CN107384940A - 大豆种子特异性磺肽素基因、其编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆种子特异性磺肽素基因、其编码肽分子及其在植物种子增大和产量增加方面的应用。该基因为SEQ ID NO：1所示的碱基序列，其编码的蛋白及最终成熟的磺肽素分子为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明首次在大豆种子中鉴定到一种新型的磺肽素前体基因GmPSKγ，通过在植物种子中特异性表达GmPSK γ基因证明了该基因及其编码的磺肽素分子具有增大种子体积、增加产量的功能。

Description

大豆种子特异性磺肽素基因、其编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种大豆种子特异性磺肽素基因、其编码蛋白及其在植物种子增大和产量增加方面的应用。

背景技术

种子是植物的繁殖器官，也是植物通过光合作用储存营养物质的主要场所。植物种子由于富含淀粉、脂肪、蛋白质等营养成分成为了人类日常生活重要的食物来源。近年来，由于土壤品质退化、极端气候增加、以及城市化等因素导致的可用耕地面积持续较少，导致农作物的种子产量增加受到严重威胁。我国是人口大国，以有限的耕地养活庞大的人口本身就是巨大的挑战，如果农作物产量增加受阻，甚至减产，势必威胁到我国的粮食安全，因此，如何进一步增加单位面积作物的籽实产量成为了植物和农业科研人员关注的重点。在影响作物产量的诸多因素中，增加种子体积和重量是提高产量最直接、最有效的途径之一。

大豆种子既是营养丰富的蔬菜，同时也是食用油的主要原料，与人们的日常生活息息相关。我国是大豆原产国，有着悠久的大豆种植历史，然而由于单产水平低下等原因，我国生产的大豆在市场上缺乏竞争力，以至于每年从巴西、美国等国家进口的大豆超过了年消费量的90%，2015年我国进口大豆总量超过了8000万吨。因此，研究大豆种子发育和增产机理具有重要的实际应用价值。然而由于大豆的遗传转化十分困难，限制了相关研究的开展。在本发明中，我们采用模式植物拟南芥作为系统，研究大豆种子特异性磺肽素基因在促进种子增大、产量增加等方面的功能。拟南芥与大豆同属双子叶植物，二者的种子结构与发育机理十分相似，同时拟南芥的遗传转化易于操作，因此，以拟南芥为系统研究大豆种子特异性基因在种子发育中的功能无论是理论上还是技术上均具有很高的可行性。

磺肽素（phytosulfokine，简称PSK）是从多种植物中分离鉴定到的一种活性小肽分子，经典的磺肽素分子由五个氨基酸（YIYTQ）组成，其中两个酪氨酸（Y）残基受磺酸基团修饰，这种磺肽素通常称为PSKα。与此同时，研究人员发现植物体中还存在另一种由四个氨基酸（YIYT）组成的磺肽素PSKβ。PSKβ活性比PSKα低至少两个数量级，因此推测可能是后者的降解产物。在植物中，PSKα由多基因家族编码，其前体蛋白由100个左右的氨基酸组成，活性五肽序列位于前体蛋白C端保守区域。PSKα前体蛋白由酪蛋白磺酸转移酶和蛋白酶先后催化形成成熟的磺肽素分子。已有研究表明磺肽素通过调节植物细胞生长从而促进根、叶等器官的生长发育，进而增加植物的生物量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ。

本发明的目的之二在于提供由该基因编码的磺肽素分子PSKγ。GmPSKγ基因被翻译成蛋白质后，先后经过磺酸化修饰和蛋白酶水解，形成由5个氨基酸（YVYTQ）组成的类似磺肽素分子，该分子与已经报道的磺肽素PSKα存在一个氨基酸的差异。功能研究发现该分子是一种新型的磺肽素，将其命名为PSKγ。

本发明的目的之三在于提供一种植物种子特异性表达载体，该载体含有本发明的基因。

本发明的目的之四在于提供该基因增加植物种子产量的应用，其特征在于过表达GmPSKγ基因能够显著增加植物种子的大小和重量。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ，其特征在于该基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

一种由上述基因编码的前体蛋白，其特征在于该蛋白是SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。PSKγ小肽分子位于该前体蛋白的靠近C端。

