ES2747844T3 - Agrupación de genes para biosíntesis de meleólidos y su aplicación - Google Patents

Abstract

Microorganismo huésped que se transforma para comprender y expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa y que comprende o consiste en una secuencia nucleica seleccionada del grupo que consiste en (i), (ii) y (iii): (i): a) SEQ ID NO 5 a 8 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO 5 a 8; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias; (ii) un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de (i), que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa, estando la secuencia de ácido nucleico unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un microorganismo huésped transformado con el vector, preferiblemente el vector es un vector de expresión, (iii) SEQ ID NO 9 de la lista de secuencias adjunta; transformándose adicionalmente el microorganismo huésped para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril- CoA (HMG-CoA) reductasa, y seleccionándose del grupo que consiste en hongos, incluyendo levadura y bacterias.

Description

DESCRIPCIÓN

Agrupación de genes para biosíntesis de meleólidos y su aplicación

La presente invención se refiere a una agrupación de genes recién identificada, en particular a polinucleótidos recién identificados dentro de dicha agrupación de genes, así como a los polipéptidos codificados por los polinucleótidos, y a su producción y usos, así como a sus variantes y a sus usos. Además, la presente invención se refiere a un método para producir protoiludeno hidroxilado y/o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide usando los polinucleótidos/polipéptidos recién identificados.

Antecedentes de la invención

Debido al hecho de que la prevalencia de patógenos microbianos con resistencia a la terapia antibiótica convencional aumenta constantemente, la investigación ha comenzado a centrarse en la búsqueda y el desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos con nuevos modos de acción. Los productos naturales son tradicionalmente una fuente rica de compuestos bioactivos, pero aunque los terpenoides son, con diferencia, la clase más grande de productos naturales, sólo hay tres fármacos antimicrobianos aprobados en la familia de los terpenoides y los tres son derivados semisintéticos del producto natural fúngico pleuromutilina (tiamulina, valnemulina y retapamulina).

Los basidiomicetos son una fuente particularmente rica de sesquiterpenoides complejos, estructuralmente diversos y bioactivos, y determinados ésteres arílicos sesquiterpenoides de tipo protoiludeno del género Armillaria son pistas prometedoras para el desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos. El género Armillaria, también conocido comúnmente como hongo de miel, actualmente se clasifica en la familia Physalacriaceae y comprende más de 600 especies en todo el mundo. Las especies de Armillaria se consideran no sólo hongos comestibles, sino también patógenos de la raíz notorios que atacan los árboles de corteza dura y las coníferas, así como los árboles frutales y la vid.

Se conocen miembros del género Armillaria para la producción de dos tipos de ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, que se dividen según la posición del doble enlace en armililorselinatos y meleólidos. Hoy en día se conocen más de 50 estructuras de armililorselinatos y meleólidos de Armillaria spp., lo que los convierte en uno de los grupos más diversos de productos naturales conocidos de hongos.

Si bien la biosíntesis de algunos terpenos, en particular de origen vegetal, como el mentol, la artemisinina o el taxol, se ha estudiado ampliamente en el pasado, se sabe poco sobre la síntesis de la gran mayoría, en particular de los terpenos producidos por hongos.

Los ésteres arílicos de tipo protoiludeno se construyen a partir de un alcohol protoiludanol sesquiterpenoide y un resto aromático derivado de ácido orselínico. Se cree que la biosíntesis de todos los sesquiterpenoide de tipo meleólido y armililorselinato se deriva de la ciclación del precursor de sesquiterpeno universal difosfato de farnesilo a protoiludeno. El sistema de anillo de protoiludeno se somete luego a varias reacciones de hidroxilación, y los alcoholes de protoiludanol resultantes se someten luego a esterificación en la posición C5-hidroxilo con derivados del ácido orselínico policétido.

Mientras que el ácido orselínico y sus derivados son biosintetizados por numerosos microorganismos, y los protoiludenos están muy difundidos en los homobasidiomicetos, el acoplamiento de ambos parece ser único en el género Armillaria

El documento WO 2012/016912 A1 da a conocer microorganismos huésped y métodos para la producción de meleólidos, en el que un gen de protoiludeno sintasa de Armiallaria se expresa en el microorganismo huésped. Engels et al. (“Cloning and characterization of an Armillaria gallica cDNA encoding protoilludene synthase, which catalyzes the first committed step in the synthesis of antimicrobial melleolides”, Journal of Biological Chemistry 286(9):6871-6878 (2011) también da a conocer la expresión heteróloga de una protoiludeno sintasa de A. gallica en E. coli.

Dado que, como ya se mencionó anteriormente, los meleólidos y armililoreselinatos, en medicina, son de gran interés debido a su potencial actividad antimicrobiana y citotóxica, sería deseable producirlos específicamente o enriquecerlos de forma controlada.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar herramientas nuevas y mejoradas mediante las cuales pueda lograrse una producción dirigida, o bien homóloga o bien heteróloga.

Sumario de la invención

Según la invención, este y otros objetos se logran proporcionando un microorganismo huésped según la reivindicación 1. Según la invención, el microorganismo huésped se transforma para comprender y expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa y que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (i) a) SEQ ID NO 5 a 8 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO 5 a 8; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias, (ii) un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de (i), que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa, estando la secuencia de ácido nucleico unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un microorganismo huésped transformado con el vector, preferiblemente el vector es un vector de expresión, (iii) SEQ ID NO 9 de la lista de secuencias adjunta, en el que el microorganismo huésped se transforma adicionalmente para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa.

Se da a conocer en el presente documento una agrupación de genes que comprende o consiste en los siguientes genes: citocromo P450 monooxigenasa 1 de Armillaria gallica, citocromo P450 monooxigenasa 2 de Armillaria gallica, P450 monooxigenasa 3 de Armillaria gallica, protoiludeno sintasa de Armillaria gallica, citocromo P450 monooxigenasa 4 de Armillaria gallica, en la que los genes están dispuestos en el orden mencionado.

Los objetos se logran adicionalmente mediante un método respectivo para producir un protoiludeno hidroxilado y/o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas.

