CN104694557B - 一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用，它涉及一种PuGGPS蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素和叶绿素代谢中的应用。本发明的基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示或与序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示或由序列表Seq ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表Seq ID No：2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。

Description

一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶PuGGPS蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素和叶绿素代谢中的应用。

背景技术

紫菜是一种重要的大型经济海藻，是中国、日本和韩国主要的栽培红藻之一。全世界的紫菜栽培产业年产值约13亿美元(Blouin et al. 2011)。紫菜不仅具有重要的经济价值，而且是研究植物生理、生化以及早期进化的理想材料(Waaland et al. 2004; Lin etal. 2009; Su et al. 2010)。紫菜生长在潮间带，必须耐受周期性的极端逆境(如高光、高盐、失水等)，长期的进化过程使其产生了在逆境下对光合系统的保护机制。

类胡萝卜素在高等植物中起着吸收光能和光保护双重作用。高等植物中类胡萝卜素通常整合在捕光色素复合物或者光系统的反应中心，不仅在结构上起着稳定光系统的作用(Dall'Osto et al. 2006)，辅助叶绿素吸收光能，并且可以通过叶黄素循环机制将吸收的多余光能以热能的形式放散到空气中从而保护光系统不受光氧化损伤(Niyogi 1999; 唐婷等 2012) (Ruban et al. 2007)。虽然研究表明，红藻大多数物种都不具有叶黄素循环所需要的花药黄素和堇菜黄素(Schuber et al. 2006)，但有工作表明，红藻等以藻胆体进行光合作用的原始藻类中，仍然主要通过类胡萝卜素结合的蛋白与藻胆体核心相互作用淬灭多余光能来保护光合系统(Kirilovsky, 2007; Rakhimberdieva et al., 2007)。不仅如此，类胡萝卜素在植物体内通常积累在花、果实和根部，鲜艳的颜色可以吸引昆虫或动物作为传粉或者散播种子的媒介。此外，类胡萝卜素作为维生素A的前体，对人类和动物有很大的营养价值（Cuningham and Gantt 1998； Shumskaya and Wurtzel 2013）。而类胡萝卜素中的叶黄素和玉米黄素存在于人类和动物眼中的黄斑区域，对人类视觉感受光线变化有十分重要的作用（Handelman et al. 1998）。

牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGPP）是由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGPS）催化产生的，是植物中十分重要的代谢中间产物，是类胡萝卜素、叶绿素、维生素E（生育酚）、维生素A、赤霉素、脱落酸、牻牛儿基牻牛儿基化蛋白等重要的生理生化物质合成代谢的前体物（Okada et al. 2000），并且可通过萜类合酶合成各种单萜、倍半萜和二萜等生理活性物质。对于可食用的植物如紫菜来说，可挥发的萜类物质可影响其口感和风味（伊纪峰等2009）。研究表明，拟南芥中GGPS是由小基因家族编码，共有12个，Okada et al.（2000）的研究表明只有GGPS11和GGPS7定位于质体中，并负责类胡萝卜素和叶绿素的合成代谢。有工作表明，不同的GGPS在植物中可能负责不同的GGPP代谢库。然而，在已形成沿海经济支柱产业的紫菜物种中，尚未有任何关于GGPS的报道。对以脐形紫菜为代表的紫菜物种中GGPS的发现和功能鉴定有利于未来利用基因工程技术提高紫菜中类胡萝卜素等营养成分的含量来提高紫菜的营养价值，并且通过提高萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从而整体上提高紫菜的经济价值。

发明内容

本发明提供了一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用，该基因转录组编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，从而使紫菜中能够合成并积累类胡萝卜素。

本发明的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列如序列表SeqID No：1所示。

本发明的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列为与序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。

本发明的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本发明的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为由序列表Seq ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表Seq ID No：2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。

本发明的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因来源于脐形紫菜（Porphyra umbilicalis），名称为PuGGPS，以下该基因简称为PuGGPS。

