WO2012169623A1 - 炭素数50のカロテノイドの製造方法 - Google Patents

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phytoene desaturase
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太輔 梅野
真衣子 古林
典彦 三沢
真一 高市
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    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a carotenoid having 50 carbon atoms, including a step of culturing cells transformed with a mutant phytoene desaturase gene in a medium.
  • Carotenoids are compounds that are usually classified into tetraterpenes consisting of an isoprene skeleton having 30 or 40 carbon atoms. Various modifications such as cyclization are imparted after formation of a linear skeleton having 30 or 40 carbon atoms, which is fundamental in nature. The structural diversity of carotenoids is due to the diversity of such modifications. In addition, carotenoids are known to vary greatly in physiological activity due to structural differences based on the variety of modifications.
  • Non-Patent Documents 1- 8, Patent Document 1 carotenoids having various structures are obtained by synthesis based on a so-called combinatorial biosynthesis technique.
  • Combinatorial biosynthesis is a technique in which a microorganism is produced by modifying a biosynthetic pathway of a microorganism using a genetic engineering technique.
  • Non-patent Document 9 Modification enzymes that give carotenoids with various structures have a “locally specific” property of acting only by recognizing only part of the substrate, and based on such properties of the modified substrate, Combinatorial biosynthesis has been carried out (Non-patent Document 9).
  • Non-Patent Documents 7, 8, 11 and Patent Document 1 various non-natural carotenoids are produced by a method of constructing a metabolic pathway using an enzyme activity that has not been found in the natural world created using protein engineering. Biosynthesis is realized.
  • carotenoids have a skeleton having 30 and 40 carbon atoms.
  • the former is derived from 4,4′-diapophytoene synthesized by head-to-head condensation of two molecules of farnesyl diphosphate (C 15 PP).
  • the latter is derived from phytoene (a carotenoid skeleton compound having 40 carbon atoms) synthesized by head-to-head condensation of two geranylgeranyl diphosphate (C 20 PP) molecules.
  • the former is the key to the biosynthetic pathway of more than a dozen types of carotenoids known to exist in nature, and the latter is the key to the biosynthetic pathway of more than 700 types of carotenoids.
  • Non-patent Document 2 A carotenoid having a skeleton having 50 carbon atoms is synthesized by attaching an isoprene unit to a carotenoid having 40 carbon atoms by “addition” and increasing the total carbon number to 45 or 50 (Non-patent Document 10).
  • Synthetic pathways for skeletons with 40 or more carbon atoms such as skeletons with 50 or 60 carbon atoms, are synthesized from geranyl farnesyl diphosphate (C 25 PP), hexaprenyl diphosphate (C 30 PP), etc. .
  • carotenoids with a skeleton of 40 or more carbon atoms are expected to have many possibilities such as physiological functions and pigment functions that are different from conventional ones, there is no detailed report on the synthetic pathway in nature. There are few reports of biosynthetic pathways.
  • Umeno the inventor of the present case, modified a carotenoid synthase (CrtM) having 30 carbon atoms derived from Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) to replace geranyl farnesyl diphosphate (C 25 PP).
  • An enzyme with the function of synthesizing a carotenoid skeleton compound with 50 carbon atoms by molecular condensation was developed.
  • Umeno co-expressed the enzyme together with an appropriate precursor synthase in Escherichia coli to produce 16,16'-diisopentenyl phytoene, which is a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms. Success for the first time (Non-Patent Document 7).
  • Non-patent Document 7 carotenoids having a skeleton with carbon numbers other than 50, such as 30, 30 and 40, were also synthesized. Even if wild-type phytoene desaturase is added to this pathway, about 75% of the 50-carbon carotenoid skeleton compounds remain unsaturated, resulting in poor synthesis efficiency. (Non-patent document 8).
  • Carotenoids with 50 carbon atoms have a larger skeleton than carotenoids with 40 carbon atoms, and therefore have the advantage of being a substance with a large conjugated double bond size that can be accommodated. If a carotenoid skeletal compound with 50 carbon atoms can be synthesized and desaturated, as in the natural pathway for the synthesis of carotenoids with 40 carbon atoms, various structures and physiological activities can be obtained by combining with various modifying enzymes. It is thought that a carotenoid having 50 carbon atoms can be produced.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing various carotenoids having 50 carbon atoms by efficiently desaturating carotenoid skeleton compounds having 50 carbon atoms.
  • a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms is obtained by a mutant phytoene desaturase in which a mutation is introduced into phytoene desaturase (phytoene desaturase: CrtI).
  • a mutation is introduced into phytoene desaturase
  • carotenoids having 50 carbon atoms can be efficiently and simply synthesized by culturing cells into which the mutant phytoene desaturase gene has been introduced. completed.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for producing a carotenoid having 50 carbon atoms Mutant phytoene desaturase gene has been introduced to encode a mutant phytoene desaturase with enhanced activity to desaturate carotenoid skeletal compounds having 50 carbon atoms
  • a method for producing a carotenoid having 50 carbon atoms comprising culturing cells transformed with a mutant phytoene desaturase gene in a medium, and obtaining a carotenoid having 50 carbon atoms from the cultured product. 2.
  • the mutant phytoene desaturase gene is introduced with a mutation that encodes a mutant phytoene desaturase with enhanced activity to desaturate a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms,
  • the mutant phytoene desaturase gene is introduced with a mutation that encodes a mutant phytoene desaturase with enhanced activity to desaturate a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms, 3.
  • Mutant phytoene desaturase gene is introduced with a mutation that encodes mutant phytoene desaturase with enhanced activity to desaturate carotenoid skeleton compounds with 50 carbon atoms. 4.
  • the cell according to any one of 1 to 6 above is further transformed with a gene encoding an enzyme that synthesizes geranyl farnesyl diphosphate from farnesyl diphosphate and / or geranylgeranyl diphosphate.
  • the cyclization described in the preceding item 8 is ⁇ -cyclization, and the cell according to the preceding item 8 further includes an enzyme for hydroxylating the ⁇ ring and / or a ⁇ ring in a carotenoid having 50 carbon atoms at the terminal.
  • the cell according to any one of 1 to 7 above is further transformed with a gene encoding an enzyme that oxidizes a C50 desaturated carotenoid obtained by desaturating a C50 carotenoid skeleton compound.
  • a gene encoding an enzyme that oxidizes a C50 desaturated carotenoid obtained by desaturating a C50 carotenoid skeleton compound 8.
  • a mutant phytoene desaturase gene, wherein a mutation encoding a mutant phytoene desaturase having enhanced activity to desaturate a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms has been introduced.
  • a mutation that encodes a mutant phytoene desaturase having enhanced activity of desaturating a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms is asparagine at position 304, phenylalanine at position 339 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 12.
  • Desaturase gene is obtained by substitution of an amino acid corresponding to one or more amino acids selected from 338th isoleucine, 395th aspartic acid, and 228th isoleucine.
  • mutant phytoene desaturase gene The mutation of the mutant phytoene desaturase gene according to item 11 or 12, wherein at least the amino acid corresponding to the 304th asparagine in SEQ ID NO: 1 is substituted with proline or serine, Mutant phytoene desaturase gene. 14 14. A mutant phytoene desaturase encoded by the mutant phytoene desaturase gene according to any one of 11 to 13 above. 15. A carotenoid having 50 carbon atoms is produced by desaturating a carotenoid skeletal compound having 50 carbon atoms, which is transformed with the mutant phytoene desaturase gene according to any one of 11 to 13 above Possible cells.
  • a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms can be efficiently desaturated, and carotenoids having 50 carbon atoms having various structures can be produced.
  • desaturated carotenoids having 50 carbon atoms can be delivered to downstream modifying enzymes, and various carotenoids having 50 carbon atoms can be produced.
  • Carotenoids have a variety of structures as a result of various modifications such as oxygenation of a carotenoid skeleton compound having 40 carbon atoms (30 carbon atoms in certain bacteria) that does not contain oxygen or the like.
  • the most important caroten in nature is ⁇ -carotene having a ⁇ ring, and various enzymes that modify the ⁇ ring exist in nature.
  • a 50-carbon carotenoid having a ⁇ ring can be synthesized.
  • various carotenoids can be produced by using enzymes that modify various ⁇ rings.
  • the carotenoid having 50 carbon atoms produced by the production method of the present invention has an improved antioxidant function compared to conventional carotenoids, and has been extended to a range where the color gamut as a pigment has not been reported so far. It is expected that there is a possibility that it has the property of being difficult to be decomposed and metabolized.
  • FIG. 3 is a diagram showing a map of plasmids used in Examples 1 to 6 and Reference Examples 1 and 2.
  • (A) is pAC-fds Y81A , V157A-crtM F26A , W38A, F233S .
  • pACmod vector with lac promoter / operator ( lacPO ) -crtM F26A , W38A, F233S and lac promoter / operator ( lacPO ) -fds Y81A, It was prepared by inserting V157A .
