 변형, 및 개선이 당업자에 의해 쉽게 수행될 것임을 이해하여야 한다. 상기 변경, 변형, 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 취지와 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예로서 제시된다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 통해 본원에 기재된 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 다음 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

본원에 개시된 모든 참조문은 그 전부가 본원에서 언급된 구체적인 목적을 위해 참고로 포함된다.

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STEPHANOPOULOS, Gregory PHON, Too Heng <120> MICROBIAL ENGINEERING FOR THE PRODUCTION OF CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL PRODUCTS FROM THE ISOPRENOID PATHWAY <130> M0656.70201WO00 <150> US 61/280,877 <151> 2009-11-10 <150> US 61/388,543 <151> 2010-09-30 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 cggcatatga gttttgatat tgccaaatac ccg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 cggctagctt atgccagcca ggccttgatt ttg 33 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 cgcggctagc gaaggagata tacatatgca aacggaacac gtcattttat tg 52 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 cggaattcgc tcacaacccc ggcaaatgtc gg 32 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 5 gcgaattcga aggagatata catatggcaa 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<223> Synthetic Polypeptide <400> 46 Met Asp Ala Leu Tyr Lys Ser Thr Val Ala Lys Phe Asn Glu Val Thr 1 5 10 15 Gln Leu Asp Cys Ser Thr Glu Ser Phe Ser Ile Ala Leu Ser Ala Ile 20 25 30 Ala Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Arg Ser Lys Arg His Ser 35 40 45 Ser Leu Lys Leu Pro Pro Gly Lys Leu Gly Ile Pro Phe Ile Gly Glu 50 55 60 Ser Phe Ile Phe Leu Arg Ala Leu Arg Ser Asn Ser Leu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Phe Asp Glu Arg Val Lys Lys Phe Gly Leu Val Phe Lys Thr Ser Leu 85 90 95 Ile Gly His Pro Thr Val Val Leu Cys Gly Pro Ala Gly Asn Arg Leu 100 105 110 Ile Leu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Val Gln Met Ser Trp Pro Ala Gln 115 120 125 Phe Met Lys Leu Met Gly Glu Asn Ser Val Ala Thr Arg Arg Gly Glu 130 135 140 Asp His Ile Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gly 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Gly Lys Met Asn Thr Glu Ile Gln Ser His 165 170 175 Ile Asn Glu Lys Trp Lys Gly Lys Asp Glu Val Asn Val Leu Pro Leu 180 185 190 Val Arg Glu Leu Val Phe Asn Ile Ser Ala Ile Leu Phe Phe Asn Ile 195 200 205 Tyr Asp Lys Gln Glu Gln Asp Arg Leu His Lys Leu Leu Glu Thr Ile 210 215 220 Leu Val Gly Ser Phe Ala Leu Pro Ile Asp Leu Pro Gly Phe Gly Phe 225 230 235 240 His Arg Ala Leu Gln Gly Arg Ala Lys Leu Asn Lys Ile Met Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Lys Lys Arg Lys Glu Asp Leu Gln Ser Gly Ser Ala Thr Ala 260 265 270 Thr Gln Asp Leu Leu Ser Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Asp Lys Gly 275 280 285 Thr Pro Leu Thr Asn Asp Glu Ile Leu Asp Asn Phe Ser Ser Leu Leu 290 295 300 His Ala Ser Tyr Asp Thr Thr Thr Ser Pro Met Ala Leu Ile Phe Lys 305 310 315 320 Leu Leu Ser Ser Asn Pro Glu Cys Tyr Gln Lys Val Val Gln Glu Gln 325 330 335 Leu Glu Ile Leu Ser Asn Lys Glu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Trp Lys 340 345 350 Asp Leu Lys Ala Met Lys Tyr Thr Trp Gln Val Ala Gln Glu Thr Leu 355 360 365 Arg Met Phe Pro Pro Val Phe Gly Thr Phe Arg Lys Ala Ile Thr Asp 370 375 380 Ile Gln Tyr Asp Gly Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Leu Trp 385 390 395 400 Thr Thr Tyr Ser Thr His Pro Lys Asp Leu Tyr Phe Asn Glu Pro Glu 405 410 415 Lys Phe Met Pro Ser Arg Phe Asp Gln Glu Gly Lys His Val Ala Pro 420 425 430 Tyr Thr Phe Leu Pro Phe Gly Gly Gly Gln Arg Ser Cys