JP2013510573A - イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学 - Google Patents
イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、2009年11月10日出願の米国仮出願第61/280,877号、名称「イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学」、および2010年9月30日出願の米国仮出願第61/388,543号、名称「イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学」のもとの利益を主張し、それらの全体の開示は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
政府の利益
本研究は、認可番号1-R01-GM085323-01A1のもとで、米国国立衛生研究所から部分的に資金援助を受けた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明分野
本発明は、微生物工学による、1種または2種以上のテルペノイドの産生に関する。
タキソールおよびその構造類似体は、この十年間に導入された最も強力で商業的に成功した抗癌剤として認められている1。タキソールはまずタイヘイヨウイチイ(Pacific Yew tree)の樹皮から単離され2、初期段階の生産方法においては、一人の患者に対して十分な用量を供給するためには2〜4本の完全に成長した木を犠牲にすることを要した3。タキソールの構造的複雑さのため、35〜51ステップの複雑な化学的合成経路を必要とし、最大で0.4%の収率であった4、5、6。しかし、生合成中間体バッカチンIIIをまず植物源から単離し続いてタキソールに変換する、半合成経路が考案された7。この手段(approach)および続く植物細胞培養物に基づく生産努力によりイチイを収穫する必要性は低下したが、それでも生産は依然として、生産性および拡張性の限界、およびより有効な薬物の探索において合成されることができるタキソール誘導体の数に対する制約を伴う、植物に基づくプロセス8に依存している9、10。
代謝工学および合成生物学における近年の発達により、より技術的に適した微生物宿主を介した、複雑な天然産物の過剰産生の新しい可能性がもたらされている11、12。イチイ属におけるタキソールの生合成機構の解明において顕著な進展がなされてきているが13〜16、商業的に関連するタキソール産生株により、この複雑な生合成機構(machinery)の微生物宿主への移行を目指す従前の試行が回避される17、18。それにもかかわらず、他の天然産物のように、代謝的な改変(engineered)株を介した微生物産生により、抗癌および他の薬学的活性を有する多様で多数の新規な化合物を合成するための、魅力的な経済性と大きな可能性が提供される19、20。
いくつかの態様において、細胞はさらに、タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼ(T5αOH)またはその触媒活性部分を発現する。ある態様において、T5αOH酵素またはその触媒活性部分を、シトクロムP450レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合させる。例えば、T5αOH酵素は、At24T5αOH−tTCPRであることができる。
本発明の側面は、非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分を過剰発現し、タキサジエンシンターゼ酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS)酵素を組み換え発現する細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。いくつかの態様において、細菌細胞は、バシラス(Bacillus)細胞などのグラム陽性菌である。いくつかの態様において、細胞は、サッカロミセス(Saccharomyces)細胞またはヤロウイア(Yarrowia)細胞などの酵母細胞である。いくつかの態様において、細胞は、藻細胞または植物細胞である。
本発明の側面は、テルペノイドの高産生を示す細胞を選択する方法であって、非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分を過剰発現する細胞を作り出すかまたは入手すること、該細胞からテルペノイドを産生すること、該細胞から産生されたテルペノイドの量を対照細胞で産生されたテルペノイドの量と比較すること、および対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第1の改善細胞を選択することを含み、ここで、対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第1の改善細胞は、テルペノイドの高産生を示す細胞である、前記方法に関する。
細胞(単数または複数)によりまたは培養物中で産生された1種または2種以上のテルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、またはテトラテルペノイドであることができる。ある態様において、テルぺノイドは、タキサジエンまたは任意のタキソール前駆体である。
本発明のこれらおよびその他の側面、ならびにその種々の態様は、図面および本発明の詳細な説明を参照することにより、さらに明らかにされるであろう。
図8.代謝産物 (a)代謝産物蓄積に対するタキサジエン間の相関。改変株からの代謝産物蓄積は、タキサジエン産生と指数関数的に逆比例する。この相関に対する相関係数は0.92と決定された。(b)タキサジエンおよび代謝産物の蓄積における変化を実証する株26〜28からの代表的なGCプロファイル。クロマトグラムにおける1および2の数字は、それぞれ代謝産物およびタキサジエンのピークに対応する。(c)代謝産物(1)とタキサジエン(2)のGC−MSプロファイル。代謝産物の観測される特性ピークは、233、207、178、117、89および62である。タキサ−4(20),11,12−ジエン特性イオンm/z272(P+), 257 (P+-CH3), 229 (P+-C3H7); 121, 122, 123(C環断片クラスター)60。星印をつけたピークは、内部標準カリオフィレンである。