  • B is pUC-pBAD-crtI * . It was prepared by removing the lac promoter / operator from the pUC18Nm vector, inserting the araC gene / araBAD promoter sequence (derived from the pBADHisA vector), and inserting the mutant crtI ( crtI * ) downstream of the promoter.
  • C is pUC-pBAD-crtI * -crtY.
  • lacPO downstream fds Y81A of pUC18Nm vector was generated by inserting the V157A gene.
  • G is pAC-crtM F26A , W38A, F233S .
  • H is pAC-crtM F26A , W38A, F233S- idi. It was prepared by inserting lacPO - idi upstream of the ClaI site of pAC-crt MF26A, W38A, F233S .
  • FDS Y81A shown V157A and CrtM F26A, W38A, when coexpressed with Idi in the metabolism pathway constructed by F233S, the synthesis of C 50 carotenoid skeleton compound (Example 1).
  • “No idi ” and “With idi ” are compounds having C 35 carotenoid skeleton obtained from HPLC analysis of acetone extract (35) and compounds having C 40 carotenoid skeleton (40).
  • Example 2 which is the figure shown about the screening of the mutant
  • A) is an outline of the operation of the screening experiment system, and (b) shows the principle of screening. It is a figure showing (a) the actual color of an acetone extract, and (b) the absorption spectrum of an acetone extract about 6 of 8 colonies obtained by screening (Example 3).
  • CrtEBI is a control and is Escherichia coli transformed with a plasmid pAC-EBI containing crtE , crtB and crtI derived from Pantoea ananatis .
  • WT (or CrtIwt) is transformed with wild-type crtI , mut1, mut2, mut8, mut4, and mut6 are CrtI-m1, CrtI-m2, CrtI-m8, CrtI-m4, and CrtI-m6 colonies, respectively. Results are shown. These transformed E. coli synthesize lycopene.
  • CrtI * indicates that a mutant crtI derived from CrtI-m2 was introduced into E. coli.
  • A), (b), (c), (d), and (e) are respectively E.
  • E. coli transformed with pUC-pBAD-CrtI E. coli transformed with pUC-pBAD-CrtI-m2, pUC-pBAD
  • the results are for E. coli transformed with -CrtI N304P , E. coli transformed with pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY, and E. coli transformed with pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY.
  • (I) is a pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtW BD -CrtZ BD.
  • (J) is pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtW BD .
  • (K) is pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZ BD .
  • (L) is pAC-crtM F26A , W38A, F233S- fds Y81A, V157A- idi. C50 produced by transforming various plasmids containing CrtW and / or CrtZ derived from Brevundimonas sp.
  • -Zeanthanthin, C50-canthaxanthin, and C50-astaxanthin are diagrams showing the results of HPLC analysis (Example 8).
  • (A), (b), and (c) are pAC-crtM F26A , W38A, F233S- fds Y81A, V157A , pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZ BD , pUC-pBAD-CrtI-m2, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing a map of plasmids used in Example 11.
  • the plasmid contains CrtW and / or CrtZ derived from Brevundimonas sp. Strain SD-212, CrtG derived from Brevundimonas sp.
  • Strain SD-212, or CrtX derived from Pantoea ananatis is pUC-pBAD- CrtIN304P- CrtY-CrtG-CrtZ BD .
  • N is a pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtG-CrtW BD -CrtZ BD.
  • O is pUC-pBAD- CrtIN304P- CrtY-CrtX-CrtZ BD .
  • P is a pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtX-CrtW BD -CrtZ BD.
  • Example 11 which is a figure explaining that a more various carotenoid can be produced by further expressing CrtG in a carotenoid biosynthetic pathway.
  • CrtG With further expression of CrtG, C 50 -astaxanthin to C 50 -2-hydroxyastaxanthin and C 50 -2,3,2 ', 3'-tetrahydroxy- ⁇ , ⁇ -carotene-4,4'-dione Is produced.
  • C 50 - from zeaxanthin C 50 - Caro xanthine (Caloxanthin) and C 50 - Nosuto xanthine (Nostoxanthin) is produced.
  • FIG. 10 is a diagram for explaining that various carotenoids can be produced by further expressing CrtX in the carotenoid biosynthetic pathway (Example 11). Further expression of CrtX produces C 50 -astaxanthin- ⁇ -D-glucoside and C 50 -astaxanthin- ⁇ -D-diglucoside from C 50 -astaxanthin.
  • Example 11 which is a figure which shows the result of having measured the absorption spectrum of the carotenoid extract obtained by the additional expression of CrtG or CrtX to the Escherichia coli strain which synthesize
  • Example 11 which shows the result of having analyzed the carotenoid produced by the additional expression of CrtG or CrtX to the E. coli strain which synthesize
  • (b) shows that C50-caroxanthin (C50-Caloxanthin, peak 3) and C50-nostoxanthin (C50-Nostoxanthin, peak 2) were produced by additional expression of CrtG.
  • C shows that C50-zeaxanthin- ⁇ -D-diglucoside (C50-Zeaxanthin- ⁇ -D-diglucoside, peak 5) was produced by additional expression of CrtX. It is a figure which shows the map of the plasmid used in Example 12.
  • (Q) is pAC-hexPS.
  • (R) is pAC-FDS I78G, Y81A- idi.
  • (S) is, pUC-CrtM F26A, W38A, a F233S.
  • the C 55 carotenoid and C 60 carotenoid is a diagram showing the result of biosynthesis (Example 12).
  • CrtM F26A , W38A, F233S and hexPS were co-expressed, C 60 carotenoid was specifically synthesized.
  • Carotenoids are biosynthesized from mevalonic acid or pyruvic acid in nature.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • C 10 PP geranyl diphosphate
  • PP farnesyl diphosphate
  • C 20 PP geranylgeranyl diphosphate
  • phytoene is synthesized by condensing two molecules of C 20 PP by phytoene synthase (CrtB), which becomes a carotenoid precursor (carotenoid skeleton compound).
  • Phytoene, zeto-carotene, neurosporene, lycopene, tetradehydrolycopene, and the like are synthesized by sequentially unsaturated phytoene.
  • Various carotenoids such as violaxanthin are synthesized.
  • Carotenoids composed only of carbon and hydrogen are classified as carotenes, and those containing oxygen in addition to carbon and hydrogen are classified as xanthophylls.
  • the present invention makes it possible to produce a carotenoid having a carbon number of 50 by modifying a biosynthetic pathway of carotenoids existing in nature.
  • a cell transformed with a mutant phytoene desaturase gene is used as a medium.
  • a method for producing a carotenoid having 50 carbon atoms which comprises obtaining the carotenoid having 50 carbon atoms from the culture after culturing.
  • “50 carbon atoms” may be simply represented as “C 50 ”, and the same applies to 35, 40, 45, 55, 60 carbon atoms, and the like.
  • C50 carotenoid is distinguished from “C50 carotenoid skeleton compound” which is desaturated by mutant phytoene desaturase, and C50 carotenoid skeleton compound is unsaturated.
  • the carotenoid having 50 carbon atoms may be subjected to any modification, for example, having a ⁇ ring or ⁇ ring at the terminal, or having a functional group containing elements other than carbon and hydrogen such as a hydroxyl group or a keto group. Also included.
  • a carotenoid having 50 carbon atoms is sufficient if the number of carbon atoms derived from the skeletal compound is 50. For example, by adding a functional group containing carbon such as a methyl group or an acetyl group by modification, the total number of carbon atoms is 50 or more. Also included are.
  • a “C50 carotenoid skeleton compound” is a precursor of a C50 carotenoid and can be desaturated by a mutant phytoene desaturase.
  • n described after the common name of a compound represents the number of conjugated double bonds.
  • C50 desaturated carotenoid a substance which has been desaturated by a mutant phytoene desaturase but which has not undergone subsequent modification.
  • the unsaturated carotenoid having 50 carbon atoms is a straight-chain compound and has no functional groups other than those derived from a skeletal compound.
  • Unsaturated carotenoids having 50 carbon atoms are included in carotenoids having 50 carbon atoms.
  • the term “compound having a carotenoid skeleton having 50 carbon atoms” is used as a concept including all of carotenoids having 50 carbon atoms, carotenoid skeleton compounds having 50 carbon atoms, and unsaturated carotenoids having 50 carbon atoms. There is also a case.
  • a mutant phytoene desaturase that catalyzes a reaction that desaturates a carotenoid skeleton compound having 50 carbon atoms is a mutant in which wild type phytoene desaturase (CrtI) is introduced.
  • Phytoene desaturase (CrtI) is an enzyme that desaturates phytoene having 40 carbon atoms. In nature, phytoene containing three conjugated double bonds is desaturated to introduce double bonds sequentially. And catalyzing the reaction of synthesizing lycopene containing 11 conjugated double bonds.
  • the mutant phytoene desaturase in the present invention has an activity of desaturating a C 50 carotenoid skeletal compound as compared to the wild-type phytoene desaturase by introducing a mutation.
