BR112012011073B1

BR112012011073B1 - Método para aumentar a produção de terpenoide em uma célula que produz um ou mais terpenoides

Info

Publication number: BR112012011073B1
Application number: BR112012011073-0A
Authority: BR
Inventors: Parayil K. Ajikumar; Gregory Stephanopoulos; Too Heng Phon
Original assignee: Massachusetts Institute Of Technology; National University Of Singapore
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2022-02-08
Also published as: CA2780415C; MY162232A; BR112012011073B8; CN102812129B; US8512988B2; KR101834020B1; EP2499257A1; EP2594648B1; US10227597B2; US20140024089A1; CN102812129A; BR112012011073A2; US9796980B2; WO2011060057A1; US20110189717A1; US9359624B2; US20170002366A1; US20180080035A1; JP2013510573A; CA2780415A1

Abstract

manipulação microbiana para a produção de produtos químicos e farmacêuticos a partir da via isoprenoide. a invenção refere-se à expressão recombinante de uma enzimal taxadieno sintase e a uma enzima geranilgeranil disfosfato sintase (ggpps) em células e à produção de terpenoides.

Description

Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica o benefício em 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório Americano No. de Série 61/280.877, intitulado “Microbial Engineering for the Production of Chemical and Pharmaceutical Products from Isoprenoid Pathway”, depositado no dia 10 de novembro de 2009, o Pedido Provisório Americano No. de Série 61/388.543, intitulado “Microbial Engineering for the Production of Chemical and Pharmaceutical Products from Isoprenoid Pathway”, depositado no dia 30 de setembro de 2010, as descrições completas os quais sendo aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

Vantagens do Governo

[002] Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health sob o Número de Referência 1-R01-GM085323-01A1. O governo tem certos direitos nesta invenção.

Campo da Invenção

[003] A invenção refere-se à produção de um ou mais terpenoides através de manipulação microbiana.

Antecedentes da Invenção

[004] O taxol e os seus análogos estruturais foram reconhecidos como os fármacos anticâncer mais potentes e comercialmente bem sucedidos introduzidos na última década.1 Taxol foi isolado pela primeira vez a partir da casca do Teixo do Pa- cífico,2 e métodos de produção em fase inicial requereram o sacrifício de duas a quatro árvores totalmente desenvolvidas para fornecer a dosagem suficiente para um paciente.3 A complexidade estrutural do taxol necessitou de uma via de síntese química complexa que exige de 35 a 51 etapas com o mais alto rendimento de 0,4%.4,5,6 No entanto, uma via semissintética foi concebida por meio da qual o inter- mediário biossintético bacatina III foi isolado pela primeira vez a partir de fontes vegetais e foi subsequentemente convertido em Taxol.7 Embora essa abordagem e subsequentes esforços de produção à base de cultura e células vegetais tenham diminuído a necessidade de coletar o teixo, a produção ainda depende de processos de base vegetal8 com limitações associadas de produtividade e escalabilidade, e as restrições sobre o número de derivados do taxol que podem ser sintetizados em busca de fármacos mais eficazes.9,10

Resumo da Invenção

[005] Os recentes desenvolvimentos na manipulação metabólica e biologia sintética oferecem novas possibilidades para a superprodução de produtos naturais complexos através de hospedeiros microbianos mais tecnicamente acesíveis.11,12 Embora tenha sido feito um notável progresso na elucidação do mecanismo biossin- tético do Taxol em Taxus,13-16, cepas produtoras de Taxol comercialmente relevantes escaparam de tentativas anteriores visando a transferência dessa maquinaria bios- sintética complexa em um hospedeiro microbiano.17,18. No entanto, como acontece com outros produtos naturais, a produção microbiana através de cepas metabolica- mente manipuladas oferece economia atraente e um grande potencial para a síntese de um gama diversificada de novos compostos com atividade anticancerosa ou outra atividade farmacêutica.19,20

[006] A via metabólica para o taxol e os seus análogos consiste em uma via isoprenoide à montante, que é nativa para E. coli, e uma via terpenoide à jusante heteróloga (Figura 6). As vias do ácido mevalônico (MVA) ou fosfato de metileritritol (MEP) à montante podem produzir os dois blocos de construção comuns, pirofosfato de isopentenila (IPP) e pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), de que o Taxol e outros compostos isoprenoides são formados.12 Estudos recentes destacaram a engenharia das vias à montante acima para suportar a biossíntese de isoprenoides heterólogos, como o licopeno e o ácido artemisinínico.21-23 A via do taxadieno à jusante foi re- construída em E. coli mas, até o momento, os títulos não excederam 1,3 mg/L.24

[007] As abordagens de manipulação metabólica racional acima se focaram na via terpenoide à montante (MVA ou MEP) ou à jusante, assumindo implicitamente que as modificações são aditivas, isto é, que apresentam um comportamento line- ar.25-27 Embora esta abordagem pode gerar aumentos moderados no fluxo, ela geralmente ignora efeitos não específicos, tais como a toxicidade de metabólitos intermediários, efeitos celulares dos vetores usados para a expressão e vias desconhecidas ocultas que podem competir com a via principal e desviar o fluxo para longe do alvo desejado. Abordagens combinatórias podem evitar tais problemas, pois elas oferecem a oportunidade de amostrar de forma adequada o parâmetro espaço e de elucidar estas interações não lineares complexas.21,28,29,30 No entanto, elas exigem uma varredura de alto potencial, que frequentemente não está disponível para muitos produtos naturais desejáveis.31 Adicionalmente outra classe de métodos de otimização de via exploraram o espaço combinatorial de diferentes fontes de genes heterólogos que compreendem a via de interesse.32 Ainda dependentes de um ensaio de alto potencial, estes métodos geralmente ignoram a necessidade de determinar um nível ótimo de expressão para os genes da via individual e, como tais, eles se mostraram menos eficazes na estruturação de uma via ótima.

[008] No presente trabalho, como um exemplo dos aspectos da invenção, nós focamos no equilíbrio ótimo entre a via de formação de IPP, à montante, com a via terpenoide à jusante da síntese de taxadieno. Isto é conseguido através do agrupamento da via de nove enzimas em dois módulos - um módulo da via nativa, à montante, de quatro genes (MEP) e uma via heteróloga à jusante, de dois genes para o taxadieno (Figura 1). Utilizando esta configuração básica, os parâmetros tais como o efeito do número de cópias de plasmídeo sobre a fisiologia celular, a ordem do gene e força do promotor em um cassete de expressão, e a integração cromos- sômica são avaliados com relação aos seus efeitos sobre a produção de taxadieno. Esta abordagem combinatorial modular e multivariável nos permite amostrar eficientemente os parâmetros principais que afetam o fluxo da via sem a necessidade de uma tela varredura de alto potencial. A busca multivariada através dos promotores múltiplos e números de cópia para cada módulo da via revela um cenário de fluxo de taxadieno altamente não linear com um máximo global exibindo um aumento de 15.000 vezes na produção de taxadieno em relação ao controle, produzindo se 300 mg/L de produção de taxadieno em fermentações de pequena escala. Além disso, foi concebida a química de oxidação à base de P450 na biossíntese de taxol em E. coli, com as nossas cepas manipuladas melhorando a produção de taxadien-5α-ol 2400 vezes em relação ao estado da técnica. Estas melhorias desbloqueiam o potencial para a produção em larga escala de milhares de terpenoides valiosos por sistemas microbianos bem estabelecidos.

[009] Aspectos da invenção referem-se aos métodos que envolvem a expressando de modo recombinante de uma enzima taxadieno sintase e de uma enzima difosfato de geranilgeranila sintase (GGPPS) em uma célula que superexpressa um ou mais componentes da via não mevalonato (MEP). Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, tal como uma célula de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a célula bacteriana é uma célula gram-positiva, tal como uma célula de Bacillus. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de levedura, tal como uma célula de Saccharomyces ou uma célula de Yarrowia. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de alga ou a uma célula vegetal.

[0010] Em algumas modalidades, a enzima taxadieno sintase é uma enzima Taxus, tal como uma enzima de Taxus brevifolia. Em algumas modalidades, a enzima GGPPS é uma enzima de Taxus, tal como uma enzima de Taxus canadenis. Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima taxadieno sintase e/ou o gene que codifica a enzima GGPPS e/ou os genes que codificam um ou mais componentes da via MEP é expresso a partir de um ou mais plasmídeos. Em algumas modali- dades, o gene que codifica para a enzima taxadieno sintase e/ou o gene que codifica a enzima GGPPS e/ou os genes que codificam um ou mais componentes do MEP é incorporado no genoma da célula.

[0011] Em algumas modalidades, um ou mais componentes da via não me- valonato (MEP) são selecionados do grupo consistindo em dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. Em certas modalidades, dxs, idi, ispD e ispF são superexpressos. Por exemplo, dxs, idi, ispD e ispF podem ser superexpressos no operon dxs-idi-idpDF. Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima taxa- dieno sintase e o gene que codifica a enzima GGPPS são expressos em conjunto em um operon.

[0012] Em algumas modalidades, a célula expressa ainda um taxadieno 5α- hidroxilase (T5αOH) ou uma porção cataliticamente ativa da mesma. Em certas modalidades, a enzima T5αOH ou uma porção cataliticamente ativa da mesma está fundida com uma enzima citocromo P450 redutase ou com uma porção catalitica- mente ativa da mesma. Por exemplo, a enzima T5αOH pode ser At24T5αOH-tTCPR.

[0013] A expressão da enzima taxadieno sintase, a enzima GGPPS e um ou mais componentes da via MEP pode ser equilibrados para maximizar a produção do taxadieno. Métodos associados com a invenção podem ainda englobar a cultura de uma célula para produzir taxadieno ou taxadieno-5α-ol. Em algumas modalidades, pelo menos, 10 mg L-1 de taxadieno é produzido. Em certas modalidades, pelo menos 250 mg L-1 de taxadieno é produzido. Em algumas modalidades, pelo menos 10 mg L-1 de taxadieno-5α-ol é produzido. Em certas modalidades, pelo menos, 50 mg L-1 de taxadieno-5α-ol é produzido. Em algumas modalidades, a porcentagem de conversão de taxadieno em taxadieno-5α-ol e o subproduto 5(12)-Oxa-3(11)- ciclotaxano é de pelo menos 50%, pelo menos 75% ou pelo menos 95%.

[0014] Métodos associados com a invenção podem ainda compreender a recuperação do taxadieno ou taxadieno-5α-ol a partir da cultura de células. Em algu- mas modalidades, o taxadieno ou taxadieno-5α-ol é recuperado da fase gasosa enquanto, em outras modalidades, uma camada orgânica é adicionada à cultura de células, e o taxadieno ou taxadieno-5α-ol é recuperado a partir da camada orgânica.

[0015] Aspectos do invento referem-se às células que superexpressam um ou mais componentes da via do não mevalonato (MEP), e que expressam de forma recombinante uma enzima taxadieno sintase e uma enzima difosfato de gera- nilgeranila sintase (GGPPS). Em algumas modalidades, a célula é uma célula bac- teriana, tal como uma célula de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a célula bacteriana é uma célula gram-positiva, tal como uma célula de Bacillus. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de levedura, tal como uma célula Saccha- romyces ou uma célula Yarrowia. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de alga ou a uma célula vegetal.

[0016] Em algumas modalidades, a enzima taxadieno sintase é uma enzima Taxus, tal como uma enzima Taxus brevifolia. Em algumas modalidades, a enzima GGPPS é uma enzima Taxus, tal como uma enzima Taxus canadenis. Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima taxadieno sintase e/ou o gene que codifica a enzima GGPPS e/ou os genes que codificam os um ou mais componentes da via MEP é expresso a partir de um ou mais plasmídeos. Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima taxadieno sintase e/ou o gene que codifica a enzima GGPPS e/ou os genes que codificam um ou mais componentes do MEP é incorporado no genoma da célula.

[0017] Em algumas modalidades, o um ou mais componentes da via não mevalonato (MEP) é selecionado a partir do grupo consistindo em dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. Em certas modalidades, dxs, idi, ispD e ispF são superexpressos. Por exemplo, dxs, idi, ispD e ispF podem ser superexpressos no operon dxs-idi-idpDF. Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima taxadieno sintase e o gene que codifica a enzima GGPPS são expressos em conjun- to em um operon. Em algumas modalidades, a expressão da enzima taxadieno sin- tase, a enzima GGPPS e um ou mais componentes da via MEP são equilibrados para maximizar a produção do taxadieno.

[0018] Em algumas modalidades, a célula expressa ainda uma taxadieno 5α- hidroxilase (T5αOH) ou uma porção cataliticamente ativa da mesma. Em certas modalidades, a enzima T5αOH ou uma porção cataliticamente ativa da mesma está fundida com uma enzima citocromo P450 redutase ou uma porção cataliticamente ativa da mesma. Por exemplo, a enzima T5αOH pode ser At24T5αOH-tTCPR. Em algumas modalidades, a célula produz taxadieno e/ou taxadieno-5α-ol.

[0019] Os aspectos da invenção dizem respeito aos métodos para a seleção de uma célula que apresenta a produção aumentada de um terpenoide, incluindo a criação ou a obtenção de uma célula que superexpressa um ou mais componentes da via não mevalonato (MEP), produzindo terpenoide a partir da célula, comparando a quantidade de terpenoide produzido a partir da célula com a quantidade de terpe- noide produzido em uma célula de controle, e selecionando uma primeira célula melhorada que produz uma maior quantidade de terpenoide do que uma célula de controle, em que uma primeira célula melhorada que produz uma maior quantidade de terpenoide do que a célula de controle é uma célula que apresenta produção melhorada de terpenoide.

[0020] Em algumas modalidades, a célula expressa de forma recombinante uma enzima terpenoide sintase e/ou uma sintase enzima difosfato de geranilgeranila sintase (GGPPS). Os métodos podem ainda compreender alterar o nível de expressão de um ou mais dos componentes da via não mevalonato (MEP), a enzima ter- penoide sintase e/ou a enzima difosfato de geranilgeranila sintase (GGPPS) na primeira célula melhorada para produzir uma segunda celular melhorada, e comparar a quantidade de terpenoide produzido a partir da segunda célula melhorada com a quantidade de terpenoide produzido na primeira célula melhorada, em que uma se- gunda célula melhorada que produz uma maior quantidade de terpenoide do que a primeira célula melhorada é uma célula que apresenta produção melhorada de ter- penoide. Em algumas modalidades, a enzima terpenoide sintase é uma enzima ta- xadieno sintase. A célula pode ainda expressar de forma recombinante qualquer um dos polipeptídeos associados com a invenção.

[0021] Aspectos da invenção dizem respeito aos polipeptídeos isolados compreendendo uma enzima taxadieno 5α-hidroxilase (T5αOH) ou uma porção cata- liticamente ativa da mesma fundida com uma enzima citocromo P450 redutase ou uma porção cataliticamente ativa da mesma. Em algumas modalidades, a enzima citocromo P450 redutase é uma citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR). Em certas modalidades, a taxadieno 5α-hidroxilase e TCPR são unidos por um ligante tal como GSTGS (SEQ ID NO: 50). Em algumas modalidades, a taxadieno 5α- hidroxilase e/ou TCPR são truncados para remover toda ou parte da região trans- membranar. Em certas modalidades, 8, 24, ou 42 aminoácidos N-terminais de taxa- dieno 5α-hidroxilase são truncados. Em certas modalidades, 74 aminoácidos de TCPR são truncados. Em algumas modalidades, um peptídeo adicional é fundido com taxadieno 5α-hidroxilase. Em certas modalidades, o peptídeo adicional é de 17a hidroxilase bovina. Em certas modalidades, o peptídeo é MALLLAVF (SEQ ID NO: 51). Em certas modalidades, o polipeptídeo isolado é At24T5αOH-tTCPR. Aspectos da invenção incluem também moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos associados com a invenção e as células que expressam de forma recombinante qualquer um dos polipeptídeos associados com a invenção.

[0022] Aspectos da invenção referem-se aos métodos para aumentar a produção de terpenoide em uma célula que produz um ou mais terpenoides. Os métodos incluem o controle do acúmulo de indol na célula ou em uma cultura de células, aumentando assim a produção de terpenoide em uma célula. Qualquer uma das células aqui descritas pode ser utilizada nos métodos, incluindo células bacterianas, tais como células de Escherichia coli; células Gram-positivas, tais como as células de Bacillus; células de levedura, tais como as células de Saccharomyces ou as células de Yarrowia; células de algas; célula vegetal; e qualquer uma das células modificadas aqui descritas.

[0023] Em algumas modalidades, a etapa de controlar a acumulação de in- dol na célula ou em uma cultura de células inclui balancear a via à montante de não mevalonato isoprenoide com as vias de síntese de produtos à jusante e/ou modificar ou regular a via de indol. Em outras modalidades, a etapa de controlar a acumulação de indol na célula ou em uma cultura de células inclui ou inclui adicionalmente a remoção do indol acumulado a partir da fermentação através de métodos químicos, tal como pelo uso de absorventes ou sequestradores.

[0024] Os um ou mais terpenoides produzidos pela(s) célula(s) ou na cultura podem ser um monoterpenoides, um sesquiterpenoide, um diterpenoide, um triter- penoide ou um tetraterpenoide. Em certas modalidades, os terpenoides são taxadie- no ou qualquer precursor taxol.

[0025] Aspectos da invenção referem-se aos métodos que incluem a medição da quantidade ou concentração de indol em uma célula que produz um ou mais terpenoides ou em uma cultura de células que produzem um ou mais terpenoides. Os métodos podem incluir a medição da quantidade ou concentração de indol duas ou mais vezes. Em algumas modalidades, a quantidade ou concentração medida de indol é usada para guiar um processo de produção de um ou mais terpenoides. Em algumas modalidades, a quantidade ou concentração medida de indol é utilizada para orientar a construção da cepa.