所述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶来源脐形紫菜。

一种重组表达载体，它包括权利要求1或2所述的基因。

一种转化子，它包括含有权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞。

所述的一种转化子，它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。

本发明的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因的应用，它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。

本发明的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因（PuGGPS）获取方式为：

一、总RNA的提取

选取脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）（由缅因大学Susan Brawley教授赠予）采用RNAiso试剂(Takara公司)并用8 mol/L的 LiCl沉淀提取纯化脐形紫菜总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度后，于-80 ºC保存；

二、脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（PuGGPS）基因的克隆

以不同生物中的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶作为查询序列，在脐形紫菜转录组数据库中搜索到一条可能编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的转录本（P_umbilicalis_esContig5139）。根据该转录本，设计引物，扩增PuGGPS ORF全长：

3'- PCR引物：TCAGTTCCTTCGCTCAAATGATGAAG

5'- PCR引物：ATGCTCCGCACCGAGCCC

用1 μg步骤一获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR反应体系中加入终浓度为5%的DMSO，PCR程序如下：98℃预变性15 sec；98℃变性10 sec，64℃退火10 sec，72℃延伸2 min，35个循环后，72℃ 5 min。

将PCR产物连接至pMD19-T（Takara公司）载体，测序后获得具有完整编码区的脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因PuGGPS的ORF序列 Seq ID No：1。

三、大肠杆菌表达载体的构建

用带有Sac I和Hind III酶切位点的引物扩增PuGGPS完整编码区或者截除信号肽后部分序列克隆至pET-32b载体。

带有Sac I和Hind III酶切位点的引物序列如下：

上游引物：GTACGAGCTCCATGCTCCGCACCGAGC

或：GTACGAGCTCCACCCAAAAAGACAGCGTGG

下游引物：CCCAAGCTTGGGTCAGTTCCTTCGCTCA

四、酶活鉴定

将步骤三获得的表达载体pET-PuGGPS与携带有一系列噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因CrtB (PSY)、CrtI (PDS/ZDS)和CrtY (LCYB)的载体pAC-94N共转入大肠杆菌。载体pAC-94N上携带的基因在有活性GGPS的情况下，可以大肠杆菌的细胞积累β-胡萝卜素，从而使大肠杆菌菌落或菌液呈橙黄色；若没有活性GGPS，大肠杆菌仍为白色。空载体pET-32b与pAC-94N共转作为负对照，已知功能烟草牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶与pAC-94N共转作为正对照。HPLC分析各个样品的产物。

本发明提供的脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）PuGGPS基因功能是，其能够参与植物的类胡萝卜素代谢，在除草剂达草灭的处理下，脐形紫菜叶状体PuGGPS基因表达发生变化。

本发明的PuGGPS基因来源于脐形紫菜，其基因工程受体植物适用于水稻等生物。

利用本法发明的PuGGPS基因作为目的基因构建植物表达载体，可以利用花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、乙醇诱导启动子等，必要时可以包括增强子。为了简化转化植株的鉴定，可使用选择性标记（如抗生素酶）。所用的表达载体可使用Ti质粒、Ri质粒以及植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法或其他方法转化植物。

本发明首次发现紫菜属物种里参与类胡萝卜素合成代谢途径里的一个酶即牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，并证实该酶参与紫菜中类胡萝卜素和萜类物质的代谢。

本发明获得编码该酶的基因序列，为利用基因工程技术改进紫菜里类胡萝卜素或者萜类物质代谢途径，以提高紫菜里类胡萝卜素和萜类物质的含量提供了基础。

通过本发明提供的PuGGPS基因和蛋白，对紫菜属物种进行基因工程改进，其产业价值着重于两个方面，一是通过提高紫菜中类胡萝卜素的含量从而提高紫菜的营养价值，另一方面通过提高紫菜中可挥发性萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从而综合提高紫菜的经济价值。

附图说明

图1为PuGGPS的核苷酸和推定氨基酸序列；其中，“*”代表终止密码子，“△”代表预测的信号肽酶切位点；

图2为不同物种GGPS多序列比对显示PuGGPS的保守序列；其中，At：拟南芥；Se：细长聚球藻PCC6301；下划线表示七个保守区；FARM和SARM分别显示第一富含天冬氨酸保守区和第二富含天冬氨酸保守区；