Además, la invención proporciona el uso de la agrupación de genes mencionada anteriormente para producir un protoiludeno hidroxilado o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, y mediante un método respectivo que usa la agrupación de genes para producir un protoiludeno hidroxilado y/o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

Los objetos se logran completamente de esa manera.

Los polinucleótidos mencionados anteriormente, codifican cada uno para un polipéptido de Armiallaria gallica con actividad monooxigenasa que, según el conocimiento de los inventores, se ha identificado, purificado y caracterizado enzimáticamente por primera vez. Estos polinucleótidos recién identificados catalizan reacciones de hidroxilación que convierten 6-protoiludeno en 6-protoiludeno mono o multi hidroxilado, cuya reacción representa una etapa crucial en la síntesis de protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide. Por tanto, al haber identificado el gen que codifica las monooxigenasas, se ha encontrado y generado una herramienta valiosa y eficaz para influir en la producción de protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide: los genes pueden, o bien solos o bien en una agrupación que también comprende protoiludeno sintasa, expresarse o sobreexpresarse de manera heteróloga con el fin de generar múltiples copias de dichos genes, por medio de los cuales la tasa de ciclación y la generación de protoiludenos hidroxilados en la síntesis de ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se eleva, y, por tanto, aumenta la producción de ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide. De esa manera, pueden obtenerse protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide altamente enriquecidos, que pueden o bien usarse como potentes sustancias antimicrobianas y citotóxicas y pueden usarse como herramientas terapéuticas en todos los diferentes campos de tratamiento y medicina, o bien modificarse adicionalmente para dar otras sustancias antimicrobianas derivadas de dichos protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

Según la presente invención, el término “polinucleótido(s)” se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. El/los “polinucleótido(s)” incluye(n), sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias o regiones mono, bi y tricatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, más normalmente, regiones bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, “polinucleótido” tal como se usa en el presente documento se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más normalmente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. Tal como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido(s)” también incluye ADN o ARN tal como se describió anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por tanto, ADN o ARN con estructuras principales modificadas por estabilidad o por otros motivos son “polinucleótido(s)” ya que ese término está previsto en el presente documento. Además, ADN o ARN que comprende bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos ya que el término se usa en el presente documento. Se apreciará que se ha realizado una gran variedad de modificaciones al ADN y al ARN que satisfacen muchos fines útiles conocidos para los expertos en la técnica. El término “polinucleótido(s)” tal como se emplea en el presente documento abarca tales formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen, por ejemplo, células simples y complejas. Además, “polinucleótido(s)” también abarca polinucleótidos cortos a menudo denominados oligonucleótido(s).

“Polipéptido(s)” se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. “Polipéptido(s)” se refiere tanto a cadenas cortas, denominadas comúnmente péptidos, oligopéptidos y oligómeros como a cadenas más largas denominadas generalmente proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El/los “polipéptido(s)” incluye(n) aquellos modificados o bien por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también por técnicas de modificación química. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una bibliografía de investigación voluminosa, y los conocen bien los expertos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden producirse en cualquier sitio en un polipéptido, incluyendo la estructura principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácido, y los extremos terminales amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación. Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y ramificados circulares pueden resultar de procesos naturales postraduccionales y pueden producirse también por métodos completamente sintéticos.

“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, tal como se emplea el término en el presente documento. De manera similar, una secuencia “sintética”, tal como se usa el término en el presente documento, significa cualquier secuencia que se haya generado sintéticamente y no directamente aislada de una fuente natural. “Recombinante” significa ADN modificado por ingeniería genética preparado mediante el trasplante o el corte y empalme de genes de una especie en las células de un organismo huésped de una especie diferente. Dicho ADN se convierte en parte de la composición genética del huésped y se replica.

El término “polinucleótido que codifica un polipéptido” tal como se usa en el presente documento abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente monooxigenasas de Armillaria gallica, que tienen las secuencias de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO 1 a 4. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, interrumpidas por fago integrado o secuencia de inserción o edición) junto con regiones adicionales que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

“Variante(s)” tal como se usa el término en el presente documento, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótido pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se comenta a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que se produce de manera natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se produzca de manera natural. Pueden producirse variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no se producen de manera natural mediante técnicas de mutagénesis, mediante síntesis directa, y mediante otros métodos recombinantes conocidos para los expertos en la técnica.

También se incluyen dentro de la presente invención y/o en la definición de polipéptido variante polipéptidos “ortólogos” (ortólogos), que son péptidos codificados por genes en diferentes especies que evolucionaron a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos conservan la misma función en el curso de la evolución.

Además, el término “célula huésped” o “microorganismo huésped” se define por la presente como una célula o microorganismo o célula de microorganismo, que se ha transformado o transfectado, o es capaz de transformación o transfección mediante una secuencia de polinucleótidos exógena, expresando así de manera heteróloga el polinucleótido introducido.

Por la presente y tal como se entiende generalmente, un “éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide” ha de entenderse que representa o bien un armililoreselinato o un meleólido. Como tal, se construyen a partir de un protoiludeno sesquiterpenoide oxigenado y ácido orselínico.

Según el microorganismo huésped y el método según la invención, el polinucleótido consiste en uno de SEQ ID NO 5 a 9 de la lista de secuencias adjunta y codifica un polipéptido con actividad monooxigenasa (SEQ ID NO 5 a 8) o representa una agrupación de genes que comprende 4 monooxigenasas y protoiludeno sintasa. SEQ ID NO 5 a 8 representa las secuencias de cuatro monooxigenasas de Armillaria gallica diferentes contenidas en la agrupación de genes para síntesis de meleólidos recién identificada de Armillaria gallica, agrupación que también comprende el gen de protoiludeno sintasa. SEQ ID NO 9 muestra la secuencia de la agrupación.