図10は、テルペノイド生合成経路およびこの経路により産生される天然の産物を表す模式図である。
図11は、タキサジエン産生を増幅するための上流経路の調節を示す模式図である。
図13は、新たに同定された経路の分岐が下流合成経路の特性ではないことを示す模式図である。
図14.経路の強度は、転写遺伝子発現レベルに相関する。 (c)31任意単位での上流経路強度および下流強度の増加による、idi、ispDおよびispF遺伝子の相対的発現、および(d)61任意単位での上流経路強度および下流強度の増加による、idi、ispDおよびispF遺伝子の相対的発現。予想されたように、遺伝子発現は、上流経路強度の増加と共に増加する。対応する株の番号は棒グラフに示す。相対的発現は、ハウスキーピングrrsA遺伝子の発現を用いて定量した。データは、4回の反復試験に対する平均+/−SDである。
タキソールはまず、タイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)の樹から天然産物として単離された、強力な抗癌剤である。しかし、植物抽出物からの従来の生産経路によるタキソールまたはタキソール類似体の信頼性の高いコスト効率的な生産は限られている。ここで、我々は、改変された大腸菌におけるタキサジエン産生を〜15000倍増幅するための、代謝経路改変に対する多変量モジュラー手段を報告する。最初に介入したタキソール中間体であるタキサジエンは、大腸菌における非メバロン酸経路の生合成産物であり、この経路は2つのモジュール、すなわちイソペンテニルピロリン酸(IPP)を形成する天然の上流経路および異種の下流テルペノイド形成経路を含む。系統的多変量探索によって、阻害性中間体の蓄積と副産物へのフラックス分流を最小化するための、2つの経路モジュールの均衡を最適化する条件を同定した。我々はまた、タキサジエンの後のタキソール生合成における次のステップ、すなわち、>98%の基質変換を産生するP450に基づく酸化ステップを改変し、大腸菌における任意の機能性タキソール中間体のin vivo産生の、最初の例を提示した。モジュラー経路改変手段は、多数ステップ経路の複雑さを強調するのみでなく、小規模発酵において高いタキサジエンおよびタキサジエン−5α−オール力価の蓄積を許容し(それぞれ〜300mg/Lおよび60mg/L)、こうして、タキソールおよびその誘導体の微生物産生の可能性を例示した。
本発明の側面は、タキサジエンなどのテルペノイドの最適化された産生のための、MEP経路における遺伝子およびタンパク質発現の制御に関する。テルペノイドの最適化された産生とは、最適化戦略に従って、かかる戦略なしの場合に達成されるよりも多量のテルペノイドを産生することを言う。MEP経路内の任意の遺伝子および/またはタンパク質は、本明細書に記載の方法および組成物に包含されると理解されるべきである。いくつかの態様において、MEP経路内の任意の遺伝子とは、以下の1つである:dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispAまたはispB。MEP経路内の1または2以上の遺伝子および/またはタンパク質の発現を、上方制御および/または下方制御することができる。ある態様において、MEP経路内の1または2以上の遺伝子および/またはタンパク質の上方制御は、MEP経路内の1または2以上の遺伝子および/またはタンパク質の下方制御と組み合わせることができる。
MEP経路内の遺伝子のモジュールの非限定的な例は、実施例のセクションに示されている、遺伝子dxs、idi、ispDおよびispFを含むモジュールであり、本明細書においてdxs−idi−ispDFと呼ぶ。MEP経路内の遺伝子のモジュールは、本発明の側面に整合して、MEP経路内の任意の遺伝子を任意の順序で含むことができることを、理解すべきである。
いくつかの態様において、細胞内で組み換え発現される前の遺伝子の修飾には、細胞内で組み換え発現される前に、遺伝子に1または2以上の変異を作成することが関与する。例えば、変異は、1つのヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドの置換または欠失に関与することができる。いくつかの態様において、遺伝子の1または2以上のヌクレオチドの変異は、該遺伝子から産生されるタンパク質における変異、例えば1または2以上のアミノ酸の置換または欠失をもたらすであろう。
タンパク質発現の最適化はまた、適切なプロモーターおよびリボソーム結合部位を選択することにより、実施可能である。いくつかの態様において、これには、高コピー数プラスミド、または中程度のコピー数フラスミドの選択を含んでよい。転写終了のステップもまた、ステムループなどの構造の導入または除外により、遺伝子発現の調節の標的とすることができる。
いくつかの態様において、本発明の方法に関連するタキサジエン−5α−ヒドロキシラーゼの最適化は、N末端膜貫通改変および/またはCPR酸化還元パートナーとの翻訳融合を介した、キメラ酵素の生成により実施される。いくつかの態様において、CPR酸化還元パートナーはイチイ属シトクロムP450レダクターゼ(TCPR;図5b)である。ある態様において、シトクロムP450タキサジエン−5α−ヒドロキシラーゼ(T5αOH)は、Taxus cuspidateから得られる(GenBankアクセッション番号AY289209、この配列は、本明細書に参照により組み込まれる)。いくつかの態様において、NADPH:シトクロムP450レダクターゼ(TCPR)は、Taxus cuspidateから得られる(GenBankアクセッション番号AY571340、この配列は、本明細書に参照により組み込まれる)。