[0026] Estes e outros aspectos da invenção, bem como várias modalidades da mesma, se tornarão mais evidentes em referência aos desenhos e à descrição detalhada da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

[0027] Os desenhos em anexo não se destinam a ser desenhados em escala. Nos desenhos, cada componente idêntico ou quase idêntico que é ilustrado nas várias figuras é representado por um numeral semelhante. Para fins de clareza, nem todos os componentes podem ser rotulados em cada desenho. Nos desenhos:

[0028] Figura 1. A manipulação da via isoprenoide multivariada modular revela forte resposta não linear na acumulação de terpenoides. Para aumentar o fluxo através da via MEP à montante, as etapas enzimáticas de estrangulamento relatadas alvejadas (dxs, idi, ispD e ispF) para a superexpressão de um operon (dxs-idi- ispDF).28 Para canalizar o fluxo excedente dos precursores isoprenoides universais, IPP e DMAPP, para a biossíntese de taxol, um operon sintético dos genes à jusante da GGPP sintase (G) e taxadieno sintase (T)16 foi construído. As vias do isoprenoi- des à montante e sintética do taxadieno à jusante foram colocadas sob o controle de promotores indutíveis para controlar as suas expressões de genes relativas. (a) Es-quema dos dois módulos, a via de isoprenoide MEP à montante nativa (esquerda) e a via sintética do taxadieno (direita). Na rede biossintética de E. coli, a via isoprenoi- de MEP é iniciada pela condensação do precursores gliceraldeído-3 fosfato (G3P) e piruvato (PYR) da glicólise. A bifurcação da via do taxol inicia a partir dos precursores de isoprenoide universais IPP e DMAPP para formar o primeiro precursor “linear” difosfato de geranilgeranila, e em seguida o taxadieno “cíclico”, um intermediário chave e envolvido com o taxol. O taxadieno de olefina cíclica é submetido a vários ciclos de oxidações estereoespecíficas, acilações, benzoilação com a montagem da cadeia lateral para, em última análise, formar taxol. (b) Esquema da abordagem de manipulação da via isoprenoide modular multivariada para sondar a resposta não linear no acúmulo de terpenoides a partir de células manipuladas da via à montante e à jusante. A expressão das vias à montante e à jusante é modulada pela variação da força do promotor (Trc, T5 e T7) ou pelo aumento do número de cópias usando plasmídeos diferentes. A variação da expressão da via à montante e à jusante for- nece máximos diferentes na acumulação de taxadieno.

[0029] Figura 2. Otimização da produção de taxadieno através da regulação da expressão das vias modulares à montante e à jusante. (a) Resposta no acúmulo de taxadieno para o aumento nas intensidades da via à montante para valores constantes da via à jusante. (b) A dependência da via à jusante pelas constantes aumenta na intensidade da via à montante. Os máximos locais múltiplos observados no taxadieno dependem do aumento da intensidade de expressão da via à montante ou à jusante. (c) Resposta do taxadieno a partir das linhagens manipuladas (17-24) com altas superexpressões da via à montante (20-100) com duas expressões à jusante diferentes (~30 e ~60) para identificar a resposta ao taxadieno com expressões equilibradas. A expressão da via à jusante a partir do plasmídeo de baixo número de cópias (p5 e p10), sob o promotor forte operon T7TG foi usado para modular essas expressões. Deve-se observar que tanto a via à montante quanto à jusante expressas de diferentes plasmídeos com diferentes promotores podem impor ônus metabólicos oriundos de plasmídeos. (d) Modulação da via à montante com a intensidade do promotor aumentada a partir do cromossomo com duas expressões à jusante diferentes (~30 e ~60) para identificar o espaço de busca faltante com efeitos tóxicos reduzidos (cepas 25-32). (e) Detalhes genéticos das cepas produtoras de taxadieno. Os números correspondentes às cepas diferentes e o seu genótipo correspondente, E - E. coli K12mG1655 ΔrecAΔenda, EDE3-E. coli K12mG1655 ΔrecAΔenda com constructo de T7 RNA polimerase DE3 no cromossomo, MEP - operon dxs-idi-ispDF, operon GT-GPPS-TS, operon TG-TS-GPPS, cópia Ch1 - 1 no cromossomo, promo-tor Trc - Trc , promotor T5 - T5, promotor T7 - T7, plasmídeo de cópia p5, p10, p20 - ~5 (SC101), ~10 (p15) e ~20 (pBR322).

[0030] Figura 3. O metabolito se correlaciona inversamente com a produção de taxadieno. (a) Espectro de massa do metabólito que foi detectado para se correlacionar inversamente com a produção de taxadieno nos constructos da cepa da fi- gura 2. Os picos característicos observados do metabólito são 233, 207, 178, 117, 89 e 62. (b) Correlação entre o subproduto isoprenoide da figura 3a e taxadieno. As cepas 26-29 e 30-32, todas com expressão da via à montante cromossomicamente integrada, foram escolhidas para comparação consistente. Nas cepas 26-29 e 30-32, a expressão à montante aumentou pela modificação dos promotores de Trc, a T5 e T7, respectivamente. Os dois grupos de cepas diferem apenas na expressão da via à jusante com o segundo conjunto (30-32) possuindo duas vezes o nível de expressão do primeiro. Com o primeiro conjunto, o equilíbrio ótimo é conseguido com a cepa 26, que utiliza o promotor Trc para a expressão da via à montante e também exibe o menor acúmulo de metabólito. Com as cepas 30-32, a cepa 31 mostra o menor acúmulo de metabólito e a mais alta produção de taxadieno. Os dados demonstram a correlação inversa observada entre a produção de metabólito desconhecido e de taxadieno.

[0031] Figura 4. Níveis de expressão do gene transcricional da via à montante e à jusante e alterações na fisiologia celular de cepas manipuladas. A expressão relativa dos primeiros genes no operon da via à montante (DXS) e à jusante (TS) é quantificada por qPCR. Perfis de expressão semelhantes foram observados com os genes à jusante dos operons. Os números da cepa correspondentes são mostrados no gráfico. (a) Nível de transcrição relativa do gene DXS quantificado a partir de diferentes expressões à montante modulado usando promotores e plasmídeos em duas diferentes expressões à jusante. (b) Nível de transcrito relativo da expressão do gene TS quantificado a partir de duas expressões à jusante diferentes moduladas usando os plasmídeos p5T7 e p10T7 sob diferentes expressões à montante. A nossa análise da expressão gênica suportou diretamente a hipótese, com o aumento do número de cópias de plasmídeo (5, 10 e 20) e intensidade do promotor (TRC, T5 e T7) a expressão das vias à montante e à jusante pode ser modulada. (c) Crescimento celular das cepas manipuladas 25-29. O crescimento do fenótipo foi afetado pela ativação do metabolismo de isoprenoide (cepa 26), a expressão da proteína recom- binante (cepa 25) do ônus metabólico oriundo do plasmídeo (cepas de controle vs manipulada) e (d) fenótipos de crescimento das cepas 17, 22, 25-32. As linhas de cor preta são a cepas manipuladas produtoras de taxadieno e as linhas de cor cinza são as cepas de controle sem expressão à jusante transportando um plasmídeo vazio, com sítios de promotor e de clonagem múltipla. O crescimento foi correlacionado com a ativação do metabolismo terpenoide, com o ônus metabólico oriundo do plasmídeo, bem como da expressão da proteína recombinante.

[0032] Figura 5. Química de oxidação de p450 de Taxol manipulada em E. coli. (a) Esquema da conversão de taxadieno em taxadieno 5α-ol em Taxol. (b) Manipulação transmembranar e construção da proteína quimera de um componente de taxadieno 5α-ol hidroxilase (T5αOH) e citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR). 1 e 2 representa as proteínas de comprimento total de T5αOH e TCPR identificadas com regiões TM de 42 e 74 aminoácidos, respectivamente, 3 - enzimas quimera geradas a partir de três diferentes constructos T5aOH TM manipulados, (At8T5αOH, At24T5αOH e At42T5αOH construídos por fusão de peptídeos sintéticos de 8 resíduos (A) para T5aOH truncado de 8, 24 e 42 AA) através de uma fusão de tradução com TCPR truncado de 74 AA (tTCPR) utilizando peptídeo ligante GSTGS de 5 resíduos. (c) Atividade funcional dos constructos At8T5αOH-tTCPR, At24T5αOH- tTCPR e At42T5αOH-tTCPR transformados na cepa produtora de taxadieno 18. (d) Perfil do progresso de tempo do acúmulo de taxadien-5α-ol e perfil de crescimento da cepa 18-At24T5aOH-tTCPR fermentada em um biorreator de 1L.

[0033] Figura 6. Esquema biossintético para a produção de taxol em E. coli. Esquemas dos dois módulos, a via isoprenoide à montante nativa (à esquerda) e a via do Taxol sintética (direita). Na rede biossintética de E. coli, divergência da via MEP isoprenoide inicia a partir dos precursores de gliceraldeído-3 fosfato (G3P) e piruvato (PYR) a partir da glicólise (I-V). A bifurcação da via do taxol começa a partir do precursor isoprenoide de E. coli IPP e DMAPP para o precursor difosfato de ge- ranilgeranila “linear” (VIII), taxadieno “cíclico” (IX), taxadieno 5α-ol “oxidado” (X) para múltiplos ciclos de oxidações, acilações, benzoilações e epoxidação estereoespecí- fica para o precursor inicial Bacatina III (XII) e, finalmente, com a montagem da cadeia lateral para o Taxol (XIII). DXP - 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato, MEP-2C-metil-D- eritritol-4-fosfato, CDP-ME - 4-difosfocitidil-2Cmetil-D-eritritol, CDP-MEP - 4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato, ME-CPP - 2C-metil-D-eritritol-2,4- ciclodifosfato, IPP -isopentenil difosfato, DMAPP - difosfato de dimetilalila. Os genes envolveram as vias biossintéticas de G3P e PYR ao taxol. DXS-1-desóxi-D-xilulose- 5-fosfato sintase, ispC-1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase, IspD-4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase, IspE-4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol qui- nase, IspF-2C-metil-D-eritritol-2,4-ciclodifosfato sintase, IspG-1-hidróxi-2-metil-2-(E)- butenil-4-difosfato sintase, IspH-4-hidróxi-3-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato-redutase, IDI-isopentenil-difosfato isomerase, GGPPS - difosfato de geranilgeranila sintase, taxadieno sintase, taxoide 5α-hidroxilase, taxoide-5α-O-acetiltransferase, taxoide 13α-hidroxilase, taxoide 10β-hidroxilase, taxoide 2α-hidroxilase, taxoide 2-O- benzoiltransferase, taxoide 7β-hidroxilase, taxoide 10-O-acetiltransferase, taxoide 1β-hidroxilase*, taxoide 9α-hidroxilase, taxoide 9-ceto-oxidase*, taxoide C4,C20-β- epoxidase*, fenilalanina aminomutase, cadeia lateral da CoA-ligase*, taxoide 13 O- fenilpropanoiltransferase, taxoide 2’-hidroxilase*, taxoide 3’-N- benzoiltransferase.216,219 * genes marcados ainda estão para ser identificados ou caracterizados.

[0034] Figura 7. Vezes de melhoria na produção de taxadieno a partir da busca da expressão da via modular. (A) Resposta de taxadieno em vezes de melhoria a partir de todos os máximos observados a partir das Figuras 2a, b, e c, em comparação com a cepa 1. As 2,5 vezes de diferença entre os dois maiores máximos (cepa 17 e 26) e de 23 vezes (cepa 26 e 10) com o menor indica que falta resultados de resposta ótimos em títulos significativamente mais baixos.

[0035] Figura 8. Metabólito (a) Correlação entre taxadieno com o acúmulo de metabólito. O acúmulo de metabólito a partir da cepa manipulada é antiproporcio- nalmente relacionado com a produção de taxadieno em uma forma exponencial. O coeficiente de correlação para esta relação foi determinado como sendo de 0,92 (b) Perfil de GC representativo das cepas 26-28 para demonstrar a mudança no acúmulo de taxadieno e de metabólito. Os números no cromatograma 1 e 2 correspondem aos picos de metabólito e de taxadieno, respectivamente. (c) Perfil de GC-MS do metabólito (1) e de taxadieno (2), respectivamente. Os picos característicos observados do metabolito são 233, 207, 178, 117, 89 e 62. m/z iônico característico para Taxa-4(20),11,12-dieno é 272(P+), 257 (P+-CH3), 229 (P+-C3H7); 121, 122, 123 (agrupamento do fragmento do anel C).60 O pico marcado com uma estrela é o padrão interno de cariofileno.

[0036] Figura 9. Perfis de GC-MS e produção de taxadieno/taxadieo-5α-ol a partir da enzima quimera artificial manipulada na cepa 26. (a) perfil de GC do extrato de hexano:éter (8:2) a partir dos três constructos (A-At8T5αOH-tTCPR, t24T5αOH- tTCPR e At42T5αOH-tTCPR) transferidos para a cepa 26 e fermentados durante 5 dias. Marcadores 1, 2 e 3 nos picos correspondendo ao taxadieno, taxadien-5α-ol e 5(12)-Oxa-3(11)-ciclotaxano (OCT), respectivamente. (b) A produção de taxa- 4(20),11,12-dien-5α-ol e OCT quantificada a partir das três cepas. (c) e (d) perfil de GC-MS de taxa-4(20),11,12-dien-5α-ol e OCT e os picos correspondendo à fragmentação foi comparado com os padrões autênticos e relatórios anteriores42,47 A análise de GC-MS confirmo a identidade do espectro de massa e a taxa-4(20),11,12-dien- 5α-ol autêntica com m/z de íons característico 288(P+), 273(P+-H2O), 255 (P+-H2O- CH3).

[0037] A figura 10 apresenta um esquema descrevendo a via biossintética terpenoide e os produtos naturais produzidos por esta via.

[0038] A figura 11 apresenta um esquema descrevendo a modulação da via à montante para amplificar a produção de taxadieno.

[0039] A figura 12 apresenta um esquema descrevendo a modulação da via à jusante para amplificar a produção de taxadieno.

[0040] A figura 13 apresenta um esquema indicando que o desvio da via re- cém-identificado não é a característica da via sintética à jusante.

[0041] Figura 14. Força da via correlaciona-se com os níveis de expressão gênico transcricionais. (c) expressão relativa dos genes idi, ispD e ispF com crescente intensidade da via à montante e intensidade à jusante em 31 unidades arbitrárias, e (d) expressão relativa dos genes idi, ispD e ispF com crescente intensidade à montante e à jusante da via em 61 unidades arbitrárias. Como esperado, a expressão gênica aumentou conforme a intensidade da via à montante aumentou. Os números da cepa correspondente são indicados no gráfico de barras. A expressão relativa foi quantificada usando a expressão do gene de controle rrsA. Os dados são a média +/- SD para quatro replicatas.

[0042] Figura 15. Impacto do acúmulo do subproduto metabólico indol na produção de taxadieno e no crescimento. (a) Correlação inversa entre taxadieno e indol. As cepas 26 a 28 e 30 a 32, todas com expressão da via à montante cromos- somicamente integrada, foram escolhidas para comparação consistente. Os dois conjuntos de cepas diferem apenas na expressão da via à jusante com o segundo conjunto (30 a 32) tendo duas vezes o nível de expressão do primeiro. Nas cepas 26 a 28 e 30 a 32, a expressão à montante aumentou pela mudança dos promotores de Trc, para T5 e T7, respectivamente. Com o primeiro conjunto, o equilíbrio ótimo é conseguida com a cepa 26, que usa o promotor Trc para a expressão da via à montante e também apresenta o menor acúmulo de indol. Com as cepas 30 a 32, a cepa 31 apresenta o menor acúmulo de indol e a maior produção de taxadieno. As vezes de melhorias são relativas às cepas 25 e 29, respectivamente, para os dois conjun- tos. (b) Efeito do indol externamente introduzido na produção de taxadieno para a cepa de alta produção 26. Diferentes concentrações de indol foram introduzidas em culturas de células cultivadas em meio mínimo com extrato de levedura 0,5%. A produção de taxadieno foi significativamente reduzida conforme a concentração de indol aumentou de 50 mg/L para 100 mg/L. (c) Efeito de indol externamente introduzido no crescimento celular para as cepas manipuladas de E. coli. Os dados são média +/- SD para três replicatas. As cepas sem a via à jusante e com diferentes intensidades da via à montante (1, 2, 6, 21, 40 e 100) foram selecionadas. A cepa 26, o grande produtor de taxadieno, exibe a mais forte inibição.

[0043] Figura 16. Metabólito desconhecido identificado como indol. (A) e (a) Cromatogramas de cromatografia a gás e espectro de massa do metabolito desconhecido extraído usando hexano da cultura de células. (B) e (b) correspondem ao cromatograma de cromatografia a gás e espectro de massa do indol puro dissolvido em hexano. Além disso para confirmar a identidade química, o metabólito foi extraído a partir do caldo de fermentação usando a extração com hexano e purificado por cromatografia em coluna de sílica usando hexano:acetato de etila (8:2) como eluen- te. A pureza do composto foi confirmada por CCF e GC-MS. Os espectros de RMN 1H e RMN 13C confirmaram a identidade química do metabólito como indol. (c) O espectro de RMN 1H do indol extraído a partir de cultura de células (CDCl3, 400 MHz) δ: 6,56 (d, 1H, Ar C-H), 7,16 (m, 3H, Ar C-H), 7,38 (d, 1H, Ar C-H), 7,66 (d, 1H, Ar CH), 8,05 (b, 1H, Indol NH), (d) 13CNMR δ: 135,7, 127,8, 124,2, 122, 120,7, 119,8, 111, 102,6. (e) é o espectro de RMN 1H de indol puro.

[0044] Figura 17. Cultivo de alimentação em lote de cepas manipuladas no biorreator de 1L. As durações de tempo de acúmulo de taxadieno (a), crescimento celular (b), acúmulo de ácido acético (c) e adição de substrato (glicerol) total (d) para as cepas 22, 17 e 26 durante 5 dias de cultivo em biorreator de alimentação em lote em frascos de biorreator de 1L sob pH controlado e condições de oxigênio com meio mínimo e extrato de levedura de 0,5%. Depois de o glicerol se esgotar até ~0,5 a 1 g/L no fermentador, 3 g/L de glicerol foram introduzidos no biorreator durante a fermentação. Os dados são as médias de dois biorreatores em replicata.