图3为 PuGGPS和不同物种中同源序列的3D结构显示其相似性图；

图4为GGPP与其合酶PuGGPS的对接及PuGGPS中Mg²⁺ 的位置图；

图5为PuGGPS 3D结构的拉氏分析图；

图6为球棍模型显示异常夹角的氨基酸在模型中的位置图；

图7为PuGGPS在大肠杆菌中的颜色互补实验图；其中，-： pET-32b和pAC-94N共转进大肠杆菌作为负对照；PuGGPS：pET-PuGGPS和pAC-94N共转进大肠杆菌；+： pET-NtGGPS和pAC-94N共转进大肠杆菌作为正对照

图8为 PuGGPS在大肠杆菌中实验的HPLC分析图；其中，A： pET-32b和pAC-94N共转进大肠杆菌作为负对照；B：pET-PuGGPS和pAC-94N共转进大肠杆菌；C： pET-NtGGPS和pAC-94N共转进大肠杆菌作为正对照；

图9为脐形紫菜叶状体经达草灭处理2 h和4 h后，定量分析PuGGPS和PuPDS的表达水平图；

图10 为不同物种中GGPS的系统发生分析图；其中，At：拟南芥；Os：水稻； Zm：玉米；Pp：苔藓；Sm：卷柏；Cr：莱茵衣藻；Vc：团藻； Sy：聚球藻；Cm：Cyanidioschyzon merolae；Pt：三角褐指藻；Pu：脐形紫菜；Pd：分散泛菌；Hs：人类；Sa：酸热硫化叶菌。

具体实施方式

本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属本发明的保护范围。

实施例1

本实施例的PuGGPS的基因获得过程如下：

1）脐形紫菜PuGGPS转录本鉴定和编码区克隆

用拟南芥中编码GGPS和牻牛儿基二磷酸合酶（GPS）共13个基因的开放阅读框（ORF），搜索脐形紫菜转录组中的同源序列，搜索方法为tblastx，截取e-value值为1×10^-10已筛选可能的同源序列，只发现一个转录本P_umbilicalis_esContig5139。根据该转录本基因序列设计引物扩增PuGGPS的ORF（图1所示）。

引物序列如下：

上游引物：ATGCTCCGCACCGAGCCC

下游引物：TCAGTTCCTTCGCTCAAATGATGAAG

用1μg步骤2）获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃ 10min。反应结束后将PCR产物连接至pET-32b载体（Promega公司），该基因全长1038，共编码含有345个氨基酸残基的蛋白序列和一个终止密码子，经分析，在该蛋白的N端有一段叶绿体定位的信号肽（图1所示）。将所推测的蛋白序列与其他物种中的同源GGPS多序列对比，发现PuGGPS具有七个保守区域，并且第二个和第六个保守区为富含天冬氨酸区，并分别命名为第一富含天冬氨酸区（FARM）和第二富含天冬氨酸区（SARM）（图2所示），说明所获得的PuGGPS与其他物种中的GGPS同源。

2）脐形紫菜PuGGPS表达载体的构建

选取培养在PES加富的海水培养基中，光周期为12h光照/12h黑暗，环境温度为12ºC（适于大多数紫菜物种）的脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）叶状体作为总RNA提取对象。

选用RNAiso试剂(Takara公司)和LiCl沉淀的方法（LiCl浓度为8 mol/L）提取脐形紫菜叶状体总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度，于-80 ºC保存。用1μg总RNA作为反转录模板，使用Takara公司的“PrimeScript^TM 1stStrand cDNA Synthesis Kit”试剂盒反转合成cDNA第一链。

根据PuGGPS的全长编码序列，设计两端引物并在上游和下游分别引入SacI和HindIII限制性内切酶位点，并用两条引物分别扩增PuGGPS全长ORF和截除信号肽后的部分序列（引物由Genscript公司合成）：