Las SEQ ID NO 5 a 8 tal como se da a conocer en la lista de secuencias adjunta son las cuatro secuencias de ADNc, respectivamente, de las monooxigenasas 1 a 4 tal como se identifica y caracteriza de Armillaria gallica. Debe entenderse que otras variantes de las mismas, que tienen al menos una identidad de secuencia del 90%, y que incluso pueden encontrarse en otras especies de Armillaria, también son adecuadas y parte de la invención, puesto que con las monooxigenasas recién identificadas se proporcionan herramientas valiosas mediante las cuales pueden identificarse monooxigenasas similares, es decir monooxigenasas que difieren ligeramente de SEQ ID NO 5 a 8, mediante comparación de secuencias y posterior prueba enzimática.

La invención también se refiere a vectores comprendidos en el microorganismo huésped, que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, microorganismos huésped y/o células huésped que se modifican por ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales polipéptidos usando ARN derivado de los constructos de ADN de la invención.

El vector tal como se emplea en el microorganismo huésped según la invención, contiene una secuencia de ácido nucleico tal como se definió anteriormente, que codifica un polipéptido con actividad monooxigenasa, en el que la secuencia de ácido nucleico se une operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula/microorganismo huésped transformado o transfectado con el vector. Según un aspecto de la invención, el vector es un vector de expresión, y, según otro aspecto, el vector puede estar presente en forma de un plásmido, cósmido, fago, liposoma o virus.

Para la producción recombinante, las células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones del mismo o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede efectuarse mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Por tanto, el polinucleótido según la invención puede, por ejemplo, estar comprendido en un vector que va a transformarse/transfectarse de manera estable en células de microorganismo huésped. En el vector, el polinucleótido de la invención está bajo el control de un promotor inducible, de modo que la expresión del gen/polinucleótido puede dirigirse específicamente y, si se desea, el gen o genes pueden sobreexpresarse de esa manera.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos. Los constructos del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan la expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped para la expresión en este aspecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., véase lo anterior.

En el presente documento también se da a conocer un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos mostrada en una de SEQ ID NO: 1 a 4;

b) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8, respectivamente;

c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8; y

(d) un fragmento de una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 1 a 4, en el que dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos y presenta actividad monooxigenasa.

La invención se refiere a una célula/microorganismo huésped según la reivindicación 1, que se ha transformado/transfectado con el polinucleótido según la invención o que contiene un vector tal como se definió anteriormente y en particular un microorganismo o célula huésped que se selecciona del grupo que consiste en hongos incluyendo levadura y bacterias.

Debe entenderse que el microorganismo huésped expresa de manera heteróloga el polinucleótido recién identificado, es decir al menos una de las monooxigenasas identificadas en el presente documento, preferiblemente en combinación con una protoiludeno sintasa, o expresa de manera heteróloga la agrupación de genes tal como se expone además a continuación.

Según otro aspecto de la invención, se usa un microorganismo huésped, con el ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad monooxigenasa que se adapta al uso de codón del respectivo microorganismo huésped. Según otra realización de la invención, la célula huésped es una Saccharomyces spp., en particular Saccharomyces cerevisiae, una Aspergillus spp., en particular Aspergillus nidulans, un homobasidiomiceto, en particular un homobasidiomiceto del género Armillaria, en particular Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, y otros miembros del género Armillaria.

Aún otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir meleólidos tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas y que comprende las etapas de:

a) hacer crecer, en condiciones de nutrientes adecuadas que permiten la producción de un protoiludeno hidroxilado o éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, un microorganismo tal como se definió anteriormente; y b) aislar dicho protoiludeno hidroxilado o dicho éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide del microorganismo huésped o del medio de crecimiento.

Según un aspecto de la invención, el protoiludeno hidroxilado se selecciona de 8-alfa-hidroxi-6-protoiludeno; 8-alfa,13-hidroxi-6-protoiludeno; y el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se selecciona de meleólido I, armilaridina, meleólido A, meleólido F, meleólido B, meleólido K, evernitato de armililo, armilarina, arnamiol, meleólido J, armilarivina, 10-alfa-hidroxi-meleólido, armililorselinato, meleólido E, 1-O-trifluoroacetil-meleólido E, meleólido H, 5'-O-metil-meledonal, meledonal, arnamial, meleólido C, meleólido D, meledonal A, meledonal C, meledonol, deshidroarmililoreslinato, armilano, armilaridina.

Según aún otro aspecto, el método que comprende las etapas mencionadas anteriormente consiste en las siguientes etapas:

a) hacer crecer, en condiciones de nutrientes adecuadas, un microorganismo huésped transformado o transfectado para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa y para comprender una secuencia de ácido nucleico seleccionada de a) SEQ ID NO 5 a 8 del protocolo de secuencia abarcado, b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO 5 a 8, y c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias;

b) sobreexpresar la secuencia de ácido nucleico;

c) potenciar así la producción de protoiludeno hidroxilado o éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide en la célula del microorganismo, y

d) aislar dicho protoiludeno hidroxilado o éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide del microorganismo o del medio de crecimiento.

Según una realización de la presente invención, la invención también se refiere a un método para producir un protoiludeno hidroxilado y/o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, comprendiendo el método las etapas de

a) proporcionar un microorganismo huésped que se ha transformado para expresar de manera heteróloga al menos todo lo siguiente: i) una protoiludeno sintasa, y ii) al menos una citocromo P450 monooxigenasa, en la que al menos una de (i) o (ii) es ajena a dicho microorganismo huésped,

b) hacer crecer, en condiciones de nutrientes adecuadas que permiten la producción de los ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, produciendo así el microorganismo huésped proporcionado en la etapa a) el protoiludeno hidroxilado y, según sea el caso, el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

El microorganismo huésped empleado en el método según la invención comprende por tanto al menos dos genes, es decir una protoiludeno sintasa y al menos una citocromo P450 monooxigenasa, preferiblemente CYP-Arm1 a 4 de Armillaria gallica tal como se identifica en la presente invención.

Por consiguiente, el método puede comprender además la etapa c):

c) aislar dicho protoiludeno hidroxilado y/o dicho éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide del microorganismo huésped o del medio de crecimiento.

