ES2575790T3 - Ingeniería microbiana para la preparación de productos químicos y farmacéuticos a partir de la vía isoprenoide - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la producción de terpenoides en una célula de E. coli que produce uno o más terpenoides, que comprende controlar la acumulación de indol en la célula o en un cultivo de las células a menos de 100 mg/L y sobre-expresar en la célula uno o más componentes de la vía no mevalonato (MEP), aumentando con ello la producción de terpenoides en la célula, en el que la etapa de controlar la acumulación de indol en la célula o en un cultivo de las células comprende (i) equilibrar una vía MEP aguas arriba con una vía de síntesis de terpenoides aguas abajo y/o modificar o regular una vía indol, o (ii) separar del cultivo celular el indol acumulado a través de métodos químicos.

Description

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Figura 15. Impacto de la acumulación de metabolito subproducto indol en la producción y el crecimiento de taxadieno. (a) Correlación inversa entre taxadieno e indol. Las cepas 26 a 28 y 30 a 32, todas con expresión cromosómicamente integrada de la vía de aguas arriba, fueron elegidas para la comparación consistente. Los dos conjuntos de cepas difieren sólo en la expresión de la vía de aguas abajo, teniendo el segundo conjunto (30 a 32) dos veces el nivel de expresión del primero. En las cepas 26 a 28 y 30 a 32, la expresión aguas arriba aumentaba al cambiar los promotores de Trc a T5 y T7, respectivamente. Con el primer conjunto, el equilibrio óptimo se logra con la cepa 26, que utiliza el promotor Trc para la expresión de la vía de aguas arriba y también muestra la acumulación de indol más baja. Con las cepas 30 a 32, la cepa 31 muestra la acumulación de indol más baja y la producción de taxadieno más alta. Las mejoras múltiples son en relación con las cepas 25 y 29, respectivamente, para los dos conjuntos. (b) Efecto de indol introducido externamente sobre la producción de taxadieno para la cepa 26 de alta producción. Diferentes concentraciones de indol se introdujeron en cultivos de células cultivadas en medio mínimo con extracto de levadura al 0,5%. La producción de taxadieno se redujo significativamente a medida que la concentración de indol aumentaba de 50 mg/L a 100 mg/L. (c) Efecto de indol introducido externamente sobre el crecimiento celular para las cepas manipuladas genéticamente de E. coli. Los datos son la media +/-SD de tres repeticiones. Se seleccionaron cepas carentes de la vía de aguas abajo y con diferentes intensidades de la vía de aguas arriba (1, 2, 6, 21, 40 y 100). La cepa 26, el alto productor de taxadieno, exhibe la inhibición más fuerte.

Figura 16. Metabolito desconocido identificado como indol. (A) y (a) Cromatograma de gases y espectro de masas del metabolito desconocido extraído utilizando hexano del cultivo celular. (B) y (b) corresponden al cromatograma de gases y al espectro de masas de indol puro disuelto en hexano. Además de para confirmar la identidad química, el metabolito se extrajo a partir del caldo de fermentación utilizando la extracción con hexano y se purificó por cromatografía en columna de sílice utilizando hexano:acetato de etilo (8:2) como eluyente. La pureza del compuesto se confirmó por TLC y GC-MS. Los espectros 1H-RMN y 13C-RMN confirmaron la identidad química del metabolito como indol. (c) El espectro de 1H-RMN de indol extraído de cultivo celular (CDCl3, 400 MHz) δ: 6,56 (d, 1H, Ar C-H), 7,16 (m, 3H, Ar C-H), 7,38 (d, 1H, Ar C-H), 7,66 (d, 1H, Ar C-H), 8,05 (b, 1H, indol NH). (d) 13C-RMN δ: 135,7, 127,8, 124,2, 122, 120,7, 119,8, 111, 102,6. (e) es el espectro de 1H-RMN de indol puro.

Figura 17. Cultivo alimentado discontinuo de cepas manipuladas genéticamente en biorreactor de 1L. Cursos en el tiempo de la acumulación de taxadieno (a), el crecimiento celular (b), la acumulación de ácido acético (c) y la adición total del sustrato (glicerol) (d) para las cepas 22, 17 y 26 durante 5 días de cultivo alimentado discontinuo en el biorreactor en recipientes del biorreactor de 1 L bajo condiciones controladas de pH y oxígeno con medios mínimos y extracto de levadura al 0,5%. Después de que el glicerol se agota a ~ 0,5 a 1 g/L en el fermentador, se introdujeron en el biorreactor 3 g/L de glicerol durante la fermentación. Los datos son la media de dos biorreactores de réplica.

Descripción Detallada de la Invención

Taxol es un potente fármaco anti-cancerígeno aislado por primera vez como un producto natural del tejo del Pacífico Taxus brevifolia. Sin embargo, la producción fiable y rentable de Taxol o análogos de Taxol por rutas tradicionales de producción de extractos vegetales es limitada. En esta memoria, los autores de la invención presentan un enfoque multivariado-modular para la ingeniería genética de la vía metabólica para amplificar ~15000 veces la producción de Taxadieno en Escherichia coli manipulada genéticamente. Taxadieno, el primer compuesto intermedio de Taxol comprometido, es el producto de biosíntesis de la vía no mevalonato en E. coli que comprende dos módulos: la vía de aguas arriba nativa formando Isopentenil Pirofosfato (IPP) y una vía de formación de terpenoide de aguas abajo heteróloga. La búsqueda sistemática multivariada identificó condiciones que equilibran de manera óptima los dos módulos de la vía para minimizar la acumulación de productos intermedios inhibitorios y el desvío del flujo a productos secundarios. Los autores de la invención también manipularon genéticamente la siguiente etapa, después de taxadieno, en la biosíntesis de Taxol, una etapa de oxidación basada en P450, que proporcionó > 98% de conversión del sustrato y presentan el primer ejemplo de la producción in vivo de cualesquiera productos intermedios de Taxol funcionalizados en E. coli. El enfoque de la ingeniería genética de la vía modular no sólo pone de manifiesto la complejidad de las vías multi-etapa, sino que también permitió la acumulación de altos títulos de taxadieno y taxadien-5α-ol (~300 mg/L y 60 mg/L, respectivamente) en fermentaciones a pequeña escala, ejemplificando así el potencial de la producción microbiana de Taxol y sus derivados.