Descrição Detalhada da Invenção

[0045] O taxol é um potente fármaco anticâncer isolado como um produto natural de teixo do Pacífico Taxus brevifolia. No entanto, a produção confiável e barata de análogos de taxol ou taxol por vias de produção tradicionais de extratos vegetais é limitada. Aqui, nós relatamos uma abordagem modular multivariada para a manipulação da via metabólica para amplificar ~ 15000 vezes a produção de taxadi- eno em uma Escherichia coli manipulada. Taxadieno, o primeiro intermediário Taxol envolvido, é o produto biossintético da via do não mevalonato em E. coli compreendendo dois módulos: a via à montante natural formando pirofosfato de isopentenila (IPP) e uma via de formação de terpenoide à jusante heteróloga. A busca multivaria- da sistemática identificou condições que equilibram otimamente os dois módulos da via para minimizar o acúmulo de intermediários inibitórios e o desvio de fluxo para produtos secundários. Também a etapa posterior foi manipulada, após o taxadieno, na biossíntese do taxol, uma etapa de oxidação à base de P450, que produziu > de 98% de conversão de substrato e apresenta o primeiro exemplo de produção in vivo de quaisquer intermediários Taxol funcionalizados em E. coli. A abordagem de manipulação da via modular não apenas destaca a complexidade das vias com múltiplas etapas, mas também permitiu o acúmulo de elevados títulos de taxadieno e ta- xadien-5α-ol (~ 300 mg/L e 60 mg/L, respectivamente) em fermentações em pequena escala, assim exemplificando o potencial de produção microbiana de Taxol e seus derivados.

[0046] Esta invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes definidos na descrição que se segue ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser prati- cada ou de ser realizado de várias maneiras. Além disso, a fraseologia e a terminologia aqui utilizadas é, para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitativas. O uso de “incluindo”, “compreendendo” ou “possuindo”, “contendo”, “envolvendo” e suas variações na presente invenção se destina a abranger os itens listados em seguida e seus equivalentes, bem como os itens adicionais.

[0047] A produção microbiana de terpenoides como taxadieno é demonstrada aqui. Quando expressas em níveis satisfatórios, as vias microbianas reduzem drasticamente o custo de produção de tais compostos. Além disso, elas utilizam matérias-primas baratas, abundantes e renováveis (tais como açúcares e outros carboidratos) e podem ser a fonte para a síntese de vários derivados que podem exibir propriedades muito superiores do que o composto original. Um elemento chave na produção de custo competitivo de compostos da via isoprenoide usando uma via microbiana é a amplificação desta via a fim de permitir a superprodução destas moléculas. São aqui descritos os métodos que melhoram ou amplificam o fluxo para a produção de terpenoide em Escherichia coli (E. coli). Especificamente, métodos são fornecidos para amplificar o fluxo metabólico para a síntese de pirofosfato de isopen- tenila (IPP) (um intermediário chave para a produção de compostos isoprenoides), pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), difosfato de geranila (GPP), difosfato de farnesi- la (FPP), difosfato de geranilgeranila (GGPP) e difosfato de farnesil geranila (FGPP), paclitaxel (Taxol), gincolídeos, geraniol, farnesol, geranilgeraniol, linalol, isopreno, monoterpenoides tais como mentol, carotenoides tais como licopeno, poliisoprenoi- des tais como poliisopreno ou borracha natural, diterpenoides como eleuterobina e sesquiterpenoides tal como artemisinina.

[0048] Aspectos da invenção referem-se à produção de terpenoides. Como aqui utilizado, um terpenoide, também referido como um isoprenoide, é um produto químico orgânico derivado de uma unidade de isopreno com cinco carbonos. Vários exemplos não limitativos de terpenoides, classificadas com base no número de uni dades de isopreno que eles contêm, incluem: hemiterpenoides (1 unidade de isopre- no), monoterpenoides (2 unidades de isopreno), sesquiterpenoides (3 unidades de isopreno), diterpenoides (4 unidades de isopreno), sesterterpenoides (5 unidades de isopreno), triterpenoides (6 unidades de isopreno), tetraterpenoides (8 unidades de isopreno) e politerpenoides com um maior número de unidades de isopreno. Em algumas modalidades, o terpenoide que é produzido é o taxadieno. Em algumas modalidades, o terpenoide que é produzido é Citronelol, Cubebol, Nootkatona, Cineol, Limoneno, Eleuterobina, Sarcodictiina, Pseudopterosinas, Ginkgolídeos, Estevosí- deo, Rebaudiosídeo A, Esclareol, Labdenodiol, Levopimaradieno, Sandracopimara- dieno ou Isopemaradieno.

[0049] São aqui descritos métodos e composições para otimizar a produção de terpenoides em células pelo controle da expressão de genes ou proteínas que participam em uma via à montante e em uma via à jusante. A via à montante envolve a produção de pirofosfato de isopentila (IPP) e pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), que pode ser conseguido por duas vias metabólicas diferentes: a via do ácido meva- lônico (MVA) e a via MEP (2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato), também chamada de via MEP/DOXP (2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato/1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato), a via do não mevalonato ou a via independente do ácido mevalônico.

[0050] A via à jusante é uma via sintética que leva à produção de um terpe- noide e envolve a expressão do gene recombinante de uma enzima terpenoide sin- tase (também referida como terpeno ciclase), e uma enzima difosfato de geranilge- ranila sintase (GGPPS). Em algumas modalidades, uma enzima terpenoide sintase é uma enzima diterpenoide sintase. Vários exemplos não limitativos de enzimas diter- penoide sintase incluem casbeno sintase, taxadieno sintase, levopimaradieno sin- tase, abietadiena sintase, isopimaradieno sintase, ent-copalil difosfato sintase, syn- stemar-13-eno sintase, syn-estemod-13(17)-eno sintase, syn-pimara-7,15-dieno sin- tase, ent-sandaracopimaradieno sintase, ent-cassa-12,15-dieno-sintase, ent-pimara- 8(14), 15-dieno sintase, ent-kaur-15-eno sintase, ent-kaur-16-eno sintase, afidicolan- 16β-ol sintase, filocladan-16α-ol sintase, fusicoca-2,10(14)-dieno sintase e terpente- trieno ciclase.

[0051] Surpreendentemente, conforme demonstrado na seção de Exemplos, a otimização da síntese de terpenoide por manipulação das vias à montante e à jusante aqui descritas não foi um processo aditivo ou linear simples. Em vez disso, através de análise combinatória complexa, a otimização foi obtida através do balanceamento dos componentes das vias à montante e à jusante. Inesperadamente, conforme demonstrado nas Figuras 1 e 2, o acúmulo de taxadieno exibiu uma forte dependência não-linear sobre as forças relativas das vias MEP à montante e de ta- xadieno sintética à jusante.

[0052] Aspectos da invenção referem-se ao controle da expressão de genes e proteínas na via MEP para a produção otimizada de um terpenoide, tal como taxa- dieno. A produção otimizada de um terpenoide refere-se à produção de uma quantidade maio de um terpenoide após a atividade de uma estratégia de optimização que seria obtida na ausência de tal estratégia. Deve ser percebido que qualquer gene e/ou proteína dentro da via MEP é englobada pelos métodos e composições aqui descritos. Em algumas modalidades, um gene da via MEP é um dos seguintes: dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA ou ispB. A expressão de um ou mais genes e/ou proteínas na via MEP pode ser suprarregulada e/ou infrarregulada. Em cer-tas modalidades, a suprarregulação de um ou mais genes e/ou proteínas na via MEP pode ser combinada com a infrarregulação de um ou mais genes e/ou proteínas na via MEP.

[0053] Deve ser percebido que os genes e/ou proteínas podem ser regulados sozinhos ou em combinação. Por exemplo, a expressão de dxs pode ser suprar- regulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação da expressão de um ou mais de ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispC pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispD pode ser su- prarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispE pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispF pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispG pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispH pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de idi pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi, ispA e ispB. A expressão de ispA pode ser suprarregulada ou infrarregula- da sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi e ispB. A expressão de ispB pode ser suprarregulada ou infrarregulada sozinha ou em combinação com a suprarregulação ou infrarregulação da expressão de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH, idi e ispA. Em algumas modalidades, a expressão do gene e/ou da proteína de um ou mais de dxs, ispC, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH e idi é suprarregulada, enquanto a expressão do gene e/ou proteína de ispA e/ou ispB é infrarregulada.

[0054] A expressão de genes na via MEP pode ser regulada por um método modular. Tal como aqui utilizado, a regulação por um método modular refere-se à regulação de genes múltiplos juntos. Por exemplo, em algumas modalidades, os genes múltiplos na via MEP são recombinantemente expressos em uma região contígua do DNA, tal como em um operon. Deve ser observado que uma célula que expressa tal módulo também pode expressar um ou mais outros genes dentro da via MEP quer de forma recombinante ou endogenamente.

[0055] Um exemplo não limitativo de um módulo de genes da via MEP é um módulo contendo os genes dxs, idi, ispI e ispF, tal como apresentado na seção de Exemplos, e aqui referido como dxs-idi-ispDF. Deve ser observado que os módulos dos genes da via MEP, consistentes com os aspectos da invenção, podem conter qualquer um dos genes dentro da via MEP, em qualquer ordem.

[0056] A expressão de genes e proteínas na via sintética terpenoide sintética à jusante também pode ser regulada a fim de otimizar a produção de terpenoide. A via sintética terpenoide à jusante sintética envolve a expressão recombinante de uma enzima terpenoide sintase e uma enzima GGPPS. Qualquer enzima terpenoide sintase, como discutido acima, pode ser expressa com GGPPS dependendo do produto à jusante a ser produzido. Por exemplo, a taxadieno sintase é usada para a produção de taxadieno. A expressão recombinante da enzima taxadieno sintase e a enzima GGPPS pode ser regulada independentemente ou em conjunto. Em algumas modalidades, as duas enzimas são reguladas em conjunto de forma modular. Por exemplo, as duas enzimas podem ser expressas em um operon em qualquer ordem (GGPPS-TS, referido como “GT”, ou TS-GGPPS, referido como “TG”).

[0057] A manipulação da expressão dos genes e/ou proteínas, incluindo os módulos, tais como o operon dxs-idi-ispDF, e o operon TS-GGPPS, pode ser conseguida através dos métodos conhecidos por uma pessoa normalmente versada na técnica. Por exemplo, a expressão dos genes ou operons pode ser regulada através da seleção de promotores, tais como promotores induzíveis, com diferentes intensidades. Vários exemplos não limitativos de promotores incluem Trc, T5 e T7. Além disso, a expressão de genes ou operons pode ser regulada através da manipulação do número de cópias do gene ou operon na célula. Por exemplo, em certas modalidades, uma cepa contendo uma cópia adicional do operon dxs-idi-ispDF no seu cromossomo sob o controle do promotor Trc produz uma maior quantidade de taxa- dieno em relação a uma superexpressando apenas a via sintética à jusante. Em algumas modalidades, a expressão dos genes ou operons pode ser regulada através da manipulação da ordem dos genes dentro de um módulo. Por exemplo, em certas modalidades, a alteração da ordem dos genes em um operon sintético à jusante a partir de GT para TG resulta em um aumento de 2 a 3 vezes na produção de taxadi- eno. Em algumas modalidades, a expressão dos genes ou operons é regulada através da integração de um ou mais genes ou operons em um cromossomo. Por exemplo, em certas modalidades, a integração do operon dxs-idi-ispDF à montante no cromossomo de uma célula resulta na produção de taxadieno aumentada.

[0058] Deve ser observado que os genes associados com a invenção podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes. Em algumas modalidades, os genes na via MEP são genes bacterianos, tais como genes de Escherichia coli. Em algumas modalidades, o gene que codifica GGPPS é um gene vegetal. Por exemplo, o gene que codifica GGPPS pode ser de uma espécie de Taxus, tal como Taxus canadensis (T. canadensis). Em algumas modalidades, o gene que codifica a taxadie- no sintase é um gene vegetal. Por exemplo, o gene que codifica a taxadieno sintase pode ser de uma espécie de Taxus, tal como Taxus brevifolia (T. brevifolia). Números de acesso do GenBank representativos para GGPPS de T. canadensis e T. bre- vifolia de taxadieno sintase são fornecidos por AF081514 e U48796, as sequências do que são aqui incorporados por referência nas suas totalidades.

[0059] Conforme uma pessoa versada na técnica estaria ciente, os genes homólogos para utilização nos métodos associados com a invenção podem ser obtidos a partir de outras espécies e podem ser identificados por buscas por homologia, por exemplo, através de uma busca BLAST de proteína, disponível no sítio da internet do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Os genes e/ou operons associados com a invenção podem ser clonados, por exemplo, por amplificação por PCR e/ou digestão de restrição, de DNA a partir de qualquer fonte de DNA que contém o determinado gene. Em algumas modalidades, um gene e/ou operon associado com a invenção é sintético. Qualquer meio de obtenção de um gene e/ou operon associado com a invenção é compatível com a presente invenção.

[0060] Em algumas modalidades, a otimização adicional da produção de ter- penoide é conseguido através da modificação de um gene antes que ele seja expresso recombinantemente em uma célula. Em algumas modalidades, a enzima GGPPS tem uma ou mais das mutações a seguir: A162V, G140C, L182M, F218Y, D160G, C184S, K367R, A151T, M185I, D264Y, E368D, C184R, L331I, G262V, R365S, A114D, S239C, G295D, I276V, K343N, P183S, I172T, D267G, I149V, T234I, E153D e T259A. Em algumas modalidades, a enzima GGPPS possui uma mutação no resíduo S239 e/ou no resíduo G295. Em certas modalidades, a enzima GGPPS tem a mutação S239C e/ou G295D.

[0061] Em algumas modalidades, a modificação de um gene antes que ele seja recombinantemente expresso em uma célula envolve a otimização de códon para a expressão em uma célula bacteriana. Os usos de códon para uma variedade de organismos podem ser acessados no Banco de Uso de Códons (www.kazusa.or.jp/codon/). A otimização de códon, incluindo a identificação de có- dons ótimos para uma variedade de organismos, e métodos para alcançar a otimização de códon, são familiares para uma pessoa normalmente versada na técnica, e pode ser realizada utilizando métodos padrão.

[0062] Em algumas modalidades, a modificação de um gene antes que ele seja expresso de forma recombinante em uma célula envolve fazer uma ou mais mutações no gene antes que ele seja recombinantemente expresso em uma célula. Por exemplo, uma mutação pode envolver uma substituição ou eliminação de um único nucleotídeo ou de múltiplos nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma mutação de um ou mais nucleotídeos em um gene irá resultar em uma mutação na proteína produzida do gene, tal como uma substituição ou eliminação de um ou mais aminoá- cidos.

[0063] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso utilizar uma célula que tenha sido otimizada para a produção de um terpenoide. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula que superexpressa um ou mais componentes da via do não mevalonato (MEP) é utilizada, pelo menos em parte, para amplificar o difosfato de isopentila (IPP) e o difosfato de dimetilalila (DMAPP), substratos de GGPPS. Em algumas modalidades, a superexpressão de um ou mais componentes da via do não mevalonato (MEP) é conseguida através do aumento do número de cópias de um ou mais componentes da via do não mevalonato (MEP). Por exemplo, números de cópias de componentes em etapas limitantes da velocidade na via MEP, tais como (dxs, ispD, ispF, idi) podem ser amplificados, tal como por expressão epissomal adi-cional.

[0064] Em algumas modalidades “design racional” está envolvido na construção de mutações específicas em proteínas, tais como enzimas. Tal como aqui utilizado, “design racional” refere-se à incorporação de conhecimento da enzima, ou enzimas relacionadas, tal como a sua estrutura tridimensional, o(s) seu(s) sítio(s) ativo(s), seu(s) substrato(s) e/ou a interação entre a enzima e o substrato, no design da mutação específica. Com base em uma abordagem de design racional, as mutações podem ser criadas em uma enzima que pode então ser testada quanto à produção aumentada de um terpenoide em relação aos níveis de controle. Em algumas modalidades, as mutações podem ser racionalmente concebidas com base na modelagem de homologia. Tal como aqui utilizado, “modelagem de homologia” refere- se ao processo de construção de um modelo de resolução atômica de uma proteína a partir da sua sequência de aminoácidos e uma estrutura tridimensional de uma proteína homóloga relacionada.

[0065] Em algumas modalidades, mutações aleatórias podem ser feitas em um gene, tal como um gene que codifica uma enzima, e estas mutações podem ser testadas quanto à produção aumentada de um terpenoide em relação aos níveis de controle. Por exemplo, a testagem por mutações em componentes da via MEP, ou componentes de outras vias, que leva à produção aumentada de um terpenoide, pode ser realizada através de um teste de mutagênese aleatória, ou através do teste de mutações conhecidas. Em algumas modalidades, a clonagem shotgun de fragmentos genômicos poderia ser usada para identificar regiões genômicas que levam a um aumento na produção de um terpenoide, através da varredura de células ou organismos que têm estes fragmentos para a produção aumentada de um terpenoi- de. Em alguns casos, uma ou mais mutações podem ser combinadas na mesma célula ou organismo.

[0066] Em algumas modalidades, a produção de um terpenoide em uma célula pode ser aumentada através da manipulação de enzimas que atuam na mesma via que as enzimas associadas com a invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, pode ser vantajoso aumentar a expressão de uma enzima ou outro fator que atua à montante de uma enzima alvo, tal como uma enzima associada com a invenção. Isto poderá ser conseguido pela superexpressão do fator à montante usando qualquer método padrão.

[0067] A otimização da expressão da proteína pode também ser conseguida através de uma seleção de promotores adequados e sítios de ligação ao ribossoma. Em algumas modalidades, isto pode incluir a seleção de plasmídeos com elevado número de cópias, ou plasmídeos com número de cópias baixo ou médio. A etapa de terminação da transcrição pode também ser alvejada para a regulação da expressão do gene, através da introdução ou da eliminação de estruturas, tais como haste e alça.