En el método según la invención, la protoiludeno sintasa es una protoiludeno sintasa de uno de los siguientes: Armillaria spp., en particular de Armillaria gallica, y/o la citocromo P450 monooxigenasa es CYPArm 1, 2, 3 ó 4 o CYP-Arm 1 a 4 monooxigenasas tal como se identifica en el presente documento.

Por tanto, en el método de la invención, la citocromo P450 monooxigenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO 1 a 4 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8;

c) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8. d) un fragmento funcional de una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 2, en el que dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos, satisfaciendo la función de una citocromo P450 monooxigenasa. Además, en un refinamiento del método de la invención, en la etapa a) se proporciona un microorganismo que se ha transformado adicionalmente para expresar una NADPH-citocromo P450 reductasa, preferiblemente una NADPH:citocromo reductasa de Taxus chinensis.

Esta enzima se introduce con el fin de mejorar la reducción de la enzima heteróloga del citocromo P450 en levadura. Según el microorganismo huésped y/o el método según la invención, el microorganismo huésped proporcionado en la etapa a) se transforma adicionalmente para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa. Esta enzima se introduce con el fin de aumentar el flujo a través de la ruta de ácido mevalónico para proporcionar difosfato de farnesilo adicional para reforzar la biosíntesis de protoiludeno.

Debe entenderse que preferiblemente el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se selecciona de meleólidos y armililorselinatos, en particular de protoiludeno monohidroxilado, en particular 8-hidroxi-6-protoiludeno, protoiludeno dihidroxilado, en particular 8,13-hidroxi-6-protoiludeno.

En el presente documento se dan a conocer protoiludeno hidroxilado o el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide obtenidos de un método según la invención.

Además, la presente invención también se refiere al uso de una agrupación de genes que comprende al menos (i) una protoiludeno sintasa y (ii) al menos una citocromo P450 monooxigenasa para la producción de un protoiludeno hidroxilado y/o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

En una realización preferida del uso y del método según la invención, se usa una agrupación de genes que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 9 de la lista de secuencias adjunta.

Con los métodos dados a conocer y la expresión dirigida de la protoiludeno sintasa y citocromo P450 monooxigenasas es posible producir y acumular protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide en el microorganismo huésped o en el medio en el que está contenido el microorganismo huésped. Debe entenderse que se haya dentro de la destreza y conocimiento de un experto en la técnica, complementar la(s) célula(s) del microorganismo huésped o cultivo de células del microorganismo huésped con precursores adicionales y/o esenciales u otras sustancias, nutrientes o metabolitos que pueden ser necesarios para completar o ayudar en la producción potenciada de protoiludeno hidroxilado o éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

Se dan a conocer en el presente documento protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide obtenidos mediante el método tal como se definió anteriormente. Los protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide así generados pueden usarse de manera eficaz como medicamentos, por ejemplo, para tratar cualquier infección o enfermedad provocada por bacterias.

Debe entenderse que la producción de protoiludenos hidroxilados o ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide según la invención puede realizarse por medio de una sobreexpresión heteróloga u homóloga del polinucleótido que codifica la protoiludeno sintasa. Los sistemas y métodos, así como las respectivas células huésped adecuadas, serán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de las enseñanzas de esta invención.

Se derivan ventajas adicionales de la descripción de las realizaciones y los dibujos adjuntos.

No hace falta decir que las características mencionadas anteriormente y las características que aún deben explicarse a continuación pueden usarse no sólo en las combinaciones especificadas respectivamente, sino también en otras combinaciones o por sí mismas, sin apartarse del alcance de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Varias realizaciones de la invención se ilustran en las figuras y se explican con más detalle en la siguiente descripción. En las figuras:

la figura 1 muestra un esquema de la síntesis de meleólido I que implica la parte de la síntesis de terpeno que comienza con la ciclación de difosfato de farnesilo a 6-protoiludeno, seguida por la oxigenación por medio de citocromo P450 monooxigenasas; la etapa final es la unión de ácido orselínico obtenido de la biosíntesis de policétido mediante una aciltransferasa;

la figura 2 muestra un esquema de la parte de biosíntesis de terpeno de la agrupación de genes de meleólido; la agrupación contiene la protoiludeno sintasa, cuatro citocromo p450 monooxigenasas y dos proteínas hipotéticas (figura 2A); las figuras 2B a 2E presentan las secuencias de las cuatro citocromo P450 monooxigenasas identificadas;

la figura 3 muestra resultados de inmunotransferencia de tipo Western de diferentes muestras de preparación de proteínas microsomales de citocromo P450 monooxigenasa CYP-Arm 1 a 4 que expresan clones de Saccharomyces cerevisiae y el control negativo;

la figura 4 muestra un ensayo no radiactivo y análisis de CG/EM de extracto de disolvente obtenido de alimentación in vivo con 6-protoiludeno: el extracto de la alimentación in vivo del clon que expresa CYP-Arm3 (B) revela un pico adicional en comparación con el control negativo (A) a un tiempo de retención de 10,6 min;

la figura 5 muestra un esquema de la levadura de panadería de gemación Saccharomyces cerevisiae para la producción de un supuesto hidroxiprotoiludeno;

la figura 6 muestra un esquema que presenta la estructura de hidroxiprotoiludeno obtenido de fermentación que se elucidó mediante espectroscopía de RMN como 8-hidroxi-protoiludeno.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La figura 1 muestra un dibujo esquemático de algunos representantes de ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, que se producen por miembros del género Armillaria. Los dos tipos de ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se dividen según la posición del doble enlace en armililorselinatos y meleólidos (figura 1).

Material y métodos

Cepas y condiciones de crecimiento: se cultivó la cepa de Armillaria gallica FU02472 tal como se describió previamente (Engels et al., “Cloning and Characterization of an Armillaria gallica cDNA encoding protoilludene synthase, which catalyzes the first committed step in the synthesis of antimicrobial melleolides, J. Biol. Chem.