  • the mutant phytoene desaturase in the present invention may be derived from any organism including plants, bacteria, etc., as long as the activity of desaturating the C 50 carotenoid skeleton compound is enhanced by mutation. Good.
  • the mutant phytoene desaturase is preferably derived from a microorganism, more preferably a bacterium belonging to the genus Pantoea (formerly Erwinia ), more preferably Pantoea ananatis ; It is derived from Erwinia uredovora and rice brown rot.
  • the amino acid sequence of wild-type phytoene desaturase (CrtI) derived from Pantoea ananatis is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the mutant phytoene desaturase gene ( crtI * ) encodes a mutant phytoene desaturase.
  • Any mutation in the mutant phytoene desaturase gene may be used as long as the object of the present invention is achieved.
  • the mutation is any one or more amino acids selected from the 304th asparagine, the 339th phenylalanine, the 338th isoleucine, the 395th aspartic acid, and the 228th isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. More preferably, at least the amino acid corresponding to the 304th asparagine in SEQ ID NO: 1 is substituted with proline or serine.
  • amino acid corresponding to at least the 304th asparagine in SEQ ID NO: 1 is substituted with proline.
  • the “amino acid corresponding to the Xth amino acid in SEQ ID NO: 1” specifies that the amino acid to be mutated is the Xth counted from the N-terminus in SEQ ID NO: 1, In the case of a phytoene desaturase having an amino acid sequence different from the amino acid sequence shown in No. 1, it is not X-th, but is expressed as a different numerical value.
  • a mutant phytoene desaturase gene a mutation causing a desired amino acid substitution is introduced into the phytoene desaturase gene derived from Pantoea ananatis (base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing).
  • the base sequence is exemplified.
  • a mutant phytoene desaturase gene is exemplified by a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 3 in which the 911st adenine (A) is replaced by guanine (G) in the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the substitution of the 911th base results in the substitution of the 304th asparagine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with serine.
  • SEQ ID NO: 2 contains G1131A and A1476T non-synonymous mutations.
  • a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence AAC at positions 910 to 912 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with CCT, CCC, CCA, CCG, more preferably CCT is used.
  • Examples of the gene possessed base sequence shown in SEQ ID NO: 28 in the Sequence Listing
  • Such substitution of bases results in substitution of the 304th asparagine with proline in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 in the Sequence Listing).
  • SEQ ID NO: 28 contains non-synonymous mutations of G1131A and A1476T.
  • the mutant phytoene desaturase gene can be prepared by preparing a mutant gene library, screening a gene encoding an enzyme having a desired function from the library, and determining the nucleotide sequence. Screening can be performed, for example, by the method described in the Examples. Once the nucleotide sequence is determined, the mutant phytoene desaturase gene can be obtained by chemical synthesis, PCR using the cloned probe as a template, site-directed mutagenesis, and the like.
  • the present invention includes a step of culturing a cell transformed with a mutant phytoene desaturase gene in a medium, but the cell may originally have another carotenoid biosynthesis gene, A carotenoid biosynthesis gene may be transformed.
  • Other carotenoid biosynthesis genes are those associated with the upstream or downstream of the reaction of the reaction which desaturate C 50 carotenoid skeleton compound.
  • the upstream reaction corresponds to a pathway for supplying a C 50 carotenoid skeleton compound
  • the downstream reaction corresponds to a pathway for further modifying the C 50 unsaturated carotenoid.
  • IPP, DMAPP, C 10 PP, C 15 PP, and C 20 PP can be originally synthesized in many cells, particularly all microorganisms.
  • the cell in the present invention synthesizes a carotenoid backbone compound of C 50 by bicondensing C 25 PP, a gene encoding an enzyme that synthesizes C 25 PP from C 15 PP and / or C 20 PP. It has been transformed with at least one of the genes encoding the enzyme.
  • the gene encoding the enzyme that synthesizes C 25 PP from C 15 PP and / or C 20 PP may be any gene as long as it has a desired function.
  • Examples of such a gene include a mutant gene of farnesyl diphosphate synthase (FDS) derived from Geobacillus stearothermophilus , a moderately thermophilic bacterium of the genus Geobacillus (Ohnuma, S. et al., J Biol Chem 271,30748-30754 (1996), Japanese Patent Application No. 2010-258989).
  • FDS farnesyl diphosphate synthase
  • the gene encoding an enzyme that synthesizes a C 50 carotenoid skeleton compound by bimolecular condensation of C 25 PP may be any gene as long as it has a desired function.
  • the mutant gene is exemplified of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) derived from Jiapofitoen synthase (CrtM) .
  • the C 50 carotenoid skeleton compound can be produced with high efficiency, which is preferable.
  • the cell of the present invention may be transformed with a gene ( idi ) encoding an enzyme that isomerizes IPP to DMAPP (for example, isopentenyl diphosphate isomerase (Idi)). .
  • C 50 desaturated carotenoids are considered to correspond to lycopene and tetradehydrolycopene in nature, and it is expected that C 50 desaturated carotenoids can be modified by various enzymes related to lycopene modification.
  • the cell in the present invention contains a gene encoding an enzyme that cyclizes the terminal end of a C 50 desaturated carotenoid and / or a gene encoding an enzyme that oxidizes the oxygenated C 50 desaturated carotenoid. May be.
  • the cell in the present invention has a gene encoding an enzyme that cyclizes (especially ⁇ -cyclization) the end of the C 50 desaturated carotenoid
  • the cell hydroxylates the cyclic portion (particularly ⁇ -ring) It may be transformed with a gene encoding an enzyme and / or a gene encoding an enzyme that ketolates a cyclic portion (particularly the ⁇ ring).
  • the ⁇ ring is synonymous with the ⁇ -ionone ring.
  • the gene encoding the enzyme that cyclizes the terminal of the C 50 desaturated carotenoid may be any gene as long as it has a desired function.
  • examples of such genes include a gene ( crtY ) encoding lycopene cyclase (CrtY) that synthesizes ⁇ -carotene from lycopene derived from Pantoea ananatis (Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704- 6712 (1990)).
  • the gene encoding the enzyme that hydroxylates the ⁇ ring and / or the gene encoding the enzyme that kets the ⁇ ring is any gene as long as it has the desired function It may be.
  • marine bacterium Paracoccus (Paracoccus) genus N81106 strain (formerly Agrobacterium A uranium tier Kum (Agrobacterium aurantiacum)) derived from, or marine bacterium Brevundimonas (Brevundimonas) from the genus SD-212 strain
  • beta- Ionone ring-3-hydroxylase (CrtZ) gene ( crtZ )
  • ⁇ -ionone ring-4-ketolase ⁇ -ionone ring-4-oxygenase
  • the gene encoding the enzyme that oxidizes the C 50 desaturated carotenoid may be any gene as long as it has a desired function.
  • An example of such a gene is a spheroidene monooxygenase (CrtA) gene ( crtA ) derived from Rhodobacter sphearoides (SEQ ID NO: 7).
  • Spheroidene monooxygenase is an enzyme that catalyzes an oxidation reaction in which an oxygen atom is inserted into spheroidene and converted to spheroidenone.
  • the cells of the present invention may be transformed with genes encoding various enzymes related to C 50 desaturated carotenoid modification pathways other than those described above, depending on the type of carotenoid to be produced.
  • ⁇ -ionone ring-2-hydroxylase (CrtG) gene derived from Brevundimonas sp. Strain SD-212 (referred to as “CrtV” in International Publication WO2005 / 049643) (Nishida, Y. et al. al, Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296, 2005), producing C 50 carotenoids by hydroxylating the 2 and 2 'positions of the ⁇ ring, which makes organic synthesis difficult by transforming the cells. Is also possible.
  • cells capable of producing a C 50 carotenoid can be produced by selecting an appropriate expression vector and introducing and expressing a known foreign gene (for example, Sambrook, J., Russel, DW, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001).
  • a gene to be introduced into a cell by transformation is prepared by a conventional method such as a PCR method, the gene is incorporated into an expression vector suitable for the host by a conventional method, a target vector is selected, and the host cell is transformed by the conventional method using the vector. Obtained by conversion.
  • these plural genes may be incorporated into the same expression vector for transformation, or may be incorporated into different expression vectors for cotransformation.
  • the host cell is not limited, but microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast are preferable in consideration of shortening of the culture time and ease of cloning.
  • Escherichia coli and yeast are preferable.
  • Suitable Escherichia coli is a terpene precursor in addition to a cloning strain such as Escherichia coli XL1-Blue (hereinafter simply referred to as “E. coli XL1-Blue”), an expression strain such as HB101 and BL21.
  • Gene knockout strains such as JW1750 ⁇ gdhA (glutamate dehydrogenase deficient), JW0110 ⁇ aceE (pyruvate dehydrogenase deficient) (Baba, T. et al .; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)), etc.
  • Suitable yeasts include standard germinating yeast, INVSc1 (invitrogen), YPH499 (stratagene) and the like.
