WO2009149578A1 - Uso de gen en la síntesis de astaxantina - Google Patents

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Jennifer Alcaino Gorman
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Victor Cifuentes Guzman
Jennifer Alcaino Gorman
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)

Definitions

  • Yeast basidiomycete Xanthophyllomyces dendrorhous synthesizes carotenoids, mainly xanthophyll astaxanthin, of great commercial interest due to its use as a food supplement in the aquaculture industry.
  • the present invention describes the genetic material and the polypeptide it encodes, which has cytochrome P450 reductase activity and participates in the synthesis of astaxanthin from beta-carotene, acting as an electron donor in the reaction catalyzed by the enzyme astaxanthin synthase .
  • Carotenes are a group of natural pigments produced mainly by plants, yeasts and microalgae. Particularly xanthophyll astaxanthin is a compound widely found in nature, it has It is of great commercial importance since it is used as a food additive to pigment trout and salmon meat in aquaculture (Johnson et al. 1977). On the other hand • and due to its highly antioxidant activity, its benefits for human health have been observed, for example, in the prevention of cardiovascular diseases, it favors the immune system, bioactivity against Helicobacter pylori and cataract prevention (Higuera-Ciapara and cois. 2006).
  • astaxanthin Another way of obtaining astaxanthin is biosynthesis and extraction from microorganisms, in this sense the use of microalgae (Haematococcus pluvials) and yeast ⁇ Xanthophyllomyces dendrorhous) are more important.
  • pluvialis has been recognized for many years as an accumulator of the astaxanthin carotenoid, under certain stress conditions, such as high light intensity and / or nitrogen limitation, the cells of this algae form cysts and accumulate high amounts of astaxanthin (> 1% dry weight) (Margalith, 1999), changing its color from green to red. This microalgae has recently received much attention due to its ability to synthesize and accumulate large amounts of astaxanthin during and at the end of its growth phase (Margalith, 1999).
  • H. pluvialis as a source of astaxanthin was poor due to the obtaining of pigments of inferior quality than the commercially required, given the high percentage of esterification of the obtained astaxanthin (Sominer et al 1991).
  • the astaxanthin produced by the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is 100% free (not esterified) and is composed of the 3R, 3R 'optical isomer and the "trans" geometric isomer, which gives it a great comparative advantage over the produced by the microalgae (Andrewes and Starr, 1976).
  • microalgae are the natural source with the highest known astaxanthin content, the interest for commercial exploitation of these organisms has not been sufficient due to the high rates of contamination with protozoa and a lower development of culture technologies , compared to heterotrophic organisms such as yeasts.
  • Figure 1 shows the route identified for X. dendrorhous and details those genes that have been isolated, sequenced, characterized and published (Kajiwara et al., 1997, Niklitschek and cois., 2008, Verdoes and cois., 1999a; Alca ⁇ no, 2002, Verdoes and cois., 1999b; León, 2000).
  • astaxanthin from beta-carotene requires two Enzymatic activities: Ketolase that incorporates a keto group at positions 4 and 4 'of the beta-carotene and hydroxylase molecule that introduces a hydroxyl group at positions 3 and 3' of beta-carotene (Cunningham and Gantt 1998; Linden 1999) . Unlike other organisms where two independent genes participate in this step, in X. dendrorhous a crtS gene has been isolated that encodes an astaxanthin synthase enzyme which exhibits both activities (EP 1.035.206; 0j ima and cois., 2006; ⁇ lvarez and cois., 2006).
  • cytochrome P450 monooxygenase enzymes require an electron donor system that in eukaryotes is a cytochrome P450 Reductase (CPR) protein (van den Brink et al., 1998).
  • CPR cytochrome P450 Reductase
  • Oj ima and cois (2006) described a work in which Escherichia was transformed coli with 3 plasmids compatible with each other, one of the plasmids contained the genes necessary for the synthesis of beta-carotene, another contained the crtS gene of X.
  • the present invention describes the sequence of the crtR gene and the polypeptide it encodes, which possesses Cytochrome P450 Reductase activity of X. dendrorhous.
  • This invention provides technical tools that allow transforming microorganisms either by enhancing their natural ability to produce astaxanthin or by creating new metabolic pathways in other non-carotenogenic organisms that allow the production of this pigment in a commercially attractive manner.
  • the present invention relates to the genetic material that codes for the cytochrome P450 reductase enzyme (CPR), genetic material being understood as the nucleic acid sequence of the genomic DNA type, complementary DNA, messenger RNA and the respective allelic variants encoding a polypeptide with CPR activity, useful for the production of astaxanthin by transforming host organisms that may or may not be natural producers of said carotenoid.
  • CPR cytochrome P450 reductase enzyme
  • Figure 1 Main steps of the astaxanthin biosynthesis path in X. dendrorhous.
  • the structural genes of the pathway that have been cloned and sequenced are indicated. It shows the color of the colonies that they accumulate intermediate carotenoids in the biosynthesis pathway. The color is an indicator of the type of pigment that is being obtained in the different stages of the synthesis.
  • the underlined sequence fragments correspond to the exons of the gene.
  • those nucleic acids identified as donor and receptor sites for splicing processes stand out. Restriction sites for the Bam ⁇ l enzyme are indicated.
  • FIG. 3 Comparison of nucleotide sequences of NADPH-cytochrome P450 reductase genes from different fungi.
  • C_echinulata Cunninghamella echinulata (Zygomycete) GenBank Access No.: AF195660.
  • S_cerevisiae Saccharomyces cerevisiae (Ascomycete) GenBank Access No.: D13788.
  • R_minuta Rhodotorula minuta (Basidiomycete) GenBank Accession No.: AB055119. Gray shows where some of the splitters described in table 1 align.
  • FIG. 5 Amino acid sequence deduced from the coding region of the crtR gene.
  • the conserved domains of the protein stand out, in order they are: Transmembrane domain, FMN binding domain, FAD binding domain and NAD (P) H binding domain, identified by the BlastP program.
  • Figure 7 Scheme of mutation events of the crtR gene by homologous recombination in wild strains UCD67-385 (385) and CBS6938 (CBS) of X. dendrorhous, where A shows the transformation of strain UCD67-385. and B shows transformation of strain CBS6938.
  • B CBS6938 PCR and CBSTr transformant.
  • CBSTr transformant PCR Lane: (1): CBSTr + SEQ754-hygSecR DNA, (2): CBSTr + HF + SEQ35 DNA, (3): CBSTr + HygSecF + M13F DNA, (4): CBSTr + M13R + SEQ15 DNA, (5): CBSTr + SEQ20 + SEQ50 and (6) DNA: CBSTr 4- SEQ30 + SEQ50 DNA.
  • the present invention relates to a gene and an enzyme that is involved in the last stage of the synthesis of astaxanthin from beta-carotene.
  • the present invention provides a genomic DNA sequence (crtR gene) and complementary DNA encoding for an enzyme with cytochrome P450 reductase (CPR) activity responsible for delivering the electrons necessary for the incorporation of keto and hydroxyl groups to the beta-carotene molecule to obtain astaxanthin, this reaction is catalyzed by the enzyme astaxanthin synthase.
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • the present invention relates to the DNA sequences of the crtR gene of X. dendrorhous, in its preferred embodiment genomic DNA and complementary DNA sequences, as well as fragments of said gene, these being semi-degenerated or not.
  • the present invention relates to a genomic DNA sequence of the crtR gene, its complementary strand, its allelic variants and sequences represented with addition, insertion, deletion and / or substitution of one or more nucleotides encoding a polypeptide having CPR enzymatic activity. . Because the genetic code is degenerated, this invention also contemplates nucleic acid sequences that hybridize with the crtR gene, under conditions of standard strictness, such as that described by Sambrook and cois 2001. In its preferred embodiment, The DNA sequence corresponds to the SEQ1 and is characterized by coming from X.
  • nucleic acids described as donor and receptor sites for splicing processes are identified, said nucleic acids are labeled in black and underlined in the SEQl (figure 2).
  • the genomic DNA sequence of said gene is characterized by having 3 segments of the sequence corresponding to the exons, underlined in SEQl.
  • This invention also considers a complementary DNA sequence, its complementary strand and the messenger RNA sequence that generates it, its allelic variants and sequences represented with addition, insertion, deletion and / or substitution of one or more nucleotides encoding a polypeptide that have CPR enzyme activity. Because the genetic code is degenerated, this invention also contemplates nucleic acid sequences that hybridize with the complement of the crtR gene, under conditions of standard strictness, such as that described by Sambrook et al. In its preferred embodiment said complementary DNA is synthesized from the messenger RNAs generated from the crtR gene, and refers to SEQ2 ( Figure 4), said complementary DNA represents the coding segment of the crtR gene and has a length of 2,241 base pairs.
  • the invention also relates to methods of obtaining DNA sequences from the crtR gene of X. dendr ⁇ rhous.
  • said method corresponds to the identification of the genomic DNA of the gene of interest, or part thereof, using semi-degenerated fragments.
  • the gene of interest is identified with fragments of the sequence isolated from the previous stage.
  • consensus sequences of segments conserved among genes equivalent to those of interest from other species are used.
  • the invention comprises the comparison by means of bioinformatics techniques of known sequences of cytochrome P450 reductase genes from other yeasts, the identification of conserved segments and the design, based on them, of short acid fragments. nucleic (between 15 and 30 base pairs), useful for the identification and amplification of DNA sequences.
  • nucleic between 15 and 30 base pairs
  • the DNA fragments described in Table 1 were designed.