Esta invención no se limita en su aplicación a los detalles de la construcción y la disposición de componentes recogidos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ser puesta en práctica o de ser llevada a cabo de diversas maneras. Además, la fraseología y terminología utilizada en esta memoria es con el propósito de descripción y no deben considerarse como limitantes. El uso de "que incluye", "que comprende" o "que tiene", "que contiene", "que implica", y variaciones de los mismos en esta memoria, pretende abarcar los elementos listados en lo sucesivo, así como elementos adicionales.

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Se debe apreciar que los genes y/o proteínas se pueden regular por sí solos o en combinación. Por ejemplo, la expresión de dxs se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o la regulación a la baja de la expresión de uno o más de ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispC se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispD se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola

o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispE se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispF se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispG se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispH, idi, ispA e ispB. La expresión de ispH se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, idi, ispA e ispB. La expresión de idi se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, ispA e ispB. La expresión de ispA se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi e ispB. La expresión de ispB se puede regular positivamente o regular negativamente por sí sola o en combinación con la regulación al alza o regulación a la baja de la expresión de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi e ispA. En algunas realizaciones, la expresión del gen y/o la proteína de uno o más de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH e idi se regula positivamente, mientras que la expresión del gen y/o la proteína de ispA y/o ISPB se regula negativamente.

La expresión de genes dentro de la vía MEP se puede regular en un método modular. Tal como se utiliza en esta memoria, la regulación mediante un método modular se refiere a la regulación de múltiples genes juntos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, múltiples genes dentro de la vía MEP se expresan de forma recombinante en una región contigua de ADN, tal como un operón. Debe apreciarse que una célula que expresa un módulo de este tipo también puede expresar uno o más de otros genes dentro de la vía MEP, ya sea de forma recombinante o endógena.

Un ejemplo no limitante de un módulo de genes dentro de la vía MEP es un módulo que contiene los genes dxs, idi, ispD e ispF, tal como se presenta en la sección de Ejemplos, y se alude en esta memoria como dxs-idi-ispDF. Se debe apreciar que los módulos de genes dentro de la vía MEP, consistente con aspectos de la invención, pueden contener cualquiera de los genes dentro de la vía MEP, en cualquier orden.

La expresión de genes y proteínas dentro de la vía de síntesis de terpenoide sintético aguas abajo también se puede regular con el fin de optimizar la producción de terpenoides. La vía de síntesis aguas debajo de terpenoide sintético implica la expresión recombinante de una enzima terpenoide sintasa y una enzima GGPPS. Cualquier enzima terpenoide sintasa, tal como se comentó anteriormente, se puede expresar con GGPPS dependiendo del producto aguas abajo a producir. Por ejemplo, taxadieno sintasa se utiliza para la producción de taxadieno. La expresión recombinante de la enzima taxadieno sintasa y la enzima GGPPS se puede regular de forma independiente o en conjunto. En algunas realizaciones, las dos enzimas se regulan juntas de una manera modular. Por ejemplo, las dos enzimas se pueden expresar en un operón en cualquier orden (GGPPS-TS, al que se alude como "GT", o TS-GGPPS, al que se alude como "TG").

La manipulación de la expresión de genes y/o proteínas, incluyendo módulos tales como el operón dxs-idi-ispDF y el operón TS-GGPPS, se puede lograr a través de métodos conocidos por un experto ordinario en la técnica. Por ejemplo, la expresión de los genes u operones se puede regular a través de la selección de promotores, tales como promotores inducibles, con diferentes fuerzas. Varios ejemplos no limitantes de promotores incluyen Trc, T5 y T7. Adicionalmente, la expresión de genes u operones se puede regular a través de la manipulación del número de copias del gen u operón en la célula. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una cepa que contiene una copia adicional del operón dxs-idi-ispDF en su cromosoma bajo el control del promotor Trc produce una cantidad incrementada de taxadieno con relación a una que sobre-expresa solamente la vía sintética aguas abajo. En algunas realizaciones, la expresión de genes u operones se puede regular a través de la manipulación del orden de los genes dentro de un módulo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cambio del orden de los genes en un operón sintético aguas abajo de GT a TG resulta en un aumento de 2-3 veces en la producción de taxadieno. En algunas realizaciones, la expresión de genes u operones se regula a través de la integración de uno o más genes u

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operones en un cromosoma. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la integración del operón dxs-idi-ispDF aguas arriba en el cromosoma de una célula resulta en una producción incrementada de taxadieno.