  • the expression vector into which the gene is incorporated is not particularly limited and may be a commonly used vector.
  • examples include those derived from pUC18, pACYC184, etc., when the host is Bacillus subtilis, pUB110, pE194, pC194, pHY300PLK DNA, etc., and when the host is yeast, pRS303 , YEp213, TOp2609 and the like.
  • Whether or not the target gene has been introduced into the host cell can be confirmed by a conventional method, for example, PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method and the like.
  • the method for producing a C 50 carotenoid of the present invention includes a step of culturing a cell, which is a transformant obtained as described above, in a medium.
  • the medium may be any medium as long as it contains a substance that can serve as a source of the C 50 carotenoid skeleton compound, and may be a medium containing components that are generally used for cell culture.
  • a carbon source that can be a supply source of IPP and DMAPP may be contained in the medium. Examples of such a carbon source include various saccharides such as glucose.
  • the temperature during the cultivation is not particularly limited, but is preferably 18 to 30 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
  • the culture time is not particularly limited, but it is preferably 12 to 72 hours, more preferably 24 to 48 hours, from the expression of the gene introduced by transformation.
  • Recovery of C 50 carotenoid from the culture after culturing can be performed according to a method commonly used for obtaining a product such as carotenoid from cells such as microorganisms.
  • Carotenoids may be obtained from the cells by separating only the cells from the culture.
  • the present invention is transformed with a mutant phytoene desaturase gene, a mutant phytoene desaturase encoded by the mutant phytoene desaturase gene, and a mutant phytoene desaturase gene. Further, cells capable of producing a C 50 carotenoid by desaturating a C 50 carotenoid skeleton compound are also targeted.
  • the present invention can also be used for highly efficient synthesis of such desaturation C 55 carotenoids and unsaturated C 60 carotenoid.
  • FDS I78G a double mutant of FDS
  • FDS farnesyl diphosphate synthase
  • I78G glycine
  • 81st tyrosine is replaced with alanine (Y81A) Y81A)
  • Y81A alanine
  • fds Y81A, V157A is a mutant of farnesyl diphosphate synthase (FDS) derived from Geobacillus stearothermophilus.
  • FDS farnesyl diphosphate synthase
  • the present inventors further shifted the size specificity to the substrate by further introducing a mutation into the mutant gene fds Y81A using the terpene synthase gene screening method described in Japanese Patent Application No. 2010-258989. Fds Y81A and V157A encoding mutant enzyme were prepared.
  • C 50 carotenoid skeletal compound (16,16'-diisopentenyl phytoene) by bimolecular condensation of C 25 PP, the mutant genes crtM F26A , W38A, 233S are used.
  • crtM Staphylococcus aureus-derived diapophytoene synthase
  • CrtM Staphylococcus aureus-derived diapophytoene synthase
  • the present inventors introduced a mutation in the crtM gene in order to produce an enzyme with improved size selectivity for the substrate (Umeno et al., J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002), Umeno et al., Nucleic Acids Res 31, e91 (2003)). It was found that when C 25 PP was given to a CrtM double mutant having mutations F26A and W38A, a C 50 carotenoid skeleton compound was slightly synthesized (Non-patent Document 7).
  • F26A the triple mutant of CrtM introduced with F233S mutation in addition to W38A is very efficient synthesis of C 50 carotenoid skeleton compounds from C 25 PP bimolecular, slightly given a C 30 PP C
  • 60 carotenoid skeletal compounds (Maiko Furubayashi, Yasutomo Ginger, Junichi Saito, Tasuke Umeno, Active Evolution of Non-Natural Carotenoid Synthetic Pathways, Japan Society for Agricultural Chemistry, Kanto Branch, 2010 Annual Meeting, October 9, 2010: Tasuke Umeno, Maiko Furubayashi, Yasutomo Ginger, Akihito Hambami, Jun Yi, Jun Jun Sugawara, Creating and nurturing non-natural biosynthetic pathways, “Creating Cells” Workshop 3.0, Institute of Industrial Science, University of Tokyo, November 12, 2010 The international chemical congress of Pacific basin societies, Hawaii, USA, December 17, 2010: Furubayashi M, Saito K, Umeno D, In-laboratory genetic
  • pAC-crt MF26A, W38A, and F233S are lac promoter / operator ( lacPO ) -crtM F26A , W38A at the BamHI site of the pACmod vector (Claudia Schmidt-Dannert et al., Nat. Biotechnol., 18: 750-753 (2000)). Then, it was prepared by inserting F233S .
  • pUC-fds Y81A, V157A is pUC18Nm vector (Umeno D. et al, J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)) fds Y81A the lacPO downstream, it was generated by inserting the V157A gene.
  • the transformed E. coli was cultured by the method described in Non-Patent Document 7.
  • Example 1 Improved fds Y81A for synthesis of C 50 carotenoid framework compound And V157A, crtM F26A, W38A, in addition to the F233S, genes encoding isopentenyl diphosphate isomerase (Idi) (from the E. coli genome) was expressed in E. coli XL1-Blue, was cultured E. coli.
  • fds Y81A Transformation of E. coli XL1-Blue with V157A and crtM F26A , W38A, F233S was carried out by a conventional method using plasmids pAC-crtM F26A , W38A, F233S- idi (FIG.
  • FIG. 2 (f): SEQ ID NO: 9 was prepared.
  • pAC-crt MF26A, W38A, and F233S - idi were prepared by inserting lacPO - idi upstream of the ClaI site of pAC-crt MF26A, W38A, and F233S .
  • pUC-fds Y81A and V157A were produced in the same manner as in Reference Example 1. Culture of transformed Escherichia coli and analysis of the produced carotenoid were performed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the inventors of the present invention attempted to link crtI downstream of the araBAD promoter that can suppress leaky expression (low level expression that occurs without induction) and to express it in E. coli XL1-Blue.
  • the carotenoid biosynthetic genes upstream of crtI are steadily expressed with lacP , and after reaching a sufficient density / number of bacteria, the expression of crtI is induced to desaturate the C 50 carotenoid skeletal compound and dye Attempted to form.
  • the plasmid used was pUC-pBAD-crtI (in which crtI was introduced into the crtI variant part of FIG. 2 (b)).
  • the lac promoter / operator ( lacPO ) of the pUC18Nm vector (Umeno D. et al, J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)) was removed, and the araC gene / araBAD promoter sequence derived from the pBADHisA vector (invitrogen) was inserted.
  • CrtI was inserted into the XhoI-ApaI site downstream of the promoter.
  • crtI is a gene encoding a wild-type phytoene desaturase derived from Pantoea ananatis (Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990)).
  • FIG. 4A shows an outline of the operation of this embodiment
  • FIG. 4B shows the principle of screening.
  • the ligation product was transformed into Escherichia coli XL10-Gold (Stragatene), and a part of the ligation product was spread on LB (Luria Bertani) solid medium.
  • the remaining transformant, E. coli was added to 10 mL LB liquid medium and cultured overnight at 37 ° C., and then a plasmid was extracted from 2 mL, and this was designated as “mutant crtI plasmid library”. Further, the number of transformed cells (library size) was calculated from the number of colonies formed in the solid medium and found to be 10 5 cfu / transformation.
  • Escherichia coli XL1-Blue having plasmids pAC-crtM F26A , W38A, F233S- fds Y81A, V157A (indicated as “pAC-C 50 ” in FIG. 4B: SEQ ID NO: 11) was transformed with the plasmid library thus obtained.
  • LB solid medium (containing 50 ⁇ g / mL carbenicillin, 30 ⁇ g / mL chloramphenicol) mounted with a nitrocellulose filter. After culturing at 37 ° C. for 24 hours until colonies formed, the mixture was further allowed to stand at room temperature for 48 hours.
  • E. coli XL1-Blue was transformed with pUC-pBAD-crtI containing wild type crtI .
  • the colony showed skin color.
  • 8 colonies exhibiting a particularly intense reddish purple were visually detected.
  • Each colony was named CrtI-m1, m2, ..., m8. 4 as shown in (b),
  • CrtI-m2 and CrtI-m8 were found to have the same mutation (N304S) in which the 304th asparagine (N) was substituted with serine (S).
  • CrtI-m1 and CrtI-m4 have a mutation (F339S, F339L) in which the 339th phenylalanine (F) is substituted with serine (S) or leucine (L).
  • CrtI-m6 and CrtI -m7 had a mutation (I338V) in which the 338th isoleucine (I) was replaced by valine (V).
  • Example 3 of the variant CrtI by colony obtained in Synthesis Example 2 desaturation C 50 carotenoid, CrtI-m1, m2, m4 dye formation has been enhanced as compared with the wild-type CrtI, For m6 and m8, the desaturation ability of the C 50 carotenoid skeleton compound was confirmed.