ある態様において、キメラ酵素はAt245αOH−tTCPRであり、これは、最初の酸化ステップを、タキサジエンの、タキサジエン−5α−オールおよび副産物5(12)−オキサ−3(11)−シクロタキサンへの98%より大きい変換率で実施可能であることが見出された(OCT;図9a)。タキサジエン−5α−オール産生ステップの改変は、タキソール産生において決定的に重要であり、酵母においてこの経路を構築する従前の努力を制限することが見出されている。本明細書で開発される改変された構築は、in vivoでのタキサジエンの98%より大きい変換と、酵母における前の異種発現に対して2400倍の改善を実証した。したがって、鍵となるタキソール中間体の顕著に多量の合成に加えて、この研究はさらに類似するP450化学による、この経路における続く代謝産物の合成についての土台もまた提供する。
いくつかの態様において、本発明に関連する1または2以上の遺伝子は、組み換え発現ベクター中に発現される。本明細書において、「ベクター」は、任意の数の核酸であって、その中に、異なる遺伝的環境の間の移送のため、または宿主細胞での発現のために、所望の1つの配列または複数配列を制限またはライゲーションにより挿入できる前記核酸であることができる。ベクターは典型的にはDNAから構成されるが、RNAベクターもまた利用可能である。ベクターは、限定はしないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含む。
方法
株、プラスミド、オリゴヌクレオチドおよび遺伝子
大腸菌K12MG1655株を、全てのタキサジエン株構築の宿主株として用いた。大腸菌K12MG1655Δ(recA,endA)および大腸菌K12MG1655Δ(recA,endA)ED3株は、MIT(Cambridge, MA)のKristala Prather教授の研究室から提供を受けた。この研究で作成された全プラスミドの詳細を表2に示す。本研究で用いた全てのオリゴヌクレオチドは、表3に含まれている。
初めにdxs−idi−ispDFオペロンを、T7プロモーターを有するpET21C+プラスミドのもとでプライマーdxs(s)、dxs(a)、idi(a)、ispDF(s)およびispDFI(a)を用いて、大腸菌K12MG1655のゲノムから各遺伝子をクローニングすることにより構築した(p20T7MEP)53。プライマーdxsidiispDFNcoI(s)およびdxsidiispDFKpnI(a)を用いて、dxs−idi−ispDFオペロンを、NcoIおよびKpnIでpTrc消化後にHis2B(Invitrogen)プラスミド中にサブクローニングして、pTrcMEPプラスミド(p20TrcMEP)を得た。p20TrcMEPプラスミドをMluIおよびPmeIで消化し、MluIおよびPmeI消化pACYC184−melA(P2A)プラスミドにクローニングして、p10TrcMEPプラスミドを構築した。pTrcMEPプラスミドをBstZ17IおよびScaIdeで消化し、PvuII消化pCL1920プラスミドにクローニングして、p5TrcMEPプラスミドを構築した。p20T5MEPプラスミドの作成のために、最初にdxs−idi−ispDFオペロンをT5プロモーター(pQR−MEP)を有するpQEプラスミドに、プライマーdxsidiispDFNcoI(s)およびdxsidiispDFXhoI(a)を用いてクローニングした。T5プロモーターを有するオペロンDNAの画分を、pQEMEPプラスミドからプライマーT5AgeI(s)およびT5NheI(a)を用いて増幅した。DNA断片をAgeI(s)/T5NheI(a)で消化し、SGrAI/NheI酵素で消化したp20T7MEPプラスミドへとクローニングした。
下流タキサジエン経路(GTおよびTGオペロン)を、GGPSおよびTSのPCR断片をpTrcHIS2BプラスミドのNocI−EcoRIおよびEcoRI−SalI部位へとクローニングして、プライマーGGPPSNcoI(s)、GGPPSEcoRI(a)、TSEcoRI(s)、TSsalI(a)、TSNcoI(s) TSEcoRI(a) GGPPSEcoRI(s)およびGGPPSSalI(a)を用いてp20TrcGTおよびp20TrcTGを生成することにより構築した。p20T5GTを作成するために、初めにオペロンをプライマーGGPPSNcoI(s)およびTSXhoI(a)で増幅し、NcoI/XhoIで消化したT5プロモーターの下でpQEプラスミドへとクローニングした。さらに、配列をXbaIおよびXhoIで消化し、プライマーpTrcSal(s)およびpTrcXba(a)を用いて増幅したpTrcプラスミド骨格へとクローニングした。p10T7TGは、p20TrcTGからNcoI/SalI消化したTGオペロンを、NcoI/SalI消化したpACYC−DUET1プラスミドへとサブクローニングすることにより構築した。p5T7TGは、BspEI/XbaI消化断片を、pCLBspEI(s)およびpCLXBaI(a)プライマーを用いてpCL1920プラスミドから増幅されたXbaI/BspEI消化DNAにクローニングして構築した。
組込み用配列の増幅のためのFRP−Km−FRPカセットを有するプラスミドを構築するために、p20T7MEPおよびp20T5MEPをXhoI/ScaIで消化した。FRP−Km−FRPカセットをpkD13プラスミドからのFRP配列を有するKmカセットから、プライマーKmFRPXhoI(s)およびKmFRPScaI(a)を用いて増幅した。増幅したDNAをXhoI/ScaIで消化し、XhoI/ScaI消化p20T7MEPおよびp20T5MEPプラスミドにクローニングした(p20T7MEPKmFRPおよびp20T5MEPKmFRP)。同様に、p20TrcMEPプラスミドをSacI/ScaIで消化し、プライマーKmFRPSacI(s)およびKmFRPScaI(a)を用いて増幅したDNAを消化して、p20TrcMEPプラスミドへとクローニングした(p20TrcMEPKm−FRP)。