286:6871-6878 (2011)). Se obtuvo la cepa de levadura S. cerevisiae CEN.PK2-1C (MATa, ura3-52, trp1-289, Leu2-3_112, his3 A1, MAL2-8c, SUC2) de EUROSCARF (EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis) Universitat Frankfurt (Frankfurt am Main, Alemania) y se mantuvo en agar de medio mínimo SC (Engels et al., “Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards TAxol production”, Metab. Eng.

10, 201-206 (2008)). Se usó medio YP tamponado (triptona al 2% p/v, extracto de levadura al 1% p/v y MES 50 mM, pH5,5) con glucosa al 2% p/v en cultivo discontinuo y galactosa al 2% p/v en fermentación semicontinua para inducción de la expresión impulsada por el promotor Gal1. Se realizó la transformación de S. cerevisiae usando el método de acetato de litio con selección previamente descrito (Engels et al., 2008).

Aislamiento de ADN genómico y construcción de bibliotecas: se aisló ADN genómico de Armillaria gallica usando el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (Murray y Thompson, 1980). Para la construcción de bibliotecas genómicas se usaron el kit de vector Lambda DASH II/BamHI en combinación con los extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold según las pautas del fabricante (Stratagene, Heidelberg, Alemania). Para la construcción de una biblioteca de “paseo” (walking) de genoma de A. gallica, se usó el kit Clontech (Saint-Germainen-Laye, Francia) GenomeWalker™Universal según el protocolo del fabricante.

Examen de bibliotecas, secuenciación y paseo genómico: se transfirieron plagas de fago a membranas de nailon cargadas (GE Healthcare) y se examinaron usando sondas de ácido nucleico marcadas con 32P. Para la prehibridación e hibridación Roti®Hybrid Quick (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) complementada con ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml. Para el marcaje de las sondas, se usó el kit de marcaje de ADN DecaLabel™ (Fermentats, St. Leon-Rot, Alemania; desde 2010 Thermo Fisher Scientific). Las membranas se hibridaron durante 15 h a 65°C y luego se lavaron cuatro veces con tampón de hibridación Roti®Hybrid Quick diluido (Roti®Hybrid Quick:H²O 1:2 durante 30 min, 1:5 durante 30 min y 1:10 dos veces durante 10 min). Las membranas se expusieron entonces a película de rayos X a -80°C durante 4 días. Entonces se secuenciaron cósmidos positivos aislados mediante paseo con cebadores. Los fragmentos obtenidos de la amplificación por PCR del paseo genómico se subclonaron para secuenciación de ADN en el kit de clonación Zero Blunt® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

Expresión heteróloga de citocromo P450 en levadura y pruebas funcionales por medio de alimentación in vivo: se clonaron las cuatro monooxigenasas dependientes del citocromo P450 de A. gallica por medio de clonación Gateway en el vector de expresión de levadura inducible de galactosa pYES-DEST52 (Invitrogen). Para la expresión heteróloga de las citocromo P450 monooxigenasas, se usó la cepa de levadura haploide CEN.PK2-1C.

Para mejorar la reducción de la enzima de citocromo P450 heterólogo en levadura, se clonó NADPH:citocromo P450 reductasa de Taxus chinensis (Jennewein et al., “Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductase with cytochrome P450 oxigenases involved en Taxol biosynthesis” Biotechnol. Bioeng. 89:588-598 (2005)) en el vector de expresión de levadura pCM183 para coexpresión heteróloga. Para la preparación de la fracción microsómica de levadura se usaron aproximadamente 5 g (peso húmedo) de biomasa de levadura recombinante inducida con galactosa para la preparación de esferoblastos. Después de la alteración de los esferoblastos usando perlas de vidrio, se limpió el extracto bruto resultante mediante centrifugación y se recogieron membranas ER del sobrenadante por medio de una ultracentrifugación 105.000xg durante tres horas. Para las pruebas funcionales por medio de alimentación in vivo, se coexpresaron de manera heteróloga las citocromo P450 monooxigenasas de A. gallica con la citocromo P450 monooxigenasa de T. chinensis. Para las cepas inducidas con galactosa se usó o bien 6-protoiludeno frío o bien [3H]-6-protoiludeno marcado con tritio. Después de incubación durante la noche, se añadió 1 ml de salmuera a los cultivos de células de levadura inducidos y se extrajo el cultivo tres veces con 5 ml de npentano. Se agruparon y se concentraron las fracciones de disolvente orgánico para radiocromatografía en capa fina (CCF) o análisis de CG/EM.

Fermentación de S. cerevisiae recombinante para la síntesis total de hidroxiprotoiludeno: para la biosíntesis total de cantidades suficientes de hidroxiprotoiludeno para elucidación de la estructura por medio de análisis de RMN, se transformaron las cepas de levadura CEN.PK2-1C que coexpresan la citocromo P450 monooxigenasa CYP-Arm3 de A. gallica con la NADPH:citocromo P450 reductasa de T. chinensis con una versión truncada de la HMG-CoA reductasa 1 de levadura (Dimster-Denk et al., “Feedback regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in Saccharomyces cerervisiae”, Mol.Biol.Cell 5:655-665 (1994)) clonadas en el vector pRS315 que contiene un promotor PGK y terminador de la transcripción cyc1. Se clonó protoiludeno sintasa de A. gallica en el vector pRS423 (que complemente la auxotrofía de histidina de levadura CEN.PK2-1C) que contiene un promotor Gal1 y un terminador de la transcripción cyc1 (ambos obtenidos del vector pYES-DEST52).