  • Escherichia coli XL1-Blue carrying pAC- crtM F26A, W38A , F233S- fds Y81A, V157A was transformed with plasmids pUC-pBAD-CrtI-m1, m2, m4, m6, m8, respectively , and a nitrocellulose (NC) membrane
  • the mixture was sprayed on an LB agar medium on which the medium was placed and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the plasmid pUC-pBAD-CrtI-m1, m2, m4, m6, m8 has various mutant genes mut1, mut2, mut4, mut6, mut8 in the crtI * part of pUC-pBAD-crtI * -crtY in FIG.
  • the nucleotide sequence of the plasmid with mut2 inserted is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the NC membrane was placed on the LB agar medium containing 0.2% arabinose and cultured at room temperature with the colonies on board. Colonies were inoculated into 2 mL LB medium (containing 50 ⁇ g / mL carbenicillin, 30 ⁇ g / mL chloramphenicol) and cultured overnight at 37 ° C. 300 ⁇ L of the culture solution was inoculated into 30 ⁇ mL TB medium (containing 50 ⁇ g / mL carbenicillin and 30 ⁇ g / mL chloramphenicol) and subjected to shaking culture at 30 ° C. and 200 ⁇ rpm. After shaking culture for 24 hours, 20% arabinose was added to the culture solution to a final concentration of 0.2%, and shaking culture (30 ° C) was further performed for 48 hours.
  • the culture was measured for OD 600 and the cells were collected by centrifugation.
  • the pellet obtained by collecting the cells was washed with physiological saline, and the fat-soluble fraction was extracted with 10 mL acetone. 300 ⁇ L was collected from the extract, and the absorption spectrum was measured using Spectra Max 384 (Molecular Device).
  • FIG. 5 (a) is a photograph showing the actual color of each acetone extract.
  • E. coli expressing mut2, mut8, mut1, mut4, and mut6 the absorbance at around 500-600 nm of the acetone extract increased compared to E. coli expressing wild-type crtI (WT) (FIG. 5 (b)). )).
  • WT wild-type crtI
  • CrtI-m2 and CrtI-m8 having mutant CrtI with N304S showed strong color and absorbance.
  • the rightmost peak (shoulder) is at about 540 nm, which contains a large amount of 6-step unsaturated products (15 conjugated double bonds). Indicates that Most C 50 of were often synthesis of the unsaturated carotenoids were in the case of introducing CrtI-m @ 2 or CrtI-m8.
  • Mass spectrometry of the fractions obtained by HPLC was performed in a field desorption mode using an M-2500 type Hitachi double-focusing mass spectrometer (Hitachi) (Takaichi (1993) Org. Mass Spectrom. 28: 785-788)).
  • the plasmid pUC-pBAD-crtI / CrtI-m2-crtY was used for transformation of the crtY gene.
  • the plasmid was prepared by inserting the SpeI site after the ApaI site of pUC-pBAD-crtI / CrtI-m2 and inserting the crtY gene into the ApaI / SpeI site.
  • the crtY gene is a gene encoding lycopene cyclase derived from Pantoea ananatis (Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990)).
  • the notation of CrtI-m2 in the plasmid means that the mutant gene crtI N304S derived from CrtI-m2 has been inserted.
  • the nucleotide sequence of pUC-pBAD-CrtI-m2-crtY is shown in SEQ ID NO: 13.
  • pUC-CrtI-m2-CrtY was transformed into E. coli XL1-Blue having pAC- crtM F26A, W38A , F233S- fds Y81A, V157A .
  • crtY was transformed with wild type crtI instead of crtI-m2.
  • Escherichia coli was spread on an LB agar medium on which a nitrocellulose (NC) membrane was placed and cultured at 37 ° C. for 24 hours. After the colony was formed, the NC membrane was transferred to an LB agar medium containing 0.2% arabinose in the state of the colony, and cultured at room temperature to observe the colony color.
  • NC nitrocellulose
  • FIG. 7 shows a photograph of the transformed E. coli cultured for 0 to 48 hours.
  • Escherichia coli (“CrtI 2 Y” in FIG. 7) transformed with a plasmid having crtY downstream of the mutant crtI derived from CrtI-m2 showed a very dark red color.
  • C 50 - ⁇ -carotene A sample corresponding to peak 7 in FIG. 6 was fractionated by HPLC and subjected to mass spectrometry. HPLC elution time C 50 - was slower than lycopene. It is known that C 40 carotenoids show similar behavior. The absorption spectrum almost coincided with the chemically synthesized product (Khachik and Beecher (1985) J. Chromatogr. 346: 237-246) (FIG. 9 (c)). The absorption spectrum was similar to that with the characteristics of bicyclic carotenoids. The mass number obtained by mass spectrometry was 668, which was consistent with the estimated structure (Compound No. 7 in FIG. 1).
  • Example 5 further extends the route for synthesizing a cyclic C 50 carotenoids was confirmed by extended Example 4 according to a further modification of the annular C 50 carotenoid pathway, was synthesized oxo carotenoids.
  • the plasmid pUC-pBAD-crtI-crtWZY containing crtW , crtZ and crtY (FIG. 2 (d): SEQ ID NO: 14) was used.
  • the plasmid was obtained by amplifying crtW , crtZ , crtY (SEQ ID NO: 6) of Paracoccus sp. N81106 from the plasmid pAK32 (Misawa N. et al., J Bacteriol 177, 6575-6584 (1995)).
  • pUC-pBAD-crtI-crtWZY and pUC-pBAD-CrtI-m2-crtWZY were prepared.
  • the prepared plasmid was introduced into E. coli (XL1-Blue) together with pAC- crtM F26A, W38A , F233S- fds Y81A, V157A , and E. coli was cultured, and the colony color was observed.
  • Example 7 Acquisition of mutant crtI having high ability to desaturate C 50 carotenoid skeleton compound
  • CrtI-m2 had the highest desaturation efficiency of the C50 skeleton. Therefore, focusing on the amino acid substitution N304S of CrtI-m2, site-specific total substitution of the 304th amino acid was performed to search for mutants with higher desaturation efficiency.
  • a library was prepared by PCR and subsequent cloning using a primer in which the 304th amino acid was randomized (NNK codon).
  • the obtained plasmid library was screened by the same method as described in Example 2.
  • a colony showing a red color than CrtI wild type was searched for, and a plasmid of CrtI mutant was isolated.
  • These CrtI mutants were screened again, those that were replaced with glycine (G), serine (S), asparagine (N), proline (P), alanine (A) gave particularly red colonies,
  • the P substitution (codon: CCT) gave the most red colonies.
  • the amino acid sequence of CrtI having a P-substitution product is shown in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Colonies were inoculated into 2 mL LB medium (containing 50 ⁇ g / mL carbenicillin and 30 ⁇ g / mL chrolamphenicol) and cultured at 37 ° C. overnight. 300 ⁇ L of the culture solution was inoculated into 30 mL TB medium (containing 50 ⁇ g / mL carbenicillin and 30 ⁇ g / mL chrolamphenicol), and subjected to shaking culture at 30 ° C. and 200 rpm. After shaking culture for 36 hours, 20% arabinose was added to the culture solution to a final concentration of 0.2%, and shaking culture (30 ° C.) was further performed for 36 hours. HPLC analysis was performed by the method shown in Example 3.
  • Example 8 Examination of use of CrtW and CrtZ derived from Brevundimonas sp. Strain SD-212 In Example 5, in addition to C50- ⁇ -carotene, CrtW and CrtZ derived from Paracoccus sp. Aimed at production of astaxanthin. Although a polar peak was observed, most of C50- ⁇ -carotene remained unmodified by CrtW or CrtZ. Therefore, we aimed to synthesize C50-astaxanthin and its intermediates, C50-zeaxanthin and C50-canthaxanthin, using more efficient CrtW and CrtZ.
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtW BD -CrtZ BD was prepared.
  • PUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtW BD and pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZ BD were also prepared.
  • Example 9 Increase of C50-astaxanthin by co-expression of idi
  • Example 8 using pAC-crtM F26A , W38A, F233S- fds Y81A, V157A and pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtW BD -CrtZ BD C50-astaxanthin was synthesized in E. coli by the method described, and the amount of synthesis was determined from the HPLC peak area.
  • pAC- c rtM F26A, W38A, F233S -fds Y81A create a V157A -idi, E. coli with pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtW BD -CrtZ BD (XL1-Blue)
  • the amount of carotenoid synthesis was determined by the same method.
  • the plasmid map of pAC-crtM F26A , W38A, F233S- fds Y81A, V157A- idi is shown in (l) of FIG. 11, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 19.
  • Example 10 The compound in the peak of C50- ⁇ -carotene obtained in Example 4 (peak 7 in Fig. 6), and the C50-zeaxanthin, C50-canthaxanthin, C50- identified in Example 8 The compounds in the astaxanthin peak (peaks 1, 2 and 3 in FIG. 12) were identified.