Se debe apreciar que los genes asociados con la invención se pueden obtener de una diversidad de fuentes. En algunas realizaciones, los genes dentro de la vía MEP son genes bacterianos tales como genes de Escherichia coli. En algunas realizaciones, el gen que codifica GGPPS es un gen vegetal. Por ejemplo, el gen que codifica GGPPS puede ser de una especie de Taxus tal como Taxus canadensis (T.canadensis). En algunas realizaciones, el gen que codifica taxadieno sintasa es un gen vegetal. Por ejemplo, el gen que codifica taxadieno sintasa puede ser de una especie de Taxus tal como Taxus brevifolia (T. brevifolia). Números de Acceso a GenBank representativos para

T. canadensis GGPPS y T. brevifolia taxadieno sintasa se proporcionan por AF081514 y U48796.

Como una persona de experiencia ordinaria en la técnica será consciente, genes homólogos para uso en métodos asociados con la invención se pueden obtener de otras especies, y pueden ser identificados mediante búsquedas de homología, por ejemplo mediante una búsqueda de proteínas BLAST, disponible en el sitio de Internet (www.ncbi.nlm.nih.gov) del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI). Genes y/u operones asociados con la invención pueden ser clonados, por ejemplo, mediante amplificación por PCR y/o digestión de restricción, a partir de ADN de cualquier fuente de ADN que contiene el gen dado. En algunas realizaciones, un gen y/u operón asociado con la invención es sintético. Cualquier medio de obtener un gen y/u operón asociado con la invención es compatible con la presente invención.

En algunas realizaciones, una optimización adicional de la producción de terpenoides se consigue mediante la modificación de un gen antes de que sea expresado de forma recombinante en una célula. En algunas realizaciones, la enzima GGPPS tiene una o más de las siguientes mutaciones: A162V, G140C, L182M, F218Y, D160G, C184S, K367R, A151T, M185I, D264Y, E368D, C184R, L331I, G262V, R365S, A114D, S239C, G295D, I276V, K343N, P183S, I172T, D267G, I149V, T234I, E153D y T259A. En algunas realizaciones, la enzima GGPPS tiene una mutación en el residuo S239 y/o residuo G295. En determinadas realizaciones, la enzima GGPPS tiene la mutación S239C y/o G295D.

En algunas realizaciones, la modificación de un gen antes de que sea expresado de forma recombinante en una célula implica la optimización de codones para la expresión en una célula bacteriana. A los usos de codones para una diversidad de organismos se puede acceder en la Base de Datos de Uso de Codones (www.kazusa.or.jp/codon/). La optimización de codones, incluyendo la identificación de codones óptimos para una diversidad de organismos, y métodos para alcanzar la optimización de los codones, es familiar para un experto normal en la técnica, y se puede lograr utilizando métodos estándares.

En algunas realizaciones, la modificación de un gen antes de que sea expresado de forma recombinante en una célula implica la realización de una o más mutaciones en el gen antes de que sea expresado de forma recombinante en una célula. Por ejemplo, una mutación puede implicar una sustitución o deleción de un solo nucleótido o de varios nucleótidos. En algunas realizaciones, una mutación de uno o más nucleótidos en un gen resultará en una mutación en la proteína producida a partir del gen, tal como una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos.

En algunas realizaciones, puede ser ventajoso utilizar una célula que haya sido optimizada para la producción de un terpenoide. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula que sobre-expresa uno o más componentes de la vía no mevalonato (MEP) se utiliza, al menos en parte, para amplificar isopentil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP), sustratos de GGPPS. En algunas realizaciones, la sobre-expresión de uno o más componentes de la vía no mevalonato (MEP) se consigue aumentando el número de copias de uno o más componentes de la vía no mevalonato (MEP). Por ejemplo, se puede amplificar los números de copias de componentes en etapas limitantes de la velocidad en la vía MEP tales como (dxs, ispD, ispF, idi) mediante expresión episomal adicional.

En algunas realizaciones, el "diseño racional" está implicado en la construcción de mutaciones específicas en proteínas tales como enzimas. Tal como se utiliza en esta memoria, "diseño racional" se refiere a la incorporación de los conocimientos de la enzima, o enzimas relacionadas, tales como su estructura tridimensional, su sitio o sitios activos, su sustrato o sustratos y/o la interacción entre la enzima y el sustrato, en el diseño de la mutación específica. Sobre la base de un enfoque de diseño racional, se pueden crear mutaciones en una enzima que puede entonces ser rastreada en cuanto a la producción incrementada de un terpenoide con relación a los niveles de control. En algunas realizaciones, las mutaciones se pueden diseñar de forma racional en base al modelado de homología. Tal como se utiliza en esta memoria, "modelado de homología" se refiere al proceso de construir un

modelo de resolución atómica de una proteína a tridimensional de una proteína homóloga relacionada.

partir de su secuencia de aminoácidos y una estructura

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transcripción de la secuencia codificadora bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes sean traducidas en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5’ resulta en la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN (1) no resulta en la introducción de una mutación de desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región del promotor para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente a ser traducido en una proteína. Por lo tanto, una región de promotor se uniría operativamente a una secuencia codificante si la región de promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de manera que el transcrito resultante se pueda traducir en la proteína o el polipéptido deseado.

Se puede utilizar una diversidad de secuencias de control de la transcripción (p. ej., secuencias de promotor/potenciador) para dirigir la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las enzimas asociadas con la invención. El promotor puede ser un promotor nativo, es decir, el promotor del gen en su contexto endógeno, que proporciona una regulación normal de expresión del gen. En algunas realizaciones, el promotor puede ser constitutivo, es decir, el promotor es no regulado, permitiendo una transcripción continua de su gen asociado. Se puede utilizar también una diversidad de promotores condicionales, tales como promotores controlados por la presencia o ausencia de una molécula.

La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras, necesarias para la expresión génica, puede variar entre especies o tipos de células, pero en general incluirá, según sea necesario, secuencias 5’ no transcritas y 5' no traducidas implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de casquete, secuencia CAAT, y similares. En particular, secuencias reguladoras 5’ no transcritas de este tipo incluirán una región de promotor que incluye una secuencia de promotor para el control transcripcional del gen operativamente unido. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias de potenciador o secuencias de activador aguas arriba, según se desee. Los vectores pueden incluir opcionalmente secuencias 5’ conductora o de señal. La elección y el diseño de un vector apropiado está dentro de la habilidad y criterio de un experto ordinario en la técnica.