  • the splitters from SEQlO to SEQ13 were used to identify clones of genomic DNA and complementary DNA libraries of X. dendrorhous carrying fragments of the crtR gene, using the PCR technique. The rest of the mentioned starters were used for the complete sequencing of the crtR gene. Table 1: DNA fragments useful for the identification and amplification of the crtR gene.
  • this invention relates to an amino acid sequence with cytochrome P450 reductase activity, corresponding in its preferred modality to that described in SEQ3 ( Figure 5), and encoded by the crtR gene, messenger RNA or complementary DNA generated from said gene, its complementary strands, allelic variants and sequences represented by SEQl or SEQ2 with addition, insertion, deletion and / or substitution of one or more nucleotides, or nucleic acid sequences that hybridize under conditions of standard strictness with the sequence genomic or complementary DNA (eg conditions detailed by Sambrook et al. 2001).
  • the amino acid sequence of the CPR activity polypeptide has 746 amino acids, SEQ3 ( Figure 5), by comparisons using bioinformatic tools, certain conserved domains marked in SEQ3 were identified, and corresponding, in order of appearance to: transmembrane domain, FMN binding domain, FAD binding domain and domain binding to NAD (P) H.
  • the present invention is also directed to variants of the SEQ3 polypeptide.
  • Said variations refer to the addition, insertion, deletion and / or substitution of one or more amino acids in said sequences, while these derivatives maintain the described activity.
  • Such activity can be measured by any essay known in the state of the art or specifically described in this document.
  • Such variants can be synthesized by chemical synthesis or by recombination based on the available DNA sequences, using state-of-the-art methods.
  • the present invention relates to the use of the CPR polypeptide, whose preferred modality is SEQ3, for obtaining modified organisms in order to increase the production of astaxanthin or generate new metabolic pathways. conducive to its bioproduction in appropriate organisms.
  • the DNA sequence coding for the modified SEQ3 sequence is used to suppress the cytochrome P450 reductase function in astaxanthin producing organisms in conjunction with astaxanthin synthase, this use is suggested for research purposes.
  • the invention comprises the suppression of the functionality of the crtR gene in yeast X. dendrorhous and the evaluation of transformed strains at phenotypic and genotypic levels.
  • the deletion of the crtR- gene is performed by replacing the native gene in wild strains of X. dendrorhous with a module that has a fragment of said gene interfered with by a selection marker, preferably antibiotic resistance genes.
  • said replacement of the native gene was performed by homologous recombination using an appropriate vector containing the module described above, particularly, the vectors described in Figure 6 were designed and two strains of native X.
  • dendrorhous were transformed with them obtaining two transformed strains (CBSTr and T13) that have a capacity reduced production of astaxanthin compared to the native strains from which they come.
  • the phenotypic evaluation of the transformed strains is carried out by visual inspection of the color of the yeast in culture and its comparison with the native strain, in another modality, by identifying the pigments it contains, preferably using the HPLC technique (High Performance Liquid Chromatography).
  • this invention contemplates the analysis and comparison of the genomic sequence corresponding to this gene by means of molecular biology techniques present in the state of the art, preferably through its PCR amplification using the fragments described in Table 1, especially the SEQ14, SEQ15, SEQ20, SEQ30, SEQ35, SEQ50, SEQ76 fragments, and those described in Table 3.
  • the present invention is also directed to a vector or plasmid comprising the DNA sequences described above and a host cell transformed or transfected with said DNA or a vector or plasmid described above.
  • this invention contemplates compositions, products and / or formulations comprising said vectors or plasmids, genomic DNA, complementary DNA and gene fragments described previously. Said compositions, products and / or formulations, as well as the sequences described above, can be used for research, production, analysis or molecular biology techniques existing in the state of the art. Preferably in the processes necessary for the transformation of organisms in order to obtain a modified production of astaxanthin and evaluation of said transformations.
  • the present invention contemplates the obtaining of recombinant organisms transformed from the vectors or plasmids and the DNA they contain, and the culture of these organisms transformed under conditions that lead to the production of said polypeptide or to the production of astaxanthin.
  • polypeptide contemplated in the present invention and the sequences encoding it are useful for genetically manipulating naturally producing organisms of astaxanthin in order to enhance its biosynthetic abilities or generate the biosynthetic pathway in other organisms, which due to their growth qualities, culture conditions, bioavailability and others can be productively more attractive for obtaining said pigment, as is the case of Saccharomyces cerevisiae.
  • Example 1 Obtaining the genomic DNA sequence of the crtR gene from X. dendrorhous.
  • oligonucleotides were designed to amplify parts of the crtR gene using the PCR technique (Chain Polymerase Reaction). To this end, nucleotide sequences of CPR enzyme genes from Cunninghamella echinulata, Saccharomyces yeasts were compared.
  • the crtR gene was amplified from X. dendrorhous genomic DNA from wild strain UCD 67-385, using a PCR protocol under the following conditions: initial denaturation 95 ° C by 3 minutes, 35 cycles: denaturation at 94 0 C for 30 seconds, alignment at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 0 C for 3 minutes.
  • the crtR gene contains BamHI sites in its sequence, therefore it was not possible to obtain a clone containing the complete crtR gene from the library used. However, two clones containing parts of the gene were obtained. One of them with an insert of 12820 bp that was completely sequenced and contains the crtR gene from nucleotide base No. 82 of exon 1 to the end of the gene, the other clone contains an insert of approximately 6500 bp that was completely sequenced and the promoter region of the crtR gene and 88 bp of exon 1.
  • the protocol used for these experiments was the following: The genomic DNA of the UCD67-385 strain of X. dendrorhous was digested with different restriction enzymes and a 0.8% agarose gel electrophoresis was performed. The DNA was then denatured and transferred to a nylon membrane and hybridization was performed using a DNA fragment that corresponds to part of the crtR gene as a probe.
  • Membrane preparation and hybridization was performed according to standard methods Sambroock et al., 2001. Based on this background, a new partial library was constructed using fragments I left DNA from X. dendrorhous selected in sizes between approximately 6400 and 4400 bp, as a vector, pBluescript SK + and strain DH5 ⁇ of E. coli were used as host, the preparation This new library was made according to the manufacturer's instructions. Using this new library, inserts were amplified by PCR, using the SEQlO and SEQ13 splitter pairs. In this way a clone was obtained that contained the entire crtR gene (SEQl).
  • Example 2 Obtaining the complementary DNA sequence of the crtR gene from X. dendrorhous.
  • a complementary DNA library of X. dendrorhous was used, from which sequences were amplified by the PCR technique using the SEQlO and SEQ13 splitter pairs that hybridize with gene coding segments, whose size of amplified Expected from complementary DNA of the crtR gene is 338_pb.
  • the cDNA library was constructed using Stratagene's "pBluescript II XR cDNA library construction kit" commercial kit, using Escherichia coli strain XLlO-GOLD as a host, according to the manufacturer's instructions.
  • the conditions used for the PCR reactions were: initial denaturation 95 0 C for 3 minutes, 35 cycles: denaturation at 94 0 C for 30 seconds, alignment at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 0 C for 3 minutes. Then a final extension at 72 0 C for 10 minutes.
  • the amplifications obtained were loaded on a 0.8% agarose gel, identifying mixtures of positive clones for amplification of the complementary DNA of the crtR gene.
  • Example 3 Determination of the functional importance of the CPR polypeptide, encoded by the crtR gene, in the carotenogenic pathway of X. dendrorhous.
  • mutants were constructed by deletion of the crtR gene in wild strains of X. dendrorhous and the phenotypes and genotypes of the mutants were compared with the original strain.
  • a construction vector was inserted into a construct in which a DNA fragment containing the crtR gene was replaced by a module of resistance to the hygromycin B antibiotic. This module is composed of the hygromycin B antibiotic resistance gene. ⁇ hph), under the control of the TEF gene promoter (which encodes the translation elongation factor, EF-IcO and the terminator region of the GPD gene of X.
  • the CPRl .3 vector has a DNA fragment of X. dendrorhous, a segment contained between nucleotides 4531 and 9902 of the SEQl, was digested with the restriction endonucleases BsiWI or Ndel to generate a deletion in the crtR gene. The ends of the fragment obtained (containing the crtR deletion), were filled with the Klenow polymerase to enable the binding of the hygromycin resistance module whose ends are blunt. and obtained two clones: CPRl .3 ⁇ BsiWI + hyg and CPRl .3 ⁇ NdeI + hyg.
  • Strain UCD67-385 was transformed with a linear DNA fragment containing the deletion of the crtR gene and the hygromycin resistance module. This fragment was obtained from the digestion of the CPR1 .3 ⁇ BsiWI + hyg clone with the Smal and Spel endonucleases. By a double homologous recombination event, an allele of the crtR gene of strain UCD67-385 was replaced by the deletion, obtaining strain T13.
  • the strain CBS6938 was transformed with the clone CPRl .3 ⁇ NdeI + hyg (circular DNA) containing the deletion of the crtR gene and the hygromycin resistance module. By a homologous recombination event, the wild crtR gene was replaced with the mutated gene, obtaining the CBSTr strain.
  • Cells were harvested and resuspended in 25 ml of BD (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0, 25 mM ditiotritol [DTT]) buffer and incubated at 22 0 C for 15 minutes.
  • the cells are washed twice with 25 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ImM MgC12) and resuspended in 1 ml of STM buffer.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ImM MgC12
  • To transform, 60 ⁇ l of electrocompetent cells are mixed with 10 to 20 ⁇ g of transforming DNA in a volume of 5 ⁇ l.