Espectrometría por RMN: se registraron todos los espectros de RMN en un espectrómetro de RMN de 500 MHz DRX de Bruker usando una sonda BBO de 5 mm con un gradiente en z. Se disolvieron muestras de hidroxiprotoiludeno en diclorometano deuterado hasta una concentración final de aproximadamente 50 mM y se calibraron con respecto a las señales de disolvente a 5,32 ppm y 54,00 ppm, respectivamente. Se adquirió espectro de 13C-RMN mediante 1000 tránsitos con un pulso de 30° y un retardo de 2 segundos. Se adquirió el 13C-DEPT-135 mediante 400 tránsitos. Se adquirieron todos los espectros bidimensionales usando programas de pulso convencional de BRUKER. Se midieron los espectros dQF-COSY y gs-NOESY con 512 incrementos con dos o cuatro tránsitos por incremento, respectivamente. Se usó un tiempo de mezclado de 600 ms para el espectro NOESY. Se midió la correlación heteronuclear mediante espectros gs-HSQC y gs-HMBC, se adquirió con 512 incrementos con cuatro y ocho tránsitos por incremento, respectivamente. Ambos espectros se optimizaron para acoplamientos 1J y nJ de 140 Hz y 8 Hz, respectivamente. Se procesaron los datos usando software TopSpin 1.3 (Bruker Biospin) y MestReNova 8.0 (MestreLab Research).

Resultados

Aislamiento de agrupación de genes biosintética usando examen de biblioteca de fagos y paseo genómico Para el aislamiento de la agrupación de genes de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se construyó una biblioteca de fatos de ADN genómico de Armillaria gallica; se realizó el examen usando protoiludeno sintasa de A. gallica como sonda. Se usaron dos de las placas positivas obtenidas de la segunda ronda de examen para aislamiento de ADN de cósmido. La digestión de restricción del ADN de cósmido obtenido mostró patrones de fragmento idénticos que condujeron a la conclusión de que ambos cósmidos son idénticos. El inserto de uno de los cósmidos (cósmido 5.1) se secuenció entones mediante paseo con cebadores que reveló un fragmento de 22,902 kb.

El análisis de los datos de secuencia obtenidos identificó la secuencia genómica de protoiludeno sintasa aislada previamente y tres secuencias con alta homología con monooxigenasas dependientes del citocromo P450 de las cuales una parece ser una secuencia parcial. Además de la protoiludeno sintasa y las citocromo P450 monooxigenasas, se identificaron dos secuencias con funciones desconocidas (marcadas como proteínas hipotéticas) y una secuencia con alta homología con una GMC oxidorreductasa en el fragmento de ~ 23 kb.

Con los ésteres arílicos de tipo protoiludeno oxigenándose en hasta ocho posiciones, la identificación de tres citocromo P450 monooxigenasas similares asociada estrechamente con la protoiludeno sintasa ya proporcionó una primera indicación de un posible agolpamiento de la ruta biosintética en A. gallica.

A continuación se construyó una biblioteca de paseo genómico ligando fragmentos adaptadores de ADN con ADN genómico de A. gallica digerido por restricción y mediante secuenciación de los fragmentos de PCR obtenidos, pudieron completarse las citocromo P450 monooxigenasas parciales encontradas del inserto de cósmido de la secuencia. Entonces se usó parte de la secuencia recién identificada para examinar 1,7 x 104 unidades formadoras de placa adicionales de la biblioteca de fagos genómica. El examen dio como resultado un clon que también demostró ser positivo en una posterior segunda ronda de examen. La secuenciación del inserto de cósmido reveló un fragmento genómico de A. gallica de 16,27 kb que contenía una citocromo P450 monooxigenasa adicional (denominada CYP-Arm1) además de tres supuestos genes con homología con una endonucleasa de reparación de ADN, un activador de la transcripción y una transcriptasa inversa. Un intento de paseo con cebadores 3' al fragmento de cósmido 5.1 no reveló más genes con posible función en la biosíntesis de terpenoides o policétido. La figura 2 muestra el esquema de la parte de biosíntesis de terpeno de la agrupación de genes de meleólido obtenida del examen de la biblioteca de ADN genómico con sondas radiactivas (protoiludeno sintasa); la agrupación contiene la protoiludeno sintasa (“Pro 1”), cuatro citocromo P450 monooxigenasas, denominadas “CYP-Arm1”, “CYP-Arm2”, “CYP-Arm3” y “CYP-Arm4”, y dos proteínas hipotéticas.

Amplificación de las citocromo P450 monooxigenasas identificadas de la biblioteca de ADNc de A. gallica

La secuenciación del ADN genómico clonado reveló un alto grado de fragmentaciones de intrones/exones de las cuatro secuencias de citocromo P450 monooxigenasa genómicas encontradas. La secuencia genómica de citocromo-P450 CYP-Arm1 que se extiende más de 2158 pb contiene 10 intrones, con exones que varían de tamaño desde 38 pb hasta 537 pb. Las secuencias genómicas de CYP-Arm2 y CYP-Arm3 muestran alta similitud, conteniendo ambas 11 intrones y presentando una identidad de secuencia global del 73,8%. El análisis de CYP-Arm4 identificó un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 509 aminoácidos, se interrumpe el ORF deducido en 14 intrones dando exones de 4 a 190 pb de longitud. El análisis adicional de las citocromo P450 monooxigenasas aisladas en los niveles de secuencia de aminoácidos presenta una similitud de secuencia de aminoácidos de CYP-Arm1, CYP-Arm2 y CYP-Arm 3 en comparación con CYP-Arm 4 del 32,5%, el 34,0% y el 34,0%, respectivamente.

Basándose en estas secuencias predichas, se amplificaron los correspondientes ADNc mediante reacción en cadena de la polimerasa a partir de una biblioteca de ADNc de A. gallica. La secuenciación de varios fragmentos de PCR subclonados reveló una fracción significativa de los clones de ADNc que todavía contienen intrones. Para las cuatro citocromo P450 monooxigenasas, sin embargo, se obtuvieron clones de ADNc correctos y se subclonaron para determinar la expresión heteróloga en Saccharomyces cerevisiae. Para facilitar el análisis de la correcta expresión heteróloga y ubicación en el retículo endoplasmático de levadura, las cuatro citocromo P450 monooxigenasas se marcaron con histidina en el extremo C-terminal.

Expresión heteróloga de citocromo P450 monooxigenasas y examen funcional.