Val Gly Trp 435 440 445 Glu Phe Ser Lys Met Glu Ile Leu Leu Phe Val His His Phe Val Lys 450 455 460 Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Pro Val Asp Pro Asp Glu Lys Ile Ser Gly 465 470 475 480 Asp Pro Leu Pro Pro Leu Pro Ser Lys Gly Phe Ser Ile Lys Leu Phe 485 490 495 Pro Arg Pro <210> 47 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 47 atggatgccc tctataagtc taccgtggcg aaatttaacg aagtaaccca gctggattgc 60 agcactgagt catttagcat cgctttgagt gcaattgccg ggatcttgct gttgctcctg 120 ctgtttcgct cgaaacgtca tagtagcctg aaattacctc cgggcaaact gggcattccg 180 tttatcggtg agtcctttat ttttttgcgc gcgctgcgca gcaattctct ggaacagttc 240 tttgatgaac gtgtgaagaa gttcggcctg gtatttaaaa cgtcccttat cggtcacccg 300 acggttgtcc tgtgcgggcc cgcaggtaat cgcctcatcc tgagcaacga agaaaagctg 360 gtacagatgt cctggccggc gcagtttatg aagctgatgg gagagaactc agttgcgacc 420 cgccgtggtg aagatcacat tgttatgcgc tccgcgttgg caggcttttt cggcccggga 480 gctctgcaat cctatatcgg caagatgaac acggaaatcc aaagccatat taatgaaaag 540 tggaaaggga aggacgaggt taatgtctta cccctggtgc gggaactggt ttttaacatc 600 agcgctattc tgttctttaa catttacgat aagcaggaac aagaccgtct gcacaagttg 660 ttagaaacca ttctggtagg ctcgtttgcc ttaccaattg atttaccggg tttcgggttt 720 caccgcgctt tacaaggtcg tgcaaaactc aataaaatca tgttgtcgct tattaaaaaa 780 cgtaaagagg acttacagtc gggatcggcc accgcgacgc aggacctgtt gtctgtgctt 840 ctgactttcc gtgatgataa gggcaccccg ttaaccaatg acgaaatcct ggacaacttt 900 agctcactgc ttcacgcctc ttacgacacc acgactagtc caatggctct gattttcaaa 960 ttactgtcaa gtaaccctga atgctatcag aaagtcgtgc aagagcaact cgagattctg 1020 agcaataagg aagaaggtga agaaattacc tggaaagatc ttaaggccat gaaatacacg 1080 tggcaggttg cgcaggagac acttcgcatg tttccaccgg tgttcgggac cttccgcaaa 1140 gcgatcacgg atattcagta tgacggatac acaatcccga aaggttggaa actgttgtgg 1200 actacctata gcactcatcc taaggacctt tacttcaacg aaccggagaa atttatgcct 1260 agtcgtttcg atcaggaagg caaacatgtt gcgccctata ccttcctgcc ctttggaggc 1320 ggtcagcgga gttgtgtggg ttgggagttc tctaagatgg agattctcct cttcgtgcat 1380 catttcgtga aaacattttc gagctatacc ccggtcgatc ccgatgaaaa aatttccggc 1440 gatccactgc cgccgttacc gagcaaaggg ttttcaatca aactgttccc tcgtccg 1497 <210> 48 <211> 717 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 48 Met Gln Ala Asn Ser Asn Thr Val Glu Gly Ala Ser Gln Gly Lys Ser 1 5 10 15 Leu Leu Asp Ile Ser Arg Leu Asp His Ile Phe Ala Leu Leu Leu Asn 20 25 30 Gly Lys Gly Gly Asp Leu Gly Ala Met Thr Gly Ser Ala Leu Ile Leu 35 40 45 Thr Glu Asn Ser Gln Asn Leu Met Ile Leu Thr Thr Ala Leu Ala Val 50 55 60 Leu Val Ala Cys Val Phe Phe Phe Val Trp Arg Arg Gly Gly Ser Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Leu Val Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ser Ala Lys Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala Glu 115 120 125 Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Val Phe Lys Val Val Asp Leu 130 135 140 Asp Asn Tyr Ala Ala Asp Asp Glu Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys 145 150 155 160 Glu Lys Leu Ala Phe Phe Met Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro 165 170 175 Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Leu Glu Gly Lys Glu 180 185 190 Arg Glu Pro Trp Leu Ser Asp Leu Thr Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly 195 200 205 Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Ala Val Asp Glu 210 215 220 Val Leu Ile Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly 225 230 235 240 Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Gln 245 250 255 Val Trp Pro Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Glu Pro 260 265 270 Thr Ser Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Glu 