  • Electroporation conditions are: 125 ⁇ iF, 600 ⁇ , 0.45 kV and then the cells resuspended in 1 ml of liquid YM medium and incubated at 22 0 C for 5 hours. Finally, the cells are plated with YM medium and 2% agar supplemented with 10 ug / ml of hygromycin B. Using this selection medium, clones were identified that possess the insert with the hygromycin resistance gene.
  • the CBSTr transformant accumulates beta-carotene and is unable to synthesize astaxanthin, unlike the wild strain from which it originates (CBS 6938), which produces astaxanthin and a minimum amount of Beta-carotene.
  • the T13 transformant reduced its production of astaxanthin by approximately 75% at the cost of an increase in the production of beta-carotene, to Unlike the wild strain from which it comes (UCD67-385), which produces high amounts of astaxanthin and minimal amounts of Beta-carotene (Figure 9).
  • the affected locus was analyzed by amplification of its inserts by PCR, using genomic DNA from the transformants and wild strains as a template.
  • PCR reactions were carried out with the following pairs of splitters: gdp rev + SEQ50, SEQ14 + Pef fwd, SEQ14 + SEQ50 and using as temperate the wild strain UCD 67-385, the transformed strain T13 and distilled water as a negative control.
  • PCR reactions were carried out with the following pairs of splitters: Pef fwd + SEQ35, gpd rev + SEQ30 and using the wild strain CBS 6938 as temperate, the transformed CBSTr strain and distilled water as a negative control,
  • the splitter pairs were used: SEQ75 + hygSecR, HF + SEQ35, HygSecF + M13F, M13R + SEQ15, SEQ20 + SEQ50 and SEQ30 + SEQ50, using the strain as tempered CBSTr transformed.
  • the PCR reactions were performed according to the following protocol: initial denaturation 95 0 C for 3 minutes , 35 cycles: denaturation at 94 0 C for 30 seconds, alignment at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 0 C for 3 minutes. Then a final extension at 72 0 C for 10 minutes and they were loaded in 0.8% agarose gels. The results obtained are shown in Figure 10 and the comparison between the sizes of the expected and obtained amplifications are shown in Table 3.
  • the hybridization experiments were performed by digesting the genomic DNA of the wild strains (UCD67-385 and CBS6938) and of the transforming strains (T13 and CBSTr) with different restriction endonucleases. Digestions were run on 0.8% agarose gels and then denaturated and transferred to nylon membranes for hybridization. The membranes were hybridized independently with two probes: 1) crtR gene amplified probe with SEQ4 and SEQ8, 2) hygromycin gene probe. Membrane preparation and hybridization was performed according to standard methods Sambroock et al., 2001.
  • the crtS gene of Xanthophyllomyces dendrorhous encodes a novel cytochrome-P450 hydroxylase involved in the conversion of beta-carotene into astaxanthin and other xanthophylls. Fungal Genet Biol. 43: 261-72.

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Abstract

Una secuencia de ADN que codifica para una enzima que tiene una actividad citocromo P450 reductasa que actúa como donador de electrones para la reacción catalizada por la enzima astaxantina sintasa y que transforma el beta-caroteno en astaxantina, preferiblemente en X. dendrorhous.

Description

USO DE GEN EN LA SÍNTESIS DE ASTAXANTINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La levadura basidiomicete Xanthophyllomyces dendrorhous sintetiza carotenoides, principalmente la xantofila astaxantina, de gran interés comercial debido a su uso como suplemento alimenticio en la industria acuicola.
En la presente invención se describe el material genético y el polipéptido que codifica, el cual posee actividad citocromo P450 reductasa y participa en la síntesis de astaxantina a partir de beta-caroteno, actuando como donador de electrones en la reacción catalizada por la enzima astaxantina sintasa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los carotenos son un grupo de pigmentos naturales producidos principalmente por plantas, levaduras y microalgas. Particularmente la xantofila astaxantina es un compuesto ampliamente encontrado en la naturaleza, este posee una gran importancia comercial ya que es utilizada como aditivo alimenticio para pigmentar la carne de truchas y salmones en la acuicultura (Johnson y cois. 1977) . Por otro lado • y debido a su actividad altamente antioxidante, se han observado sus beneficios para la salud humana como, por ejemplo, en la prevención de enfermedades cardiovasculares, favorece al sistema inmune, bioactividad contra Helicobacter pylori y prevención de cataratas (Higuera-Ciapara y cois. 2006) .
Originalmente, la obtención de este compuesto se realizaba directamente a partir de crustáceos (organismos ricos en este pigmento) , en la actualidad la producción se realiza mayoritariamente mediante síntesis química, algunos ejemplos son los descritos en las patentes US4.245.109, US5.210.314, US5.625.099 y US5.654.488.
Otra manera de obtención de astaxantina es la biosintesis y extracción a partir de microorganismos, en este sentido tienen mayor importancia el uso de microalga (Haematococcus pluviales) y levadura {Xanthophyllomyces dendrorhous) . El crecimiento, producción y extracción de astaxantina en microalgas ha sido descrita en varias patentes, entre ellas CNl.966.660, JP2007/222168, KR2005/0005341, MX/PA05/007801, sin embargo, si se compara la astaxantina producida por Haematococcus pluvialís con la obtenida de Xanthophyllomyces dendrorhous, existen diferencias importantes. En agua dulce, la microalga verde unicelular H. pluvialis ha sido reconocida durante muchos años como un acumulador del carotenoide astaxantina, bajo ciertas condiciones de stress, tales como alta intensidad de luz y/o limitación de nitrógeno, las células de esta alga forman quistes y acumulan altas cantidades de astaxantina (>1% de peso seco) (Margalith, 1999) , cambiando su coloración de verde a rojo. Esta microalga ha recibido recientemente mucha atención debido a su capacidad de sintetizar y acumular grandes cantidades de astaxantina durante y al finalizar su fase de crecimiento (Margalith, 1999) . Sin embargo, la utilización H. pluvialis como fuente de astaxantina resultó deficiente debido a la obtención de pigmentos de calidad inferior a la requerida comercialmente, dado el elevado porcentaje de esterificación de la astaxantina obtenida (Sominer et al 1991) . En este sentido, la astaxantina producida por la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous, es 100% libre (no esterificada) y está compuesta por el isómero óptico 3R, 3R' y el isómero geométrico "trans", lo que le otorga una gran ventaja comparativa sobre la producida por la microalga (Andrewes y Starr, 1976) . A pesar de que las microalgas son la fuente natural con el más alto contenido de astaxantina conocido, el interés para la explotación comercial de estos organismos no ha sido suficiente debido a los altos Índices de contaminación con protozoos y a un menor desarrollo de las tecnologías de cultivo, en comparación con organismos heterotróficos como las levaduras.
La ruta biosintética de pigmentos carotenoides ha sido ampliamente estudiada en levaduras, en la Figura 1 se muestra la ruta identificada para X. dendrorhous y se detallan aquellos genes que han sido aislados, secuenciados, caracterizados y publicados (Kajiwara y cois., 1997, Niklitschek y cois., 2008, Verdoes y cois., 1999a; Alcaíno, 2002, Verdoes y cois., 1999b; León, 2000) . En la formación de astaxantina a partir de beta-caroteno se requiere de dos actividades enzimáticas: cetolasa que incorpora un grupo ceto en las posiciones 4 y 4' de la molécula de beta-caroteno e hidroxilasa que introduce un grupo hidroxilo en las posiciones 3 y 3' del beta-caroteno (Cunningham y Gantt 1998; Linden 1999) . A diferencia de otros organismos donde participan dos genes independientes en este paso, en X. dendrorhous se ha aislado un gen crtS que codifica para una enzima astaxantina sintasa la que presenta ambas actividades (EP 1.035.206; 0j ima y cois., 2006; Álvarez y cois., 2006) . A partir de la secuencia aminoacidica deducida del gen crtS y realizando análisis bioinformáticos, se determinó que la enzima astaxantina sintasa de X. dendrorhous pertenece a la familia de proteínas citocromo P450 monooxigenasas (Oj ima y cois. , 2006) .
Para la inserción del oxigeno al sustrato, las enzimas del tipo Citocromo P450 monooxigenasas requieren de un sistema donador de electrones que en eucariontes es una proteina citocromo P450 Reductasa (CPR) (van den Brink y cois., 1998) . Adicionalmente, Oj ima y cois (2006) describieron un trabajo en el cual se transformó Escherichia coli con 3 plasmidios compatibles entre si, uno de los plasmidios contenia los genes necesarios para la síntesis de beta-caroteno, otro contenia el gen crtS de X. dendrorhous y el tercero contenia un gen de la Citocromo P450 reductasa de Saccharomyces cerevisiae, mediante este sistema sólo fue posible obtener derivados oxigenados de beta-caroteno, pero no astaxantina. A partir de estos resultados se puede inferir la necesidad de contar con la secuencia de Citocromo P450 reductasa adecuada para complementar la ruta biosintética en el sistema.
En este sentido, no se ha aislado ni secuenciado aun el gen que codifica para la enzima Citocromo P450 reductasa proveniente de X. dendrorhous, ni se ha demostrado su participación en la síntesis de astaxantina.