プロモーターT7、T5およびTrcの下で作成されたMEP経路を、Kanマーカー付き染色体におけるaraオペロン領域に局在化させた。p20T7MEPKmFRP、p20T5MEPKmFRP、およびp20TrcMEPKmFRPからのPCR断片を、プライマーIntT7T5(s)、IntTrc(s)、およびInt(a)を用いて増幅し、次に大腸菌MG1655recA-end-および大腸菌MG1655recA-end-EDE3細胞にエレクトロポレーションして、λRed組み換え技法を介する染色体組込みを行った54。成功的な遺伝子組込み後に、部位特異的局在化を確認し、KmマーカーをFLPリコンビナーゼの作用を介して除去した。
タキサジエン5α−オールヒドロキシラーゼ(T5αOH)およびイチイ属シトクロムP450レダクターゼ(TCPR)の膜貫通領域(TM)を、PredictProteinソフトウェア(www.predictprotein.org)を用いて同定した55。膜貫通改変のために、タキサジエン5α−オールヒドロキシラーゼ(T5αOH)のN末端膜貫通領域の8、24および42個のアミノ酸残基および、TCPRでの74個のアミノ酸領域において、選択的切断を行った。タキサジエン5α−オールヒドロキシラーゼ(T5αOH)のN末端アミノ酸の8、24および42個のアミノ酸残基の除去、1つのアミノ酸が置換されたウシ17aヒドロキシラーゼN末端8残基ペプチドMALLLAVF(配列番号:51)の、N末端切断T5αOH配列44およびGSTGSペプチドリンカーへの組込みを、プライマーCYP17At8AANdeI(s)、CYP17At24AANdeI(s)、CYP17At42AANdeI(s)、およびCYPLinkBamHI(a)を用いて行った。これらのプライマーを用いて、各修飾DNAを増幅し、NdeI/BamHI消化し、NdeI/BamHI消化pACYCDUET1プラスミドにクローニングして、p10At8T5αOH、p10At24T5αOH、およびp10At42T5αOHプラスミドを構築した。74アミノ酸切断TCPR(tTCPR)配列を、プライマーCPRBamHI(s)およびCPRSalI(a)を用いて増幅した。増幅されたtTCPR配列およびプラスミドp10At8T5αOH、p10At24T5αOH、およびp10At42T5αOHを、BamHI/SalIで消化し、クローニングして、プラスミドp10At8T5αOH−tTCPR、p10At24T5αOH−tTCPR、およびp10At42T5αOH−tTCPRを構築した。
上流(MEP)、下流タキサジエン経路およびタキサジエン5α−オールを有する適切なプラスミドを含む、前もって改変された大腸菌株の単一の形質転換体を、Luria-Bertani(LB)培地(適切な抗生物質、100mg/mLのカルベニシリン、34mg/mLのクロラムフェニコール、25mg/Lのカナマイシンまたは50mg/Lのスペクチノマイシンで補足)中30℃で18時間培養した。改変株をスクリーニングするための小規模培養物ついては、これらの前接種材料(preinnoculum)を用いて新鮮な2mLの富化培地(6g/Lの酵母抽出物、10g/Lのトリプトン、15g/Lのグルコース、10g/LのNaCl、100mMのHEPS、3mL/Lの消泡剤B、pH7.6、100ug/mLのカルベニシリンおよび34ug/mLのクロラムフェニコール)に播種し、ここで開始時のA600は0.1であった。培養物は適切な抗生物質および100mMのIPTGを用いて、遺伝子誘導のために22℃にて5日間維持した。
3−L Biofloバイオリアクター(New Brunswick)を製造業者の指示書に従って組み立てた。1%グリセロール(v/v)入りの富化培地1Lに、同じ濃度で抗生物質(100mg/mLのカルベニシリン、34mg/mLのクロラムフェニコール)を含有するLB培地で増殖させた株26−At24T5αOH−tTCPRの8時間培養物(A600〜2.2)50mLを植菌した。1Lのバイオリアクターで、20%v/vドデカンを用いた2相性液体−液体発酵。酸素を、ろ過空気として0.5v/v/mで供給し、溶存酸素レベルを50%より高く維持するように撹拌を調節した。培養物のpHは、10%NaOHを用いて7.0に調節した。発酵槽内の培養物の温度は、600nm(OD600)の波長で測定した光学密度が約0.8になるまで細胞が増殖するまでは、30℃に調節した。発酵槽の温度を22℃に下げ、細胞を0.lmMのIPTGで誘導した。ドデカンを無菌的に培地容積の20%(v/v)まで加えた。発酵の経過の間、グリセロールの濃度および酢酸塩の蓄積は、一定の時間間隔でモニタリングした。発酵の間、グリセロール濃度が0.5g/L未満に下がった際には、グリセロール(3g/L)をバイオリアクターに導入した。
小規模培養物からのタキサジエンの分析のために、1.5mLの培養物を1mLのヘキサンで30分、ボルテックスした。混合物を遠心分離して有機層を分離した。バイオリアクターで、1uLのドデカン層をヘキサンを用いて200uLに希釈した。1uLのヘキサン層を、GC−MS(Varian saturn 3800 GC付きVarian 2000 MS)で分析した。試料をHP5msカラム(30m×250uM×0.25uM厚さ)(Agilent Technologies USA)に注入した。ヘリウム(超純粋)を流量1.0ml/分でキャリアガスとして用いた。オーブン温度は初めは50℃一定に1分間保ち、次に220℃に10℃/分の速度で上昇させ、最後にこの温度で10分間維持した。注入および移送ラインの温度は、それぞれ200℃および250℃に設定した。
各遺伝子の転写遺伝子発現レベルは、適切な株から単離されたmRNAのqPCRにより検出した。分解を防ぐために、RNAを、RNAPprotect細菌試薬(Qiagen)を用いて細胞溶解の前に安定化させた。続いて、RNeasy mini kit(Qiagen)をヌクレアーゼに基づくゲノムDNA不純物除去と組み合わせて用いて、全RNAを単離した。cDNAをiScript cDNA合成キット(Biorad)を用いて増幅した。qPCRを、iQ SYBR Green Supermix(Biorad)を用いてBio-Rad iCycler(Biorad)上で実施した。発現が変化しないrrrA遺伝子の発現レベルを、qPCR値の正規化に用いた56。表3に、qPCRに用いたプライマーを示す。各プライマー対について、大腸菌のmRNAをテンプレートとして標準曲線を作成した。