275 280 285 Ile Tyr Asp Ser Val Val Ser Val Tyr Glu Glu Thr His Ala Leu Lys 290 295 300 Gln Asn Gly Gln Ala Val Tyr Asp Ile His His Pro Cys Arg Ser Asn 305 310 315 320 Val Ala Val Arg Arg Glu Leu His Thr Pro Leu Ser Asp Arg Ser Cys 325 330 335 Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ser Asp Thr Gly Leu Ile Tyr Glu Thr 340 345 350 Gly Asp His Val Gly Val His Thr Glu Asn Ser Ile Glu Thr Val Glu 355 360 365 Glu Ala Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gln Leu Asp Thr Ile Phe Ser Val 370 375 380 His Gly Asp Lys Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu Pro 385 390 395 400 Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Ala Arg Tyr 405 410 415 Ala Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys Ala Ala Phe Leu Ala Leu Ala 420 425 430 Ala His Ala Ser Asp Pro Ala Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ser 435 440 445 Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Gln Trp Val Thr Ala Ser Gln 450 455 460 Arg Ser Leu Leu Glu Ile Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro 465 470 475 480 Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr 485 490 495 Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Phe Ala Pro Ser Arg Ile His Val 500 505 510 Thr Cys Ala Leu Val Tyr Gly Pro Ser Pro Thr Gly Arg Ile His Lys 515 520 525 Gly Val Cys Ser Asn Trp Met Lys Asn Ser Leu Pro Ser Glu Glu Thr 530 535 540 His Asp Cys Ser Trp Ala Pro Val Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys 545 550 555 560 Leu Pro Ala Asp Ser Thr Thr Pro Ile Val Met Val Gly Pro Gly Thr 565 570 575 Gly Phe Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Ala Lys Leu Gln 580 585 590 Glu Ala Gly Glu Lys Leu Gly Pro Ala Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg 595 600 605 Asn Arg Gln Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Lys Gly Tyr Val 610 615 620 Glu Lys Gly Ile Leu Thr Asn Leu Ile Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly 625 630 635 640 Ala Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Leu Glu Lys Ala Ser Asp 645 650 655 Thr Trp Ser Leu Ile Ala Gln Gly Gly Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp 660 665 670 Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val 675 680 685 Gln Glu Gln Glu Ser Val Asp Ser Ser Lys Ala Glu Phe Leu Val Lys 690 695 700 Lys Leu Gln Met Asp Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Ile Trp 705 710 715 <210> 49 <211> 2151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 49 atgcaggcga attctaatac ggttgaaggc gcgagccaag gcaagtctct tctggacatt 60 agtcgcctcg accatatctt cgccctgctg ttgaacggga aaggcggaga ccttggtgcg 120 atgaccgggt cggccttaat tctgacggaa aatagccaga acttgatgat tctgaccact 180 gcgctggccg ttctggtcgc ttgcgttttt tttttcgttt ggcgccgtgg tggaagtgat 240 acacagaagc ccgccgtacg tcccacacct cttgttaaag aagaggacga agaagaagaa 300 gatgatagcg ccaagaaaaa ggtcacaata ttttttggca cccagaccgg caccgccgaa 360 ggtttcgcaa aggccttagc tgaggaagca aaggcacgtt atgaaaaggc ggtatttaaa 420 gtcgtggatt tggataacta tgcagcggat gacgaacagt acgaagagaa gttgaaaaag 480 gaaaagctag cgttcttcat gctcgccacc tacggtgacg gcgaaccgac tgataatgcc 540 gctcgctttt ataaatggtt tctcgagggt aaagagcgcg agccatggtt gtcagatctg 600 acttatggcg tgtttggctt aggtaaccgt cagtatgaac actttaacaa ggtcgcgaaa 660 gcggtggacg aagtgctcat tgaacaaggc gccaaacgtc tggtaccggt agggcttggt 720 gatgatgatc agtgcattga ggacgacttc actgcctgga gagaacaagt gtggcctgag 780 ctggatcagc tcttacgtga tgaagatgac gagccgacgt ctgcgacccc gtacacggcg 840 gctattccag aataccgggt ggaaatctac gactcagtag tgtcggtcta tgaggaaacc 900 catgcgctga aacaaaatgg acaagccgta tacgatatcc accacccgtg tcgcagcaac 