La presente invención describe la secuencia del gen crtR y el polipéptido que codifica, el cual posee actividad Citocromo P450 Reductasa de X. dendrorhous. Esta invención otorga herramientas técnicas que permiten transformar microorganismos ya sea potenciando su capacidad natural de producir astaxantina o creando nuevas rutas metabólicas en otros organismos no carotenogénicos que permitan la producción de este pigmento de una manera comercialmente atractiva.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al material genético que codifica para la enzima citocromo P450 reductasa (CPR) , entendiéndose material genético como la secuencia de ácidos nucleicos del tipo ADN genómico, ADN complementario, ARN mensajero y las respectivas variantes alélicas que codifiquen para un polipéptido con actividad de CPR, útil para la producción de astaxantina mediante la transformación de organismos huéspedes que pueden o no ser productores naturales de dicho carotenoide.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1, Principales pasos de la ruta de biosintesis de astaxantina en X. dendrorhous. Se señalan los genes estructurales de la via que han sido clonados y secuenciados . Se muestra el color de las colonias que acumulan carotenoides intermedios en la ruta de biosíntesis. El color es un indicador del tipo de pigmento que se está obteniendo en las diferentes etapas de la síntesis.
Figura 2, Secuencia de ADN genómico (SEQl) del gen crtR de X. dendrorhous . Los fragmentos de la secuencia subrayados corresponden a los exones del gen. En negritas y subrayados se destacan aquellos ácidos nucleicos identificados como sitios dadores y receptores para procesos de empalme. Se indican los sitios de restricción para la enzima Bamñl .
Figura 3, Comparación de secuencias nucleotidicas de genes de NADPH-citocromo P450 reductasa de diferentes hongos. C_echinulata : Cunninghamella echinulata (Zygomycete) N°Acceso GenBank: AF195660. S_cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae (Ascomycete) N°Acceso GenBank: D13788. R_minuta: Rhodotorula minuta (Basidiomycete) N°Acceso GenBank: AB055119. En gris se muestra donde alinean algunos de los partidores descritos en la tabla 1.
Figura 4, Secuencia de ADN complementario (SEQ2) correspondiente a la región codificante del gen crtR y traducción a secuencia aminoacidica (SEQ3) con código de una letra por cada aminoácido. En letras cursivas: Exon 1 gen crtR. En letras negras: Exon 2 gen crtR. Secuencia subrayada: Exon 3 gen crtR.
Figura 5, Secuencia de aminoácidos deducida a partir de la región codificante del gen crtR. En negro y subrayado se destacan los dominios conservados de la proteina, en orden se encuentran: Dominio de transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H, identificados mediante el programa BlastP.
Figura 6, Esquema del proceso de obtención de las construcciones diseñadas para obtener la deleción del gen crtR en cepas silvestres UCD67-385 y CBS6938 de X. dendrorhous .
Figura 7, Esquema de los eventos de mutación del gen crtR por recombinación homologa en las cepas silvestres UCD67-385 (385) y CBS6938 (CBS) de X. dendrorhous, donde A muestra la transformación de la cepa UCD67-385. y B muestra transformación de cepa CBS6938.
Figura 8, Cultivo de levaduras silvestres (UCD 67- 385 y CBS 6938) y transformantes (T13: derivada de UCD 67-385 y CBSTr: derivada de CBS 6938) en placa de petri con medio de cultivo YM-agar.
Figura 9, Análisis de los pigmentos presentes en las levaduras silvestres (UCD 67-385 y CBS 6938) y transformadas (T13 y CBSTr) .
(A) Cromatogramas por HPLC (465 nm) . En cada pico se indica al carotenoide que corresponde, NI: No Identificado.
(B) Gráfico que muestra una comparación de los pigmentos producidos por cepas silvestres y su respectivo mutante, expresado en ppm (partes por millón) de cada pigmento detectado.
Figura 10, GeI de reacción de PCR de cepas silvestres y transformantes, λ: Estándar de tamaño molecular ADN bacteriófago λ digerido con la enzima HindIII (Bandas de 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0 y 0.6 kb)
A: PCR de UCD67-385 y transformante T13. Carril: (1) : ADN 385 + gpd rev+SEQ50, (2) : ADN T13 + gpd rev+SEQ50, (3) H2O + gpd rev+SEQ50, (4): ADN 385 + SEQ14+Pef fwd, (5): ADN T13 + SEQ14+Pef fwd, (β) : H2O + SEQ14+Pef fwd, (7) : ADN 385 + SEQ14+SEQ50, (8) : ADN T13 + SEQ14+SEQ50, (9) : H2O + SEQ14+SEQ50, (10) : ADN 385 + SEQ14+SEQ15, (11) : ADN T13+ SEQ14+SEQ15 y (12) : H2O+ SEQ14+SEQ15.
B: PCR de CBS6938 y transformante CBSTr. Carril: (1) : ADN CBS + Pef fwd+SEQ35, (2) : ADN CBSTr + Pef fwd+SEQ35, (3) : H2O + Pef fwd+SEQ35, (4) : ADN CBS 4- gpd rev+SEQ30, (5) : ADN CBSTr 4- gpd rev+SEQ30 y (6) : H2O 4- gpd rev+SEQ30.
C: PCR de transformante CBSTr. Carril: (1) : ADN CBSTr + SEQ754-hygSecR, (2) : ADN CBSTr + HF+SEQ35, (3) : ADN CBSTr + HygSecF+M13F, (4) : ADN CBSTr + M13R+SEQ15, (5) : ADN CBSTr + SEQ20+SEQ50 y (6) : ADN CBSTr 4- SEQ30+SEQ50.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con un gen y una enzima que está involucrada en la última etapa de la sintesis de astaxantina a partir de beta-caroteno.
La presente invención provee una secuencia de ADN genómico (gen crtR) y ADN complementario que codifica para una enzima con actividad Citocromo P450 reductasa (CPR) responsable de entregar los electrones necesarios para la incorporación de los grupos ceto e hidroxilo a la molécula de beta-caroteno para obtener astaxantina, esta reacción es catalizada por la enzima astaxantina sintasa.
La presente invención se refiere a las secuencias de ADN del gen crtR de X. dendrorhous, en su modalidad preferida secuencias de ADN genómico y ADN complementario, asi como también fragmentos de dicho gen, siendo estos semi- degenerados o no.
La presente invención se refiere a una secuencia de ADN genómico del gen crtR, su hebra complementaria, sus variantes alélicas y secuencias representadas con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos que codifiquen para un polipéptido que tenga actividad enzimática CPR. Debido a que el código genético es degenerado, esta invención también contempla secuencias de ácidos nucleicos que hibriden con el gen crtR, bajo condiciones de estrictez estándar, como por ejemplo la descrita por Sambrook y cois 2001. En su modalidad preferida, la secuencia de ADN corresponde a la SEQl y se caracteriza por provenir de X. dendrorhous y poseer 9.903 pares de bases, dentro de ella se identifican ácidos nucleicos descritos como sitios dadores y receptores para procesos de empalme {splicing) , dichos ácidos nucleicos están marcados en negro y subrayados en la SEQl (figura 2) . La secuencia de ADN genómico de dicho gen se caracteriza por poseer 3 segmentos de la secuencia que corresponden a los exones, subrayados en la SEQl.
Esta invención también considera una secuencia de ADN complementario, su hebra complementaria y la secuencia de ARN mensajero que la genera, sus variantes alélicas y secuencias representadas con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos que codifique para un polipéptido que tenga actividad enzimática CPR. Debido a que el código genético es degenerado, esta invención también contempla secuencias de ácidos nucleicos que hibriden con el complemento del gen crtR, bajo condiciones de estrictez estándar, como por ejemplo la descrita por Sambrook y cois. En su modalidad preferida dicho ADN complementario es sintetizado a partir de los ARN mensajeros generados del gen crtR, y se refiere a la SEQ2 (figura 4), dicho ADN complementario representa el segmento codificante del gen crtR y posee un largo de 2.241 pares de bases.
La invención también se refiere a métodos de obtención de secuencias de ADN del gen crtR de X. dendrσrhous. En una primera modalidad o etapa dicho método corresponde a la identificación del ADN genómico del gen de interés, o parte de éste, empleando fragmentos semi- degenerados . Adicionalmente, en otra modalidad o etapa consecutiva, se identifica el gen de interés con fragmentos de la secuencia aislada de la etapa anterior. De preferencia en la primera etapa se emplean secuencias de consensos de segmentos conservados entre genes equivalentes al de interés provenientes de otras especies.
En una modalidad preferida, la invención comprende la comparación mediante técnicas de bioinformática de secuencias conocidas de genes de Citocromo P450 reductasa de otras levaduras, la identificación de segmentos conservados y el diseño, en base a ellos, de fragmentos cortos de ácidos nucleicos (entre 15 y 30 pares de bases), útiles para la identificación y amplificación de secuencias de ADN. En su modalidad preferida, se diseñaron los fragmentos de ADN descritos en la tabla 1 (SEQ4 a SEQ9) . Dichos partidores son semi-degenerados y consideran los caracteres R, K, D, H, W, Y como representaciones de los siguientes grupos de ácidos nucleicos: R= G o A, K= G o T, D = G o A o T, H = A o T o C, W = A o T, Y = T o C, la ubicación de dichos partidores dentro de la secuencia genómica del gen crtR, de las especies consideradas para este diseño se describe en la figura 3. Dichos fragmentos fueron utilizados para amplificar parte del gen crtf? a partir de ADN genómico de X. dendrorhous mediante la técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) . En la segunda etapa se diseñan los fragmentos no degenerados de ADN de la tabla 1 (SEQlO a SEQ106) . En particular los partidores desde SEQlO a SEQ13 fueron utilizados para identificar clones de genotecas de ADN genómico y ADN complementario de X. dendrorhous portadores de fragmentos del gen crtR, mediante la técnica de PCR. El resto de los partidores mencionados fueron usados para la secuenciación completa del gen crtR. Tabla 1: Fragmentos de ADN útiles para la identificación y amplificación del gen crtR.