Están disponibles comercialmente vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión y son conocidos para los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las células son manipuladas genéticamente mediante la introducción en las células de ADN heterólogo (ARN). Ese ADN heterólogo (ARN) es colocado bajo el control operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula huésped.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima asociada con la invención se puede introducir en una célula

o células de E.coli utilizando métodos y técnicas que son estándares en la técnica. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas mediante protocolos estándares tales como transformación, incluyendo la transformación química y la electroporación, transducción, bombardeo de partículas, etc. La expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica las enzimas asociadas con la invención también puede lograrse mediante la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma.

Células de E. coli de acuerdo con la invención pueden cultivarse en medios de cualquier tipo (rico o mínimo) y de cualquier composición. Como se entenderá por un experto normal en la técnica, la optimización de rutina permitiría el uso de una diversidad de tipos de medios. El medio seleccionado puede suplementarse con diversos componentes adicionales. Algunos ejemplos no limitativos de componentes suplementarios incluyen glucosa, antibióticos, IPTG para la inducción de genes, Suplemento de minerales traza ATCC, y glicolato. De manera similar, otros aspectos del medio, y las condiciones de crecimiento de las células pueden ser optimizados mediante experimentación rutinaria. Por ejemplo, el pH y la temperatura son ejemplos no limitativos de factores que pueden ser optimizados. En algunas realizaciones, factores tales como la elección de los medios, los suplementos de los medios y la temperatura pueden influir en los niveles de producción de terpenoides, tales como taxadieno. En algunas realizaciones, se pueden optimizar la concentración y la cantidad de un componente suplementario. En algunas realizaciones, se optimiza la frecuencia con la que los medios se suplementan con uno o más componentes suplementarios, y la cantidad de tiempo que los medios se cultivan antes de recoger un terpenoide, tal como taxadieno.

De acuerdo con aspectos de la invención, títulos elevados de un terpenoide tal como taxadieno se producen a través de la expresión recombinante de genes asociados con la invención, en una célula de E. coli. Tal como se utiliza en esta memoria "título elevado" se refiere a un título a escala en miligramos por litro (mg L-1). El título producido para

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un producto dado se verá influenciado por múltiples factores, incluyendo la elección de los medios. En algunas realizaciones, el título total de taxadieno es de al menos 1 mg L-1 . En algunas realizaciones, el título total de taxadieno es de al menos 10 mg L-1. En algunas realizaciones, el título total de taxadieno es de al menos 250 mg L-1 . Por ejemplo, el título total de taxadieno puede ser al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 , 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900 o más de 900 mg L-1, incluyendo todos los valores intermedios. En algunas realizaciones, el título total de taxadieno puede ser al menos 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2.9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,4,9, 5,0, o más de 5,0 g L-1 incluyendo cualesquiera valores intermedios.

En algunas realizaciones, el título total de taxadieno 5α-ol es al menos 1 mg L-1. En algunas realizaciones, el título total de taxadieno 5α-ol es al menos 10 mg L-1. En algunas realizaciones, el título total de taxadieno 5α-ol es al menos 50 mg L-1. Por ejemplo, el título total de taxadieno 5α-ol puede ser de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, o más de 70 mg L-1, incluyendo cualesquiera valores intermedios.

Los cultivos líquidos utilizados para cultivar las células de E. coli asociadas con la invención pueden alojarse en cualquiera de los recipientes de cultivo conocidos y utilizados en la técnica. En algunas realizaciones de producción a gran escala en un recipiente de reacción ventilado tal como un reactor de tanque agitado puede utilizarse para producir grandes cantidades de terpenoides tales como taxadieno, que se pueden recuperar del cultivo celular. En algunas realizaciones, el terpenoide se recupera de la fase gaseosa del cultivo de células, por ejemplo mediante la adición de una capa orgánica, tal como dodecano, al cultivo celular y la recuperación del terpenoide de la capa orgánica.

Terpenoides tales como taxadieno, producidos a través de métodos descritos en esta memoria tienen amplias aplicaciones, incluyendo productos farmacéuticos tales como paclitaxel (Taxol), artemisinina, ginkolidas, eleuterobina y pseudopterosinas, y muchos otros compuestos farmacéuticos potenciales. Aplicaciones adicionales incluyen compuestos utilizados en sabores y cosméticos tales como geraniol, farnesol, geranligeraniol, linalool, limoneno, pineno, cineol e isopreno. Aplicaciones adicionales incluyen compuestos para uso como biocombustibles tales como alcoholes de 5, 10 y 15 átomos de carbono de longitud. Se señala que los compuestos anteriores se producen actualmente como extractos de diversas plantas. Métodos basados en extractos de plantas son tediosos, proporcionan cantidades muy pequeñas y están limitados en cuanto a las moléculas reales que se pueden obtener de esta manera, a saber, no permiten la fácil producción de derivados que pueden poseer propiedades muy superiores a las de los compuestos originales.

Ejemplos

MÉTODOS

Cepas, plásmidos, oligonucleótidos y genes

La cepa K12 MG1655 de E. coli se utilizó como cepa huésped de toda la construcción de la cepa taxadieno. Las cepas K12MG1655 Δ (recA, endA) de E coli y K12MG1655  cepas (recA, endA) ED3 de E coli fueron proporcionados por el laboratorio del Profesor Kristala Prather en el MIT (Cambridge, MA). Un detalle de todos los plásmidos construidos para el estudio se muestra en la Tabla 2. Todos los oligonucleótidos utilizados en este estudio están contenidos en la Tabla 3.