960 gtggcagtac gtcgtgagct gcataccccg ctgtcggatc gtagttgtat tcatctggaa 1020 ttcgatatta gtgatactgg gttaatctat gagacgggcg accacgttgg agttcatacc 1080 gagaattcaa ttgaaaccgt ggaagaagca gctaaactgt taggttacca actggataca 1140 atcttcagcg tgcatgggga caaggaagat ggaacaccat tgggcgggag tagcctgcca 1200 ccgccgtttc cggggccctg cacgctgcgg acggcgctgg cacgttacgc ggacctgctg 1260 aaccctccgc gcaaagccgc cttcctggca ctggccgcac acgcgtcaga tccggctgaa 1320 gctgaacgcc ttaaatttct cagttctcca gccggaaaag acgaatactc acagtgggtc 1380 actgcgtccc aacgcagcct cctcgagatt atggccgaat tccccagcgc gaaaccgccg 1440 ctgggagtgt ttttcgccgc aatagcgccg cgcttgcaac ctaggtatta tagcatctcc 1500 tcctccccgc gtttcgcgcc gtctcgtatc catgtaacgt gcgcgctggt ctatggtcct 1560 agccctacgg ggcgtattca taaaggtgtg tgcagcaact ggatgaagaa ttctttgccc 1620 tccgaagaaa cccacgattg cagctgggca ccggtctttg tgcgccagtc aaactttaaa 1680 ctgcccgccg attcgacgac gccaatcgtg atggttggac ctggaaccgg cttcgctcca 1740 tttcgcggct tccttcagga acgcgcaaaa ctgcaggaag cgggcgaaaa attgggcccg 1800 gcagtgctgt tttttgggtg ccgcaaccgc cagatggatt acatctatga agatgagctt 1860 aagggttacg ttgaaaaagg tattctgacg aatctgatcg ttgcattttc acgagaaggc 1920 gccaccaaag agtatgttca gcacaagatg ttagagaaag cctccgacac gtggtcttta 1980 atcgcccagg gtggttatct gtatgtttgc ggtgatgcga agggtatggc cagagacgta 2040 catcgcaccc tgcatacaat cgttcaggaa caagaatccg tagactcgtc aaaagcggag 2100 tttttagtca aaaagctgca aatggatgga cgctacttac gggatatttg g 2151 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 50 Gly Ser Thr Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 51 Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe 1 5 <210> 52 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 52 cgtaccatgg ttgatttcaa tgaatatatg aaaagtaagg c 41

Claims (99)

1. 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하는 세포에서 탁사디엔 신타제 효소 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 재조합 방식으로 발현시키는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
3. 제2항에 있어서, 세포가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포인 방법.
4. 제2항에 있어서, 세포가 그람-양성 세포인 방법.
5. 제4항에 있어서, 세포가 바실러스 (Bacillus) 세포인 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
7. 제6항에 있어서, 효모 세포가 사카로미세스 (Saccharomyces) 세포인 방법.
8. 제6항에 있어서, 효모 세포가 야로위아 (Yarrowia) 세포인 방법.
9. 제1항에 있어서, 세포가 조류 세포인 방법.
10. 제1항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
11. 제1항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소가 탁수스 (Taxus) 효소인 방법.
12. 제11항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소가 탁수스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia) 효소인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, GGPPS 효소가 탁수스 효소인 방법.
14. 제13항에 있어서, GGPPS 효소가 탁수스 카나데니스 (Taxus canadenis) 효소인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP 경로의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자가 하나 이상의 플라스미드로부터 발현되는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자가 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분이 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 과다발현되는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 오페론 dxs-idi-idpDF 상에서 과다발현되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자가 오페론에서 함께 발현되는 것인 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 또는 그의 촉매 활성 부분을 추가로 발현하는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, T5αOH 효소 또는 그의 촉매 활성 부분이 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합되는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, T5αOH 효소가 At24T5αOH-tTCPR인 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소, GGPPS 효소 및 MEP 경로의 하나 이상의 성분의 발현이 탁사디엔의 생산을 최대화하기 위해 균형잡히는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올을 생산하는 것인 방법.