  • the maximum absorption wavelength of the compound in the peak of C50- ⁇ -carotene (peak 7 in Fig. 6) is 467 (shoulder), 501, and 534 nm in methanol, and the peak shifts to a lower wavelength side than C50-lycopene. Therefore, it is a carotenoid with a ring structure (Takaichi, S. & Shimada, K. Methods Enzymol. 213, 374-385 (1992)). Cyclization is also evident from the increased elution time in reverse phase HPLC. The molecular mass was 668, identical to the value calculated for C50- ⁇ -carotene.
  • the compound in the C50-zeaxanthin peak (peak 1 in FIG. 12) has a molecular mass of 700, and its HPLC elution profile and absorption spectrum are as shown in panel (a) of FIG. 12.
  • the polarity of the elution peak Considering the shift to the side, it was determined that it was C50-zeaxanthin.
  • the compound in the peak of C50-canthaxanthin (peak 2 in FIG. 12) has a molecular mass of 696, and its HPLC elution profile and absorption spectrum are as shown in panel (b) of FIG. Considering the shift to the polar side, it was determined that it was C50-canthaxanthin.
  • Example 11 Production of carotenoids of various structures by additional expression of CrtG and CrtX crtG gene derived from Brevundimonas sp. Strain SD-212 (Nishida, Y. et al, Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296, 2005) And further diversification of the synthesized carotenoid structure by further expressing the crtX gene from Pantoea ananatis.
  • the crtX gene is a gene encoding zeaxanthin glucosyltransferase.
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtG-CrtZ BD and pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtG-CrtW BD -CrtZ BD were prepared using the crtG gene derived from the Brevandimonas sp. Strain SD-212. did.
  • C 50 -2-hydroxycanthaxanthin (Hydroxycanthaxanthin) and C 50 -2,2′-dihydroxycanthaxanthin (Dihidroxycanthaxanthin) in which the 2nd and 2 ′ positions of canthaxanthin are hydroxylated can be synthesized (FIG. 16). .
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtX-CrtZ BD and pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtX-CrtW BD -CrtZ BD were prepared using the crtX gene derived from Pantoea ananatis.
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtX-CrtZ shows BD and pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY- CrtX-CrtW BD -CrtZ BD plasmid maps in the respective Figure 15 (o) and (p), the nucleotide sequence Are shown in SEQ ID NOs: 22 and 23, respectively.
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtG-CrtZ BD is co-expressed with pAC- CrtM F26A, W38A , F233S -FDS Y81A, V157A in Escherichia coli (XL1-Blue) and sprayed on LB solid medium Then, when a colony was formed, a reddish purple colony was formed (FIG. 18).
  • the colonies were inoculated into a 2 mL mL LB liquid medium and cultured for 16 hours, and then this was inoculated in a 1/100 volume amount into a 30 mL TB liquid medium.
  • L-arabinose was added to a final concentration of 0.2% (v / v), and further cultured for 36 hours.
  • 2 mL was collected and collected from the culture solution, washed with physiological saline, and then 1 mL of acetone was added to extract the carotenoid fraction.
  • the cell pellet and acetone extract are shown in FIG.
  • the absorption spectrum of each extract is shown in FIG.
  • pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtX-CrtZ BD or pUC-pBAD-CrtI N304P -CrtY-CrtG-CrtZ BD and pAC-CrtM F26A , W38A, F233S -FDS Y81A, V157A were transferred to E. coli (XL1-Blue ). This cell colony was inoculated into a 2 mL LB liquid medium and cultured for 16 hours, and then this was inoculated into a 30 mL TB liquid medium in an amount of 1/100.
  • L-arabinose was added to a final concentration of 0.2% (v / v) and further cultured for 36 hours.
  • the culture solution was collected by centrifugation and washed with physiological saline.
  • 10 mL of acetone was added to extract the carotenoid fraction.
  • 1 mL chloroform and 35 mL 10% NaCl were added to extract the carotenoid fraction in the chloroform phase. All chloroform extracts were collected and MgSO 4 was added to remove water.
  • pAC-hexPS, pAC-FDS I78G, Y81A- idi, and pUC-CrtM F26A , W38A, F233S were prepared.
  • the plasmid maps of pAC-hexPS, pAC-FDS I78G, Y81A- idi, and pUC-CrtM F26A , W38A, F233S are shown in FIG. 20 (q), (r), and (s), respectively.
  • the numbers 24, 25, and 26 are shown.
  • pAC-FDS I78G, Y81A- idi or pAC-hexPS was transformed into E. coli (XL1-Blue) together with pUC-CrtM F26A , W38A or pUC-CrtM F26A, W38A, F233S, respectively .
  • Cell culture and analysis of the produced carotenoid were performed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the production method of the present invention can synthesize unsaturated C 50 carotenoids with high efficiency, and can synthesize various C 50 carotenoids.
  • C 50 carotenoids have hardly been confirmed in nature, and it can be said that there are no examples of synthesis.
  • Carotenoids are known to have physiological activities such as antioxidant activity, but C 50 carotenoids exhibit new effects that have never been seen before, and their activities are significantly enhanced compared to conventional carotenoids. It is expected that For example, C 50 carotenoid is expected to have high antioxidant activity, use as a new seed for physiologically active substances such as antitumor activity, and use as a functional dye molecule.
  • the manufacturing method of the present invention can also be used for highly efficient synthesis of such desaturation C 55 carotenoids and unsaturated C 60 carotenoid. Furthermore, the production method of the present invention can be applied to conventional methods such as cells (Klein-Marcuschamer D et al .: Trends Biotechnol 25,417-424 (2007), Kirby J et al .: Nat Prod Rep 25, 656-661 (2008)) with enhanced isoprenoid synthesis pathway. Combined with technology, it is considered that the types of carotenoids that can be synthesized are dramatically increased.

Abstract

本発明は、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養物から炭素数50 のカロテノイドを得ることを手段とする、効率よく炭素数50 のカロテノイドを不飽和化して種々の炭素数50 のカロテノイドを製造する方法を提供する。前記変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子は、炭素数50 のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするよう変異が導入されたものである。

Description

炭素数50のカロテノイドの製造方法
　本発明は、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養する工程を含む、炭素数50のカロテノイドの製造方法に関する。