引物序列如下：

上游引物：GTACGAGCTCCATGCTCCGCACCGAGC

或：GTACGAGCTCCACCCAAAAAGACAGCGTGG

下游引物：CCCAAGCTTGGGTCAGTTCCTTCGCTCA

用1μg步骤2）获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，67℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃ 10min。反应结束后将PCR产物连接至pET-32b载体（Promega公司），连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后筛选阳性克隆，得到携带PuGGPS的重组载体，命名为pET-PuGGPS，对其进行测序（Genscript公司完成），测序表明获得序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，由1038个碱基组成，编码序列表中Seq ID No：2的氨基酸残基序列，共编码345个氨基酸。

3）同源建模

为了确定PuGGPS是否与其他物种的GGPS具有相同的高级结构，同源构建PuGGPS的3D模型，将推测的目标蛋白的完整氨基酸序列导入Accelrys Discovery Studio Client2.5工作平台，依据TargetP等在线预测软件包的预测结果删除蛋白序列中对应的叶绿体信号肽序列，应用Blast Search方法，在PDB (Protein Data Bank)数据库中与已有晶体结构的蛋白质序列进行同源比对，筛选序列相似性高、生物学功能相近的同一蛋白家族内的若干蛋白质晶体结构作为同源建模的模板，详细参数如表1所示。

表1 同源建模所用参数

所构建的PuGGPS的3D模型（红色）与其他物种中GGPS的晶体结构（蓝色）十分相似（图3所示），并且PuGGPS的理论产物GGPP（黄色）可以很好地对接在酶的反应腔内（图4所示）。我们用拉氏图分析了PuGGPS模型的可靠性，分析表明大多数的氨基酸面夹角都在合理范围内（绿色的点），只有少数夹角有些异常（图5所示），但是分析发现具有异常夹角的氨基酸都位于拐角或者环处（图6所示），推测因为正常氨基酸拉扯所致，说明PuGGPS具有与其他物种GGPS相似的高级结构，并且在结构上可以催化GGPP的产生。

4）PuGGPS的异源表达和功能鉴定

用步骤 2）中所述引物扩增PuGGPS的ORF扩增产物纯化后由Sac I-Hind III进行双酶切，并克隆进pET-32b载体，命名为pET-PuGGPS。构建好的含有PuGGPS的载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在含有羧苄霉素(50 μg ·mL^-1)的LB-Agar培养基上培养过夜筛选，挑单菌落转入含有相同浓度羧苄霉素的LB液体培养基上37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4~0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.5 mmol· L^-1)诱导表达3~4 h。表达的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，10%)分析。

实施例2

PuGGPS的功能验证如下：

为了鉴定PuGGPS的功能，我们采用的是大肠杆菌体内酶活鉴定系统，用颜色互补的方法结合HPLC分析酶的活性。该系统用到质粒pAC-94N，该质粒携带噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因八氢番茄红素合酶 (CrtB，PSY)、八氢番茄红素去饱和酶(CrtI，PDS/ZDS)和番茄红素β-环化酶(CrtY，LCYB)，但缺少GGPS (CrtE)基因，在有底物GGPP或者GGPS酶活的情况下可以在大肠杆菌细胞中合成并积累β-胡萝卜素，使大肠杆菌呈现橙黄色；而没有GGPP或者GGPS酶活的情况下大肠杆菌没有颜色，可以很容易分辨是否有GGPS酶活存在。将可以正常表达的pET-PuGGPS与pAC-94N用热激法共转进大肠杆菌DH5α菌株里。以带有来自烟草的GGPS基因(NtGGPS)的载体pET-NtGGPS和空载体pET-32b分别与pAC-94N共转作为正、负对照。共转的菌株在含氯霉素(50 μg· mL^-1)和羧苄霉素(50 μg ·mL^-1)的LB培养基中培养。挑选黄色菌落接种至5 mL带有氯霉素和羧苄青霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，取200 μL接种至20 mL抗性LB培养基中200 rpm振荡培养3 d，离心收集菌体，发现在含有烟草NtGGPS的正对照和脐形紫菜PuGGPS的样品中，大肠杆菌的颜色都呈橙黄色，而含有空载体pET-32B的负对照大肠杆菌呈白色（图7所示），说明PuGGPS和已鉴定的烟草GGPS一样具有催化GGPP生成的活性，从而使大肠杆菌细胞积累β-胡萝卜素。