27. 제26항에 있어서, 적어도 10 mg L^-1의 탁사디엔이 생산되는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 적어도 250 mg L^-1의 탁사디엔이 생산되는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, 적어도 10 mg L^-1의 탁사디엔-5α-올이 생산되는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 적어도 50 mg L^-1의 탁사디엔-5α-올이 생산되는 것인 방법.
31. 제26항, 제29항 또는 제30항에 있어서, 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 탁사디엔 전환 백분율이 적어도 50%인 방법.
32. 제31항에 있어서, 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 탁사디엔 전환 백분율이 적어도 75%인 방법.
33. 제32항에 있어서, 탁사디엔-5α-올 및 부산물 5(12)-옥사-3(11)-시클로탁산으로의 탁사디엔 전환 백분율이 적어도 95%인 방법.
34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양액으로부터 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올이 기체 상으로부터 회수되는 것인 방법.
36. 제34항에 있어서, 유기 층이 세포 배양액에 첨가되고, 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올이 유기 층으로부터 회수되는 것인 방법.
37. 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하고 탁사디엔 신타제 효소 및 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 재조합 방식으로 발현하는 세포.
38. 제37항에 있어서, 박테리아 세포인 세포.
39. 제38항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 세포인 세포.
40. 제38항에 있어서, 그람-양성 세포인 세포.
41. 제40항에 있어서, 바실러스 세포인 세포.
42. 제37항에 있어서, 효모 세포인 세포.
43. 제42항에 있어서, 효모 세포가 사카로미세스 세포인 세포.
44. 제42항에 있어서, 효모 세포가 야로위아 세포인 세포.
45. 제37항에 있어서, 조류 세포인 세포.
46. 제37항에 있어서, 식물 세포인 세포.
47. 제37항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소가 탁수스 효소인 세포.
48. 제47항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소가 탁수스 브레비폴리아 효소인 세포.
49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, GGPPS 효소가 탁수스 효소인 세포.
50. 제49항에 있어서, GGPPS 효소가 탁수스 카나데니스 효소인 세포.
51. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP 경로의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자가 하나 이상의 플라스미드로부터 발현되는 것인 세포.
52. 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 MEP의 하나 이상의 성분을 코딩하는 유전자가 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 세포.
53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분이 dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA 및 ispB로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 세포.
54. 제53항에 있어서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 과다발현되는 것인 세포.
55. 제54항에 있어서, dxs, idi, ispD 및 ispF가 오페론 dxs-idi-idpDF 상에서 과다발현되는 것인 세포.
56. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소를 코딩하는 유전자 및 GGPPS 효소를 코딩하는 유전자가 오페론에서 함께 발현되는 것인 세포.
57. 제37항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 또는 그의 촉매 활성 부분을 추가로 발현하는 세포.
58. 제57항에 있어서, T5αOH 효소 또는 그의 촉매 활성 부분이 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합되는 것인 세포.
59. 제58항에 있어서, T5αOH 효소가 At24T5αOH-tTCPR로서 발현되는 것인 세포.
60. 제37항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 신타제 효소, GGPPS 효소 및 MEP 경로의 하나 이상의 성분의 발현이 탁사디엔의 생산을 최대화하기 위해 균형잡히는 것인 세포.
61. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 탁사디엔 또는 탁사디엔-5α-올을 생산하는 것인 세포.
62. 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분을 과다발현하는 세포를 생성하거나 얻고,
    세포로부터 테르페노이드를 생산하고,
    세포로부터 생산된 테르페노이드의 양을 대조군 세포에서 생산된 테르페노이드의 양과 비교하고,
    대조군 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제1의 개선된 세포를 선택하는 것
    을 포함하고, 여기서 대조군 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제1의 개선된 세포가 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포인, 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포를 선택하는 방법.
63. 제62항에 있어서, 세포가 테르페노이드 신타제 효소를 재조합 방식으로 발현하는 것인 방법.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 세포가 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소를 재조합 방식으로 발현하는 것인 방법.