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Por otro lado, esta invención se refiere a una secuencia de aminoácidos con actividad Citocromo P450 reductasa, correspondiente en su modalidad preferida a la descrita en la SEQ3 (Figura 5) , y codificada por el gen crtR, el ARN mensajero o el ADN complementario generado a partir de dicho gen, sus hebras complementarias, variantes alélicas y secuencias representadas por SEQl o SEQ2 con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos, o secuencias de ácidos nucleicos que hibriden bajo condiciones de estrictez estándar con la secuencia genómica o ADN complementario (ej . Condiciones detalladas por Sambrook y cois. 2001) . En su modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido con actividad CPR posee 746 aminoácidos , SEQ3 (figura 5) , mediante comparaciones utilizando herramientas bioinformáticas, se identificaron ciertos dominios conservados marcados en la SEQ3, y que corresponden, en orden de aparición a: dominio transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H.
La presente invención está dirigida también a variantes del polipéptido SEQ3. Dichas variaciones se refieren a la adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos en dichas secuencias, mientras estos derivados mantengan la actividad descrita. Dicha actividad puede ser medida por cualquier ensayo conocido en el estado del arte o descritos especificamente en este documento. Dichas variantes pueden ser sintetizadas mediante síntesis químico o mediante recombinación en base a las secuencias de ADN disponibles, utilizando métodos del estado del arte.
La presente invención se refiere al uso del polipéptido CPR, cuya modalidad preferida es la SEQ3, para la obtención de organismos modificados con fines de aumentar la producción de astaxantina o generar nuevas rutas metabólicas conducentes a su bioproducción en organismos apropiados. En otra modalidad, se utiliza la secuencia de ADN codificante para la secuencia SEQ3 modificada para suprimir la función citocromo P450 reductasa en organismos productores de astaxantina en conjunto con astaxantina sintasa, este uso es sugerido con fines de investigación.
En su modalidad preferida, la invención comprende la supresión de la funcionalidad del gen crtR en la levadura X. dendrorhous y la evaluación de las cepas transformadas a nivel fenotipico y genotipico. La deleción del gen crtR- se realiza reemplazando el gen nativo en cepas silvestres de X. dendrorhous por un módulo que posee un fragmento de dicho gen interferido por un marcador de selección, de preferencia genes de resistencia a antibiótico. En su modalidad preferida dicho reemplazo del gen nativo se realizó por recombinación homologa utilizando un vector apropiado que contiene el módulo descrito anteriormente, particularmente, se diseñaron los vectores descritos en la figura 6 y se transformó con ellos dos cepas de X. dendrorhous nativas obteniéndose dos cepas transformadas (CBSTr y T13) que poseen una capacidad reducida de producción de astaxantina respecto de las cepas nativas de las que provienen. La evaluación fenotipica de las cepas transformadas se realiza mediante la inspección visual del color de la levadura en cultivo y su comparación con la cepa nativa, en otra modalidad, mediante la identificación de los pigmentos que contiene, de preferencia utilizando la técnica HPLC (High Performance Liquid Chromatography) . En la evaluación a nivel genómiσo de la deleción del gen crtR en las cepas transformadas, esta invención contempla el análisis y comparación de la secuencia genómica correspondiente a este gen mediante técnicas de biología molecular presentes en el estado del arte, de preferencia a través de su amplificación mediante PCR utilizando los fragmentos descritos en la tabla 1, en especial los fragmentos SEQ14, SEQ15, SEQ20, SEQ30, SEQ35, SEQ50, SEQ76, y aquellos descritos en la tabla 3.
La presente invención está también dirigida un vector o plasmidio que comprenda las secuencias de ADN descritas anteriormente y una célula huésped transformada o transfectada con dicho ADN o un vector o plasmidio descrito anteriormente . Asimismo, esta invención contempla composiciones, productos y/o formulaciones que comprenden dichos vectores o plasmidios, ADN genómico, ADN complementario y fragmentos del gen descritos previamente. Dichas composiciones, productos y/o formulaciones, asi como las secuencias descritas anteriormente, pueden ser empleadas con fines de investigación, producción, análisis o técnicas de biología molecular existentes en el estado del arte. De manera preferida en los procesos necesarios para la transformación de organismos con el fin de obtener una producción modificada de astaxantina y evaluación de dichas transformaciones.
La presente invención contempla la obtención de organismos recombinantes transformados a partir de los vectores o plasmidios y el ADN que contienen, y el cultivo de estos organismos transformados bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicho polipéptido o a la producción de astaxantina.
El polipéptido contemplado en la presente invención y las secuencias que lo codifican son útiles para manipular genéticamente organismos naturalmente productores de astaxantina con el fin de potenciar sus capacidades de biosintesis o de generar la ruta biosintética en otros organismos, que por sus cualidades de crecimiento, condiciones de cultivo, biodisponibilidad y otros pueden ser productivamente más atractivas para la obtención de dicho pigmento, tal como es el caso de Saccharomyces cerevisiae.
A continuación se describen algunos ejemplos de aplicación, los que no pretenden ser exclusivos ni limitantes a la invención.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Obtención de la secuencia de ADN genómico del gen crtR a partir de X. dendrorhous .
Para aislar y caracterizar el gen crtR de X. dendrorhous se diseñaron oligonucleótidos que permitieran amplificar partes del gen crtR mediante la técnica de PCR (Reacción de la Polimerasa en Cadena) . Con este fin se compararon secuencias nucleotidicas de genes de enzimas CPRs de las levaduras Cunninghamella echinulata, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula minuta mediante el programa Clustal W, se identificaron zonas conservadas y en base a ellas se diseñaron los oligonucleótidos semi-degenerados descritos en la tabla 1 (SEQ4 a SEQ9) y cuya ubicación dentro de las secuencias comparadas se muestra en la figura 3. Utilizando la pareja de partidores SEQ4 y SEQ8, se amplificó el gen crtR a partir de ADN genómico de X. dendrorhous de la cepa silvestre UCD 67-385, utilizando un protocolo de PCR bajo las siguientes condiciones: denaturación inicial 95°C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 940C por 30 segundos, alineamiento a 55° C por 30 segundos, extensión a 720C por 3 minutos. Luego una extensión final a 720C por 10 minutos. El amplificado obtenido fue corrido en un gel de agarosa al 0,8% y purificado a partir de él, posteriormente fue secuenciado. Mediante esta técnica fue posible obtener un amplificado de 1649 pares de bases. Al comparar la secuencia obtenida con las bases de datos internacionales, utilizando el programa BlastX (Búsqueda en base de datos de proteínas usando la secuencia de nucleótidos obtenida traducida a aminoácidos) se encontró que el amplificado obtenido poseía un elevado porcentaje de similitud con CPRs de otras levaduras, encontrándose las mayores identidades con Trametes versicolor BAB83588.1 (identidad: 61% y valor de E: 3xlO~142) y Phanerochaete chrysosporium AAG31351.1 (identidad: 59% y valor de E: IxICT137) .
A partir de la secuencia obtenida, se analizaron aquellos segmentos codificantes conservados (mediante programa BlastP) y en base a ellos se diseñó nuevos partidores específicos para el gen crtR de X. dendrorhous (SEQlO a SEQ13, Tabla 1) . Estos partidores se utilizaron para buscar clones en una genoteca de X. dendrorhous construida en el sitio BamHI del plasmidio YIp5 que utiliza como huésped a la cepa DH5α de E. coli, que contenían segmentos de ADN genómico codificantes para el gen crtR. La búsqueda de estos clones se realizó mediante la amplificación, por PCR, de los insertos de los clones de la genoteca. El gen crtR contiene sitios BamHI en su secuencia, por lo tanto no se logró obtener un clon que contenia al gen crtR completo desde la genoteca utilizada. Sin embargo, se obtuvieron dos clones que contenían partes del gen. Uno de ellos con un inserto de 12820 pb que fue secuenciado completamente y contiene el gen crtR desde la base nucleotídica N° 82 del exón 1 hasta el final del gen, el otro clon contiene un inserto de aproximadamente 6500 pb que fue secuenciado completamente y la región promotora del gen crtR y 88 pb del exón 1. Mediante digestión con enzimas de restricción y ensayos de hibridación del ADN genómico y utilizando como sonda un fragmento amplificado con los partidores SEQ4 y SEQ8 se determinó que el gen crtR no contiene sitios Salí en su secuencia y que un fragmento de Salí de aproximadamente 4900 pb, contiene al gen en su totalidad. Básicamente, el protocolo utilizado para estos experimentos fue el siguiente: El ADN genómico de la cepa UCD67-385 de X. dendrorhous, fue digerido con distintas enzimas de restricción y se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Luego el ADN fue denaturado y transferido a una membrana de nylon y se realizó una hibridación utilizando un fragmento de DNA que corresponde a parte del gen crtR como sonda. La preparación de las membranas y la hibridación se realizó de a acuerdo a métodos estándares Sambroock y cois., 2001. En base a estos antecedentes, se construyó una nueva genoteca parcial utilizando fragmentos Salí de ADN de X. dendrorhous seleccionados de tamaños entre 6400 y 4400 pb aproximadamente, como vector se utilizó pBluescript SK+ y la cepa DH5α de E. coli como huésped, la elaboración de esta nueva genoteca fue realizada según las instrucciones del fabricante. Utilizando esta nueva genoteca, se amplificaron insertos mediante PCR, utilizando los pares de partidores SEQlO y SEQ13. De esta manera se obtuvo un clon que contenia al gen crtR en su totalidad (SEQl) .