[0068] Aspectos da invenção referem-se à expressão de genes recombinan- tes nas células. A invenção abrange qualquer tipo de célula que expressa de forma recombinante genes associados com a invenção, incluindo as células procarióticas e eucarióticas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, tais como Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymonas spp., Acetobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Xanthomonas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Comamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp., Gluconobacter spp., Ralstonia spp., Acidithiobacillus spp., Microlunatus spp., Geobacter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Serratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotrophomonas spp., Chromobacterium spp., Sinorhizobium spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp. e Pantoea spp. A célula bacteriana pode ser uma célula gram-negativa, tal como uma célula de Escherichia coli (E. coli), ou uma célula gram-positiva, tal como uma espécie de Bacillus. Em outras modalidades, a célula é uma célula fúngica, tal como uma célula de levedura, por exemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Paffia spp., Kluyve- romyces spp., Candida spp., Talaromyces spp., Brettanomyces spp., Pachysolen spp., Debaryomyces spp., Yarrowia spp., e cepas de leveduras poliploides industri-ais. De preferência, a cepa de levedura é uma cepa de S. cerevisiae ou uma cepa de Yarrowia spp. Outros exemplos de fungos incluem Aspergillus spp., Pennicilium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Acremonium spp., Neurospora spp., Sordaria spp., Magnaporthe spp., Allomyces spp., Ustilago spp., Botrytis spp., e Trichoderma spp. Em outras modalidades, a célula é uma célula de alga, ou uma célula vegetal. Deve ser observado que algumas células compatíveis com a invenção podem expressar uma cópia endógena de um ou mais dos genes associados com a invenção, bem como uma cópia recombinante. Em algumas modalidades, se uma célula tem uma cópia endógena de um ou mais dos genes associados com a invenção, então os métodos não necessitarão necessariamente da adição de uma cópia recombinan- te do(s) gene(s) que são expressos endogenamente. Em algumas modalidades, a célula pode endogenamente expressar uma ou mais enzimas a partir das vias aqui descritos e pode expressar de forma recombinante uma ou mais outras enzimas das vias aqui descritos para a produção eficiente de um terpenoide.

[0069] Outros aspectos da invenção referem-se à testagem para células bac- terianas ou cepas que exibem produção otimizada de terpenoides. Como descrito acima, os métodos associados com a invenção envolvem células geradoras que su- perexpressam um ou mais genes na via MEP. A produção de terpenoides a partir da cultura de tais células podem ser medida e comparada com uma célula de controle em que uma célula que apresenta uma maior quantidade de produção de terpenoide em relação a uma célula de controle é selecionada como uma primeira célula melhorada. A célula pode ser adicionalmente modificada por expressão recombinante de uma enzima terpenoide sintase e uma enzima GGPPS. O nível de expressão de um ou mais dos componentes da via do não mevalonato (MEP), a enzima terpenoide sintase e/ou a enzima GGPPS na célula pode então ser manipulado e a produção de terpenoide pode ser medida novamente, levando à seleção de uma segunda célula melhorada que produz maiores quantidades de um terpenoide do que a primeira célula melhorada. Em algumas modalidades, a enzima terpenoide sintase é uma enzima taxadieno sintase.

[0070] Outros aspectos da invenção referem-se à identificação e caracterização (via GC-MS) de um metabolito previamente desconhecido em células de E. coli bacterianas (Figuras 3 e 6). O nível de acúmulo do metabólito recém- identificado, indol, pode ser controlado pela manipulação genética da via microbiana pela superexpressão, infrarregulação ou mutação dos genes da via isoprenoide. O metabólito indol se anticorrelaciona como uma variável direta para a produção de taxadieno em cepas manipuladas (Figuras 3, 6 e 15). O controle adicional do acúmulo de indol para melhorar o fluxo para a biossíntese de terpenoide em sistemas bac- terianos (especificamente em células, tais como em células de E. coli) ou outras células pode ser alcançado através do equilíbrio da via isoprenoide não mevalonato à montante com as vias de síntese do produto à jusante ou por modificações para ou a regulação da via indol. Ao fazer isso, a pessoa versada na técnica pode reduzir ou controlar o acúmulo de indol e, assim, reduzir o efeito inibitório do indol sobre a produção de taxadieno, e outros terpenoides derivados das vias descritas, tais como: monoterpenoides, sesquiterpenoides (incluindo amorfadieno), diterpenoides (incluindo levopimaradieno), triterpenos e tetraterpenos. Outros métodos para reduzir ou controlar o acúmulo de indol incluem a remoção do indol acumulado a partir da fermentação através de métodos químicos, tais como pelo uso de absorventes, sequestradores, etc.

[0071] Em outras modalidades, são fornecidos métodos que incluem a medição da quantidade ou concentração de indol em uma célula que produz um ou mais terpenoides ou em uma cultura das células que produz um ou mais terpenoides. A quantidade ou concentração de indol pode ser medida uma vez, ou duas ou mais vezes, conforme adequado, utilizando métodos conhecidos na técnica e como aqui descritos. Tais métodos podem ser utilizados para orientar os processos de produção de um ou mais terpenoides, por exemplo, na melhoria do processo. Tais métodos podem ser usados para guiar a construção de cepa, por exemplo, para a melhoria da cepa.

[0072] A identificação dos meios para atingir este equilíbrio produziu uma melhoria de 15.000 vezes na superprodução de terpenoides, tal como taxadieno, em comparação com células bacterianas do tipo selvagem, expressas com uma via bi- ossintética de taxadieno heteróloga. A produção foi adicionalmente aumentada atra-vés de métodos de fermentação modificados que produziram concentrações de aproximadamente 2 g/L, que é 1500 vezes maior em comparação com qualquer produção de taxadieno reportada anterior. Como aqui demonstrado, por manipulação genética da via não mevalonato isoprenoide em E. coli o acúmulo deste metabo- lito pode ser agora controlado, que regula o fluxo para a biossíntese de isoprenoide em células de E. coli bacterianas.

[0073] Aqui também é demonstrado o desafio adicional da produção de ta- xadieno no precursor chave seguinte ao Taxol, taxadien-5a-ol, obtido por manipulação da química de oxidação para a biossíntese do taxol. O exemplo 5 apresenta a primeira extensão bem sucedida da via sintética do taxadieno para o taxadien-5α-ol. Semelhante à maioria dos outros terpenoides, a biossíntese de Taxol obedece a forma unificada de processo biossintético de “duas fases”, (i) a “fase da ciclase” do acoplamento linear dos precursores de prenila (IPP e DMAPP) ao GGPP, seguido pela ciclização molecular e rearranjo para o precursor envolvido de taxadieno (Figura 6, VIII-IX).57,58 Depois do precursor envolvido, (ii) a “fase de oxidação”, a estrutura central de taxadieno da olefina cíclica é então funcionalizada por sete citocromo P450 oxigenases juntamente com os seus parceiros redox, ligada com dois grupos acetato e um grupo benzoato por transferases dependentes de acil e aroil CoA, grupo ceto por cetoxidase e grupo epóxido por chumbo epoxidase ao intermediário tardio de bacatina III, ao que a cadeia lateral C13 está ligada para o taxol ((Figura 6, X- XIII).15 Embora uma ordem sequencial aproximada das reações de fase de oxidação inicial seja prevista, o momento/ordem exata de algumas das reações de hidroxila- ções, acilações e benzoilação é incerto. No entanto, fica claro que a bifurcação inicial começa a partir da hidroxilação mediada pela citocromo P450 do núcleo de taxa- dieno na posição C5 seguido pelas hidroxilações à jusante que utilizam uma família homóloga de enzimas citocromo P450 com alta similaridade deduzida entre si (> 70%), mas com semelhança limitada (<30%) com outras p450 vegetais.41,59 Além disso, a diversidade estrutural e funcional com a análise evolutiva possível indica que o gene taxadieno-5α-ol pode ser a sequência original da qual os outros genes hidroxilase na via biossintética do Taxol evoluíram, refletindo a ordem das hidroxila- ções.15

[0074] Outros aspectos da invenção referem-se às enzimas P450 quiméricas. A expressão funcional do citocromo P450 vegetal tem sido considerado desafiadora devido às limitações inerentes de plataformas bacterianas, tais como a ausência de maquinaria de transferência de elétrons, citocromo P450 redutases e incompatibilidade de tradução dos módulos de sinal de membrana das enzimas P450, devido à falta de um retículo endoplasmático.

[0075] Em algumas modalidades, a taxadiene-5α-hidroxilase associada com os métodos da invenção é otimizada através da manipulação transmembranar N- terminal e/ou da geração de enzimas quiméricas através da fusão por tradução com um parceiro CPR redox. Em algumas modalidades, o parceiro de CPR redox é uma citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR; Figura 5b). Em certas modalidades, a citocromo P450 taxadieno-5α-hidroxilase (T5αOH) é obtida de Taxus cuspidado (Número de acesso GenBank AY289209, a sequência da qual sendo aqui incorporada por referência). Em algumas modalidades, a NADPH:citocromo P450 redutase (TCPR) é obtida a partir de Taxus cuspidate (Número de Acesso GenBank AY571340, a sequência da qual sendo aqui incorporada por referência).

[0076] A taxadieno 5α-hidroxilase e TCPR podem ser unidas por um ligante, tal como GSTGS (SEQ ID NO: 50). Em algumas modalidades, taxadieno 5α- hidroxilase e/ou TCPR são truncados para remover a totalidade ou parte da região transmembranar de uma ou ambas as proteínas. Por exemplo, taxadieno 5α- hidroxilase, em algumas modalidades, é truncada para remover 8, 24, ou 42 amino- ácidos. Em algumas modalidades, os 74 aminoácidos N-terminais de TCPR são truncados. Um peptídeo adicional pode também ser fundido à taxadieno 5α- hidroxilase. Por exemplo, um ou mais aminoácidos da 17a hidroxilase bovina podem ser adicionados à taxadieno 5α-hidroxilase. Em certas modalidades, o peptídeo MALLLAVF (SEQ ID NO: 51) é adicionado à taxadieno 5α-hidroxilase. Um exemplo não limitativo de polipeptídeo compreendendo taxadieno 5α-hidroxilase fundido ao TCPR é At24T5αOH-tTCPR.

[0077] Em algumas modalidades, a enzima quimérica é capaz de realizar a primeira etapa de oxidação com mais de 10% de conversão de taxadieno em taxadi- eno-5α-ol e o subproduto 5(12)-oxa-3(11)-ciclotaxano. Por exemplo, a conversão de taxadieno porcentual em taxadieno-5α-ol e o subproduto 5(12)-oxa-3(11)-ciclotaxano pode ser de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, aproximadamente 99% ou aproximadamente 100%.

[0078] Em certas modalidades, a enzima quimérica é At245αOH-tTCPR, que foi verificado como sendo capaz de realizar a primeira etapa de oxidação com mais de 98% da conversão de taxadieno em taxadieno-5α-ol e o subproduto 5(12)-Oxa- 3(11)-ciclotaxano (OCT; Figura 9a). A manipulação da etapa de produção de taxadi- eno-5α-ol é crítica na produção de taxol e foi verificado que é limitante em esforços anteriores para construir esta via em leveduras. O constructo manipulado desenvolvido aqui demonstrou mais do que 98% de conversão de taxadieno in vivo com uma melhoria de 2400 vezes em relação à expressão heteróloga anterior em leveduras. Assim, além de sintetizar quantidades significativamente maiores de intermediários Taxol chave, este estudo também fornece a base para a síntese de metabólitos subsequentes na via química por química de P450 similar.

[0079] Tal como aqui utilizado, os termos “proteína” e “polipeptídeo” são utili- zados alternadamente e, assim, o termo polipeptídeo pode ser utilizado para se referir a um polipeptídeo de comprimento total e pode também ser utilizado para se referir a um fragmento de um polipeptídeo de comprimento total. Tal como aqui utilizado em relação aos polipeptídeos, proteínas ou seus fragmentos, “isolado” significa separado do seu ambiente natural e presente em quantidade suficiente para permitir a sua identificação ou utilização. Isolado, quando se refere a uma proteína ou polipep- tídeo, significa, por exemplo: (i) seletivamente produzido por clonagem de expressão ou (ii) purificado como por cromatografia ou eletroforese. Proteínas ou polipeptídeos isolados podem ser, mas não precisam ser, substancialmente puros. O termo “subs-tancialmente puro” significa que as proteínas ou polipeptídeos são essencialmente isentos de outras substâncias com as quais eles podem ser encontrados em sistemas de produção, naturais ou in vivo até uma extensão prática e apropriada para os seus usos pretendidos. Polipeptídeos substancialmente puros podem ser obtidos naturalmente ou produzidos utilizando métodos aqui descritos e podem ser purificados com técnicas bem conhecidas na técnica. Uma vez que uma proteína isolada pode ser misturada com outros componentes em uma preparação, a proteína pode compreender apenas uma pequena porcentagem em peso da preparação. A proteína é, entretanto, isolada na medida em que foi separada das substâncias com as quais ela pode estar associada em sistemas vivos, isto é, isolada de outras proteínas.

[0080] A invenção também engloba ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos, as bibliotecas que contêm qualquer um dos ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos aqui descritos, e as composições que contêm qualquer um dos ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos aqui descritos.

[0081] Em algumas modalidades, um ou mais dos genes associados com a invenção é expresso em um vetor de expressão recombinante. Como aqui utilizado, um “vetor” pode ser qualquer um de uma variedade de ácidos nucleicos em que uma sequência ou sequências desejadas podem ser inseridas por restrição e ligação para o transporte entre ambientes genéticos diferentes ou para expressão em uma célula hospedeira. Vetores são tipicamente compostos de DNA, embora vetores de RNA também estejam disponíveis. Vetores incluem, mas não estão limitados, aos plasmídeos, fosmídeo, fagemídeos, genomas virais e cromossomos artificiais.

[0082] Um vetor de clonagem é um que é capaz de se replicar autonomamente ou integrado no genoma de uma célula hospedeira, e que é ainda caracterizado por um ou mais sítios de restrição da endonucleases, em que o vetor pode ser cortado de uma forma determinável e em que uma sequência de DNA desejada pode ser ligada de tal modo que o novo vetor recombinante retenha a sua capacidade de se replicar na célula hospedeira. No caso de plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes à medida que aumenta o número de cópias do plasmídeo na célula hospedeira, tal como uma bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso de fagos, a replicação pode ocorrer ativamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogênica.

[0083] Um vetor de expressão é um em que uma sequência de DNA desejada pode ser inserida por restrição e ligação, de tal forma que seja operativamente ligada às sequências regulatórias e que pode ser expressa como um transcrito de RNA. Os vetores podem ainda conter um ou mais sequências marcadoras adequadas para utilização na identificação de células que foram ou não transformadas ou transfectadas com o vetor. Marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou sensibilidade aos antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas atividades são detectáveis por ensaios padrão conhecidos na técnica (por exemplo, β-galactosidase, luciferase ou fosfatase alcalina) e genes que visivelmente afetam o fenótipo de células transformadas ou transfectadas, hospedeiros, colônias ou placas (por exemplo, proteína fluorescente verde). Os vetores preferidos são aqueles capazes de realizar replica- ção autônoma e expressão dos produtos dos genes estruturais presentes nos segmentos de DNA a que eles estão operativamente associados.

[0084] Como aqui utilizado, uma sequência codificadora e sequências regu- latórias são consideradas como sendo “operavelmente” unidas quando elas são co- valentemente ligadas de tal forma a colocar a expressão ou a transcrição da sequência codificadora sob a influência ou o controle das sequências regulatórias. Se for desejado que as sequências de codificação sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são consideradas como sendo operativamente ligadas se a indução de um promotor nas sequências regulatórias 5’ resultar na transcrição da sequência codificadora e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação de mudança de estrutura, (2) interferir com a capacidade da região promotora de direcionar a transcrição das sequências de codificação, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de DNA de ser traduzido em uma proteína. Assim, uma região promotora estaria operativamente ligada a uma sequência codificadora se a região promotora fosse capaz de efetuar a transcrição daquela sequência de DNA, de tal forma que o transcrito resultante possa ser traduzido na proteína ou polipeptídeo desejado.

[0085] Quando a molécula de ácido nucleico que codifica qualquer uma das enzimas da invenção reivindicada é expressa em uma célula, uma variedade de sequências de controle de transcrição (por exemplo, sequências promoto- ras/intensificadoras) podem ser usadas para direcionar a sua expressão. O promotor pode ser um promotor natural, isto é, o promotor do gene no seu contexto endógeno, que fornece regulação normal da expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor pode ser constitutivo, isto é, o promotor é infrarregulado permitindo a transcrição contínua do seu gene associado. Uma variedade de promotores condicionais também pode ser utilizada, tais como promotores controlados pela presença ou ausência de uma molécula.

[0086] A natureza precisa das sequências regulatórias necessárias para a expressão do gene pode variar entre espécies ou tipos de células, mas deve, em geral incluir, conforme necessário, sequências 5’ não transcritas e 5’ não traduzidas envolvidas com a iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, tais como a TATA box, sequência de capeamento, sequência CAAT e similares. Em particular, tais sequências regulatórias 5’ não transcritas irão incluir uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle transcricional do gene operativamente associado. As sequências regulatórias podem também incluir sequências in- tensificadoras ou sequências ativadoras à montante, conforme desejado. Os vetores da invenção podem opcionalmente incluir sequências líder ou de sinal 5’. A escolha e o design de um vetor apropriado está dentro da capacidade e da discrição de uma pessoa normalmente versada na técnica.

[0087] Os vetores de expressão contendo todos os elementos necessários para a expressão são comercialmente disponíveis e conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. As células são geneticamente manipuladas pela introdução nas células de DNA heterólogo (RNA). Aquele DNA heterólogo (RNA) é colocado sob o controle operável de elementos de transcrição para permitir a expressão do DNA heterólogo na célula hospedeira. A expressão heteróloga dos genes associados com a invenção, para a produção de um terpenoide, tal como taxadieno, é demonstrada na seção de Exemplos utilizando E. coli. O novo método para a produção de terpenoides pode também ser expresso em outras células bacterianas, fungos (incluindo células de levedura), células vegetais, etc.

[0088] Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima associada com a invenção pode ser introduzida em uma célula ou células utilizando métodos e técnicas que são padrão na técnica. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas por protocolos padrão, tais como transformação incluindo transformação química e eletroporação, transdução, bombardeamento de partículas, etc. A expressão da molécula de ácido nucleico que codifica as enzimas da invenção reivindicada também pode ser realizada por integração da molécula de ácido nuclei- co no genoma.