一种植物种子特异性表达载体，该载体含有本发明的基因。

一种上述的大豆种子特异性的磺肽素前体基因在增加植物种子的大小和重量，增加作物产量中的应用。

本发明首次在大豆中鉴定并克隆到一个在种子中特异性表达的新型磺肽素前体基因GmPSKγ，通过构建植物种子特异性表达载体并转化模式植物拟南芥，证明了GmPSKγ编码的新型磺肽素分子PSKγ具有促进种子增大、重量增加的功能，为植物分子育种提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为本发明的大豆GmPSKγ基因及14个GmPSKα基因编码的前体蛋白的序列比对图。方框中显示的是前体蛋白成熟后的最终产物——磺肽素分子。由图可知，GmPSKγ和GmPSKα的蛋白序列十分相似，但磺肽素5个氨基酸残基由YIYTQ变为YVYTQ。

图2为本发明的大豆GmPSKγ和GmPSKα蛋白系统发生关系图。

图3为本发明的GmPSKγ基因的组织表达模式图，可见GmPSKγ基因特异性地在大豆种子中高表达。

图4为本发明的GmPSKγ基因的种子特异性表达载体OLEOp:GmPSKγ和对照载体OLEOp:GmPSKγtc的构建示意图（A），以及qRT-PCR检测OLEOp:GmPSKγ（B）和OLEOp:GmPSKγ tc（C）代表性转基因株系种子中目的基因的表达量。

图5为本发明的OLEOp:GmPSKγ（A-C）和OLEOp:GmPSKγtc（D-F）转基因拟南芥的种子表型图，标尺均为1mm。（G-I）分别为对应转基因株系的种子粒长（G）、粒宽（H）和百粒重（I），不同字母代表显著性差异，p < 0.01, ANOVA。由图可知，OLEOp:GmPSKγ与对照OLEOp: GmPSKγtc转基因植株相比，种子明显增大，粒长、粒宽均显著增大，且种子重量显著增加。

具体实施方法

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一: 大豆磺肽素前体基因发掘及蛋白序列比对

以已经报道的拟南芥磺肽素前体基因序列为诱饵，在大豆基因组数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/）中通过同源比对发掘大豆磺肽素基因信息，共找到15个预测为磺肽素前体的基因（图1）。BioEdit软件分析发现，这15个磺肽素前体基因编码的蛋白序列相似度较高，且具有典型的磺肽素前体蛋白结构特征。对上述蛋白C末端分析发现，其中14个前体蛋白具有PSKα（YIYTQ）序列，而最后一个前体蛋白的C末端是YVYTQ序列，与PSKα的第二个氨基酸存在差异（图1），故将其命名为大豆新型磺肽素PSKγ。

实施例二：大豆磺肽素前体基因系统发生关系分析

将大豆15个磺肽素前体蛋白序列经MEGA6软件进行系统发生关系分析发现， GmPSKγ与GmPSKα1,2,5,6,10,13聚为一支，亲缘关系较近，预测具有磺肽素的功能（图2）。

实施例三：GmPSKγ基因的克隆及组织表达模式分析

以大豆种子cDNA为模板，运用聚合酶链式反应（PCR）方法克隆了GmPSKγ基因的CDS序列。该CDS序列全长285bp，编码由94个氨基酸残基组成的前体蛋白，PSKγ五肽位于前体蛋白的靠近C端。

为了研究GmPSKγ基因的组织表达模式，取大豆子叶、下胚轴、叶片、茎、根、根瘤、花、果皮和种子共九种组织或器官的cDNA作为模板，以GmEF1β作为内参基因，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测GmPSKγ基因的组织表达模式。结果显示GmPSKγ基因特异性地在大豆种子中高表达（图3）。

实施例四：GmPSKγ种子特异性表达载体构建及遗传转化拟南芥

（1）OLEOp:GmPSKγ种子特异性高表达载体的构建：首先用分别带有限制性酶切位点Nco I和BamH I的上游和下游引物PCR克隆GmPSKγ基因CDS序列，通过酶切—连接系列反应将GmPSKγ CDS 连入中间载体（pRNAi）上；然后用带有酶切位点Kpn I和Nco I的上、下游引物从拟南芥基因组DNA中克隆得到种子特异性高表达的OLEO基因的启动子序列（OLEOp, 2005bp），并用OLEOp替换pRNAi载体上的35S启动子，得到OLEOp:GmPSKγ-pRNAi中间载体；最后用Kpn I和Sac I双酶切反应将OLEOp:GmPSKγ片段切下并连入pCAMBIA2301双元载体上，得到最终的OLEOp:GmPSKγ-pCAMBIA2301载体。严谨起见，本发明同时还构建了阴性对照载体OLEOp:GmPSKγtc-pCAMBIA2301，该载体与上述载体的唯一区别在于GmPSKγ CDS不含有表达磺肽素的区段，为GmPSKγ的截短形式（称为GmPSKγtc），因此，该阴性对照载体无法编码磺肽素PSKγ（图4A）。