65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2의 개선된 세포를 생산하기 위해 제1의 개선된 세포에서 비-메발로네이트 (MEP) 경로의 하나 이상의 성분, 테르페노이드 신타제 효소 및/또는 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 효소의 발현 수준을 변경하고,
    제2의 개선된 세포로부터 생산된 테르페노이드의 양을 제1의 개선된 세포에서 생산된 테르페노이드의 양과 비교하는 것
    을 추가로 포함하고, 여기서 제1의 개선된 세포보다 더 많은 양의 테르페노이드를 생산하는 제2의 개선된 세포가 테르페노이드의 향상된 생산을 보이는 세포인 방법.
66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 테르페노이드 신타제 효소가 탁사디엔 신타제 효소인 방법.
67. 시토크롬 P450 리덕타제 효소 또는 그의 촉매 활성 부분에 융합된 탁사디엔 5α-히드록실라제 (T5αOH) 효소 또는 그의 촉매 활성 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
68. 제67항에 있어서, 시토크롬 P450 리덕타제 효소가 탁수스 시토크롬 P450 리덕타제 (TCPR)인 단리된 폴리펩티드.
69. 제68항에 있어서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 및 TCPR이 링커에 의해 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
70. 제69항에 있어서, 링커가 GSTGS (서열 50)인 단리된 폴리펩티드.
71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 탁사디엔 5α-히드록실라제 및/또는 TCPR이 막횡단 영역의 전부 또는 일부가 제거되도록 말단절단되는 것인 단리된 폴리펩티드.
72. 제71항에 있어서, 탁사디엔 5α-히드록실라제의 8, 24 또는 42개의 N-말단 아미노산이 말단절단되는 것인 단리된 폴리펩티드.
73. 제71항 또는 제72항에 있어서, TCPR의 74개의 아미노산이 말단절단되는 것인 단리된 폴리펩티드.
74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 펩티드가 탁사디엔 5α-히드록실라제에 융합되는 것인 단리된 폴리펩티드.
75. 제74항에 있어서, 추가의 펩티드가 소 17α 히드록실라제로부터 유래하는 것인 단리된 폴리펩티드.
76. 제75항에 있어서, 펩티드가 MALLLAVF (서열 51)인 단리된 폴리펩티드.
77. 제67항에 있어서, At24T5αOH-tTCPR인 단리된 폴리펩티드.
78. 제67항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
79. 제67항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 재조합 방식으로 발현하는 세포.
80. 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하여 세포에서 테르페노이드 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포에서 테르페노이드 생산을 증가시키는 방법.
81. 제80항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
82. 제81항에 있어서, 세포가 에스케리키아 콜라이 세포인 방법.
83. 제81항에 있어서, 세포가 그람-양성 세포인 방법.
84. 제83항에 있어서, 세포가 바실러스 세포인 방법.
85. 제80항에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
86. 제85항에 있어서, 효모 세포가 사카로미세스 세포인 방법.
87. 제85항에 있어서, 효모 세포가 야로위아 세포인 방법.
88. 제80항에 있어서, 세포가 조류 세포인 방법.
89. 제80항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
90. 제80항에 있어서, 세포가 제37항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 세포인 방법.
91. 제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하는 단계가 상류 비-메발로네이트 이소프레노이드 경로를 하류 생성물 합성 경로와 균형잡히게 하고/하거나 인돌 경로를 변형하거나 조절하는 것을 포함하는 것인 방법.
92. 제80항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 또는 세포의 배양액에서 인돌의 축적을 제어하는 단계가 임의로 흡수제 또는 스캐빈저를 사용하는 화학적 방법을 통해 발효로부터 축적된 인돌을 제거하는 것을 포함하거나 추가로 포함하는 것인 방법.
93. 제80항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 테르페노이드가 모노테르페노이드, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 트리테르페노이드 또는 테트라테르페노이드인 방법.
94. 제93항에 있어서, 하나 이상의 테르페노이드가 탁사디엔 또는 임의의 탁솔 전구체인 방법.
95. 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포에서 또는 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 세포의 배양액에서 인돌의 양 또는 농도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
96. 제95항에 있어서, 인돌의 양 또는 농도를 2회 이상의 횟수로 측정하는 것을 포함하는 방법.
97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 측정된 인돌의 양 또는 농도가 하나 이상의 테르페노이드를 생산하는 방법을 안내하기 위해 사용되는 것인 방법.
98. 제95항 또는 제96항에 있어서, 측정된 인돌의 양 또는 농도가 균주 구축을 안내하기 위해 사용되는 것인 방법.
99. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제67항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 재조합 방식으로 추가로 발현하는 것인 방법.
    

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