Las secuencias de geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS )50, Taxadieno sintasa (TS)51, Citocromo P450 Taxadieno 5α-hidroxilasa (T5αOH) y NADPH:citocromo P450 reductasa de Taxus (TCPR)46 se obtuvieron deTaxus canadensis, Taxus brevifolia, Taxus cuspidate (Códigos de acceso a GenBank: AF081514, U48796, AY289209 y AY571340). Los genes fueron sintetizados por encargo utilizando los plásmidos y protocolos reseñados por Kodumal et al.52 (Detalles complementarios, Apéndice 1) para incorporar el codón de traducción de E. coli y separar sitios de restricción para fines de clonación. Los nucleótidos que corresponden a los 98 y 60 aminoácidos N-terminales de GGPPS y TS (péptido de tránsito de plastidio) se separaron y se insertó la secuencia de inserción de la traducción Met.17

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CYPLinkBamHI(a). Utilizando estos cebadores se amplificó cada uno de los ADN modificados, se digirió NdeI/BamHI y se clonó en el plásmido pACYC DUET1 digerido con NdeI/BamHI para construir los plásmidos p10At8T5αOH, p10At24T5αOH y p10At42T5αOH. La secuencia TCPR truncada (tTCPR) de 74 aminoácidos se amplificó utilizando los cebadores CPRBamHI(s) y CPRSalI(a). La secuencia tTCPR amplificada y los plásmidos p10At8T5αOH, p10At24T5αOH y p10At42T5αOH, se digirieron con BamHI/SalI y se clonaron para construir los plásmidos p10At8T5αOH-tTCPR, p10At24T5αOH-tTCPR y p10At42T5αOH-tTCPR.

Crecimiento del cultivo para el rastreo de taxadieno y análisis de taxadieno-5α-ol

Transformantes individuales de cepas de E. coli pre-manipuladas, que albergan el plásmido apropiado con la vía (MEP) aguas arriba, la vía taxadieno aguas abajo y taxadieno 5α ol-se cultivaron durante 18 h a 30°C en medio de Luria-Bertani (LB) (suplementado con antibióticos apropiados, 100 mg/mL de carbenecilinal, 34 mg/mL de cloranfenicol, 25 mg/L de kanamicina o 50 mg/L de espectinomicina). Para los cultivos a pequeña escala para rastrear las cepas manipuladas, éste pre-inóculo se utilizó para sembrar medios ricos de 2 mL recientes (5 g/L de extracto de levaduras, 10 g/L de triptona, 15 g/L de glucosa, 10 g/L de NaCl, HEPS 100 mM, 3 mL/L de Antiespumante B, pH 7,6, 100 ug/mL de carbenicilina y 34 ug/mL de cloranfenicol), a una A600 de partida de 0,1. El cultivo se mantuvo con los antibióticos apropiados e IPTG 100 mM para la inducción génica a 22°C durante 5 días.

Experimentos de biorreactores para la cepa productora de taxadieno 5a-ol.

El biorreactor Bioflo de 3-L (New Brunswick) fue montado según las instrucciones del fabricante. Un litro de medio rico con glicerol al 1% (v/v) se inoculó con 50 mL de cultivo de 8 h (A600 de ~2,2) de la cepa 26-At24T5αOH-tTCPR cultivada en medio LB que contiene los antibióticos (100 mg/mL de carbenicilina, 34 mg/mL de cloranfenicol) a las mismas concentraciones. Biorreactores de 1 L con fermentación bifásica líquido-líquido utilizando dodecano al 20% v/v. El oxígeno se suministró como aire filtrado a 0,5 v/v/m y la agitación se ajustó para mantener los niveles de oxígeno disuelto por encima del 50%. El pH del cultivo se controló a 7,0 utilizando NaOH al 10%. La temperatura del cultivo en el fermentador se controló a 30°C hasta que las células fueron cultivadas en una densidad óptica de aproximadamente 0,8, según se mide a una longitud de onda de 600 nm (OD600). La temperatura del fermentador se redujo a 22°C y las células se indujeron con IPTG 0,1 mM. Dodecano se añadió en condiciones asépticas al 20% (v/v) del volumen del medio. Durante el curso de la fermentación se vigiló la concentración de glicerol y la acumulación de acetato a intervalos de tiempo constantes. Durante la fermentación, a medida que la concentración de glicerol se agotaba por debajo de 0,5 g/L, se introdujo glicerol (3 g/L) en el biorreactor.

La fermentación se optimizó adicionalmente utilizando un cultivo alimentado discontinuo con un medio de alimentación definido que contiene extracto de levadura al 0,5% y dodecano al 20% (v/v) (13,3 g/L de KH2PO4, 4 g/L de (NH4)2HPO4, 1,7 g/L de ácido cítrico, 0,0084 g/L de EDTA, 0,0025 g/L de CoCl2, 0,015 g/L de MnCl2, 0,0015 g/L de CuCl2, 0,003 g/L de H3BO3, 0,0025 g/L de Na2MoO4, 0,008 g/L de Zn(CH3COO)2, 0,06 g/L de citrato de Fe(III), 0,0045 g/L de tiamina, 1,3 g/L de MgSO4, 10 g/L de glicerol, 5 g/L de extracto de levadura, pH 7,0). La misma composición del medio se utilizó para la fermentación de las cepas 17 y 26 con los antibióticos apropiados (cepa 17: 100 µg/mL de carbenicilina y 50 µg/mL de espectinomicina; cepa 26: 50 µg/mL de espectinomicina).