図1bは、プロモーターおよび遺伝子コピー数を組み合わせて、タキサジエン合成の上流および下流経路を介して相対的フラックス(または強度)を調節する、種々の方法を示す。MEP回路の障害を取り除き、これを下流タキサジエン経路と最適に均衡化させるために、全部で16株を作成した。図2a、bは、これらの各株におけるタキサジエン蓄積の結果の概要であり、図2aは、下流経路の一定の値について、タキサジエン蓄積の上流経路への依存性を強調し、図2bは、上流経路強度の一定の値について、下流経路への依存性を強調する(報告されたプロモーター強度およびプラスミドコピー数からの、上流および下流経路発現の計算については、表1も参照のこと33−36)。明らかに、上流および下流経路発現の両方について、極大値が示されている。一定の下流経路発現に対して(図2a)、上流経路発現が非常に低いレベルから増加すると、全体の経路への前駆体供給の増加により、タキサジエン産生は最初に増加する。しかし、中間値を過ぎると、下流経路の能力のために上流経路のさらなる増加は生じない。この経路の非均衡により、細胞に阻害性であるか、または競合経路へのフラックス分流を単純に示すかのどちらかである、中間体(下記参照)の蓄積がもたらされ、最終的にタキサジエン蓄積の低下が生じる。
プラスミドが担う代謝負担を最小化しつつ37、豊富な下流経路強度を提供するために37、各4株の2つの新しいセットを改変したが(株25〜28および29〜32)、ここで、下流経路は、それぞれ比較的低いコピー数である5および10コピーを維持しつつ、強いプロモーター(T7)の制御下に配置された。示されるように(図2c)、タキサジエンの極大値は、高い下流強度において維持され(株21〜24)、低い下流経路強度においては単調な応答が得られた(株17〜20、図2c)。この観察は、前と同じレベルの下流経路強度を維持しているが、非常に低レベルの上流経路を発現する、それぞれ4株の追加の2セットの作成を促進した(株25〜28および29〜32、図2d)。さらに、後者株セットの上流経路のオペロンを、染色体に組み込んだ。タキサジエン最大値が回復したばかりでなく、非常に低い上流経路レベルにおいても、大幅に高いタキサジエン最大値が達成された(300mg/L)ことがわかる。我々は、この顕著な増加は、細胞の代謝負担の減少による可能性があると考える。これは、1)経路を染色体に組み込むことによりプラスミド依存性を除去し、および2)上流および下流経路発現の間の精巧な均衡化を得ることにより、達成された。
前に改変された株のメタボロミクス解析は、経路発現レベルおよびタキサジエン産生に強く相関する、まだ未知の代謝副産物を同定した(図3および図8)。この代謝産物の化学的同一性は未知であったが、我々はこれを、経路分岐から生じた、直接的変数として改変株からのタキサジエン産生に逆相関するイソプレノイド副産物であるとの仮説を立てた(図3および図8)。我々の最適株の重大な属性は、この代謝産物の蓄積を緩和する精密な均衡化であり、これにより、より高いタキサジエン産生がもたらされる。この均衡化は、異なるプロモーターを用いて、染色体からの異なるレベルまたは異なるコピー数のプラスミドにおいて、顕著に異なるタキサジエン蓄積について調節することができる。
改変株について、制御された条件下でのタキサジエン産生の可能性を調査するために、3つの最大のタキサジエン蓄積株(株22から〜60mg/L、株17から〜125mg/L、株26から〜300mg/L)のフェドバッチ培養を1Lバイオリアクター内で行った(図17)。フェドバッチ培養試験は、20%(v/v)ドデカンオーバーレイを用いた液体−液体2相発酵として実施した。予備的所見に示されるように、有機溶媒を導入して、発酵培地から分泌されたタキサジエンのエアストリッピングを防いだ。制御されたグリセロール供給の規定培地中で、タキサジエンの産生力は株22、17および26について、それぞれ174±5mg/L(SD)、210±7mg/L(SD)、および1020±80mg/L(SD)に増加した(図17a)。さらに、タキサジエン産生は、増殖表現型、酢酸塩蓄積およびグリセロール消費に顕著に影響した(図17b〜17d)。
明らかに、株26の高い生産性およびより堅固な増殖は、非常に高いタキサジエン蓄積を可能とした。さらなる改善は、バイオリアクター条件の最適化、増殖培地の栄養分の均衡化、および炭素送達の最適化により、可能となるだろう。
経路発現における改変された均衡化のより詳細な理解のために、我々は、タキサジエンの最大産生株および図2cおよびdからの隣接する株(株17、22および25〜32)について、dxs(上流経路)およびTS(下流経路)の転写遺伝子発現レベルを定量した(図4a、b)。我々の立てた仮説のとおり、上流経路の発現は、天然プロモーター、Trc、T5、T7、および10コピーおよび20コピープラスミドからのMEPベクターについてのプロモーター強度およびコピー数と共に単調に増加し、これは、DXS発現において見られるのと同様であった(図4a)。したがって我々は、dxs発現レベルが、上流経路強度と良好に相関することを見出した。同様の相関は、上流経路の他の遺伝子、idi、ispDおよびispFについても見出された(図14a、b)。下流遺伝子発現において、〜2倍の改善が、経路を5コピーから10コピープラスミドに移行させた後に定量された(25〜28系および29〜32系)(図4b)。
タキソール生合成の中心的特徴は、タキサンコア構造の複数部位における酸素化、すなわち、シトクロムP450依存性モノオキシゲナーゼにより媒介されると考えられている反応である41。経路の関係する環化ステップの完了後、親オレフィンであるタキサ−4(5),11(12)−ジエンが次に、C5位においてシトクロムP450酵素によりヒドロキシル化され、タキソールへの道における(タキサンコアの)8つの酸素化ステップの第1のものを表す(図6)42。したがって、タキソール産生微生物を改変する鍵となるステップは、in vivoでのP450に基づく酸化化学の開発である。第1の酸素化ステップはシトクロムP450、タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼにより触媒され、これは、ジテルペン前駆体タキサジエンにおける二重結合マイグレーションと共にヒドロキシル化反応を触媒する、独特のモノオキシゲナーゼである(図5a)。我々は、タキサジエンからタキサジエン−5α−オールへの合成経路の最初の成功した拡張を報告し、大腸菌における任意の官能化タキソール中間体の、in vivo産生の最初の例を示す。