　自然界には様々なカロテノイド（carotenoid）が存在する。現在までにおよそ750種類のカロテノイドが同定されており、その多くに、有用な生理機能や産業応用の可能性、例えば、抗酸化活性や抗腫瘍活性や、機能性色素分子としての用途が示されている。カロテノイドは、通常、炭素数が30または40のイソプレン骨格からなるテトラテルペンに分類される化合物である。自然界では基本となる炭素数30または40の直鎖状骨格の形成後に、環化などの種々の修飾が付与される。カロテノイドの構造多様性はかかる修飾の多様性に起因するものである。またカロテノイドは、修飾の多様性に基づく構造的差異により、生理活性が大きく変わることが知られている。
　数多くのカロテノイドが、植物等の自然界からの単離・抽出や化学合成により得られているが、最近では、微生物発酵を利用した生産も行われている。自然界にごく微量にしか存在しない希少なカロテノイドや、自然界には存在が認められない非天然のカロテノイドの生合成経路を確立するため、多くの研究者によって研究がなされてきた（非特許文献１～８、特許文献１）。非特許文献１～６では、いわゆるコンビナトリアル生合成という手法に基づき合成することにより、種々の構造のカロテノイドが得られている。コンビナトリアル生合成とは、遺伝子工学的手法を用いて微生物の生合成経路を改変し、目的の化合物を微生物に生産させる技術である。種々の構造をカロテノイドに与える修飾酵素は、基質の一部のみを認識して作用するという「局所特異的（locally specific）な」特質を持つものであり、修飾基質のかかる特質に基づき、カロテノイドのコンビナトリアル生合成が行われている（非特許文献９）。一方、非特許文献７、８、１１および特許文献１では、タンパク質工学を用いて創られた自然界には見いだされない酵素活性を使った代謝経路を構築するという方法で、種々の非天然カロテノイドの生合成を実現している。
　前述のとおり、自然界に存在するカロテノイドは、炭素数30および炭素数40の骨格を持つ。前者は、ファルネシル二リン酸（C15PP）二分子を頭‐頭縮合させて合成される4,4'-ジアポフィトエンから派生するものである。後者は、ゲラニルゲラニル二リン酸（C20PP）二分子を頭‐頭縮合させて合成されるフィトエン（炭素数40のカロテノイド骨格化合物）から派生するものである。前者は、自然界に存在すると知られている10数種類のカロテノイドの生合成経路の要であり、後者は約700種類以上のカロテノイドの生合成経路の要となっている。
　また、自然界には炭素数40よりも大きな炭素数50の骨格を持つカロテノイドが存在することも報告されている（特許文献２）。炭素数50の骨格を持つカロテノイドは、炭素数40のカロテノイドにイソプレンユニットを「あとづけ」で結合させて、総炭素数を45、50と増加させることにより合成される（非特許文献１０）。炭素数40以上の骨格、例えば炭素数50や炭素数60の骨格の合成経路は、ゲラニルファルネシル二リン酸（C25PP）やヘキサプレニル二リン酸（C30PP）などを原料として合成される。炭素数40以上の骨格を持つカロテノイドは、従来とは異なる生理機能、色素機能などの多くの可能性が期待されるにも関わらず、自然界における合成経路についての詳細な報告はなく、人工的な生合成経路の報告もほとんどない。
　本件の発明者の梅野は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus：黄色ブドウ球菌）由来の炭素数30のカロテノイドの合成酵素（CrtM）を改変し、ゲラニルファルネシル二リン酸（C25PP）を二分子縮合して炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成する機能をもつ酵素を開発した。さらに梅野は、大腸菌（Escherichia coli）において当該酵素を適当な前駆体合成酵素とともに共発現させ、炭素数50のカロテノイド骨格化合物である16,16'-ジイソペンテニルフィトエンを生産させることに、世界で初めて成功した（非特許文献７）。しかし非特許文献７における合成経路では、炭素数50以外の炭素数30、炭素数40、炭素数45などの骨格を持つカロテノイドも共に合成されていた。この経路に野生型のフィトエン不飽和化酵素（フィトエンデサチュラーゼ）を追加しても、炭素数50のカロテノイド骨格化合物の約75%が不飽和化されずに残っており、合成効率の悪いものであった（非特許文献８）。
米国特許出願公開第2002/0051998号明細書 特開平7-132096号公開公報
Takaichi S. et al., Eur J Biochem 241, 291-6(1996) Yokoyama A. et al., Tetrahedron Lett. 39, 3709-12 (1998) Albrecht M. et al., Nat. Biotechnol. 18,843-6 (2000) Lee P. C. et al., Chem. Biol. 10, 453-462 (2003) Mijts B. N. et al., Chem. Biol. 12, 453-460 (2005) Umeno D. et al., Appl Environ Microbiol 69, 3573-3579 (2003) Umeno D. et al., J Bacteriol, 186, 1531-1536 (2004) Tobias A. V. et al., Biochim Biophys Acta, 1761, 235-246(2006) Umeno D. et al., Microbiol Mol Biol Rev 69, 51-78 (2005) Krubasik P. et al., Eur J Biochem 268, 3702-3708 (2001) Schmidt-Dannert C. et al., Nature Biotech. 18, 750-753(2000)
　炭素数50のカロテノイドは炭素数40のカロテノイドに比べて、より大きな骨格を持つため、収容できる共役二重結合サイズが大きいという物質としての優位性を持つ。自然界における炭素数40カロテノイドの合成経路のように、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成して不飽和化したものを得ることができれば、様々な修飾酵素と組み合わせることにより、多様な構造および生理活性を持つ炭素数50のカロテノイドを製造することができると考えられる。本発明の課題は、効率よく炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して、種々の炭素数50のカロテノイドを製造する方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、フィトエン不飽和化酵素（フィトエンデサチュラーゼ：CrtI）に変異を導入した変異型フィトエン不飽和化酵素により、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を効率よく不飽和化し得ることを見出し、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子を導入した細胞を培養することにより、炭素数50のカロテノイドを効率よく簡便に合成し得ることに着目し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は以下に関する。
１．炭素数50のカロテノイドの製造方法であって、
変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするよう変異が導入されたものであり、
変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養後の培養物から炭素数50のカロテノイドを得ることを手段とする炭素数50のカロテノイドの製造方法。
２．変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、前項１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
３．変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、前項１または２に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
４．変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、パントエア・アナナチス（Pantoea ananatis）由来のフィトエン不飽和化酵素遺伝子に変異を導入したことを特徴とする、前項１～３のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
５．前記細胞が、大腸菌または酵母である、前項１～４のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
６．変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞がさらに、ゲラニルファルネシル二リン酸を二分子縮合することにより炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項１～５のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
７．前項１～６のいずれか１に記載の細胞がさらに、ファルネシル二リン酸および／またはゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルファルネシル二リン酸を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項１～６のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
８．前項１～７のいずれか１に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項１～７のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
９．前項８に記載の環化がβ環化であり、前項８に記載の細胞がさらに、末端にβ環を有する炭素数50のカロテノイドにおいて、β環をヒドロキシル化する酵素および／またはβ環をケト化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項８に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
１０．前項１～７のいずれか１に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドを酸化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項１～７のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
１１．炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたことを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
１２．炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が、配列番号１に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、前項１１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
１３．前項１１または１２に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子の変異が少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
１４．前項１１～１３のいずれか１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子によりコードされていることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素。
１５．前項１１～１３のいずれか１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して炭素数50のカロテノイドを製造し得る細胞。
　本発明の製造方法によれば、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を効率よく不飽和化することができ、多様な構造を持つ炭素数50のカロテノイドを製造することができる。野生型フィトエン不飽和化酵素を含むいくつかの酵素では、炭素数50のカロテノイド骨格化合物に対して最大で数%程度の不飽和化効率しか示さなかったが、本発明の製造方法によれば飛躍的に不飽和化効率が上昇した。このため炭素数50の不飽和化カロテノイドを下流の修飾酵素に受け渡すことが可能となり、多様な炭素数50のカロテノイドが製造可能となった。
　カロテノイドは、酸素等を含まない炭素数40（ある種の細菌では炭素数30）のカロテノイド骨格化合物が酸素添加等の種々の修飾を受けることにより多様な構造を獲得している。自然界の最も主要なカロテンはβ環をもつβ-カロテンであり、自然界にはβ環を修飾する種々の酵素が存在している。本発明の製造方法によれば、β環をもつ炭素数50カロテノイドを合成することが可能である。さらに種々のβ環を修飾する酵素を用いることにより、多様なカロテノイドの生産が可能になる。
　本発明の製造方法により製造された炭素数50のカロテノイドは、従来カロテノイドに比べて抗酸化機能が向上している可能性や、色素としての色域が従来報告されていない範囲まで拡張したものである可能性、分解代謝されにくい性質を有する可能性などが期待される。
　また本発明の製造方法によれば、培地や培養条件は一般的なものを用いることができるため、炭素数50のカロテノイドを簡便に合成することが可能である。
　さらに本発明の製造方法を利用することにより、不飽和化C55カロテノイドや不飽和化C60カロテノイドなどの高効率な合成を実施することができる。