Ejemplo 2: Obtención de la secuencia de ADN complementario del gen crtR a partir de X. dendrorhous .
Con el fin de obtener la secuencia de ADN complementario del gen crtR, se utilizó una genoteca de ADN complementario de X. dendrorhous, a partir de la cual se amplificaron secuencias mediante la técnica de PCR utilizando los pares de partidores SEQlO y SEQ13 que hibridan con segmentos codificantes del gen, cuyo tamaño de amplificado esperado a partir de ADN complementario del gen crtR es de 338_pb. La genoteca de cDNA se construyó utilizando el kit comercial "pBluescript II XR cDNA library construction kit" de Stratagene, utilizando como huésped a la cepa XLlO-GOLD de Escherichia coli, según las instrucciones dadas por el fabricante. Las condiciones utilizadas para las reacciones de PCR fueron de: denaturación inicial 950C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 940C por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 30 segundos, extensión a 720C por 3 minutos. Luego una extensión final a 720C por 10 minutos. Los amplificados obtenidos se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%, identificándose mezclas de clones positivas para la amplificación del ADN complementario del gen crtR.
Mediante esta técnica se identificó un clon con un inserto de ADN complementario del gen crtR. Dicho inserto fue secuenciado, obteniéndose una secuencia de 2.241 pares de bases (SEQ2) .
Comparando las secuencia obtenida del ADN complementario con la secuencia de ADN genómico del gen se determinó la organización de exones e intrones (figura 2) . Posteriormente se realizó la traducción a aminoácidos de la secuencia obtenida (SEQ2) , mediante el paquete de software Vector NTI Suite 10 (Informax) , una vez determinado el marco de lectura correcto, se identificaron los dominios conservados de la proteina descritos en la figura 5, en orden de aparición son dominio transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H. La identificación del dominio transmembrana fue realizado mediante el programa TMPred (www. ch. embnet . org/software/TMPRED forín, html) , obteniéndose un puntaje de 2.280, los dominios consecutivos fueron identificados mediante el programa InterProScan (http: //www. ebi.ac.uk/ínterProScan/) , con valores de E 2,5x10" 41 , l,6xlθ~67 y 7,8xlO~23 respectivamente.
Ejemplo 3. Determinación de la importancia funcional del polipéptido CPR, codificado por el gen crtR, en la ruta carotenogénica de X. dendrorhous .
Para demostrar la importancia del gen crtR en la ruta biosintética de astaxantina en la levadura X. dendrorhous, se construyeron mutantes por deleción del gen crtR en cepas de X. dendrorhous silvestres y se compararon los fenotipos y genotipos de las mutantes con la cepa original. Con este fin, se insertó en un vector de transformación, una construcción en la cual se reemplazó un fragmento de ADN que contenía al gen crtR por un módulo de resistencia al antibiótico higromicina B. Este módulo se compone del gen de resistencia al antibiótico higromicina B {hph) , bajo el control del promotor del gen TEF (que codifica al Factor de la elongación de la traducción, EF-IcO y la región terminadora del gen GPD de X. dendrorhous. En la figura 6 se muestra el detalle de los constructos realizados, básicamente, el vector CPRl .3 posee un fragmento de ADN de X. dendrorhous, segmento contenido entre los nucleótidos 4531 y 9902 de la SEQl, fue digerido con la endonucleasas de restricción BsiWI o Ndel para generar una deleción en el gen crtR. Los extremos del fragmento obtenido (que contiene la deleción crtR) , fueron rellenados con la polimerasa Klenow para posibilitar el ligado del módulo de resistencia a higromicina cuyos extremos son romos. De esta manera se obtuvo dos clones: CPRl .3ΔBsiWI+hyg y CPRl .3ΔNdeI+hyg. La inserción de este constructo en el genoma de las cepas silvestres utilizadas se realizó mediante la técnica de recombinación homologa detallada más adelante. Utilizando estos vectores se transformaron cepas silvestres de X. dendrorhous: UCD 67-385 y CBS 6938.
La cepa UCD67-385 fue transformada con un fragmento de ADN lineal que contiene la deleción del gen crtR y el módulo de resistencia a higromicina. Este fragmento fue obtenido a partir de la digestión del clon CPRl .3ΔBsiWI+hyg con las endonucleasas Smal y Spel . Por un evento de doble recombinación homologa, un alelo del gen crtR de la cepa UCD67-385 fue reemplazado por la deleción, obteniéndose la cepa T13.
La cepa CBS6938 fue transformada con el clon CPRl .3ΔNdeI+hyg (ADN circular) que contiene la deleción del gen crtR y el módulo de resistencia a higromicina. Por un evento de recombinación homologa, se reemplazó el gen crtR silvestre con el gen mutado, obteniéndose la cepa CBSTr.
La transformación de ambas cepas silvestres se realizó por medio de electroporación, en base a los protocolos descritos por Adrio y cois. (1995) y Kim y cois. (1998) . Brevemente, se inocula 200 mi de medio YM comercial (glucosa 1%, extracto de levadura 0,3%, extracto de malta 0,3% y bacto-peptona 0,5%) con 1-2 mi de un cultivo de X. dendrorhous de 48 horas de crecimiento y se incuba con agitación constante a 220C hasta alcanzar una DO55On1n de 1,2. Las células se cosechan y se resuspenden en 25 mi de tampón BD (50 mM tampón fosfato de potasio, pH 7.0, 25 mM ditiotritol [DTT]) y se incuban a 220C por 15 minutos. Las células se lavan dos veces con 25 mi de tampón STM (270 mM sacarosa, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ImM MgC12) frío y se resuspenden en 1 mi de tampón STM. Para transformar se mezcla 60 μl de células electrocompetentes con 10 a 20 μg de ADN transformante en un volumen de 5 μl . Las condiciones de electroporación son: 125 πiF, 600 Ω, 0,45 kV y posteriormente las células se resuspenden en 1 mi de medio YM líquido y se incuban a 220C por 5 horas. Finalmente, las células se siembran en placas con el medio YM y agar al 2% suplementado con 10 ug/ml de higromicina B. Utilizando este medio de selección se identificaron clones que poseen el inserto con el gen de resistencia a higromicina.
De los clones obtenidos en la primera selección con antibióticos, se eligieron dos clones transformantes de cada una de las cepas silvestres. A partir de transformación de la cepa CBS 6938 se obtuvo una cepa color amarillo (CBSTr) , cuyo color indica que acumula beta-caroteno y es incapaz de sintetizar astaxantina. Al transformar la cepa UCD 67-385, se obtuvo un transformante pálido (T13), lo cual igualmente indica la via metabólica de síntesis de astaxantina esta afectada (evidencias fenotipicas se muestran en la figura 8) . Se extrajeron los pigmentos totales de las 2 cepas silvestres y de las 2 cepas transformantes y su composición fue analizada por HPLC (figura 9) , siguiendo el siguiente protocolo basado en el método de An y cois. (1989) : A un pellet de células provenientes de 5 a 20 mi de cultivo se le agregó entre 1 y 3 mi de acetona más un volumen de perlas de vidrio, que luego fue agitado a máxima velocidad en vórtex por 1 min. La fase orgánica se recuperó por centrifugación a 12.100 x g a 4°C. Los pigmentos totales se extrajeron con éter de petróleo, luego se secaron con nitrógeno gaseoso, se disolvieron en acetona y se separaron por HPLC con una columna de fase reversa
RP-18 Lichrocart 125-4 (Merck) , utilizando acetonitrilo:metanol : isopropanol (85:10:5 v/v) como fase móvil con un flujo de 1 ml/min a temperatura ambiente, en condiciones isocráticas. Los espectros de cada máximo de elusión fueron recuperados por un detector con arreglo de diodos. Los caretonoides fueron identificados de acuerdo a su espectro de absorción, tiempos de retención y comparación con estándares específicos. Se observó que la composición de carotenoides en las cepas transformantes es completamente distinto al de las cepas silvestres de las cuales provienen. El transformante CBSTr acumula beta-caroteno y es incapaz de sintetizar astaxantina, a diferencia de la cepa silvestre de la cual proviene (CBS 6938), que produce astaxantina y una cantidad mínima de Beta-caroteno. El transformante T13 redujo su producción de astaxantina en un 75% aproximadamente a costa de un aumento en la producción de beta-caroteno, a diferencia de la cepa silvestre de la cual proviene (UCD67- 385) , que produce altas cantidades de astaxantina y cantidades mínimas de Beta-caroteno (Figura 9) .