本明細書に開示された全ての参考文献は、本明細書に述べられた特定の目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
Claims (99)
- 非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分を過剰発現する細胞において、タキサジエンシンターゼ酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS)酵素を組み換え発現させることを含む、方法。
- 細胞が細菌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が大腸菌(Escherichia Coli)細胞である、請求項2に記載の方法。
- 細胞がグラム陽性細胞である、請求項2に記載の方法。
- 細胞がバシラス(Bacillus)細胞である、請求項4に記載の方法。
- 細胞が酵母細胞である、請求項1に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)細胞である、請求項6に記載の方法。
- 酵母細胞がヤロウイア(Yarrowia)細胞である、請求項6に記載の方法。
- 細胞が藻細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が植物細胞である、請求項1に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素が、イチイ属酵素である、請求項1に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素が、Taxus brevifolia酵素である、請求項11に記載の方法。
- GGPPS酵素が、イチイ属酵素である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- GGPPS酵素が、Taxus canadenis酵素である、請求項13に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および/またはGGPPS酵素をコードする遺伝子および/またはMEP経路の1または2以上の成分をコードする遺伝子が、1または2以上のプラスミドから発現される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および/またはGGPPS酵素をコードする遺伝子および/またはMEP経路の1または2以上の成分をコードする遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれている、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分が、dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispAおよびispBからなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- dxs、idi、ispDおよびispFが過剰発現される、請求項17に記載の方法。
- dxs、idi、ispDおよびispFが、オペロンdxs−idi−idpDF上で過剰発現される、請求項18に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子およびGGPPS酵素をコードする遺伝子が、オペロン上で一緒に発現される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がさらに、タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼ(T5αOH)またはその触媒活性部分を発現する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- T5αOH酵素またはその触媒活性部分を、シトクロムP450レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合させる、請求項21に記載の方法。
- T5αOH酵素が、At24T5αOH−tTCPRである、請求項22に記載の方法。
- タキサジエンシンターゼ酵素、GGPPS酵素、およびMEP経路の1または2以上の成分の発現が、タキサジエンの産生を最大化するように均衡化される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を培養することをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がタキサジエンまたはタキサジエン−5α−オールを産生する、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも10mgL−1のタキサジエンを産生する、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも250mgL−1のタキサジエンを産生する、請求項27に記載の方法。
- 少なくとも10mgL−1のタキサジエン−5α−オールを産生する、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも50mgL−1のタキサジエン−5α−オールを産生する、請求項29に記載の方法。
- タキサジエンの、タキサジエン−5α−オールおよび副産物5(12)−オキサ−3(11)−シクロタキサンへの変換のパーセンテージが、少なくとも50%である、請求項26、29または30に記載の方法。
- タキサジエンの、タキサジエン−5α−オールおよび副産物5(12)−オキサ−3(11)−シクロタキサンへの変換のパーセンテージが、少なくとも75%である、請求項31に記載の方法。