[0089] Em algumas modalidades um ou mais genes associados com a invenção é expresso de forma recombinante em uma célula bacteriana. As células bacterianas de acordo com a invenção podem ser cultivadas em meios de qualquer tipo (rico ou mínimo) e de qualquer composição. Como seria compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica, a otimização de rotina poderia permitir a utilização de uma variedade de tipos de meios. O meio selecionado pode ser suplementado com vários componentes adicionais. Alguns exemplos não limitativos dos componentes suplementares incluem glicose, antibióticos, IPTG para a indução gê- nica, Suplemento Mineral Traço ATCC e glicolato. Semelhantemente, outros aspectos do meio e as condições de crescimento das células da invenção podem ser otimizados através de experimentação de rotina. Por exemplo, o pH e a temperatura são exemplos não limitativos de fatores que podem ser otimizados. Em algumas modalidades, os fatores tais como a escolha dos meios, suplementos dos meios e temperatura podem influenciar os níveis de produção de terpenoides, tal como taxa- dieno. Em algumas modalidades, a concentração e a quantidade de um componente suplementar podem ser otimizadas. Em algumas modalidades, a frequência com que o meio é suplementado com um ou mais componentes adicionais e a quantidade de tempo que o meio é cultivado antes da coleta de um terpenoide, tal como ta- xadieno, é otimizada.

[0090] De acordo com aspectos da invenção, títulos elevados de um terpe- noide, tal como taxadieno, são produzidos através da expressão recombinante de genes associados com a invenção, em uma célula. Como usado aqui “título elevado” refere-se a um título na escala de miligramas por litro (mg L-1) escala. O título produzido para um determinado produto será influenciado por múltiplos fatores, incluindo a escolha dos meios. Em algumas modalidades, o título de taxadieno total é de pelo menos 1 mg L-1. Em algumas modalidades, o título de taxadieno total é de pelo menos 10 mg L-1. Em algumas modalidades, o título de taxadieno total é de pelo menos 250 mg L-1. Por exemplo, o título de taxadieno total pode ser de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75,80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425,450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900 ou mais do que 900 mg L-1, incluindo quaisquer valores intermédios. Emalgumas modalidades, o título de taxadieno total pode ser de pelo menos 1,0, 1,1,1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0,3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9,5,0 ou mais de 5,0 g L-1, incluindo quaisquer valores intermediários.

[0091] Em algumas modalidades, o título de taxadieno 5a-ol total é de pelo menos 1 mg L-1. Em algumas modalidades, o total de taxadieno 5α-ol total é de pelo menos 10 mg L-1. Em algumas modalidades, o título de taxadieno 5α-ol total é de pelo menos 50 mg L-1. Por exemplo, o título de taxadieno 5α-ol total pode ser de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou mais do que 70 mg L-1, incluindo quaisquer valores intermediários.

[0092] As culturas líquidas utilizadas para crescimento de células associadas com a invenção podem ser colocadas em qualquer um dos recipientes de cultura conhecidos e utilizados na técnica. Em algumas modalidades, a produção em larga escala em um vaso reacional aerado, tal como um reator de tanque agitado, pode ser usada para produzir grandes quantidades de terpenoides, tais como taxadieno, que podem ser recuperadas a partir da cultura de células. Em algumas modalidades, o terpenoide é recuperado da fase de gás da cultura de células, por exemplo, por adição de uma camada orgânica, tal como dodecano à cultura de células e recuperando o terpenoide da camada orgânica.

[0093] Terpenoides, tal como taxadieno, produzidos através dos métodos aqui descritos, têm aplicações difundidas, incluindo produtos farmacêuticos, tais como o paclitaxel (Taxol), artemisinina, ginkolídeos e eleuterobina e pseudopterosinas, e muitos outras compostos farmacêuticos potenciais. Outras aplicações incluem os compostos utilizados em sabores e cosméticos, tais como geraniol, farnesol, gera- nilgeraniol, linalool, limoneno, pineno, cineol e isopreno. Outras aplicações incluem compostos para utilização como biocombustíveis, tais como álcoois de 5, 10, e 15 átomos de carbono de comprimento. Deve-se observar que os compostos acima são atualmente produzidos como extratos de várias plantas. Métodos à base de extratos vegetais são tediosos, têm produtividade muito pequena e são limitados às molécu-las efetivas que podem ser assim obtidas, a saber, eles não permitem a produção fácil de derivados que podem possuir propriedades muito superiores do que os compostos originais.ExemplosMétodosCepas, plasmídeos, oligonucleotídeos e genes

[0094] A cepa de E. coli K12 MG1655 foi usada como a cepa hospedeira de toda a construção da cepa de taxadieno. As cepas E coli K12MG1655 Δ(recA,endA) e E coli K12MG1655Δ(recA,endA)ED3 foram fornecidas pelo laboratório do Professor Kristala Prather no MIT (Cambridge, MA). Os detalhes de todos os plasmídeos construídos para o estudo são mostrados na Tabela 2. Todos os oligonucleotídeos utilizados neste estudo estão mostrados na Tabela 3.

[0095] As sequências de pirofosfato de geranilgeranila sintase (GGPPS),50, Taxadieno sintase (TS)51, citocromo P450 Taxadieno 5α-hidroxilase (T5αOH) e Taxus NADPH:citocromo P450 redutase (TCPR)46 foram obtidas de Taxus canadensis, Taxus brevifolia, Taxus cuspidate (Códigos de Acesso Genbank: AF081514, U48796, AY289209 e AY571340). Os genes foram sintetizados de maneira customizada utilizando os plasmídeos e protocolos relatados por Kodumal et al.52 (Detalhes adicionais Apêndice 1) para incorporar o códon de tradução de E. coli e a remoção dos sítios de restrição para fins de clonagem. Nucleotídeos correspondendo aos aminoácidos N-terminais 98 e 60 de GGPPS e TS (peptídeo de trânsito de plastídeo) foram removidos e a sequência de inserção de tradução Met foi inserida.17Construção da via MEP (operon dxs-idi-idpDF).

[0096] O operon dxs-idi-ispDF foi inicialmente construído por clonagem de cada um dos genes a partir do genoma de E. coli K12 MG1655 usando os iniciadores dxs(s), dxs(a), idi(s), idi(a), ispDF(s) e ispDFI(a) sob o plasmídeo pET21C+ com o promotor T7 (p20T7MEP).53 Usando os iniciadores dxsidiispDFNcoI (s) e dxsidiis- pDFKpnI (a) o operon dxs-idi-ispDF foi subclonado no plasmídeo pTrcHis2B (Invitro- gen) após ser digerido com Ncol e Kpnl no plasmídeo pTrcMEP (p20TrcMEP). O plasmídeo p20TrcMEP digerido com MluI e PmeI e clonado em MluI e PmeI digeriu o plasmídeo pACYC184-melA (P2A) no constructo do plasmídeo p10TrcMEP. O plas- mídeo pTrcMEP foi digerido com BstZ17I e ScaI e clonado no plasmídeo pCL1920 digerido com PvuII para construir o plasmídeo p5TrcMEP. Para a construção do plasmídeo p20T5MEP inicialmente o operon dxs-idi-ispDF foi clonado no plasmídeo pQE com o promotor T5 (pQE-MEP), utilizando os iniciadores dxsidiispDFNcoI (s) e dxsidiispDFXhoI (a). Uma fração do DNA do operon com o promotor T5 foi amplificada utilizando os iniciadores T5AgeI (s) e T5NheI (a) do plasmídeo pQEMEP. O fragmento de DNA foi digerido com AgeI/Nhel e clonado no plasmídeo p20T7MEP digerido com as enzimas SGrAI/Nhel.Construção da via do taxadieno (operons GT e TG).

[0097] As vias do taxadieno à jusante (operon GT e TG) foram construídas por clonagem de fragmentos de PCR de GGPS e TS nos sítios de NocI-EcoRI e EcoRI-SalI do plasmídeo pTrcHIS2B para criar p20TrcGT e p20TrcTG usando os iniciadores GGPPSNcoI(s), GGPPSEcoRI(a), TSEcoRI(s), TSsalI(a), TSNcoI(s) TSEcoRI(a) GGPPSEcoRI(s) e GGPPSSalI(a). Para a construção de p20T5GT, inicialmente o operon foi amplificado com os iniciadores GGPPSNcoI (s) e TSXhoI (a) e clonado em um plasmídeo pQE sob o promotor T5 digerido com NcoI/XhoI. Além disso, a sequência foi digerida com XbaI e XhoI e clonada na estrutura do plasmídeo pTrc amplificada utilizando os iniciadores pTrcSal (s) e pTrcXba (a). p10T7TG foi construído por subclonagem do operon TG digerido com NcoI/SalI de p20TrcTG no plasmídeo pACYC-DUET1 digerido com NcoI/SalI. p5T7TG foi construído por clonagem do fragmento BspEI/XbaI digerido no DNA digerido XbaI/BspEI amplificado a partir do plasmídeo pCL1920 usando os iniciadores pCLBspEI(s) e pCLXbaI(a).Construção de plasmídeos da via MEP de integração cromossômica

[0098] Para a construção dos plasmídeos com o cassete PRF-km-FRP para amplificar a sequência para integração, p20T7MEP e p20T5MEP foram digeridos com XhoI/ScaI. O cassete FRP-km-FRP foi amplificado a partir do cassete Km com a sequência FRP do plasmídeo pkD13 usando os iniciadores KmFRPXhoI(s) e KmFRPScaI(a). O DNA amplificado foi digerido com XhoI/ScaI e clonado no plasmí- deo p20T7MEP e p20T5MEP digerido com XhoI/ScaI (p20T7MEPKmFRP e p20T5MEPKmFRP). Do mesmo modo, o plasmídeo p20TrcMEP foi digerido com SacI/ScaI e o DNA foi amplificado usando os iniciadores KmFRPSacI(s) e KmFRPS- caI(a) foi digerido, clonado no plasmídeo p20TrcMEP (p20TrcMEPKm-FRP).Integração cromossômica do cassete da via MEP (LacIq-MEP-FRP-Km- FRP)

[0099] As vias MEP construídas sob os promotores T7, T5 e Trc foram localizadas na região do operon ara no cromossomo com o marcador Kan. Os fragmentos de PCR foram amplificados a partir de p20T7MEPKmFRP, p20T5MEPKmFRP e p20TrcMEPKm-FRP utilizando os iniciadores IntT7T5(s), IntTrc(s) e Int(a) e, em seguida, foram eletroporados nas células de E. coli MG1655 recA-end- e E. coli MG1655 recA-end- EDE3 para a integração cromossômica através da técnica de recombinação X Red.54 A localização específica do sítio foi confirmada e o marcador Km foi removido através da ação da FLP recombinase após a integração do gene bem sucedida.Construção da via Taxadieno 5α-ol

[00100] A região transmembranar (TM) da taxadieno 5α-ol hidroxilase (T5αOH) e da citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR) foi identificada utilizando o software PredictProtein (www.predictprotein.org).55 Para a manipulação transmem- branar, o truncamento seletivo os resíduos de aminoácidos 8, 24 e 42 na região transmembranar N-terminal da taxadieno 5α-ol hidroxilase (T5αOH) e na região do aminoácido 74 no TCPR foi realizada. A remoção dos resíduos de aminoácidos N- terminais 8, 24 e 42 de taxadieno 5α-ol (T5αOH), a incorporação de um peptídeo de 8 resíduos N-terminal 17a hidroxilase bovino substituído com um aminoácido MALLLAVF (SEQ ID NO: 51) para as sequências T5aOH truncadas N-terminais44 e o ligante do peptídeo GSTGS foi realizada utilizando os iniciadores CYP17At8AANdeI(s), CYP17At24AANdeI(s), CYP17At42AANdeI(s) e CYPLink- BamHI(a). Utilizando estes iniciadores cada DNA modificado foi amplificado, digerido com NdeI/BamHI e clonado no plasmídeo pACYC DUET1 digerido com NdeI/BamHI para construir os plasmídeos p10At8T5αOH, p10At24T5αOH e p10At42T5αOH. A sequência TCPR truncada com 74 aminoácidos (tTCPR) foi amplificada utilizando os iniciadores CPRBamHI(s) e CPRSalI(a). A sequência de tTCPR amplificada e os plasmídeos p10At8T5αOH, p10At24T5αOH e p10At42T5αOH foram digeridos com BamHI/SalI e clonados para construir os plasmídeos p10At8T5αOH-tTCPR, p10At24T5αOH-tTCPR e p10At42T5αOH-tTCPR.Crescimento em cultura para testar o taxadieno e análise de taxadieno-5α-ol

[00101] Transformantes individuais das cepas de E. coli pré-manipuladas abrigando o plasmídeo apropriado com a via do taxadieno à montante (MEP), à jusante e taxadieno 5α-ol foram cultivados durante 18h a 30 °C em meio Luria-Bertani (LB) (suplementado com antibióticos apropriados, 100 mg/mL de carbenecilina, 34 mg/mL de cloranfenicol, 25 mg/L de canamicina ou 50 mg/L de espectinomicina). Para as culturas em escala pequena para testar as cepas manipuladas, estes pré- inóculos foram utilizados para semear meio rico de 2 mL fresco (5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de triptona, 15 g/L de glicose, 10 g/L de NaCl, HEPS 100 mM, 3 mL/L de antiespumante B, pH 7,6, 100 ug/mL de carbenicilina e 34 ug/mL de cloran- fenicol), a uma A600 inicial de 0,1. A cultura foi mantida com antibióticos adequados e IPTG 100 mM para indução do gene a 22 °C durante 5 dias.Experimentos do biorreator para a cepa produtora de taxadieno 5a-ol

[00102] O biorreator Bioflo de 3 L (New Brunswick) foi montado de acordo com as instruções do fabricante. Um litro de meio rico com glicerol 1% (v/v) foi inoculado com 50 mL de cultura de 8h (A600 de ~ 2,2) da cepa 26-At24T5αOH-tTCPR cultivada em meio LB contendo os antibióticos (100 mg/mL de carbenicilina, 34 mg/mL de cloranfenicol) nas mesmas concentrações. biorreatores de 1L com fermentação líquido-líquido bifásica usando 20% v/v de dodecano. Oxigênio foi fornecido como ar filtrado a 0,5 v/v/m, e a agitação foi ajustada para manter os níveis de oxigênio dissolvido acima de 50%. O pH da cultura foi controlado a 7,0 utilizando NaOH 10%. A temperatura da cultura no fermentador foi controlada a 30 °C até que as células foram cultivadas em uma densidade ótica de cerca de 0,8, conforme medido em um comprimento de onda de 600 nm (OD600). A temperatura do fermentador foi reduzi- da para 22 °C e as células foram induzidas com IPTG 0,1 mM. Dodecano foi adicionado assepticamente a 20% (v/v) do volume do meio. Durante o curso da fermentação, a concentração de glicerol e o acúmulo de acetato foi monitorado com intervalos de tempo constantes. Durante a fermentação, conforme a concentração de glice- rol diminuiu abaixo de 0,5 g/L, o glicerol (3 g/L) foi introduzido no biorreator.

[00103] A fermentação foi adicionalmente otimizada utilizando um cultivo de lote por alimentação com um meio de alimentação definido contendo 0,5% de extrato de levedura e 20% (v/v) de dodecano (13,3 g/L de KH2PO4, 4 g/L de (NH4)2HPO4, 1,7 g/L de ácido cítrico, 0,0084 g/L de EDTA, 0,0025 g/L de CoCl2, 0,015 g/L de MnCl2, 0,0015 g/L de CuCl2, 0,003 g/L de H3BO3, 0,0025 g/L de Na2MoO4, 0,008 g/L de Zn(CH3COO)2, 0,06 g/L de citrato de ferro (III), 0,0045 g/L de tiamina, 1,3 g/L de MgSO4, 10 g/L de glicerol, 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,0). A mesma composição do meio foi utilizada para a fermentação das cepas 17 e 26 com os antibióticos apropriados (cepa 17: 100 μg/mL de carbenicilina e 50 μg/mL de espectinomicina; cepa 26: 50 μg/mL de espectinomicina).

[00104] Para a cepa produtora de taxadien-5α-ol, um litro de meio complexo com glicerol a 1% (v/v) foi inoculado com 50 mL de uma cultura de 8h (OD de ~ 2,2) da cepa 26-At24T5aOH-tTCPR cultivada em meio LB contendo 50 μg/mL de espec- tinomicina e 34 μg/mL de cloranfenicol). Oxigênio foi fornecido como ar filtrado a 0,5 (vvm) e a agitação foi ajustada para manter os níveis de oxigênio dissolvido acima de 30%. O pH da cultura foi controlado a 7,0 utilizando NaOH a 10%. A temperatura da cultura no fermentador foi controlada a 30 °C até que as células foram cultivadas em uma densidade ótica de cerca de 0,8, tal como medido em um comprimento de onda de 600 nm (OD600). A temperatura do fermentador foi reduzida para 22 °C e a via foi induzida com IPTG 0,1 mM. Dodecano foi adicionado assepticamente a 20% (v/v) do volume do meio. Durante o curso da fermentação, a concentração de glice- rol e o acúmulo de acetato foram monitorados com intervalos de tempo constantes. Durante a fermentação, conforme a concentração de glicerol diminuiu, 0,5 a 1 g/L, 3 g/L de glicerol foi introduzido no biorreator.Análise de GC-MS de taxadieno e taxadieno-5α-ol

[00105] Para a análise de acúmulo de taxadieno a partir de cultura de pequena escala, 1,5 mL da cultura foi agitado em vórtex com 1 mL de hexano durante 30 min. A mistura foi centrifugada para separar a camada orgânica. Para o biorreator 1 uL da camada de dodecano foi diluído para 200 uL usando hexano. 1 uL da camada de hexano foi analisado por GC-MS (GC 3800 da Varian saturn ligado a um MS 2000 da Varian). A amostra foi injetada em uma coluna HP5ms (30 m x 250 uM x espessura de 0,25 uM) (Agilent Technologies USA). Hélio (grau ultrapuro) a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min, foi usado como um gás carreador. A temperatura do forno foi primeiro mantida constante a 50 °C durante 1 min e, em seguida, aumentou até 220 °C no incremento de 10 °C/min, e, finalmente, foi mantida nesta temperatura durante 10 min. As temperaturas do injetor e da linha de transferência foram fixadas em 200 °C e 250 °C, respectivamente.