Para la expresión heteróloga, los cuatro constructos de expresión construidos que contienen las citocromo P450 monooxigenasas aisladas de A. gallica se transformaron en CEN.PK2-1C de levadura. Tras la inducción de la expresión heteróloga con L-galactosa, se recogieron las células de levadura recombinantes y se examinó la ubicación correcta del P450 expresado de manera heteróloga por medio de la preparación de proteína microsómica de levadura. El análisis de inmunotransferencia que usa un anticuerpo primario específico de hexa-histidina mostró la ubicación correcta de la proteína heteróloga expresada (con un peso molecular esperado de 57 a 60 kDa) con respecto a la fracción microsómica (véase la figura 3).

Para pruebas funcionales de las monooxigenasas dependientes del citocromo P450 clonadas, la NADPH:citocromo P450 reductasa de Taxus chinensis se coexpresó en la levadura recombinante. Para un examen funcional inicial del citocromo P450 clonado de A. gallica se tomó un enfoque de alimentación in vivo. Para el experimento de alimentación in vivo, se le añadieron 15.000 cpm de 6-protoiludeno marcado con 3H a un cultivo de levadura de 5 ml inducido y los cultivos se incubaron durante la noche. Entonces se analizaron los extractos orgánicos de los cultivos de levadura individuales por medio de radiocromatografía en capa fina (radio-CCF). El análisis de radio-CCF para CEN.PK2-1C que expresa la CYP-Arm3 junto con la citocromo P450 reductasa de T. chinensis mostró una conversión casi completa del 6-protoiludeno marcado con tritio de alimentación en un supuesto producto hidroxilado más polar. Además, con CYP-Arm2, se observó un producto más polar, sin embargo la conversión se produjo en este caso en un grado mucho menor. De manera interesante, la reextracción del 6-protoiludeno proporcionado a partir del cultivo de células de levadura usando n-pentano demostró ser difícil, sin embargo parecía mejorar significativamente para derivados hidroxilados.

Para análisis adicional usando CG/EM, se alimentaron las cepas de levadura recombinante con 6-protoiludeno “frío” derivadas de la reacción de síntesis basada en biocatálisis usando difosfato de farnesilo y protoiludeno sintasa recombinante. Los cultivos de levadura recombinante inducidos y alimentados in vivo se extrajeron entonces de manera similar con n-pentano y se analizó el extracto orgánico por medio de CG/EM. El CG-cromatograma de CYPArm3 mostró en comparación con el control negativo (que sólo expresa la NADPH:citocromo P450 reductasa de T. chinensis) un pico adicional (figura 4). El espectro de masas obtenido mostró masas correspondientes a un producto de hidroxiprotoiludeno.

Biosíntesis total de hidroxiprotoiludeno mediante S. cerevisiae recombinante.

A continuación, se elucidó la estructura del posible producto de hidroxiprotoiludeno mediante análisis por RMN. Puesto que para la elucidación estructural adecuada del compuesto se requieren varios miligramos de producto puro, fue necesario obtener suficiente material. Para este fin, y para la purificación del compuesto a homogeneidad y análisis, se modificó por ingeniería genética una cepa de Saccharomyces cerevisiae que podía realizar biosíntesis total del supuesto hidroxiprotoiludeno.

Para la fermentación total, se empleó la cepa de S. cerevisiae CEN.PK2-1C transformada con vectores de expresión episomales que contienen la NADPH:citocromo P450 reductasa de T. chinensis, las citocromo P450 monooxigenasas CYP-Arm3, una versión truncada de la HMG-CoA reductasa (tHMGR) de levadura y la protoiludeno sintasa de A. gallica. Se coexpresó la NADPH:citocromo P450 reductasa de T. chinensis de manera heteróloga con el fin de aumentar la reducción y, por tanto, la actividad catalítica de la citocromo P450 monooxigenasa. Se incluyó la versión truncada, desregulada de la HMG-CoA reductasa de levadura para aumentar el flujo a través de la ruta de ácido mevalónico para proporcionar difosfato de farnesilo adicional para reforzar la biosíntesis de protoiludeno (véase la figura 6).

La tabla 1 a continuación muestra un resumen de los plásmidos transformados y los genes expresados de manera heteróloga en la cepa de S. cerevisiae recombinante para la producción de hidroxiprotoiludeno:

Tabla 1:

Se llevó a cabo la fermentación para la síntesis total del supuesto producto de hidroxiprotoiludeno usando la cepa metabólica modificada por ingeniería genética en una escala de 2,8 l. Para la purificación del producto CYP-Arm3, se empleó el sobrenadante del cultivo, separado de la biomasa.

Purificación de hidroxiprotoiludeno y elucidación de la estructura

Se extrajo el sobrenadante de cultivo obtenido mediante adición de polvo de sílice C18 RP e incubación a 4°C durante Se recuperó el material de sílice C18 RP mediante filtración y se secó mediante liofilización. Se realizó la extracción usando un aparato Soxhlet con n-pentano como disolvente orgánico. Se concentró el extracto resultante a vacío. Entonces se purificó el extracto en bruto mediante cromatografía sobre gel de sílice 60, gel de sílice con funcionalidad cloropropilo y mediante HPLC semipreparativa de fase inversa. Después de tres etapas de purificación, pudieron obtenerse aproximadamente 40 mg de producto puro para análisis de RMN.

Para la determinación estructural se realizaron tanto análisis de RMN de 1H como de 13C. La tabla 2 a continuación muestra los desplazamientos de RMN de 1H y de 13C completos y sus asignaciones como resultado del análisis de espectros de RMN bidimensionales:

Tabla 2:

El análisis mostró que el compuesto aislado era 8-hidroxi-6-protoiludeno, que es por lo que CYP-Arm3 ha demostrado actuar como una 8-alfa-hidroxilasa. Además, los resultados mostraron, por primera vez, la caracterización funcional, junto con la elucidación de la estructura molecular del producto, de una catalización mediada por citocromo P450 monooxigenasa a un alcohol de sesquiterpeno a partir de un basidiomiceto.

En una siguiente etapa, se elucidó si la expresión adicional de CYP-Arm2 podría conducir a una estructura de protoiludeno dihidroxilada.