- タキサジエンの、タキサジエン−5α−オールおよび副産物5(12)−オキサ−3(11)−シクロタキサンへの変換のパーセンテージが、少なくとも95%である、請求項32に記載の方法。
- 細胞培養物からタキサジエンまたはタキサジエン−5α−オールを回収することをさらに含む、請求項25〜33のいずれか一項に記載の方法。
- タキサジエンまたはタキサジエン−5α−オールが、気相から回収される、請求項34に記載の方法。
- 有機層を細胞培養物に加え、タキサジエンまたはタキサジエン−5α−オールが有機層から回収される、請求項34に記載の方法。
- 非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分を過剰発現し、タキサジエンシンターゼ酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS)酵素を組み換え発現する、細胞。
- 細胞が細菌細胞である、請求項37に記載の細胞。
- 細胞が大腸菌細胞である、請求項38に記載の細胞。
- 細胞がグラム陽性細胞である、請求項38に記載の細胞。
- 細胞がバシラス(Bacillus)細胞である、請求項40に記載の細胞。
- 細胞が酵母細胞である、請求項37に記載の細胞。
- 酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)細胞である、請求項42に記載の細胞。
- 酵母細胞がヤロウイア(Yarrowia)細胞である、請求項42に記載の細胞。
- 細胞が藻細胞である、請求項37に記載の細胞。
- 細胞が植物細胞である、請求項37に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素が、イチイ属酵素である、請求項37に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素が、Taxus brevifolia酵素である、請求項47に記載の細胞。
- GGPPS酵素が、イチイ属酵素である、請求項37〜48のいずれか一項に記載の細胞。
- GGPPS酵素が、Taxus canadenis酵素である、請求項49に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および/またはGGPPS酵素をコードする遺伝子および/またはMEP経路の1または2以上の成分をコードする遺伝子が、1または2以上のプラスミドから発現される、請求項37〜50のいずれか一項に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および/またはGGPPS酵素をコードする遺伝子および/またはMEP経路の1または2以上の成分をコードする遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれている、請求項37〜51のいずれか一項に記載の細胞。
- 非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分が、dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispAおよびispBからなる群から選択される、請求項37〜52のいずれか一項に記載の細胞。
- dxs、idi、ispDおよびispFが過剰発現される、請求項53に記載の細胞。
- dxs、idi、ispDおよびispFが、オペロンdxs−idi−idpDF上で過剰発現される、請求項54に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子およびGGPPS酵素をコードする遺伝子が、オペロン上で一緒に発現される、請求項37〜55のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が、タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼ(T5αOH)またはその触媒活性部分をさらに発現する、請求項37〜56のいずれか一項に記載の細胞。
- T5αOH酵素またはその触媒活性部分が、シトクロムP450レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合されている、請求項57に記載の細胞。
- T5αOH酵素が、At24T5αOH−tTCPRとして発現されている、請求項58に記載の細胞。
- タキサジエンシンターゼ酵素、GGPPS酵素、およびMEP経路の1または2以上の成分の発現が、タキサジエンの産生を最大化するように均衡化される、請求項37〜59のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞がタキサジエンまたはタキサジエン−5α−オールを産生する、請求項37〜60のいずれか一項に記載の細胞。
- テルペノイドの高産生を示す細胞を選択する方法であって、
非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分を過剰発現する細胞を作り出すか、または入手すること、
該細胞からテルペノイドを産生すること、
該細胞から産生されたテルペノイドの量を、対照細胞から産生されたテルペノイドの量と比較すること、および
対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する、第1の改善細胞を選択すること、ここで、対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第1の改善細胞は、テルペノイドの高産生を示す細胞である、
を含む、前記方法。 - 細胞が、テルペノイドシンターゼ酵素を組み換え発現する、請求項62に記載の方法。
- 細胞が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS)酵素を組み換え発現する、請求項62または63に記載の方法。
- 第1の改善細胞における、非メバロン酸(MEP)経路の1または2以上の成分、テルペノイドシンターゼ酵素および/またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS)酵素の発現レベルを変化させて、第2の改善細胞を作成すること、および