[00106] Compostos padrão a partir de fontes biológicas ou sintética para o taxadieno e taxadieno 5α-ol não estavam disponíveis comercialmente. Deste modo, foram realizadas fermentações de E. coli produtora de taxadieno em um biorreator de 2L para extrair o material puro. Taxadieno foi extraído por extração com solvente, utilizando hexano, seguido por múltiplos ciclos de cromatografia em coluna de sílica para obter o material puro para a construção de uma curva padrão para a análise de GC-MS. Foram comparados os perfis de GC e MS do taxadieno puro com a literatura reportada para confirmar a autenticidade do compound.60 A fim de verificar a pureza realizamos RMN 1H de taxadieno. Uma vez que o acúmulo de taxadieno-5α-ol apresentou um nível muito baixo, taxadieno foi utilizado como uma medida para quantificar a produção desta molécula e características de fragmentação espectral de massa autêntica de relatórios anteriores42. Medições de qPCR para análise transcricional de cepas manipuladas

[00107] Níveis de expressão gênica transcricionais de cada gene foram detectados por qPCR em mRNA isolado a partir das cepas apropriadas. Para evitar a degradação, o RNA foi estabilizado antes da lise celular usando o reagente bacteri- ano RNAprotect (Qiagen). Subsequentemente, o RNA total foi isolado utilizando o mini kit RNeasy (Qiagen), combinado com remoção dos contaminantes de DNA ge- nômico à base de RNA. O cDNA foi amplificado usando o kit de síntese de cDNA iScript (Biorad). qPCR foi realizado em um iCycler da Bio-Rad utilizando o iQ SYBR Green Supermix (Biorad). O nível de expressão do gene rrsA, que não está sujeito à expressão variável, foi utilizado para a normalização dos valores de qPCR.56 A Tabela 3 tem iniciadores utilizados para qPCR. Para cada par de iniciadores, uma curva padrão foi construída com mRNA de E. coli como o molde.Exemplo 1: Acúmulo de taxadieno exibe uma dependência não linear forte nas intensidades relativas das vias do taxadieno sintética à montante de MEP e à jusante.

[00108] A figura 1b mostra as várias formas pelas quais os promotores e os números de cópias do gene foram combinados para modular o fluxo relativo (ou intensidade) através das vias à montante e à jusante da síntese de taxadieno. Um total de 16 cepas foram construídas de modo a desobstruir a via MEP, bem como equilibrá-la otimamente com a via de taxadieno à jusante. As figuras 2a, b resumem os resultados do acúmulo de taxadieno em cada uma destas cepas, com a figura 2a acentuando a dependência do acúmulo de taxadieno na via à montante para valores constantes da via à jusante, e a figura 2b a dependência na via à jusante para a intensidade da via à montante constante (ver também a Tabela 1 para o cálculo da expressão da via à montante e à jusante da intensidade do promotor e dos números de cópia de plasmídeo reportados33-36). Claramente, existem máximos exibidos em relação à expressão da via tanto à montante quanto à jusante. Para a expressão da via à jusante constante (Figura 2a), à medida que aumenta a expressão da via à montante a partir de níveis muito baixos, a produção de taxadieno é aumentada inicialmente devido ao fornecimento aumentado de precursores para a via geral. No entanto, após um valor intermédio, os aumentos da via à montante adicionais não podem ser acomodados pela capacidade da via à jusante. Este desequilíbrio da via leva ao acúmulo de um intermediário (ver abaixo) que pode ser inibitório para as células ou simplesmente indicar desvio de fluxo para uma via competidora, em última análise, resultando na redução do acúmulo de taxadieno.

[00109] Para a expressão da via à montante constante (Figura 2b), um máximo é similarmente observado com relação ao nível de expressão da via à jusante. Isto é atribuído a uma limitação inicial de produção de taxadieno por níveis de expressão baixos da via à jusante, que é, assim, limitador da taxa em relação à produção de taxadieno. Em níveis elevados de expressão da via à jusante, é provavelmente observado o efeito negativo do elevado número de cópias na fisiologia celular, por conseguinte, um máximo existe com relação à expressão da via à jusante. Estes resultados demonstram que alterações dramáticas no acúmulo de taxadieno podem ser obtidas a partir de mudanças dentro de uma janela estreita de níveis de expressão para as vias à montante e à jusante. Por exemplo, uma cepa contendo uma cópia adicional da via à montante no seu cromossoma sob controle do promotor Trc (Cepa 8, figura 2a) produziu 2000 vezes mais taxadieno do que uma superex- pressando apenas a via sintética à jusante (Cepa 1, figura 2a). Além disso, a mudança da ordem dos genes no operon sintético à jusante de GT (GPPS-TS) para TG (TS-GPPS) resultou em um aumento de 2 a 3 vezes (cepas 1 a 4 em comparação com 5, 8, 11 e 14). Os resultados observados mostram que a chave para a super-produção de taxadieno é a ampla capacidade da via à jusante e o cuidadoso equilíbrio entre a via do precursor à montante com a via do taxadieno sintética à jusante. Em conjunto, as cepas manipuladas estabeleceram que o fluxo da via MEP pode ser substancial, se uma ampla variedade de níveis de expressão para a via à montante endógena e à jusante sintética são pesquisados simultaneamente.Exemplo 2: Integração cromossômica e ajuste fino das vias à montante e à jusante aumenta ainda mais a produção de taxadieno.

[00110] Para fornecer uma ampla intensidade da via à jusante enquanto se minimiza o ônus metabólico exibido pelo plasmídeo37, dois novos conjuntos de 4 cepas cada foram manipulados (cepas 25-28 e 29-32), em que a via à jusante foi colocada sob o controle de um promotor forte (T7), mantendo um número relativamente baixo de 5 e 10 cópias, respectivamente. Pode ser observado (Figura 2c) que, enquanto o máximo de taxadieno é mantida em alta intensidade à jusante (cepas 21 a 24), uma resposta monotônica é obtida na baixa intensidade da via à jusante (cepas 17 a 20, figura 2c). Esta observação levou à construção de dois conjuntos adicionais de 4 cepas cada que mantinham o mesmo nível de força intensidade da via à jusante como antes, mas expressavam níveis muito baixos da via à montante (cepas 25 a 28 e 29 a 32, Figura 2d). Além disso, o operon da via à montante do último conjunto de cepas foi cromossomicamente integrado. Pode ser observado que não apenas é o máximo de taxadieno recuperado, embora um máximo de taxadieno muito maior seja obtido (300 mg/L). Acredita-se que um aumento significativo pode ser atribuído a uma diminuição no ônus metabólico celular. Isto foi conseguido por 1) eliminação da dependência do plasmídeo através da integração da via no cromossomo e 2) atingindo um bom equilíbrio entre a expressão da via à montante e à jusante.

[00111] Os 32 constructos recombinantes nos permitiram investigar adequadamente o espaço de expressão da via modular e amplificar ~ 15000 vezes a melhoria na produção de taxadieno. Isto é de longe a maior produção de terpenoides da via isoprenoide do MEP de E. coli reportada (Figura 3a). Além disso, as melhorias em vezes observadas na produção de terpenoides são significativamente maiores do que aquelas das abordagens de manipulação metabólicas combinatoriais repor- tadas que buscavam um espaço genético extensivo compreendendo até um bilhão de variantes combinatoriais da via do isoprenoide.30 Isto sugere que a otimização da via depende muito mais de um delicado equilíbrio da expressão dos módulos da via do que a otimização gênica combinatorial multifonte. Os máximos múltiplos exibidos no cenário fenotípico da figura 1 realçam a importância de sondagem do espaço de expressão em resolução suficiente para identificar a região de desempenho da via global ótimo. A figura 7 demonstra as vezes da melhoria na produção de taxadieno a partir da busca de expressão da via modular.Exemplo 3: O metabólito se correlaciona inversamente com a produção de taxadieno e a identificação do metabólito.

[00112] A análise metabolômica das cepas anteriormente manipuladas identificaram um subproduto metabólico ainda desconhecido que se correlacionou fortemente com os níveis de expressão da via e com a produção de taxadieno (Figura 3 e Figura 8). Embora a identidade química do metabólito fosse desconhecida, levantou-se a hipótese de que ele é um isoprenoide secundário, resultante do desvio da via e que foi anticorrelacionado como uma variável direta para a produção de taxadi- eno (Figura 3 e a Figura 8) a partir das cepas manipuladas. Um atributo essencial de nossas cepas ótimas é o fino equilíbrio que alivia o acúmulo deste metabólito, resultando em maior produção de taxadieno. Este equilíbrio pode ser modulado em diferentes níveis de cromossomo, ou diferentes números de cópia de plasmídeos, utilizando diferentes promotores, com acúmulo de taxadieno significativamente diferente.

[00113] Subsequentemente, o pico correspondente no cromatograma de cromatografia a gás-espectrometria de massa (GC-MS) foi identificado como indol por GC-MS, estudos de ressonância magnética nuclear (RMN) 1H e 13C (Figura 16). Foi verificado que a síntese de taxadieno pela cepa 26 é severamente inibida pelo indol exógeno em níveis indólicos superiores a ~ 100 mg/L (Figura 15b). O aumento adicional da concentração de indol também inibiu o crescimento celular, com o nível de inibição sendo dependente da cepa (Figura 15c). Embora o mecanismo bioquímico de interação do indol com a via isoprenoide é atualmente pouco claro, os resultados na figura 15 sugerem um possível efeito sinérgico entre os compostos de indol e terpenoides da via isoprenoide na inibição do crescimento celular. Sem conhecer o mecanismo específico, parece que a cepa 26 atenuou o efeito do indol, que nós transportamos para estudo posterior.Exemplo 4: Cultivo de cepas manipuladas.

[00114] A fim de explorar o potencial de produção de taxadieno sob condições controladas para as amostras manipuladas, os cultivos do lote por alimentação das cepas de acúmulo de taxadieno mais altos (~ 60 mg/L da cepa 22; ~ 125 mg/L a cepa 17; ~ 300 mg/L da cepa 26) foram realizados em biorreatores de 1L (Figura 17). Os estudos de cultivo de alimentação em lote foram realizados como uma fermentação de duas fases líquido-líquido utilizando uma cobertura de dodecano de 20% (v/v). O solvente orgânico foi introduzido para evitar a retirada de ar do taxadie- no secretado do meio de fermentação, como indicado por resultados preliminares. No meio definido com alimentação de glicerol controlada, a produtividade de taxadi- eno aumentou até 174 ± 5 mg/L (SD), 210 ± 7 mg/L (SD) e 1020 ± 80 mg/L (SD), respectivamente, para as cepas 22, 17 e 26 (Figura 17a). Além disso, a produção de taxadieno afetou significativamente o fenótipo de crescimento, o acúmulo de acetato e o consumo de glicerol (Figuras 17b-17d).

[00115] A figura 17c mostra que o acetato se acumula em todas as cepas inicialmente, no entanto, após ~ 60 horas, o nível de acetato diminui nas cepas 17 e 26, enquanto ele continua a aumentar na cepa 22. Este fenômeno destaca as diferenças no metabolismo de carbono central entre cepas com fluxo de MEP elevado (26 e 17) e a cepa de fluxo de MEP baixo (22). Além disso, essa observação é outra ilustração da boa fisiologia que caracteriza uma cepa bem equilibrada, e eu funciona bem. Ácido acético, como um produto do metabolismo demasiado, é inicialmente produzido por todas as cepas devido às elevadas concentrações de glicerol iniciais utilizadas nestas fermentações e ao fluxo da via do glicerol elevado. Este fluxo é suficiente para fornecer também a via MEP, bem como as outras vias metabólicas na célula.

[00116] Em ~ 48 horas, o glicerol inicial é esgotado e o cultivo é modificado para um modo de lote por alimentação, durante o que baixos, porém constantes níveis de glicerol são mantidos. Isto resulta em um fluxo de glicerol global baixo, o que, para as cepas com elevado fluxo de MEP (cepas 26 e 17), é em grande parte desviado para a via MEP, minimizando ao mesmo tempo o metabolismo excessivo. Como resultado, a produção de ácido acético é reduzida ou mesmo totalmente eliminada. Em relação ao declínio na concentração de ácido acético, é possível que a assimilação de ácido acético possa ter acontecido até certa medida, embora isto não tenha sido investigado adicionalmente de um ponto de vista de análise de fluxo. Certa extensão de evaporação e diluição devido à alimentação de glicerol contribuem adicionalmente para o declínio da concentração de ácido acético observado. Ao contrário, para cepas com baixo fluxo de MEP (cepa 22), o desvio do fluxo para a via do MEP não é muito significativo, de modo que o fluxo de glicerol fornece adicionalmente todo o carbono necessário e as necessidades energéticas. O metabolismo demasiado continua a ocorrer, levando à secreção de acetato.

[00117] Claramente, a alta produtividade e o crescimento mais robusto da cepa 26 permitiu acúmulo de taxadieno muito elevado. Outras melhorias devem ser possíveis através da otimização das condições no biorreator, equilíbrio dos nutrientes no meio de crescimento, e otimização da distribuição do carbono.Exemplo 5: Níveis de expressão das vias à montante e à jusante e crescimento celular revelou a complexidade subjacente.

[00118] Para uma compreensão mais detalhada do equilíbrio de engenharia na expressão da via, nós quantificados os níveis de expressão do gene transcricio- nais de dxs (via à montante) e TS (via à jusante) para as cepas produtoras de taxa- dieno mais elevadas e cepas vizinhas das figuras 2c e d (cepas 17, 22 e 25 a 32) (figuras 4a, b). Conforme a hipótese levantada, a expressão da via à montante aumentou monotonicamente com a intensidade do promotor e o número de cópias para o vector MEP de: promotor nativo, Trc, T5, T7, e plasmídeos de 10 cópias e 20 cópias, como observado na expressão de DXS (Figura 4a). Assim, verificamos que o nível de expressão de dxs se correlaciona bem com a intensidade de via à montante. Correlações similares foram encontradas para os outros genes da via à montan-te, idi, ispD e ispF (figuras 14a, b). Na expressão do gene à jusante, uma melhoria de ~ 2 vezes foi quantificada após a transferência da via do plasmídeo de 5 para cópias (séries 25 a 28 série e séries 29 a 32) (Figura 4b).

[00119] Embora os efeitos do número de cópias e promotor influenciaram as expressões dos genes, os efeitos secundários sobre a expressão da outra via também foram proeminentes. A figura 4a mostra que, para os mesmos cassetes de expressão dxs, através do aumento do número de cópias do plasmídeo Ts de 5 para 10, a expressão de dxs foi aumentada. Curiosamente, o plasmídeo TS de 5 cópias (séries de cepas 25 a 28) continham níveis de taxadieno substancialmente mais elevados (Figura 2d) e com menos crescimento (figuras 4c, d) do que o plasmídeo TS com 10 cópias. Plasmídeos de controle que não continham a via heteróloga de taxa- dieno cresceram com densidades duas vezes maiores, o que implica na inibição do crescimento nas séries de cepas 25 a 28 sendo diretamente relacionado com a via metabólica do taxadieno e o acúmulo de taxadieno e seus intermediários diretos (Figura 4c). No entanto, a série das cepas 29 a 32 série só mostraram aumentos mo-destos no rendimento de crescimento em comparação com os plasmídeos de controle vazio para as cepas que expressam taxadieno (Figura 4d). Esta interação entre o crescimento, a produção de taxadieno e o nível de expressão também pode ser observada com os vetores de expressão à montante à base de plasmídeos (cepas 17 e 22). A inibição do crescimento foi muito maior na cepa altamente produtora de taxadieno de 10 cópias (cepa 17) em comparação com a cepa pouco produtora de taxadieno de 20 cópias (cepa 22) (figura 4d). Portanto, a toxicidade do produto e o desvio de carbono para a via heteróloga são susceptíveis de impedir o crescimento, ao invés da manutenção do plasmídeo.

[00120] Também foi inesperado o efeito intenso do vetor de expressão à montante na expressão à jusante. A figura 4b poderia ter duas linhas retas, no caso de não haver comunicação cruzada entre as vias. No entanto, mudanças de ~ 3 vezes na expressão de TS são observadas para vetores de expressão de MEP diferentes. Isto é provavelmente devido à competição significativa para os recursos (matéria-prima e energia) que são retirados do metabolismo do hospedeiro para a supe- rexpressão tanto dos quatro genes à montante quanto dos dois genes à jusante.38 Em comparação com a cepa de controle 25c, uma inibição do crescimento de 4 vezes foi observada com a cepa 25 que indicou que a elevada superexpressão da via do taxadieno sintética induziu a toxicidade, alterando o fenótipo de crescimento em comparação com a superexpressão da via nativa (Figura 4c). No entanto, conforme a expressão à montante aumentou, a expressão à jusante foi reduzida, inadvertidamente no nosso caso, até níveis desejáveis para equilibrar as vias à montante e à jusante, minimizando a inibição do crescimento (cepa 26).

[00121] No extremo da superexpressão da proteína, a via MEP direcionada pelo promotor T7 resultou na inibição do crescimento severa devido à síntese de quatro proteínas em alto nível (cepas 28 e 32). A expressão dos genes TS por T7 não parece ter efeito drástico por si só. As altas taxas de síntese de proteínas a partir da expressão induzida por T7 (Figura 4AB) poderia levar à infrarregulação da maquinaria de síntese de proteínas, incluindo componentes dos genes de controle da fase de crescimento inicial que prejudicam o crescimento celular e diminuir o aumen- to em biomassa.39,40 Foi levantada a hipótese de que os nossos fenótipos de crescimento complexos observados são efeitos cumulativos de (1) toxicidade induzida por ativação do metabolismo de isoprenoide/taxadieno, (2) e os efeitos da alta expressão da proteína recombinante. Ao todo, nossa abordagem da via multivariada modular gerou diversidade inesperada no metabolismo terpenoide e sua correlação com a expressão da via e a fisiologia celular. O design racional dos micróbios para a produção de metabólitos secundários exigirá uma compreensão da expressão da via que vai além de uma compreensão linear/independente das intensidades do promotor e dos números de cópias. No entanto, abordagens simples, multivariadas, como aqui utilizadas, podem introduzir a diversidade necessária (1) tanto para encontrar grandes produtores, (2) quanto para proporcionar um cenário para a investigação sistemática dos efeitos de ordem superior que são dominantes, ainda que subapre- ciados, na manipulação da via metabólica.Exemplo 6: Manipulação da Química de Oxidação à base de P450 e Taxol em E. coli.