Para este fin, el conjunto de plásmidos que iba a emplearse tuvo que adaptarse para la expresión de un quinto gen foráneo. La siguiente tabla 3 muestra los plásmidos transformados y los genes expresados de manera heteróloga en la cepa de S. cerevisiae recombinante para la producción de protoiludeno dihidroxilado:

Tabla 3:

Para la fermentación de un protoiludeno dihidroxilado, se llevó a cabo una fermentación a una escala de 3 l, de manera análoga a la fermentación descrita anteriormente para la producción del 8-alfa-6-protoiludeno monohidroxilado. Para la purificación del producto, el sobrenadante de cultivo, separado de la biomasa, se sometió a una extracción con cloroformo. Se analizó el extracto concentrado por medio de CG/EM y CL/EM/EM, de manera análoga al proceso de aislamiento del 8-alfa-6-protoiludeno.

Purificación de protoiludeno dihidroxilado y elucidación de la estructura

Se extrajo el sobrenadante de cultivo obtenido en cloroformo-d1 y se secó al aire, se disolvió en disolvente deuterado, y se analizó por medio de CG/EM.

Para la determinación estructural adicional, se realizaron análisis tanto de RMN de 1H como de 13C directos. La tabla 4 a continuación muestra los desplazamientos de RMN de 1H y de 13C completos y sus asignaciones como resultado del análisis de espectros de RMN bidimensionales:

Tabla 4:

El análisis de los espectros mostró que el compuesto aislado era 8-alfa-13-hidroxi-6-protoiludeno. Como consecuencia, la citocromo P450 monooxigenasa CYP-Arm2 se ha caracterizado que actúa como una 13-hidroxilasa.

Con la biosíntesis introducida de manera heteróloga descrita, se ha producido por primera vez un alcohol de sesquiterpeno dihidroxilado en S. cerevisiae y se ha caracterizado estructuralmente.

Es posible la identificación de la agrupación de genes de A. gallica descrita en el presente documento, la identificación de otras rutas de biosíntesis de sesquiterpenos en basidiomicetos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Microorganismo huésped que se transforma para comprender y expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa y que comprende o consiste en una secuencia nucleica seleccionada del grupo que consiste en (i), (ii) y (iii):

(i): a) SEQ ID NO 5 a 8 de la lista de secuencias adjunta; b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO 5 a 8; c) secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ácido nucleico definidas en a) y b) o sus hebras complementarias;

(ii) un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de (i), que codifica un polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa, estando la secuencia de ácido nucleico unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un microorganismo huésped transformado con el vector, preferiblemente el vector es un vector de expresión,

(iii) SEQ ID NO 9 de la lista de secuencias adjunta;

transformándose adicionalmente el microorganismo huésped para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, y

seleccionándose del grupo que consiste en hongos, incluyendo levadura y bacterias.

2. Microorganismo huésped de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido con actividad citocromo P450 monooxigenasa se adapta al uso de codón de la respectiva célula.

3. Microorganismo huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el microorganismo de célula huésped se selecciona de Saccharomyces spp. en particular Saccharomyces cerevisiae; Escherichia coli; Aspergillus nidulans; homobasidiomicetos, en particular del género Armillaria, en particular Armillaria gallica, Armillaria mellea.

4. Microorganismo huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo huésped se transforma adicionalmente para comprender una protoiludeno sintasa, en particular una protoiludeno sintasa de uno de los siguientes: Armillaria spp., en particular de Armillaria gallica, y/o para expresar al menos uno de los siguientes: (i) una NADPH-citocromo P450 reductasa, en particular una NADPH:citocromo reductasa de Taxus chinensis.

5. Método para producir un protoiludeno hidroxilado y/o un éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, comprendiendo el método las etapas de

a) proporcionar un microorganismo huésped que se selecciona del grupo que consiste en hongos, incluyendo levadura y bacterias, y que se ha transformado para expresar de manera heteróloga SEQ ID NO 9, o para expresar de manera heteróloga al menos todo lo siguiente: i) una protoiludeno sintasa, y ii) al menos una citocromo P450 monooxigenasa, en la que la citocromo P450 monooxigenasa tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de

1) una de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4,

2) una secuencia de aminoácidos de una variante alélica de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8, o

3) una secuencia de aminoácidos de un ortólogo de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO 1 a 4, en la que dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra opuesta de una molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 5 a 8,

en el que al menos uno de (i) o (ii) es ajeno a dicho microorganismo huésped, y

en el que el microorganismo huésped se transforma adicionalmente para expresar una 2-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMGCoA) reductasa;

b) hacer crecer, en condiciones de nutrientes adecuadas que permiten la producción de los ésteres arílicos de tipo protoiludeno sesquiterpenoide, el microorganismo huésped proporcionado en la etapa a); produciendo así el protoiludeno hidroxilado y, según sea el caso, el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide.

6. Método de la reivindicación 5, en el que el microorganismo huésped se ha transformado con SEQ ID NO 5 a 8 de la lista de secuencias adjunta para expresar una citocromo P450 monooxigenasa.

7. Método de la reivindicación 5 ó 6, que comprende además la etapa c):

c) aislar dicho protoiludeno hidroxilado y/o dicho éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide del microorganismo huésped o del medio de crecimiento.

8. Método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la protoiludeno sintasa y/o la citocromo P450 monooxigenasa es una protoiludeno sintasa y/o una citocromo P450 monooxigenasa, respectivamente, de uno de los siguientes: Armillaria spp., en particular de Armillaria gallica.

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que en la etapa a) se proporciona un microorganismo que se ha transformado adicionalmente para expresar una NADPH-citocromo P450 reductasa, preferiblemente una NADPH:citocromo reductasa de Taxus chinensis.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el éster arílico de tipo protoiludeno sesquiterpenoide se selecciona de meleólidos y armililorselinatos.

11. Método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el protoiludeno hidroxilado se selecciona de protoiludeno monohidroxilado, en particular 8-hidroxi-6-protoiludeno, protoiludeno dihidroxilado, en particular 8,13-hidroxi-6-protoiludeno.