Para confirmar la transformación a nivel genómico de las cepas mencionadas anteriormente, se analizó el locus afectado mediante amplificación de sus insertos por PCR, utilizando como molde ADN genómico de los transformantes y las cepas silvestres. Para el análisis de la cepa transformada T13, se realizaron reacciones de PCR con los siguientes pares de partidores: gdp rev + SEQ50, SEQ14 + Pef fwd, SEQ14 + SEQ50 y utilizando como templados la cepa silvestre UCD 67-385, la cepa transformada T13 y agua destilada como control negativo. Para el análisis de la cepa transformada CBSTr se realizaron reacciones de PCR con los siguientes pares de partidores: Pef fwd + SEQ35, gpd rev + SEQ30 y utilizando como templados la cepa silvestre CBS 6938, la cepa transformada CBSTr y agua destilada como control negativo, además se usaron los pares de partidores: SEQ75 + hygSecR, HF + SEQ35, HygSecF + M13F, M13R + SEQ15, SEQ20 + SEQ50 y SEQ30 + SEQ50, utilizando como templado la cepa transformada CBSTr. Algunos de estos partidores no hibridan con la secuencia de crtR, su secuencia se detalla en la tabla 2 y su ubicación relativa se muestra en la figura 7. Las reacciones de PCR se realizaron según el siguiente protocolo: denaturación inicial 950C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 940C por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 30 segundos, extensión a 720C por 3 minutos. Luego una extensión final a 720C por 10 minutos y fueron cargados en geles de agarosa al 0,8%. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 10 y la comparación entre los tamaños de los amplificados esperados y obtenidos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2 : Partidores no complementarios a la secuencias de crtR, utilizados en el análisis genómico de las cepas transformadas
Figure imgf000039_0001
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Tabla 3 : Tamaño de amplificados esperados y obtenidos en el análisis de transformantes T13 y CBSTr
A. Resultados para el transformante T13
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B. Resultados para el transformante CBSTr
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Los tamaños de los amplificados obtenidos en las cepas transformadas coinciden los resultados esperados (tabla 3) . Este análisis fue confirmado mediante hibridación ADN- ADN. Los experimentos de hibridación se realizaron digiriendo el ADN genómico de las cepas silvestres (UCD67-385 y CBS6938) y de las cepas transformantes (T13 y CBSTr) con distintas endonucleasas de restricción. Las digestiones fueron corridas en geles de agarosa al 0,8% y luego denaturadas y transferidas a membranas de nylon para la hibridación. Las membranas fueron hibridadas de manera independiente con dos sondas: 1) sonda amplificado gen gen crtR con partidores SEQ4 y SEQ8, 2) sonda gen higromicina. La preparación de las membranas y la hibridación se realizó de acuerdo a métodos estándares Sambroock y cois., 2001.
Los resultados obtenidos indican el transformante T13 es heterocigoto para el gen crtR, donde hay un alelo silvestre y otro mutante, por un efecto de dosis génica, este transformante produce menos astaxantina y acumula más beta- caroteno que su parental silvestre, con estos resultados se demuestra que la inserción de la deleción del gen crtR con la resistencia a higromicina B corresponde a la esquematizada en la figura 7. En el caso del transformante CBSTr, la copia del gen crtR fue mutada y por lo tanto no es capaz de producir astaxantina, acumulando beta-caroteno. Este resultado indica que la cepa CBS6938 es haploide, al menos para el gen crtR.
Todos los amplificados fueron secuenciados completamente y su análisis confirmó su origen
Referencias :
Adrio J., Veiga M. 1995. Transformation of the astaxanthin-producing yeast Phaffia rhodozyma. Biotech. Techniques 9: 509-512.
Andrewes A., Starr M. 1976. (3R, 3R')- Astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma. Phytochem 15: 1009-1011.
Alcaíno, J. 2002. Organización estructural del gen de la fitoeno sintasa en el genoma de Xanthophyllomyces dendrorhous (ex Phaffia rhodozyma) . Tesis para optar al grado de Ingeniería en Biotecnología Molecular. Universidad de Chile.
Alvarez V, Rodriguez-Saiz M, de la Fuente JL, Gudina EJ, Godio RP, Martin JF, Barredo JL. 2006. The crtS gene of Xanthophyllomyces dendrorhous encodes a novel cytochrome-P450 hydroxylase involved in the conversión of beta-carotene into astaxanthin and other xanthophylls . Fungal Genet Biol. 43:261-72.
An, G-H., D. B. Schuman, y E. Johnson. 1989. Isolation of Phaffia rhodozyma mutants with increased astaxanthin content. Appl . Environ. Microbiol. 55: 116-124. Cunningham, F. X. y E. Gantt. 1998. Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 557-583.
Higuera-Ciapara, I, Félix-Valenzuela L., Goycoolea FM: Astaxanthin: a review of its chemistry and applications . Crit . Rev. Food. Sci. Nutr. 2006, 46:185-196.
Johnson, E. A., Conklin, D., Lewis, M. J., 1977. The yeast Phaffia rhodozyma as a dietary pigment source for salrαonids and crustaceans . J. Fish. Beast. Board Can. 34, 2417-2421.
Kajiwara, P., P. D. Fraser, K. Kondo, y N. Misawa. 1997. Expression of an exogenous isopentenyl diphosphate isomerase gene enhances isoprenoid biosynthesis in Escherichia coli. Biochem. J. 324: 421-426.
Kim I., Nam S., Sohn J., Rhee S., An G., Lee S. y Choi E. 1998. Cloning of the ribosomál protein L41 gene of Phaffia rhodozyma and its use as a drug resistance marker for transformation. Appl. Environ . Microbiol .
64:1947-1949.
Linden H. 1999. Carotenoid hydroxylase frorα Haematococcus pluvialis: cDNA sequence, regulation and functional complementation. Biochim Biophys Acta 1446: 203-212. León, R. 2000. Caracterización de determinantes genéticos de la síntesis de astaxantma en Xanthophyllomyces dendrorhous (ex Phaffia rhodozyma) . Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias c/m en Biología. Universidad de Chile.
Margalith PZ. 1999. Production of ketocarotenoids by microalgae. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4 ) : 431-8.
Niklitschek, M., J. Alcaíno, S. Barahona, D. Sepúlveda, M. Carmona, A. Wozniak, A. Marcoleta, P. Lodato, M. Baeza y V. Cifuentes. 2008. Genomic organization of the structural gene controllmg the astaxanthm biosynthesis pathway of Xanthophyllomyces dendrorhous. Biol. Res. En prensa. (MS 05-512) .
Cgima K, Breitenbach J, Visser H, Setoguchi Y, Tabata K, Hoshmo T, van den Berg J, Sandmann G. 2006. Clomng of the astaxanthm synthase gene from Xanthophyllomyces dendrorhous {Phaffia rhodozyma) and íts assignment as a beta-carotene 3-hydroxylase/4-ketolase. Mol Genet Genomics . 275(2) :148-58.
Sambroock, J., Russell, D, W. 2001. Molecular clomng. A laboratory manual, 3rd ed. CoId Spπng Harbor Laboratory Press, CoId Sprmg Harbor, N. Y. Somraer, T. R., Potts, W. T., Morrissy, N. M., 1991. "Utilization of microalgal astaxanthin by rainbow trout Oncorhynchus rαykiss". Aquaculture 94, 79-88.
van den Brink HM, van Gorcom RF, van den Hondel CΛ and Punt PJ. 1998. Cytochrorae P450 enzyme systems in fungi . Fungal Genet Biol. 23: 1-17.
Verdoes, J. C, P. Krubasik, G. Sandmann, y A. J. J. van Ooyen. 1999a. Isolation and funtional characterisation of a novel type of carotenoid biosynthetic gene from Xanthophyllomyces dendrorhous . Mol. Gen. Genet. 262: 453-461.
Verdoes, J. C, N. Misawa, y A. J. J. van Ooyen. 1999b. Cloning and characterization of the astaxanthin biosynthetic gene encoding phytoene desaturase of Xanthophyllomyces dendrorhous. Biotechnol . Bioeng. 63: 750- 755.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Una secuencia de ADN CARACTERIZADA porque codifica para una enzima que tiene una actividad citocromo P450 reductasa que actúa como donador de electrones para la reacción de catalizada por la enzima astaxantina sintasa y que transforma el beta-caroteno en astaxantina, preferiblemente en X. dendrorhous.
2.- El ADN aislado de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque: a) la secuencia de nucleótidos codifica para dicha enzima y tiene una secuencia mostrada en SEQl, o b) Una secuencia de nucleótidos que, debido a que el código genético es degenerado, codifica para citocromo P450 reductasa teniendo igual secuencia de aminoácidos que la codificada por la secuencia nucleotidica a) ;
c) Una secuencia de nucleótidos que híbrida el complemento de la secuencia nucleotidica de a) y b) bajo condiciones de estrictez estándar.
3.- El ADN aislado de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque: a) Una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ2; b) Una secuencia de nucleótidos que, debido a que el código genético es degenerado, codifica para citocromo P450 reductasa teniendo igual secuencia de aminoácidos que la codificada por la secuencia nucleotidica a) ; c) Una secuencia de nucleótidos que hibrida el complemento de la secuencia nucleotidica de a) y b) bajo condiciones de estrictez estándar.
4.- Una secuencia de aminoácidos que tiene actividad citocromo P450 reductasa, codificada por las secuencias nucleotidicas de las reivindicaciones 2 y 3, CARACTERIZADA porque tiene la secuencia SEQ3, preferiblemente de X. dendrorhous.
5.- El polipéptido aislado de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque: a) Una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ3; o b) Un polipéptido similar a la SEQ3 que posea cambios en uno o más aminoácidos y que mantenga la actividad citocromo P450 reductasa descrita. c) Un polipéptido descrito en a) y b) sintetizado mediante síntesis química o biosintesis.
6.- Un oligonucleótido CARACTERIZADO por hibridar con las secuencias correspondientes a las reivindicaciones 1 a 3.
7. - Un oligonucleótido aislado de acuerdo a la reivindicación 6 CARACTERIZADO porque es útil para amplificar secuencias de ADN mediante técnica de PCR u otra utilización para técnicas de biología molecular descritas en el estado del arte.
8.- Un vector o plasmidio CARACTERIZADO porque comprende el segmento de ADN reivindicado en las reivindicaciones 1 a 3.
9.- Un organismo huésped CARACTERIZADO porque es transformado o transfectado por el ADN aislado descrito en las reivindicaciones 1 a 3 o un vector o plasmidio descrito en la reivindicación 7.