Para la cepa productora de taxadien-5α-ol, un litro de medio complejo con glicerol al 1% (v/v) se inoculó con 50 mL de un cultivo de 8 h (OD de ~ 2,2) de la cepa 26-At24T5aOH-tTCPR cultivada en medio LB que contiene 50 µg/mL de espectinomicina y 34 µg/mL de cloranfenicol). El oxígeno fue suministrado como aire filtrado a 0,5 (vvm) y la agitación se ajustó para mantener los niveles de oxígeno disuelto por encima del 30%. El pH del cultivo se controló a 7,0 utilizando NaOH al 10%. La temperatura del cultivo en el fermentador se controló a 30°C hasta que las células fueron cultivadas en una densidad óptica de aproximadamente 0,8, según se mide a una longitud de onda de 600 nm (OD600). La temperatura del fermentador se redujo a 22°C y la vía se indujo con IPTG 0,1 mM. Se añadió dodecano en condiciones asépticas al 20% (v/v) del volumen del medio. Durante el curso de la fermentación, la concentración de glicerol y la acumulación de acetato se controlaron a intervalos de tiempo constantes. Durante la fermentación a medida que la concentración de glicerol se agotaba por debajo de 0,5-1 g/L, se introdujeron 3 g/L de glicerol en el biorreactor.

Análisis GC-MS de taxadieno y taxadieno-5α-ol

Para el análisis de la acumulación de taxadieno de cultivo a pequeña escala, 1,5 mL del cultivo se sometieron a vórtice con 1 mL de hexano durante 30 min. La mezcla se centrifuga para separar la capa orgánica. Para el biorreactor 1 uL de la capa de dodecano se diluyó a 200 uL utilizando hexano. 1 ul de la capa de hexano se analizó mediante GC-MS (Varian saturn 3800 GC unido a un Varian 2000 MS). La muestra se inyectó en una columna

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metabólica de taxadieno y la acumulación de taxadieno y sus compuestos intermedios directos (Fig. 4c). Sin embargo, la serie de cepas 29-32 sólo mostró un modesto incremento en el rendimiento del crecimiento cuando se comparan los plásmidos de control vacíos con las cepas que expresan taxadieno (Fig. 4d). Esta interacción entre el crecimiento, la producción de taxadieno y el nivel de expresión también se puede ver con los vectores de expresión de aguas arriba basados en plásmidos (cepas 17 y 22). La inhibición del crecimiento era mucho mayor en la cepa de 10 copias, de alta producción de taxadieno (cepa 17) en comparación con la cepa de 20 copias, de menor producción de taxadieno (cepa 22) (Fig. 4d). Por lo tanto la toxicidad del producto y la desviación de carbono a la vía heteróloga es probable que impidan el crecimiento, en lugar del mantenimiento del plásmido.

También inesperado era el profundo efecto del vector de expresión aguas arriba sobre la expresión aguas abajo. La Fig. 4b tendría dos líneas rectas, si no hubiera interferencias entre las vías. Sin embargo, se observan ~ 3 veces cambios en la expresión de TS para los diferentes vectores de expresión MEP. Esto se debe, probablemente, a una competencia significativa por los recursos (materias primas y energía) que se retiran del metabolismo del huésped para la sobreexpresión tanto de los cuatro genes de aguas arriba como de los dos genes de aguas abajo38. En comparación con la cepa de control 25c, se observó una inhibición del crecimiento de 4 veces con la cepa 25, indicando que la alta sobreexpresión de la vía de taxadieno sintética inducía toxicidad, alterando el fenotipo de crecimiento en comparación con la sobre-expresión de la vía nativo (Fig. 4c). Sin embargo, aumentó la expresión aguas arriba, se redujo la expresión aguas abajo, de manera inadvertida en el caso de los autores de la invención, a niveles deseables para equilibrar las vías de aguas arriba y aguas abajo, reduciendo al mínimo la inhibición del crecimiento (cepa 26).

En el extremo de la sobre-expresión de proteínas, la vía MEP impulsada por el promotor T7 resultó en una inhibición severa del crecimiento, debido a la síntesis de cuatro proteínas de alto nivel (cepas 28 y 32). La expresión de los genes TS por parte de T7 no parece tener un efecto tan drástico por sí mismo. Las altas tasas de síntesis de proteínas a partir de la expresión inducida por T7 (Fig. 4ab) podría conducir a la regulación a la baja de la maquinaria de síntesis de proteínas, incluyendo los componentes de genes de referencia de la fase temprana de crecimiento, perjudica el crecimiento celular y reduce el aumento de la biomasa39,40. Los autores de la invención hipotetizaron que los fenotipos de crecimiento complejos observados son efectos acumulativos de (1) toxicidad inducida por la activación del metabolismo de isoprenoide/taxadieno, y (2) los efectos de la alta expresión de proteína recombinante. En conjunto el enfoque de manipulación de la vía multivariante-modular de los autores de la invención generó una diversidad inesperada en el metabolismo de terpenoide y su correlación con la expresión de la vía y la fisiología celular. Un diseño racional de microbios para la producción de metabolitos secundarios requerirá una comprensión de la expresión de la vía que va más allá de una comprensión lineal/independiente de las fuerzas del promotor y de los números de copias. Sin embargo, enfoques multivariados simples, tal como se emplean aquí, pueden introducir la diversidad necesaria tanto para (1) encontrar altos productores como para (2) proporcionar un panorama para la investigación sistemática de efectos de mayor orden que son dominantes, pero poco apreciados, en la manipulación de la vía metabólica.

Ejemplo 6: Ingeniería de la química de oxidación basada en Taxol P450 en E. coli.

Una característica central en la biosíntesis de Taxol es la oxigenación en múltiples posiciones de la estructura del núcleo de taxano, reacciones que se consideran que son mediadas por monooxigenasas dependientes del citocromo P45041. Después de completarse la etapa de ciclación comprometida de la vía, la olefina parental, taxa-4 5),11(12)-dieno, se hidroxila seguidamente en la posición C5 por una enzima citocromo P450, lo que representa la primera de las ocho etapas de oxigenación (del núcleo de taxano) en la ruta a Taxol (Fig. 6)42. Por lo tanto, una etapa clave hacia la manipulación de microbios productores de Taxol es el desarrollo de la química de oxidación basada en P450 in vivo. La primera etapa de oxigenación es catalizada por un citocromo P450, taxadieno 5αhidroxilasa, una monooxigenasa inusual que cataliza la reacción de hidroxilación junto con la migración del doble enlace en el taxadieno precursor de diterpeno (Fig. 5a). Los autores de la invención informan sobre la primera ampliación con éxito de la vía sintética de taxadieno a taxadien-5α-ol y presentan los primeros ejemplos de la producción in vivo de cualquier producto intermedio de Taxol funcionalizado en E. coli.