[00122] Uma característica central na biossíntese de taxol é a oxigenação em múltiplas posições da estrutura do núcleo de taxano, reações que são consideradas como sendo mediadas pelas monoxigenases dependentes da citocromo P450.41 Após o completamento da etapa de ciclização envolvida da via, a olefina original, taxa-4(5),11(12)-dieno, é a seguir hidroxilada na posição C5 por uma enzima citocromo P450, representando a primeira de oito etapas de oxigenação (do núcleo de taxano) na via do Taxol (Figura 6).42 Assim, uma etapa chave para manipular micróbios produtores de Taxol é o desenvolvimento da química de oxidação à base de P450 in vivo. A primeira etapa de oxidação é catalisada por uma citocromo P450, taxadieno 5α-hidroxilase, uma monoxigenase incomum que catalisa a reação de hi- droxilação, juntamente com a migração da ligação dupla no taxadieno precursor de diterpeno (Figura 5a). Foi relatada a primeira extensão bem sucedida da via sintética do taxadieno para taxadien-5α-ol e apresentados os primeiros exemplos de produção in vivo de quaisquer intermediários funcionalizados do Taxol em E. coli.

[00123] Em geral, a expressão funcional do citocromo P450 vegetal é desa- fiadora43 devido às limitações inerentes das plataformas bacterianas, tais como a ausência de maquinaria de transferência de elétrons, citocromo P450redutases e incompatibilidade de tradução dos módulos de sinal de membrana das enzimas P450 devido à falta de um retículo endoplasmático. Recentemente, por meio da manipulação transmembranar (TM) e da geração de enzimas quimera de P450 e CPR redutases, algumas P450 vegetais foram expressas em E. coli para a biossíntese de moléculas funcionais.22,44 Ainda assim, cada citocromo P450 vegetal é único na sua sequência de sinal transmembranar e as características de transferência de elétrons de suas contrapartes de redutase.45 Nossos estudos iniciais foram concentrados na otimização da expressão sintética da taxadieno 5a-hidrolase otimizada por códon por manipulação transmembranar N-terminal e geração de enzimas quimera através da fusão de tradução com o parceiro CPR redox da espécie Taxus, citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR) (figura 5b).42,44,46 Uma das enzimas quimera geradas, At24T5αOH-tTCPR, foi altamente eficiente para a realização da primeira etapa de oxidação, com mais de 98% de conversão de taxadieno para taxadien-5α-ol e o subproduto 5(12)-Oxa-3(11)-ciclotaxano (OCT) (Figura 9a).

[00124] Em comparação com as outras P450s quiméricas, At24T5αOH- tTCPR forneceu uma produção duas vezes maior (21 mg/L) de taxadien-5α-ol. Da mesma forma, a atividade mais fraca de At8T5αOH-tTCPR e At24T5αOH-tTCPR resultou na acumulação de um subproduto recém-caracterizado, um rearranjo estrutural complexo de taxadieno no éter cíclico 5(12)-Oxa-3(11)-ciclotaxano (OCT) (Figura 9).47 O subproduto se acumulou em quantidades aproximadamente iguais ao produto desejado taxadien-5α-ol. A formação de OCT foi mediada por uma sequência reacional de citocromo P450 de Taxus sem precedentes que envolve a oxidação e subsequentes ciclizações.47 Assim, parece provável que por manipulação de proteína das taxadieno 5α-hidroxilases, a terminação da reação antes de ciclização irá prevenir o acúmulo de tal subproduto indesejável, e a canalização do fluxo para ta- xadien-5α-ol pode ser alcançada.

[00125] A produtividade da cepa 26-At24T5αOH-tTCPR foi significativamente reduzida em relação à produção de taxadieno pela cepa original 26 (~ 300 mg/L) com um aumento concomitante no acúmulo do metabólito não caracterizado descrito anteriormente. Nenhum acúmulo de taxadieno foi observado. Aparentemente, a introdução de um plasmídeo de cópia de meio adicional (10 cópias, p10T7), com o constructo At24T5αOH-tTCPR perturbou o equilíbrio cuidadosamente concebido na via à montante e à jusante da cepa 26. Fermentações em pequena escala foram realizadas nos biorreatores para quantificar a produção de álcool pela cepa 26- At24T5αOH-tTCPR. O perfil de duração de tempo do acúmulo de taxadien-5α-ol (Figura 5d) indica produção de álcool de até 58 ± 3 mg/L com uma quantidade igual de subproduto OCT produzido. A produção de álcool observada foi ~ 2400 vezes maior do que a produção anterior de S. cerevisiae.17 Aumentos adicionais da produção de taxadien-5α-ol são provavelmente possíveis através da otimização da via e manipulação da proteína.

[00126] A abordagem multivariada modular da otimização da via produziu cepas altamente produtoras de um precursor de Taxol crítico. Além disso, os cons- tructos recombinantes foram igualmente eficazes na reorientação do fluxo para a síntese de outros compostos farmacêuticos complexos, tais como produtos de mono, sesqui e diterpeno (geraniol, linalool, amorfadieno e levopimaradieno) manipulados a partir da mesma via (resultados não publicados). Assim, a nossa manipulação da via abre novas vias para biossintetizar produtos naturais, especialmente no contexto de terpenoides microbianamente derivados para uso como produtos químicos e combustíveis a partir de fontes renováveis. Ao concentrar-se nos precursores de terpenoides universais IPP e DMAPP, foi possível, em primeiro lugar, definir os módulos da via crítica e, em seguida, modular a expressão de modo a equilibrar otimamente os módulos da via para a conversão do precursor sem emenda e acúmulo mínimo de intermediário. Esta abordagem parece ser mais eficaz do que as buscas combinatórias de grandes espaços genéticos e também não depende de uma varredura de rendimento elevado.

[00127] A via do MEP é energeticamente equilibrada e, portanto, em geral mais eficiente na conversão de glicose ou glicerol em isoprenoides. No entanto, durante os últimos 10 anos, muitas tentativas de manipulação da via do MEP em E. coli para aumentar a oferta dos precursores chave IPP e DMAPP para a superprodução de carotenoides28,47, sesquiterpenoides23 e diterpenoides61 foram satisfatórias com limitado sucesso. Esta ineficiência foi atribuída aos efeitos reguladores desconhecidos associados especificamente com a expressão da via do MEP em E. coli23. Aqui, fornecemos evidências de que tais limitações são correlacionadas com o acúmulo do metabólito indol, devido à expressão não ótima da via, que inibe a atividade da via de isoprenoide. A superprodução de taxadieno (sob condições de supressão da formação de indol), estabelece a via do MEP como uma via muito eficaz para a bios- síntese de produtos farmacêuticos e químicas da família isoprenoide. Uma pessoa simplesmente precisa equilibrar cuidadosamente as vias modulares, conforme sugerido pela nossa abordagem de manipulação da via modular multivariada.

[00128] Para a produção microbiana bem sucedida de Taxol, a demonstração da decoração química do núcleo de taxadieno por química de oxidação à base de P450 é essential.41 As citocromo P450 monoxigenases constituem cerca de metade das 19 etapas distintas na via biossintética do Taxol. Caracteristicamente, estes genes apresentam alta similaridade de sequência incomum entre si (> 70%), porém baixa similaridade (< 30%) com outras P450s vegetais.14 Devido à semelhança aparente entre as monoxigenases do Taxol, a expressão da atividade adequada para a realização da química de oxidação de P450 específica foi um desafio particular. Através da manipulação de TM e construção de uma enzima quimera artificial com o parceiro redox (TCPR), o citocromo P450 de Taxol, taxadieno 5α-hidroxilase, foi funcionalmente expresso em E. coli e mostrou que converte eficientemente o taxadieno ao produto de álcool correspondente in vivo. Estudos in vitro anteriores descreveram o mecanismo de conversão do taxadieno em taxadien-5α-ol pela enzima taxadieno 5α-hidrolase nativa, mas não discutiram a mesma conversão in vivo.42 Esta reação de oxigenação e rearranjo envolve a abstração de hidrogênio a partir da posição C20 do taxadieno para formar um intermediário radical alílico, seguido pela inserção de oxigênio régio e estereoespecifica na posição C5 para produzir o derivado de álcool (Figura 5a). A abundância modesta observada da enzima em células Taxus e os baixos valores kcat sugeriram que a etapa de 5a-hidroxilação da biossíntese de taxol é lenta em relação às oxigenações e acilações à jusante na via do Taxol.41 Desse modo, a manipulação desta etapa é chave para a síntese do Taxol, especialmente no contexto de manipulação funcional de P450 de Taxol no hospedeiro proca- riótico, tal como E. coli. Além disso, esta etapa foi limitante em esforços anteriores de construção da via em leveduras.17 A construção manipulada neste estudo demonstrou > de 98% de conversão de taxadieno in vivo com acúmulo de produto até ~ 60 mg/L, uma melhoria de 2400 vezes em relação à expressão heteróloga anterior em levedura. Este estudo foi, por conseguinte, bem sucedido não apenas na síntese de quantidades maiores dos intermediários de Taxol chave, mas também fornece a base para a síntese de metabólitos subsequentes na via por química de P450 similar.

[00129] Estudos anteriores sobre a relação estrutura-atividade no Taxol mostraram que as alterações feitas quer por remoção ou adição de alguns dos seus grupos funcionais não alterou significativamente a atividade do Taxol.1,48 Tais estudos, no entanto, foram limitados devido à capacidade restrita para introduzir altera- ções por síntese química. A disponibilidade de um caminho microbiano para a síntese do Taxol será expandir drasticamente o espaço de modificações químicas que podem ser examinadas, aumentando assim a probabilidade de identificar fármacos candidatos mais potentes. Isto oferece novas oportunidades notáveis para o desenvolvimento de fármacos, ao considerar que tais candidatos a fármacos tais também estarão associados com uma via de produção eficiente.

[00130] Nas últimas algumas décadas, Taxol gerou mais interesse nas comunidades científicas e no público em geral do que qualquer outro fármaco de produto natural candidato.10 Uma grande crise de abastecimento está prevista a partir do aumento projetado no uso de Taxol ou análogos de Taxol para a quimioterapia do câncer, exigindo novas vias de produção, tal como a manipulação da maquinaria biossintética do Taxol em micróbios.8 Embora alguns fungos endofíticos da espécie de Taxus foram isolados capazes de produzir Taxol naturalmente, estes sistemas microbianos ainda têm que demonstrar adequabilidade para a produção sustentável do fármaco.49 Os resultados aqui relatados representam uma etapa disruptiva em direção a um Taxol microbianamente derivado ou precursor do Taxol, pela remoção das restrições na via precursora envolvida. Além disso, a montagem de uma via sin-tética oferece novas possibilidades para adaptar os análogos de Taxol por manipulação seletiva da via, deste modo alterando a estrutura do taxano. Estes desenvolvimentos suscitam otimismo para uma via microbiana para a produção economicamente eficaz de Taxol ou de precursores do Taxol adequados.

[00131] Tabela 1. Classificação de expressão da via à montante e à jusante em unidades arbitrárias (a.u.). Os níveis de expressão da via MEP e da via da GGPP sintase/taxadieno sintase foram estimados utilizando os valores publicados de forças do promotor e número de cópias. As forças do promotor foram calculadas como trc = 1, T5 = 1,96, T7 = 4,97, com base em Brosius et. al. e Brunner et. al.33,34 O número de cópias do gene foi designado pelo número de cópias publicado para a origem de replicação para os diferentes plasmídeos utilizados, e uma cópia foi utilizada para integrações.35-37 A expressão total foi calculada como o produto da força do promotor e o número de cópias do gene. À expressão nativa da via MEP foi arbitrariamente atribuído a um valor de um, e a mudança da ordem do operon da GGPP sintase e taxadieno foi considerada como afetando a expressão da taxadieno sintase em 20%.35 Estas estimativas da expressão total direcionaram os esforços de manipulação. E - E coli K12 MG1655 com duas eliminações ΔrecAΔendA; EDE3 - K12 MG1655 ΔrecAΔendA com uma T7 RNA polimerase (DE3) integrada; MEP - operon dxs-idi-ispDF; GT - operon GPPS-TS; TG - operon TS-GPPS; Ch1 - 1 cópia no cromossomo; Trc - promotor trc; T5 - promotor T5; T7 - promotor T7, p5 - plasmídeo de ~ 5 cópias (pSC101);, p10 - plasmídeo de ~ 10 cópias (p15A); e p20 - plasmídeo de ~ 20 cópias (pBR322).

* Um valor de 1 foi dado para responder pelas cópias naturais da via MEP.$ O constructo MEP está localizado no cromossomo.# P20T5GT-TrcT - Uma cópia adicional do gene T sob controle do promotor separado (Trc) juntamente com o opero GT (sob o promotor T5) no mesmo plasmí- deo. Para a força de cálculo, nós adicionamos o valor como equivalente de dois ope- rons separados (TrcT + T5GT = (20 x 1,96 + 20 x 1 = 59)), pois nossos estudos demonstram que a expressão de T foi limitada em comparação com G.

Tabela 2. Detalhe de todos os plasmídeos construídos para o estudoSEQ ID NO Nome do Iniciador Sequências