（2）遗传转化拟南芥：将上述构建完成的两个载体OLEOp:GmPSKγ-pCAMBIA2301和OLEOp:GmPSKγtc-pCAMBIA2301通过热激法转化进入农杆菌菌株GV3101中，再通过蘸花法经由农杆菌侵染介导将目的基因转化进入拟南芥中。通过抗生素平板筛选获得转基因阳性植株，再经过两代自交繁殖后获得T3代纯合转基因植株。

实施例五：种子特异性表达GmPSKγ基因植物的表型分析

（1）转基因植物种子中GmPSKγ表达量检测：首先抽提转基因阳性株系发育中的种子的总RNA，具体操作方法如下（Omega 植物RNA抽提试剂盒）：

1）称取约0.1g种子，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，装于1.5mL的离心管中。

2）加入500μL RCL，用力摇动使混合均匀，55℃放置2-3min。离心（室温，10000rpm，5min）。

3）将上清液（约450μL）转移至去除基因组的柱子中。离心（室温，14000rpm，2min）。

4）弃柱子，向溶液中加等体积RCB，吹打混匀，转移至RNA吸附柱中。离心（室温，12000rpm，1min）。

5）弃溶液，加400μL RWF洗涤柱子。离心（室温，10000rpm，1min）。

6）更换新的2mL离心管，加500μL Wash Buffer洗涤柱子。离心（室温，10000rpm，1min）。

7）重复步骤6）一次。

8）弃溶液，离心（室温，10000rpm，3min）。

9）将柱子转移到新的1.5mL 离心管，在超净台干燥5min。

10）向柱子中加入40μL RNase-free水。-80℃保存RNA。

然后将RNA反转录成cDNA（TAKARA公司反转录试剂盒），具体操作方法为：每个样品均精确取1μg RNA，加入 gDNA Eraser，42℃反应10min去除基因组DNA；接着加入PrimeScript RT Enzyme Mix，RT primers，反应缓冲液等，于37℃反应30min即得到cDNA。将上述cDNA稀释30倍后作为模板，运用qRT-PCR技术检测各转基因株系种子中目的基因的表达量。

结果：OLEOp:GmPSKγ-pCAMBIA2301和OLEOp:GmPSKγtc-pCAMBIA2301两个载体均成功获得多个目的基因高表达的转基因株系，各选取3个代表性的株系进行种子表型分析（图4B，C）。

（2）转基因植物种子表型分析：上述纯合的转基因植株在标准人工植物培养箱（22℃，光周期：16h光照/8h黑暗）中生长一代后，将成熟的种子于28℃烘箱干燥处理两天。随机取各转基因株系种子用实体显微镜拍照，再用Image J软件测量、统计种子的大小（粒长和粒宽），最后用精密天平称量种子的重量（百粒重）（图5）。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

<110> 上海大学

<120> 大豆种子特异性磺肽素基因、其编码肽分子及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 285

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 1

Atggc aaggt gcatc acaat agtag tattc tatgt tattt atgtt cttct tttca cggtt 60

gttga gggca ggtcc ttgtt catga tcaac accaa tagtc cagat gttgt tccac ataga 120

ccagt ttctt cttcc catgt aacaa caatg tcact tgaaa agaca cggtt caatg atgat 180

ggtgg tgctt gcaag ggact agaca ggact gagtg tgtgg ttaaa acaac aatgg ttgct 240

catac ggatt atgtt tacac acaag acatt aataa tgggc cttga 285

<210> 1

<211> 94

<212> 蛋白质

<213> 蛋白序列

<400> 2

MARCI TIVVF YVIYV LLFTV VEGRS LFMIN TNSPD VVPHR PVSSS HVTTM SLEKT RFNDD 60

GGACK GLDRT ECVVK TTMVA HTDYV YTQDI NNGP 94

Claims (5)

1.一种大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ，其特征在于该基因具有SEQ IDNO: 1所示的DNA序列。

2.一种根据权利要求1所述的大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ的编码蛋白，其特征在于该蛋白具有SEQ ID NO: 2 所示的氨基酸序列。

3.一种植物种子特异性表达载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ。

4.一种根据权利要求1所述的大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ在增加植物种子的大小和重量，增加作物产量中的应用。

5.一种根据权利要求2所述的大豆种子特异性的磺肽素前体基因GmPSKγ的编码蛋白在增加植物种子的大小和重量，增加作物产量中的应用。