5）色素提取及HPLC分析

将含有双载体pAC-94N和pET-NtGGPS/pET-PuGGPS/ pET-32b的大肠杆菌菌体经10,000 g离心1 min收集后超声破碎。向超声破碎的材料中加入400 μL 80%的丙酮，剧烈振荡30 min以彻底提取材料中所含色素，然后依次加入250 μL乙酸乙酯和ddH₂O，分别剧烈振荡15 sec，静置5 min后，10,000 g、4℃离心5 min。吸取上清，用氮气吹干后溶于100 μL乙酸乙酯。所提取的色素用反相高效液相色谱(reverse-phase HPLC)方法，在SpherisorbODS2 C18色谱柱(Waters)上分离，色谱柱为4.6 × 250 mm，流动相为在乙腈:水:三乙胺(9:1:0.01)中线性展开乙酸乙酯(0-100%)。展开时间为45 min，流速为1 mL ·min^-1，柱温50℃。检测器扫描波长为300~800 nm。选择296 nm和440 nm的扫描结果。类胡萝卜素的鉴定根据标准品或已报道的保留时间和吸收谱来确定。用于相对定量分析的色素样品中加入内标(internal standard) trans-β-apo-8'-carotenal。所有的化学试剂均为色谱纯。分析结构表明正对照和样品中均积累β-胡萝卜素和微量的番茄红素，而负对照中没有任何类胡萝卜素的积累（图8），进一步证明了PuGGPS可以产生类胡萝卜素合成所需要的前体GGPP。

6）基因表达水平分析

为了确定PuGGPS在脐形紫菜体内类胡萝卜素代谢中的作用，用类胡萝卜素代谢抑制剂除草剂达草灭(Norflurazon)处理脐形紫菜叶状体，使用实时定量PCR分析处理2h和4h后脐形紫菜叶状体中PuGGPS和PuPDS编码基因的表达水平变化。实时定量PCR在StepOne PlusReal-Time PCR System (Applied Biosystems)仪器上进行，用SYBR Premix ExTaq II(Perfect Real Time) Kit (Takara)。25μL扩增体系中含12.5 μL SYBR Premix ExTaqII，5% DMSO (v/v)，1 μL正向引物，1 μL反向引物，1 μL cDNA。

扩增条件为：95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，共40个循环。每个处理取三个样品，每个样品做三个重复，根据溶解曲线确定扩增产物的特异性。用脐形紫菜中条斑紫菜Actin2的同源物(PuACT2)作为内参。扩增产物经TA克隆、测序确定为所扩增的目的基因，确定起始循环数(Ct值)，根据公式2^-ΔCT计算每个基因相对表达水平。所得数据用GraphPadPrism5作图。

分析结果显示，PuGGPS在类胡萝卜素合成途径遭到阻断后表达上升（图9所示），表明在紫菜体内PuGGPS参与类胡萝卜素的合成代谢。

7）系统学分析

为了确定所克隆基因PuGGPS所属的类型，，我们检索了GenBank里PuGGPS的同源序列，并根据前人报道取不同类型的GGPS并对其进行系统发生分析。所有序列用ClustalX比对，用MEGA5.1 (Tamura et al., 2011)中的邻接法构建系统树。自举检验重复1,000次用于分析每个节点的可靠性。分析结果显示PuGGPS属于高等植物Type II的GGPS（图10所示）。

Claims (1)

1.一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因的应用，其特征在于，所述牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因参与紫菜中类胡萝卜素合成代谢途径，在类胡萝卜素合成途径遭到阻断后牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因表达量上升，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No:1 所示。