Tabela 3. Detalhes do iniciador usado para a clonagem dos plasmídeos, distribuição cromossômica da via MEP e medições de qPCR Tabela 4. Sequências de nucleotídeo otimizadas de Proteína e Códon GGPP sintaseMFDFNEYMKSKAVAVDAALDKAIPLEYPEKIHESMRYSLLAGGKRVRPALCI AACELVGGSQDLAMPTACAMEMIHTMSLIHDDLPCMDNDDFRRGKPTNHKVFGED TAVLAGDALLSFAFEHIAVATSKTVPSDRTLRVISELGKTIGSQGLVGGQVVDITSEG DANVDLKTLEWIHIHKTAVLLECSVVSGGILGGATEDEIARIRRYARCVGLLFQVVDDI LDVTKSSEELGKTAGKDLLTDKATYPKLMGLEKAKEFAAELATRAKEELSSFDQIKA APLLGLADYIAFRQN (SEQ ID NO:42)ATGTTTGATTTCAATGAATATATGAAAAGTAAGGCTGTTGCGGTAGACGC GGCTCTGGATAAAGCGATTCCGCTGGAATATCCCGAGAAGATTCACGAATCGAT GCGCTACTCCCTGTTAGCAGGAGGGAAACGCGTTCGTCCGGCATTATGCATCG CGGCCTGTGAACTCGTCGGCGGTTCACAGGACTTAGCAATGCCAACTGCTTGC GCAATGGAAATGATTCACACAATGAGCCTGATTCATGATGATTTGCCTTGCATGG ACAACGATGACTTTCGGCGCGGTAAACCTACTAATCATAAGGTTTTTGGCGAAG ATACTGCAGTGCTGGCGGGCGATGCGCTGCTGTCGTTTGCCTTCGAACATATC GCCGTCGCGACCTCGAAAACCGTCCCGTCGGACCGTACGCTTCGCGTGATTTC CGAGCTGGGAAAGACCATCGGCTCTCAAGGACTCGTGGGTGGTCAGGTAGTTG ATATCACGTCTGAGGGTGACGCGAACGTGGACCTGAAAACCCTGGAGTGGATC CATATTCACAAAACGGCCGTGCTGCTGGAATGTAGCGTGGTGTCAGGGGGGAT CTTGGGGGGCGCCACGGAGGATGAAATCGCGCGTATTCGTCGTTATGCCCGCT GTGTTGGACTGTTATTTCAGGTGGTGGATGACATCCTGGATGTCACAAAATCCA GCGAAGAGCTTGGCAAGACCGCGGGCAAAGACCTTCTGACGGATAAGGCTACA TACCCGAAATTGATGGGCTTGGAGAAAGCCAAGGAGTTCGCAGCTGAACTTGC CACGCGGGCGAAGGAAGAACTCTCTTCTTTCGATCAAATCAAAGCCGCGCCACT GCTGGGCCTCGCCGATTACATTGCGTTTCGTCAGAAC (SEQ ID NO:43) Taxadieno sintaseMSSSTGTSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTY QERADELVVKIKDMFNALGDGDISPSAYDTAWVARLATISSDGSEKPRFPQALNWV FNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVIALSVWKTGHSQVQQGAEFIAENLRLL NEEDELSPDFQIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLSTTREARLTDVSAAADNIPAN MLNALEGLEEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCFTFLNNLLDKF GGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIKGALDYVYRHWSERGIGWGRD SLVPDLNTTALGLRTLRMHGYNVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLF RASDLAFPDERAMDDARKFAEPYLREALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRL EARSYIDSYDDNYVWQRKTLYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRW WKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPEYSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLD ELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEEVNNDVVKVQGRDMLAHIR KPWELYFNCYVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILLMGELVKDDV VEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAI KHICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKD YIRKVYIDPIQV (SEQ ID NO:44)ATGTCTAGCTCTACGGGTACGTCTAAAGTCGTGAGTGAAACCTCATCGA CGATCGTGGACGATATTCCACGCTTGTCGGCGAACTATCATGGAGATCTGTGGC ATCATAACGTCATTCAGACATTGGAAACCCCGTTTCGCGAAAGTAGCACCTACC AGGAACGGGCAGATGAATTAGTCGTGAAAATCAAAGATATGTTTAATGCATTAG GAGATGGAGACATCTCGCCCAGCGCATATGATACGGCGTGGGTGGCTCGGTTG GCCACGATTAGCTCCGATGGCAGTGAAAAGCCGCGTTTCCCGCAGGCGCTGAA CTGGGTGTTTAATAATCAATTGCAGGATGGCAGCTGGGGCATTGAATCTCACTT TAGCCTCTGTGACCGGTTACTCAACACGACAAACTCCGTAATTGCGTTGTCAGT TTGGAAAACGGGCCATAGCCAGGTTCAACAGGGCGCGGAATTTATCGCTGAAA ATCTGCGCCTGCTGAACGAGGAGGACGAACTGTCACCCGATTTTCAGATTATTT TTCCGGCTTTACTCCAGAAAGCCAAAGCCTTAGGCATCAACCTGCCATATGATCTGCCGTTCATCAAGTATCTGTCTACTACCCGCGAAGCCCGTCTCACTGACGTCTCTGCGGCGGCGGACAATATTCCAGCGAACATGCTGAACGCACTGGAAGGGCTGGAAGAGGTTATCGACTGGAATAAAATCATGCGCTTCCAAAGCAAGGACGGTAGCTTCTTAAGCAGCCCAGCATCTACTGCTTGTGTTCTGATGAATACCGGAGACGAAAAGTGCTTTACGTTTCTGAACAATCTGCTGGACAAATTTGGGGGTTGTGTTCCTTGTATGTATTCCATTGATCTGTTGGAACGTCTGTCGCTGGTCGATAACATTGAACACTTAGGTATCGGCCGCCACTTCAAACAAGAAATCAAGGGGGCGTTGGATTATGTATACCGTCATTGGAGCGAGCGTGGTATTGGTTGGGGGCGCGATAGCTTGGTACCTGATCTGAACACCACTGCTTTGGGACTGCGCACTCTTCGTATGCACGGATACAACGTTAGTTCCGATGTCCTCAATAATTTCAAGGACGAGAACGGCCGTTTTTTCAGCTCGGCCGGTCAGACGCATGTTGAACTGCGGTCCGTAGTCAATCTCTTTCGCGCTAGTGATCTGGCCTTCCCCGACGAGCGCGCTATGGACGATGCACGGAAGTTTGCCGAGCCGTATCTCCGCGAAGCCCTGGCCACCAAAATTTCAACCAACACCAAGCTTTTCAAAGAAATTGAGTATGTAGTAGAGTATCCGTGGCATATGTCTATTCCGCGCCTGGAAGCCCGCTCGTATATCGATTCTTACGATGACAATTATGTGTGGCAACGCAAAACACTGTACCGTATGCCCAGCCTGTCAAATAGTAAGTGTCTGGAGCTGGCGAAACTGGATTTCAACATTGTGCAATCCCTGCACCAAGAAGAGCTGAAATTACTGACTCGCTGGTGGAAGGAATCCGGCATGGCAGACATCAATTTTACGCGTCACCGTGTTGCAGAGGTGTACTTCTCCTCGGCGACCTTTGAGCCGGAGTATTCGGCCACACGTATTGCATTTACCAAGATTGGCTGCCTTCAGGTGCTTTTTGACGATATGGCGGATATTTTTGCGACACTTGATGAGCTTAAATCATTTACCGAAGGCGTGAAGCGTTGGGATACCTCTCTGTTGCATGAAATCCCCGAATGTATGCAGACCTGCTTCAAAGTTTGGTTCAAACTGATGGAAGAAGTGAACAACGACGTCGTGAAAGTTCAGGGTCGTGATATGTTAGCACACATCCGCAAGCCGTGGGAACTCTATTTCAATTGCTATGTGCAGGAGCGTGAATGGTTAGAAGCGGGCTACATTCCTACCTTCGAAGAGTACTTAAAAACCTATGCCATTTCCGTCGGTTTAGGCCCGTGCACTCTGCAGCCT ATCTTGCTGATGGGTGAGCTGGTAAAGGATGATGTGGTGGAAAAAGTTCACTAC CCGTCGAATATGTTTGAACTGGTAAGTCTGAGTTGGCGTCTGACAAACGACACC AAAACGTACCAGGCAGAAAAGGCACGTGGGCAACAGGCAAGCGGTATCGCGTG TTATATGAAGGATAATCCGGGCGCTACTGAGGAAGATGCCATTAAGCATATCTG CCGTGTTGTGGATCGCGCTCTTAAAGAAGCGTCATTCGAATATTTTAAACCTAGT AATGATATTCCGATGGGTTGTAAGTCATTCATTTTCAATCTTCGCCTGTGCGTGC AAATTTTTTACAAATTTATTGACGGCTACGGAATCGCCAACGAAGAAATCAAAGA CTATATTCGTAAAGTTTACATCGATCCAATCCAGGTC (SEQ ID NO:45)Citocromo P450 Taxadieno 5a-hidroxilase (T5aOH)MDALYKSTVAKFNEVTQLDCSTESFSIALSAIAGILLLLLLFRSKRHSSLKLPP GKLGIPFIGESFIFLRALRSNSLEQFFDERVKKFGLVFKTSLIGHPTVVLCGPAGNRLI LSNEEKLVQMSWPAQFMKLMGENSVATRRGEDHIVMRSALAGFFGPGALQSYIGK MNTEIQSHINEKWKGKDEVNVLPLVRELVFNISAILFFNIYDKQEQDRLHKLLETILVG SFALPIDLPGFGFHRALQGRAKLNKIMLSLIKKRKEDLQSGSATATQDLLSVLLTFRD DKGTPLTNDEILDNFSSLLHASYDTTTSPMALIFKLLSSNPECYQKVVQEQLEILSNK EEGEEITWKDLKAMKYTWQVAQETLRMFPPVFGTFRKAITDIQYDGYTIPKGWKLL WTTYSTHPKDLYFNEPEKFMPSRFDQEGKHVAPYTFLPFGGGQRSCVGWEFSKM EILLFVHHFVKTFSSYTPVDPDEKISGDPLPPLPSKGFSIKLFPRP (SEQ ID NO:46)ATGGATGCCCTCTATAAGTCTACCGTGGCGAAATTTAACGAAGTAACCC AGCTGGATTGCAGCACTGAGTCATTTAGCATCGCTTTGAGTGCAATTGCCGGGA TCTTGCTGTTGCTCCTGCTGTTTCGCTCGAAACGTCATAGTAGCCTGAAATTACC TCCGGGCAAACTGGGCATTCCGTTTATCGGTGAGTCCTTTATTTTTTTGCGCGC GCTGCGCAGCAATTCTCTGGAACAGTTCTTTGATGAACGTGTGAAGAAGTTCGG CCTGGTATTTAAAACGTCCCTTATCGGTCACCCGACGGTTGTCCTGTGCGGGCC CGCAGGTAATCGCCTCATCCTGAGCAACGAAGAAAAGCTGGTACAGATGTCCTG GCCGGCGCAGTTTATGAAGCTGATGGGAGAGAACTCAGTTGCGACCCGCCGTG GTGAAGATCACATTGTTATGCGCTCCGCGTTGGCAGGCTTTTTCGGCCCGGGA GCTCTGCAATCCTATATCGGCAAGATGAACACGGAAATCCAAAGCCATATTAAT GAAAAGTGGAAAGGGAAGGACGAGGTTAATGTCTTACCCCTGGTGCGGGAACT GGTTTTTAACATCAGCGCTATTCTGTTCTTTAACATTTACGATAAGCAGGAACAA GACCGTCTGCACAAGTTGTTAGAAACCATTCTGGTAGGCTCGTTTGCCTTACCA ATTGATTTACCGGGTTTCGGGTTTCACCGCGCTTTACAAGGTCGTGCAAAACTC AATAAAATCATGTTGTCGCTTATTAAAAAACGTAAAGAGGACTTACAGTCGGGAT CGGCCACCGCGACGCAGGACCTGTTGTCTGTGCTTCTGACTTTCCGTGATGATA AGGGCACCCCGTTAACCAATGACGAAATCCTGGACAACTTTAGCTCACTGCTTC ACGCCTCTTACGACACCACGACTAGTCCAATGGCTCTGATTTTCAAATTACTGTC AAGTAACCCTGAATGCTATCAGAAAGTCGTGCAAGAGCAACTCGAGATTCTGAG CAATAAGGAAGAAGGTGAAGAAATTACCTGGAAAGATCTTAAGGCCATGAAATA CACGTGGCAGGTTGCGCAGGAGACACTTCGCATGTTTCCACCGGTGTTCGGGA CCTTCCGCAAAGCGATCACGGATATTCAGTATGACGGATACACAATCCCGAAAG GTTGGAAACTGTTGTGGACTACCTATAGCACTCATCCTAAGGACCTTTACTTCAA CGAACCGGAGAAATTTATGCCTAGTCGTTTCGATCAGGAAGGCAAACATGTTGC GCCCTATACCTTCCTGCCCTTTGGAGGCGGTCAGCGGAGTTGTGTGGGTTGGG AGTTCTCTAAGATGGAGATTCTCCTCTTCGTGCATCATTTCGTGAAAACATTTTC GAGCTATACCCCGGTCGATCCCGATGAAAAAATTTCCGGCGATCCACTGCCGC CGTTACCGAGCAAAGGGTTTTCAATCAAACTGTTCCCTCGTCCG (SEQ ID NO:47)NADPH:citocromo P450 redutase de Taxus (TCPR)MQANSNTVEGASQGKSLLDISRLDHIFALLLNGKGGDLGAMTGSALILTENS QNLMILTTALAVLVACVFFFVWRRGGSDTQKPAVRPTPLVKEEDEEEEDDSAKKKV TIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYEKAVFKVVDLDNYAADDEQYEEKLKKEKLAF FMLATYGDGEPTDNAARFYKWFLEGKEREPWLSDLTYGVFGLGNRQYEHFNKVAK AVDEVLIEQGAKRLVPVGLGDDDQCIEDDFTAWREQVWPELDQLLRDEDDEPTSAT PYTAAIPEYRVEIYDSVVSVYEETHALKQNGQAVYDIHHPCRSNVAVRRELHTPLSD RSCIHLEFDISDTGLIYETGDHVGVHTENSIETVEEAAKLLGYQLDTIFSVHGDKEDG TPLGGSSLPPPFPGPCTLRTALARYADLLNPPRKAAFLALAAHASDPAEAERLKFLS SPAGKDEYSQWVTASQRSLLEIMAEFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSSPRF APSRIHVTCALVYGPSPTGRIHKGVCSNWMKNSLPSEETHDCSWAPVFVRQSNFK LPADSTTPIVMVGPGTGFAPFRGFLQERAKLQEAGEKLGPAVLFFGCRNRQMDYIY EDELKGYVEKGILTNLIVAFSREGATKEYVQHKMLEKASDTWSLIAQGGYLYVCGDA KGMARDVHRTLHTIVQEQESVDSSKAEFLVKKLQMDGRYLRDIW (SEQ ID NO:48)ATGCAGGCGAATTCTAATACGGTTGAAGGCGCGAGCCAAGGCAAGTCT CTTCTGGACATTAGTCGCCTCGACCATATCTTCGCCCTGCTGTTGAACGGGAAA GGCGGAGACCTTGGTGCGATGACCGGGTCGGCCTTAATTCTGACGGAAAATAG CCAGAACTTGATGATTCTGACCACTGCGCTGGCCGTTCTGGTCGCTTGCGTTTT TTTTTTCGTTTGGCGCCGTGGTGGAAGTGATACACAGAAGCCCGCCGTACGTCC CACACCTCTTGTTAAAGAAGAGGACGAAGAAGAAGAAGATGATAGCGCCAAGAA AAAGGTCACAATATTTTTTGGCACCCAGACCGGCACCGCCGAAGGTTTCGCAAA GGCCTTAGCTGAGGAAGCAAAGGCACGTTATGAAAAGGCGGTATTTAAAGTCGT GGATTTGGATAACTATGCAGCGGATGACGAACAGTACGAAGAGAAGTTGAAAAA GGAAAAGCTAGCGTTCTTCATGCTCGCCACCTACGGTGACGGCGAACCGACTG ATAATGCCGCTCGCTTTTATAAATGGTTTCTCGAGGGTAAAGAGCGCGAGCCAT GGTTGTCAGATCTGACTTATGGCGTGTTTGGCTTAGGTAACCGTCAGTATGAAC ACTTTAACAAGGTCGCGAAAGCGGTGGACGAAGTGCTCATTGAACAAGGCGCC AAACGTCTGGTACCGGTAGGGCTTGGTGATGATGATCAGTGCATTGAGGACGA CTTCACTGCCTGGAGAGAACAAGTGTGGCCTGAGCTGGATCAGCTCTTACGTGA TGAAGATGACGAGCCGACGTCTGCGACCCCGTACACGGCGGCTATTCCAGAAT ACCGGGTGGAAATCTACGACTCAGTAGTGTCGGTCTATGAGGAAACCCATGCG CTGAAACAAAATGGACAAGCCGTATACGATATCCACCACCCGTGTCGCAGCAAC GTGGCAGTACGTCGTGAGCTGCATACCCCGCTGTCGGATCGTAGTTGTATTCAT CTGGAATTCGATATTAGTGATACTGGGTTAATCTATGAGACGGGCGACCACGTT GGAGTTCATACCGAGAATTCAATTGAAACCGTGGAAGAAGCAGCTAAACTGTTA GGTTACCAACTGGATACAATCTTCAGCGTGCATGGGGACAAGGAAGATGGAACA CCATTGGGCGGGAGTAGCCTGCCACCGCCGTTTCCGGGGCCCTGCACGCTGC GGACGGCGCTGGCACGTTACGCGGACCTGCTGAACCCTCCGCGCAAAGCCGC CTTCCTGGCACTGGCCGCACACGCGTCAGATCCGGCTGAAGCTGAACGCCTTA AATTTCTCAGTTCTCCAGCCGGAAAAGACGAATACTCACAGTGGGTCACTGCGT CCCAACGCAGCCTCCTCGAGATTATGGCCGAATTCCCCAGCGCGAAACCGCCG CTGGGAGTGTTTTTCGCCGCAATAGCGCCGCGCTTGCAACCTAGGTATTATAGC ATCTCCTCCTCCCCGCGTTTCGCGCCGTCTCGTATCCATGTAACGTGCGCGCTG GTCTATGGTCCTAGCCCTACGGGGCGTATTCATAAAGGTGTGTGCAGCAACTGG ATGAAGAATTCTTTGCCCTCCGAAGAAACCCACGATTGCAGCTGGGCACCGGTC TTTGTGCGCCAGTCAAACTTTAAACTGCCCGCCGATTCGACGACGCCAATCGTG ATGGTTGGACCTGGAACCGGCTTCGCTCCATTTCGCGGCTTCCTTCAGGAACG CGCAAAACTGCAGGAAGCGGGCGAAAAATTGGGCCCGGCAGTGCTGTTTTTTG GGTGCCGCAACCGCCAGATGGATTACATCTATGAAGATGAGCTTAAGGGTTACG TTGAAAAAGGTATTCTGACGAATCTGATCGTTGCATTTTCACGAGAAGGCGCCA CCAAAGAGTATGTTCAGCACAAGATGTTAGAGAAAGCCTCCGACACGTGGTCTT TAATCGCCCAGGGTGGTTATCTGTATGTTTGCGGTGATGCGAAGGGTATGGCCA GAGACGTACATCGCACCCTGCATACAATCGTTCAGGAACAAGAATCCGTAGACT CGTCAAAAGCGGAGTTTTTAGTCAAAAAGCTGCAAATGGATGGACGCTACTTAC GGGATATTTGG (SEQ ID NO:49)Referências1 .Kingston, D. 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[00132] Tendo assim descrito vários aspectos de pelo menos uma modalidade desta invenção, deve-se observar que várias alterações, modificações e me- lhorias irão prontamente ocorrer para as pessoas versadas na técnica. Tais alterações, modificações e melhorias são destinadas a serem parte desta divulgação, e destinam-se a estar dentro do espírito e do escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição anterior e os desenhos são apenas a título de exemplo. As pessoas versadas na técnica irão reconhecer, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descrita. Tais equivalentes se destinam a serem englobados pelas reivindicações a seguir.

[00133] Todas as referências aqui divulgadas são incorporadas por referência nas suas totalidades com o objetivo específico aqui mencionado.

Claims

1. Método para aumentar a produção de terpenoide em uma célula que produz um ou mais terpenoides, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:fornecer uma Escherichia coli (E. coli) que produz pirofosfato de isopentila (IPP) e pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) por meio da superexpressão de um ou mais componentes de uma via de metileritritol (MEP) à montante e converte o IPP e DMAPP em um terpenoide por meio de uma via de síntese de terpenoides expressa de forma recombinante à jusante; ecultivar a E. coli para produzir o terpenoide, em que o acúmulo de indol na cultura é controlado a menos de 100 mg/L, em que que o acúmulo de indol na cultura é controlado pelo equilíbrio da via de MEP à montante com a via de síntese de terpenoide à jusante.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de cultivar compreende a remoção do indol acumulado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a E. coli expressa de forma recombinante uma difosfato de geranilgeranila sin- tase (GGPPS) e uma enzima terpenoide sintase.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a E. coli tem um número de cópia amplificado dos genes dxs, idi, ispD e ispE da via de MEP.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais terpenoides é um monoterpenoide, um sesquiterpenoide, um di- terpenoide, um triterpenoide ou um tetraterpenoide.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais terpenoides é um taxadieno ou um precursor de taxol.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda medir a quantidade ou concentração de indol na cultura.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende medir a quantidade ou concentração de indol duas ou mais vezes.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade ou concentração medida de indol é usada para guiar um processo de produção de um ou mais terpenoides.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade ou concentração medida de indol é usada para guiar a construção da cepa.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método amplifica o fluxo metabólico por meio de IPP e DMAPP, e pelo menos um intermediário selecionado dentre difosfato de geranila (GPP), difosfato de geranilgeranila (GGPP), difosfato de farnesila (FPP) e difosfato de farnesil geranila (FGPP).

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o terpenoide é geraniol, citronelol, nootkatona, cineol, limoneno, eleuterobina, sarcodictina, pseudopterosina, ginkgolida, esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, esclareol, labdenodiol, levopimaradieno, sandracopimaradieno ou isopemaradieno.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a E. coli tem um número de cópia amplificado de um ou mais dos dxs, idi, ispD e ispE, e em que o terpenoide é selecionado dentre taxadieno ou precursor de taxol, citronelol, geraniol, nootkatona, cineol, limoneno, eleuterobina, sarcodictina, pseudopterosina, ginkgolida, esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, esclareol, labdenodiol, levopimaradieno, sandracopimaradieno e isopemaradieno.