En general, la expresión funcional del citocromo P450 de vegetales es un reto43, debido a las limitaciones inherentes de las plataformas bacterianas tales como la ausencia de la maquinaría de transferencia de electrones, reductasas del citocromo P450 y la incompatibilidad de traducción de los módulos de señales de la membrana de enzimas P450, debido a la falta de un retículo endoplásmico. Recientemente, a través de la manipulación de transmembrana (TM) y de la generación de enzimas quimeras de P450 y reductasas de CPR, algunos P450s de vegetales han sido expresados en E. coli para la biosíntesis de moléculas funcionales22,44. Sin embargo, cada citocromo p450 de vegetales es único en su secuencia señal de transmembrana y características de transferencia de electrones de su homólogo reductasa45. Los estudios iniciales de los autores de la invención se centraron en la optimización de la

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expresión de taxadieno 5α-hidroxilasa sintética optimizada en codones por manipulación N-terminal de la transmembrana y la generación de enzimas quimeras a través de fusión traduccional con el participante CPR redox de las especies de Taxus, citocromo P450 reductasa de Taxus (TCPR) (Fig. 5b)42,44,46. Una de las enzimas quimeras generadas, At24T5αOH-tTCPR, era altamente eficaz en llevar a cabo la primera etapa de oxidación con más de 98% de conversión de taxadieno en taxadien-5α-ol y el subproducto 5(12)-Oxa-3(11)-ciclotaxano (OCT) (Fig. 9a).

Comparado con los otros P450s quiméricos, At24T5αOH-tTCPR proporcionó una producción dos veces mayor (21 mg/L) de taxadien-5α-ol. Asimismo, la actividad más débil de At8T5αOH-tTCPR y At24T5αOH-tTCPR resultó en la acumulación de un subproducto recientemente caracterizado, una reorganización estructural compleja de taxadieno en el éter cíclico 5(12)-Oxa-3(11)-ciclotaxano (OCT) (Fig. 9)47. El subproducto se acumulaba aproximadamente en cantidades iguales que el producto deseado taxadien-5α-ol. La formación de OCT estaba mediada por una secuencia de reacción del citocromo P450 de Taxus sin precedentes que implicaba la oxidación y ciclaciones subsiguientes47. Por lo tanto, parece probable que mediante manipulación de proteínas de las taxadieno 5ahidroxilasas, la conclusión de la reacción antes de la ciclación evitará la acumulación de tal subproducto indeseable y se podría lograr canalizar el flujo de taxadien-5α-ol.

La productividad de la cepa 26-At24T5αOH-tTCPR se redujo significativamente con relación a la de la producción taxadieno por parte de la cepa parental 26 (~ 300 mg/L) con un aumento concomitante en la acumulación del metabolito no caracterizado anteriormente descrito. No se observó acumulación de taxadieno. Aparentemente, la introducción de un plásmido de copias medias adicional (10 copias, p10T7) que porta la construcción At24T5αOHtTCPR alteró el equilibrio cuidadosamente manipulado en la vía de aguas arriba y de aguas abajo de la cepa 26. Se llevaron a cabo fermentaciones a pequeña escala en biorreactores para cuantificar la producción de alcohol por parte de la cepa 26-At24T5αOH-tTCPR. El perfil de evolución en el tiempo de la acumulación de taxadien-5α-ol (Fig. 5d) indica una producción de alcohol de hasta 58 ± 3 mg/L con una cantidad igual del subproducto OCT producido. La producción de alcohol observada era ~2400 veces mayor que la producción previa en S. cerevisiae17. Aumentos adicionales de la producción de taxadien-5α-ol son probablemente posibles a través de la optimización de la vía y la manipulación de proteínas.

El enfoque multivariado-modular de la optimización de la vía ha proporcionado muy altas cepas productoras de un precursor de Taxol crítico. Además de ello, las construcciones recombinantes han sido igualmente eficaces en la reorientación del flujo hacia la síntesis de otros compuestos farmacéuticos complejos tales como productos de mono-, sesqui-y di-terpenos (geraniol, linalool, amorfadieno y levopimaradieno) manipulados a partir de la misma vía (resultados no publicados). Por lo tanto, la manipulación de las vías realizada por los autores de la invención abre nuevas vías para bio-sintetizar productos naturales, especialmente en el contexto de terpenoides derivados microbianamente, para su uso como productos químicos y combustibles a partir de recursos renovables. Al centrarse en los precursores terpenoides universales IPP y DMAPP, era posible, primero, definir los módulos de vía críticos y, a continuación, modular la expresión tal como equilibrar de manera óptima los módulos de las vías para la conversión de precursor sin fisuras y la acumulación mínima de compuestos intermedios. Este enfoque parece ser más eficaz que las búsquedas combinatorias de grandes espacios genéticos y tampoco depende de un rastreo de alto rendimiento.