第2の改善細胞から産生されたテルペノイドの量を、第1の改善細胞で産生されたテルペノイドの量と比較すること、ここで、第1の改善細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第2の改善細胞は、テルペノイドの高産生を示す細胞である、
をさらに含む、請求項62〜64のいずれか一項に記載の方法。 - テルペノイドシンターゼ酵素がタキサジエンシンターゼ酵素である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- シトクロムP450レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合したタキサジエン5α−ヒドロキシラーゼ(T5αOH)またはその触媒活性部分を含む、単離されたポリペプチド。
- シトクロムP450レダクターゼ酵素がイチイ属シトクロムP450レダクターゼ(TCPR)である、請求項67に記載の単離されたポリペプチド。
- タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼおよびTCPRがリンカーにより結合されている、請求項68に記載の単離されたポリペプチド。
- リンカーがGSTGS(配列番号:50)である、請求項69に記載の単離されたポリペプチド。
- タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼおよび/またはTCPRが切断されて膜貫通領域の全てまたは一部が除去されている、請求項67〜70のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
- タキサジエン5α−ヒドロキシラーゼの8、24、または42個のN末端アミノ酸が切断されている、請求項71に記載の単離されたポリペプチド。
- TCPRの74個のアミノ酸が切断されている、請求項71または72に記載の単離されたポリペプチド。
- 追加のペプチドがタキサジエン5α−ヒドロキシラーゼに融合されている、請求項67〜73のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
- 追加のペプチドがウシの17αヒドロキシラーゼからである、請求項74に記載の単離されたポリペプチド。
- ペプチドがMALLLAVF(配列番号:51)である、請求項75に記載の単離されたポリペプチド。
- 単離されたポリペプチドがAt24T5αOH−tTCPRである、請求項67に記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項67〜77のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項67〜77のいずれか一項に記載のポリペプチドを組み換え発現する細胞。
- 1種または2種以上のテルペノイドを産生する細胞におけるテルペノイド産生を増加させる方法であって、細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御し、これにより細胞におけるテルペノイド産生を増加させる、前記方法。
- 細胞が細菌細胞である、請求項80に記載の方法。
- 細胞が大腸菌細胞である、請求項81に記載の方法。
- 細胞がグラム陽性細胞である、請求項81に記載の方法。
- 細胞がバシラス(Bacillus)細胞である、請求項83に記載の方法。
- 細胞が酵母細胞である、請求項80に記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)細胞である、請求項85に記載の方法。
- 酵母細胞がヤロウイア(Yarrowia)細胞である、請求項85に記載の方法。
- 細胞が藻細胞である、請求項80に記載の方法。
- 細胞が植物細胞である、請求項80に記載の方法。
- 細胞が請求項37〜61のいずれか一項に列挙されている細胞である、請求項80に記載の方法。
- 細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御するステップが、上流非メバロン酸イソプレノイド経路を、下流の産物合成経路と均衡化させること、および/またはインドール経路を修飾または調節することを含む、請求項80〜90のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御するステップが、蓄積されたインドールを、化学的方法により、任意に吸収剤または捕捉剤を用いて、発酵物から除去することを含むまたはさらに含む、請求項80〜91のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または2種以上のテルペノイドが、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、またはテトラテルペノイドである、請求項80〜92のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または2種以上のテルペノイドがタキサジエンまたは任意のタキソール前駆体である、請求項93に記載の方法。
- 1種または2種以上のテルペノイドを産生する細胞中の、または1種または2種以上のテルペノイドを産生する細胞の培養物中の、インドールの量または濃度を測定することを含む方法。
- 方法が、インドールの量または濃度を2または3回以上測定することを含む、請求項95に記載の方法。
- インドールの測定量または濃度を1種または2種以上のテルペノイド産生のプロセスを導くために用いる、請求項95または96に記載の方法。
- インドールの測定量または濃度を株の作成を導くために用いる、請求項95または96に記載の方法。
- 細胞が請求項67〜77のいずれか一項に記載のポリペプチドをさらに組み換え発現する、請求項62〜66のいずれか一項に記載の方法。
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