10.- Un proceso de producción de un polipéptido que tenga una actividad citocromo P450 reductasa CARACTERIZADO porque comprende el cultivo de un organismo huésped transformado como se describe en la reivindicación 8, cultivado bajo condiciones conducentes a la producción de dicha enzima.
11.- Un proceso para la producción biológica de astaxantina CARACTERIZADO porque comprende la introducción de uno o más aislados de ADN como los detallados en las reivindicaciones de 1 a 4 en un organismo huésped apropiado, cultivado bajo condiciones que conduzcan a la producción de astaxantina y la recuperación de astaxantina a partir del cultivo.
12.- Un proceso de producción de astaxantina a partir de Beta-caroteno CARACTERIZADO porque contempla la donación de electrones por parte del polipéptido detallado en las reivindicaciones 4 y 5 para la reacción catalizada por astaxantina sintasa, en una mezcla de reacción apropiada que contenga una membrana reconstituida apropiada.
13.- El proceso de producción de astaxantina a partir de beta-caroteno CARACTERIZADO porque el polipéptido de las reivindicaciones 4 y 5 está presente en forma de una membrana reconstituida la cual es preparada a partir de una membrana biológica como un microsoma o una membrana mitocondrial .
14,- El proceso de producción de astaxantina a partir de betacaroteno CARACTERIZADO porque el polipéptido de las reivindicaciones 4 y 5 es presentado en la forma de una membrana reconstituida artificial, como un liposoma.
15.- Las composiciones, productos y/o formulaciones CARACTERIZADAS porque comprenden los vectores o plasmidios, ADN genómico, ADN complementario y fragmentos del gen crtR contemplados en las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 7, 8, útiles para transformación de organismos huéspedes y producción de astaxantina contempladas en las reivindicaciones 9, 10 y 11.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103805623B (zh) * 2014-01-17 2016-02-03 河北大学 一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途
CA3109156C (en) * 2014-05-16 2023-08-15 Academia Sinica Recombinant polynucleotide sequence for producing astaxanthin and uses thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4245109A (en) 1978-06-02 1981-01-13 Hoffmann-La Roche Inc. Process for producing astaxanthin
US5210314A (en) 1990-05-03 1993-05-11 Basf Aktiengesellschaft Preparation of canthaxanthin and astaxanthin
US5625099A (en) 1993-07-05 1997-04-29 Ernst; Hansgeorg Preparation of astaxanthin, novel intermediates therefor and the preparation thereof
US5654488A (en) 1995-03-18 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Preparation of astaxanthin
EP1035206A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Astaxanthin Synthetase
KR20050005341A (ko) 2003-07-01 2005-01-13 주식회사 포스코 아스타잔틴의 생산 방법
CN1966660A (zh) 2006-11-20 2007-05-23 宁波大学 大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法
JP2007222168A (ja) 2006-02-21 2007-09-06 Sungkyunkwan Univ Foundation For Corporate Collaboration 緑藻類からフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4245109A (en) 1978-06-02 1981-01-13 Hoffmann-La Roche Inc. Process for producing astaxanthin
US5210314A (en) 1990-05-03 1993-05-11 Basf Aktiengesellschaft Preparation of canthaxanthin and astaxanthin
US5625099A (en) 1993-07-05 1997-04-29 Ernst; Hansgeorg Preparation of astaxanthin, novel intermediates therefor and the preparation thereof
US5654488A (en) 1995-03-18 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Preparation of astaxanthin
EP1035206A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Astaxanthin Synthetase
KR20050005341A (ko) 2003-07-01 2005-01-13 주식회사 포스코 아스타잔틴의 생산 방법
JP2007222168A (ja) 2006-02-21 2007-09-06 Sungkyunkwan Univ Foundation For Corporate Collaboration 緑藻類からフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法
CN1966660A (zh) 2006-11-20 2007-05-23 宁波大学 大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIO J.; VEIGA M.: "Transformation of the astaxanthin-producing yeast Phaffia rhodozyma", BIOTECH. TECHNIQUES, vol. 9, 1995, pages 509 - 512
ALCAINO, J. ET AL.: "Cloning of the cytochrome p450 reductase (crtR) gene and its involvement in the astaxanthin biosynthesis of Xanthophyllomyces dendrorhous", BMC MICROBIOLOGY, vol. 8, 6 October 2008 (2008-10-06), pages 169, XP021042382 *
ALCAINO, J.: "Thesis for the degree in Molecular Biotechnology Engineering", 2002, UNIVERSIDAD DE CHILE, article "Structural organization of the phytoene synthase gene in the genome of Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma)"
ALVAREZ V; RODRIGUEZ-SAIZ M; FUENTE JL; GUDINA EJ; GODIO RP; MARTIN JF; BARREDO JL: "The crtS gene of Xanthophyllomyces dendrorhous encodes a novel cytochrome-P450 hydroxylase involved in the conversion of beta-carotene into astaxanthin and other xanthophylls", FUNGAL GENET BIOL., vol. 43, 2006, pages 261 - 72
AN, G-H.; D. B. SCHUMAN; Y E. JOHNSON: "Isolation of Phaffia rhodozyma mutants with increased astaxanthin content", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 55, 1989, pages 116 - 124
ANDREWES A.; STARR M.: "Astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma", PHYTOCHEM, vol. 15, 1976, pages 1009 - 1011
BRINK HM; GORCOM RF; CA VAN DEN HONDEL; PJ PUNT.: "Cytochrome P450 enzyme systems in fungi", FUNGAL GENET BIOL, vol. 23, 1998, pages 1 - 17
CUNNINGHAM, F. X; Y E. GANTT.: "Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants", ANNU. REV. PLANT PHYSIOL. PLANT MOL. BIOL., vol. 49, 1998, pages 557 - 583
GREEN, JC; N. MISAWA; AJJ VAN OOYEN: "Cloning and characterization of the astaxanthin biosynthetic gene encoding phytoene desaturase of Xanthophyllomyces dendrorhous", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 63, 1999, pages 750 - 755
GREEN, JC; P. KRUBASIK; G. SANDMANN; AJJ VAN OOYEN: "Funtional Isolation and Characterisation of a novel type of carotenoid biosynthetic gene from Xanthophyllomyces dendrorhous", MOL. GEN. GENET., vol. 262, 1999, pages 453 - 461
HIGUERA-CIAPARA, I; FELIX-VALENZUELA L.; GOYCOOLEA FM: "Astaxanthin: a review of its chemistry and applications", CRIT. REV. FOOD. SCI. NUTR., vol. 46, 2006, pages 185 - 196
JOHNSON, E.A.; CONKLIN, D.; LEWIS, M.J.: "The yeast Phaffia rhodozyma as a dietary pigment source for salmonids and crustaceans", J. FISH. BEAST. BOARD CAN., vol. 34, 1977, pages 2417 - 2421
KAJIWARA, P.; P. D. FRASER; K. KONDO; Y N. MISAWA.: "Expression of an exogenous isopentenyl diphosphate isomerase gene enhances isoprenoid biosynthesis in Escherichia coli", BIOCHEM. J., vol. 324, 1997, pages 421 - 426
KIM I.; NAM S.; SOHN J.; RHEE S.; AN G.; LEE S.; CHOI E.: "Cloning of the ribosomal protein L41 gene of Phaffia rhodozyma and its use as a drug resistance marker for transformation", APPL. ENVIRON. MICROBIOL, vol. 64, 1998, pages 1947 - 1949
LEON, R.: "Thesis for the degree of Doctor of Science c/m in Biology", 2000, UNIVERSIDAD DE CHILE, article "Characterization of genetic determinants of the synthesis of astaxanthin in Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma)"
LINDEN H.: "Carotenoid hydroxylase from Haematococcus pluvialis: cDNA sequence, regulation and functional complementation", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1446, 1999, pages 203 - 212
MARGALITH PZ.: "Production of ketocarotenoids by Microalgae", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 51, no. 4, 1999, pages 431 - 8
NIKLITSCHEK, M.; J. ALCAINO; S. BARAHONA; D. SEP6LVEDA; M. CARMONA; A. WOZNIAK; A. MARCOLETA; P. LODATO; M. BAEZA; V. CIFUENTES: "Genomic organization of the structural gene controlling the astaxanthin biosynthesis pathway of Xanthophyllomyces dendrorhous", BIOL RES, IN PRESS., 2008
OJIMA K; BREITENBACH J; VISSER H; SETOGUCHI Y; TABATA K; HOSHINO T; VAN DEN BERG J; SANDMANN G.: "Cloning of the astaxanthin synthase gene from Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) and Its assignment as a beta-carotene 3-hydroxylase/4-ketolase", MOL GENET GENOMICS., vol. 275, no. 2, 2006, pages 148 - 58
OJIMA, K. ET AL.: "Cloning of the astaxanthin synthase gene from Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) and its assignment as a beta- carotene 3-hydroxylase/4-ketolase", MOL. GEN. GENOMICS, vol. 275, no. 2, 2006, pages 148 - 158, XP019346028 *
SAMBROOCK, J.; RUSSELL, D, W.: "Molecular cloning. A laboratory manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2345725A4 *
SOMMER, TR; POTTS WT; MORRISSY, NM: "Utilization of microalgal astaxanthin by rainbow trout Oncorhynchus mykiss", AQUACULTURE, vol. 94, 1991, pages 79 - 88
VAN DEN BRINK, H.J.M. ET AL.: "Cytochrome P450 enzyme systems in fungi", FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY, vol. 23, 1998, pages 1 - 17, XP008138982 *

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