La vía MEP está energéticamente equilibrada y, por lo tanto, en conjunto es más eficiente en la conversión de glucosa o glicerol en isoprenoides. Sin embargo, durante los últimos 10 años, muchos intentos de manipular la vía MEP en E.coli para aumentar el suministro de los precursores claves IPP y DMAPP para la sobreproducción de carotenoide28,47, sesquiterpenoide23 y diterpenoide61 se encontraron con un éxito limitado. Esta ineficiencia se atribuyó a efectos reguladores desconocidos asociados específicamente con la expresión de la vía MEP en E.coli23. Aquí, los autores de la invención proporcionan evidencia de que tales limitaciones se correlacionan con la acumulación del metabolito indol, debido a la expresión no óptima de la vía, que inhibe la actividad de la vía isoprenoide. La sobreproducción de taxadieno (en condiciones de supresión de la formación de indol), establece la vía MEP como una vía muy eficiente para la biosíntesis de productos farmacéuticos y químicos de la familia de isoprenoides. Simplemente se tienen que equilibrar cuidadosamente las vías modulares según lo sugerido por el enfoque de los autores de la invención de manipulación de la vía multivariante-modular.

Para la producción microbiana con éxito de Taxol, la demostración de la decoración química del núcleo de taxadieno mediante la química de oxidación basada en P450 es esencial41. Monooxigenasas del citocromo P450 constituyen aproximadamente la mitad de las 19 etapas enzimáticas distintas en la vía biosintética de Taxol. De forma característica, estos genes muestran una inusual alta similitud de la secuencia entre sí (> 70%), pero una baja similitud (<30%) con otros P450s de vegetales14. Debido a la similitud aparente entre monooxigenasas de Taxol, que expresan la actividad adecuada para llevar a cabo la química de oxidación específica de P450 fue un desafío particular. A través de la manipulación TM y la construcción de una enzima quimera artificial con el participante

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Nº

Plásmido Origen de replicación Marcador antibiótico

1

p20T7MEP pBR322 Amp

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p20TrcMEP pBR322 Amp

3

p20T5MEP pBR322 Amp

4

p20T7MEPKmFRP pBR322 Km

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p20T5MEPKmFRP pBR322 Km

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p10TrcMEP p15A Cm

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p5TrcMEP SC101 Spect

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p20TrcGT pBR322 Amp

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p20TrcTG pBR322 Amp

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p20T5GT pBR322 Amp

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p10T7TG p15A Cm

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p5T7TG SC101 Spect

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p10At8T5αOH-tTCPR p15A Cm

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p10At24T5αOH-tTCPR p15A Cm

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p10At42T5aOH-tTCPR p15A Cm

Tabla 2. Detalle de todos los plásmidos construidos para el estudio

SEQ ID NO

Nombre del Cebador Secuencias

1

dxsNdeI(s) CGGCATATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG

2

dxsNheI(a) CGGCTAGCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG

3

idiNheI (s) imagen18

4

idiEcoRI(a) CGGAATTCGCTCACAACCCCGGCAAATGTCGG

5

ispDFEcoRI(s) imagen19

6

ispDFXhoI(a) GCGCTCGAGTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC

7

dxsidiispDFNcoI(s) TAAACCATGGGTTTTGATATTGCCAAATACCCG

8

dxsidiispDFKpnI(a) CGGGGTACCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGC

9

dxsidiispDFXhoI(a) CGGCTCGAGTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGC

10

T5AgeI(s) CGTAACCGGTGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTC

11

T5NheI(a) CTCCTTCGCTAGCTTATGCCAGCC

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GGPPSNcoI(s) imagen20

SEQ ID NO

Nombre del Cebador Secuencias

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12

GGPPSEcoRI(a) CGTAGAATTCACTCACAACTGACGAAACGCAATGTAATC

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TXSEcoRI(s) imagen24

14

TXSsaII(a) GATGGTCGACTTAGACCTGGATTGGATCGATGTAAAC

15

TXSNcoI(s) CGTACCATGGCTAGCTCTACGGGTACG

16

TXSEcoRI(a) CGTAGAATTCTTAGACCTGGATTGGATCGATGTAAAC

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GGPPSEcoRI(s) imagen25

18

GGPPSSaII(a) GATGGTCGACTCACAACTGACGAAACGCAATGTAATC

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TSXhoI(a) GATGCTCGAGTTAGACCTGGATTGGATCGATGTAAAC

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pTrcSal(s) GCCGTCGACCATCATCATCATCATC

21

pTrcXba(a) GCAGTCTAGAGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGC

22

pCLBspEI(s) CGTGTCCGGAGCATCTAACGCTTGAGTTAAGCCGC

23

pCLXbaI(a) GCAGTCTAGAGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC

24

KmFRPXhoI(s) imagen26

25

KmFRPScaI(a) GACGAGTACTGAACGTCGGAATTGATCCGTCGAC

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KmFRPSacI(s) imagen27

27

IntT7T5(s) imagen28

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IntTrc(s) imagen32

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Int(a) imagen33

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CYP17At8AANdeI( s) imagen34

SEQ ID NO

Nombre del Cebador Secuencias

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31

CYP17At24AANdeI (s) imagen38

32

CYP17At42AANdeI (s) imagen39

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CYPLinkBamHI(a) imagen40

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CPRBamHI(s) CGCGGGATCCCGCCGTGGTGGAAGTGATACACAG

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CPRSalI(a) imagen41

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DXS qPCR (s) ATTCAAAAGCTTCCGGTCCT

37

DXS qPCR (a) ATCTGGCGACATTCGTTTTC

38

TS qPCR (s) GACGAACTGTCACCCGATTT

39

TS qPCR (a) GCTTCGCGGGTAGTAGACAG

40

rrsA qPCR (s) AGGCCTTCGGGTTGTAAAGT

41

rrsa qPCR (a) ATTCCGATTAACGCTTGCAC

Tabla 3. Detalles del cebador utilizado para la clonación de plásmidos, suministro cromosómico de la vía MEP y mediciones qPCR.

Tabla 4. Secuencias de nucleótidos optimizadas en Proteínas y Codones

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Claims (1)

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