カロテノイド生合成に関連する酵素の機能と生合成経路を表す図である。各矢印の横に該当する反応を触媒する酵素の略称を示す。また、化合物名の後ろに括弧書きで示す数字は、図６のHPLC解析のピークの番号と対応している。 実施例１～６および参考例１および２において使用したプラスミドのマップを示す図である。（ａ）は、pAC-fdsY81A,V157A-crtMF26A,W38A,F233Sである。pACmodベクターにlacプロモータ／オペレータ(lacPO)-crtM F26A,W38A,F233S とlacプロモータ／オペレータ(lacPO)-fds Y81A,   V157A を挿入することによって作製した。（ｂ）は、pUC-pBAD-crtI*である。pUC18Nmベクターのlacプロモータ／オペレータを取り除き、araC遺伝子／araBADプロモータ配列（pBADHisAベクター由来）を挿入し、プロモータ下流に変異型crtI（crtI *）を挿入することによって作製した。（ｃ）は、pUC-pBAD-crtI*-crtYである。pUC-pBAD-crtI*の変異型crtIの下流にcrtYを挿入することによって作製した。（ｄ）は、pUC-pBAD-crtI*-crtWZYである。pUC-pBAD-crtI*の変異型crtIの下流にcrtW、crtZ、crtYを挿入することによって作製した。（ｅ）は、pUC-pBAD-crtI*-crtAである。pUC-pBAD-crtI*の変異型crtIの下流にcrtAを挿入することによって作製した。（ｆ）は、pUC-fdsY81A,V157Aである。pUC18NmベクターのlacPO下流にfds Y81A,V157A 遺伝子を挿入することによって作製した。（ｇ）は、pAC-crtMF26A,W38A,F233Sである。pACmodベクターのBamHIサイトにlacPO-crtM F26A,W38A,F233S を挿入することによって作製した。（ｈ）は、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-idiである。pAC-crtMF26A,W38A,F233SのClaIサイト上流にlacPO-idiを挿入することによって作製した。 FDSY81A, V157AとCrtMF26A, W38A, F233Sにより構築された代謝経路においてIdiを共発現させた場合の、C50カロテノイド骨格化合物の合成量を示す（実施例１）。「idiなし」および「idiあり」は、各種遺伝子により形質転換した大腸菌について、アセトン抽出液のHPLC分析から得たC35カロテノイド骨格を有する化合物（35）、C40カロテノイド骨格を有する化合物（40）、C45カロテノイド骨格を有する化合物（45）、C50カロテノイド骨格を有する化合物（50）の合成量を表す。具体的には図３中、「35」は4-アポフィトエン、「40」はフィトエン、「45」は16-イソペンテニルフィトエン、「50」はC50-カロテン(n=3)である。 炭素数50のカロテノイド骨格化合物を効率的に不飽和化し得る変異型フィトエン不飽和化酵素のスクリーニングについて示した図である（実施例２）。（ａ）はスクリーニング実験系の操作概略であり、（ｂ）はスクリーニングの原理を示す。 スクリーニングにより得られた8個のコロニーのうち6個について、（ａ）アセトン抽出液の実際の色と、（ｂ）アセトン抽出液の吸収スペクトルを表す図である（実施例３）。CrtEBIとはコントロールであり、パントエア・アナナチス（Pantoea ananatis）由来のcrtE、crtB、crtIを含むプラスミドpAC-EBIにより形質転換した大腸菌である。WT（またはCrtIwt）は、野生型crtIにより形質転換したもの、mut1、mut2、mut8、mut4、mut6は、各々CrtI-m1、CrtI-m2、CrtI-m8、CrtI-m4、CrtI-m6のコロニーの結果を示す。なお、これらの形質転換した大腸菌はリコペンを合成している。 pAC-fdsY81A,V157A-crtMF26A,W38A,F233Sと各種プラスミドにより大腸菌を共形質転換して培養した場合に製造されたカロテノイドについて、HPLC解析を行った結果を示す図である（実施例３～６）。（ａ）～（ｈ）は各種プラスミドを導入した場合のHPLC解析から得られたクロマトグラムを示す図である。（ｉ）は各ピークを形成する化合物の吸収スペクトルを示す図である。（ｉ）において右端の数値はクロマトグラムのピークの番号に該当し、3桁の数値は最大吸収波長の値である。 CrtIとCrtYの協働によるβ環化カロテノイド合成結果を示す図であり、各種遺伝子が導入された細胞を0～48時間培養したときのコロニー色を示す写真である（実施例４）。CrtIは、野生型crtIを大腸菌に導入した場合であり、CrtIYは野生型crtIとcrtYの両方を大腸菌に導入した場合であり、CrtI2は、CrtI-m2に由来する変異型crtIを大腸菌に導入した場合であり、CrtI2Yは、CrtI-m2に由来する変異型crtIとcrtYの両方を大腸菌に導入した場合である。なお各大腸菌にはpAC-fds Y81A,V157A -crtM F26A,W38A,F233S が導入されている。 （ａ）CrtIとCrtW、CrtZ、CrtYの協働、および（ｂ）CrtIとCrtAの協働によるカロテノイド合成結果を示す図である（実施例５）。（ａ）および（ｂ）は、各種遺伝子により形質転換した大腸菌について、アセトン抽出液の吸収スペクトルを表す図であり、（ｃ）は同様の場合について細胞ペレット（上段）とアセトン抽出液（下段）の実際の色を示す写真である。CrtI*はCrtI-m2に由来する変異型crtIを大腸菌に導入したことを表す。 （ａ）C50-カロテン(n=3)、（ｂ）C50-リコペン(n=15)、（ｃ）C50-β-カロテンの吸収スペクトルを示す図である（実施例３および４）。 CrtI-m2およびCrtIN304PによるC50-カロテン(n=3)、C50-リコペン、およびC50-β-カロテンの合成量をHPLCによって解析した結果を示す図である（実施例７）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）はそれぞれ、pUC-pBAD-CrtIで形質転換した大腸菌、pUC-pBAD-CrtI-m2で形質転換した大腸菌、pUC-pBAD-CrtIN304Pで形質転換した大腸菌、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtYで形質転換した大腸菌、およびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtYで形質転換した大腸菌についての結果である。（ａ）ではC50-カロテン(n=3)のみが合成され、（ｂ）および（ｃ）ではC50-カロテン(n=3)とC50-リコペンが合成され、（ｄ）および（ｅ）ではC50-カロテン(n=3)とC50-β-カロテンが合成されている。 実施例８および９において使用したプラスミドのマップを示す図である。当該プラスミドは、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属SD-212株由来のCrtWおよび／またはCrtZを含むものである。（ｉ）は、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDである。（ｊ）は、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtWBDである。（ｋ）は、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZBDである。（ｌ）は、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157A-idiである。 ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtWおよび／またはCrtZを含む各種プラスミドとpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aとを大腸菌に形質転換して培養した場合に製造された、C50-ゼアキサンチン、C50-カンタキサンチン、およびC50-アスタキサンチンについて、HPLC解析を行った結果を示す図である（実施例８）。（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）はそれぞれ、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aと、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZBD、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtWBD、およびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDとを形質転換した結果を示す。図中の数字１、２、および３はそれぞれC50-ゼアキサンチン、C50-カンタキサンチン、およびC50-アスタキサンチンのピークを示し、ダッシュ（プライム）のついた数字はそれらのシスピークを示す。 pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDとpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aとを形質転換した大腸菌におけるC50-アスタキサンチンの合成量が、idiを共発現させることにより著しく増加したことを示す図である（実施例９）。（ａ）はidiを共発現させなかった時の結果、すなわちpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157AとpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDとを形質転換した大腸菌におけるC50-カロテン(n=3)およびC50-アスタキサンチンの合成量を示す。（ｂ）はidiを共発現させた時の結果、すなわちpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157A-idiとpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDとを形質転換した大腸菌におけるC50-カロテン(n=3)およびC50-アスタキサンチンの合成量を示す。 pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDとpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aとを形質転換した大腸菌において合成された化合物がC50-アスタキサンチンであることをNMR解析により同定した結果を示す図である（実施例１０）。 実施例１１において使用したプラスミドのマップを示す図である。当該プラスミドは、ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtWおよび／またはCrtZに加え、ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtGまたはパントエア・アナナチス由来のCrtXを含むものである。（ｍ）は、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBDである。（ｎ）は、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtWBD-CrtZBDである。（ｏ）は、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBDである。（ｐ）は、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtWBD-CrtZBDである。 カロテノイド生合成経路において、CrtGをさらに発現させることより、さらに多様なカロテノイドを生産できることを説明する図である（実施例１１）。CrtGのさらなる発現により、C50-アスタキサンチンからC50-2-ヒドロキシアスタキサンチン（Hydroxyastaxanthin）およびC50-2,3,2’,3’-テトラヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4'-ジオンが生産される。C50-ゼアキサンチンからはC50-カロキサンチン（Caloxanthin）およびC50-ノストキサンチン（Nostoxanthin）が生産される。また、C50-カンタキサンチンからC50-2-ヒドロキシカンタキサンチン（Hydroxycanthaxanthin）およびC50-2,2'-ジヒドロキシカンタキサンチン（Dihidroxycanthaxanthin）が生産される。 カロテノイド生合成経路において、CrtXをさらに発現させることより、さらに多様なカロテノイドを生産できることを説明する図である（実施例１１）。CrtXのさらなる発現により、C50-アスタキサンチンからC50-アスタキサンチン-β-D-グルコシドおよびC50-アスタキサンチン-β-D-ジグルコシドが生産される。C50-ゼアキサンチンからはC50-ゼアキサンチン-β-D-グルコシドおよびC50-ゼアキサンチン-β-D-ジグルコシドが生産される。 C50-ゼアキサンチンおよびC50-アスタキサンチンを特異的に合成する大腸菌株へのCrtGまたはCrtXの追加発現により多様なカロテノイドを生産できたことを、コロニーーの色、細胞ペレットの色、およびカロテノイド抽出液の色により確認した結果を示す図である（実施例１１）。 C50-ゼアキサンチンおよびC50-アスタキサンチンを特異的に合成する大腸菌株へのCrtGまたはCrtXの追加発現により得たカロテノイド抽出液の吸収スペクトルを測定した結果を示す図である（実施例１１）。 C50-ゼアキサンチンを特異的に合成する大腸菌株へのCrtGまたはCrtXの追加発現により生産されたカロテノイドをHPLCによって解析した結果を示す図である（実施例１１）。図中、（ｂ）はCrtGの追加発現により、C50-カロキサンチン（C50-Caloxanthin、ピーク３）およびC50-ノストキサンチン（C50-Nostoxanthin、ピーク２）が生産されたことを示す。（ｃ）はCrtXの追加発現により、C50-ゼアキサンチン-β-D-ジグルコシド（C50-Zeaxanthin-β-D-diglucoside、ピーク５）が生産されたことを示す 実施例１２において使用したプラスミドのマップを示す図である。（ｑ）は、pAC-hexPSである。（ｒ）は、pAC-FDSI78G,Y81A-idiである。（ｓ）は、pUC-CrtMF26A,W38A,F233Sである。 C55カロテノイドおよびC60カロテノイドを生合成した結果を示す図である（実施例１２）。CrtMF26A,W38A,F233SとpAC-FDSI78G,Y81A-idiとを共発現した場合は、C45およびC50カロテノイドに加えてC55カロテノイドを生産した。また、CrtMF26A,W38A,F233SとhexPSとを共発現した場合はC60カロテノイドを特異的に合成した。一方で、CrtMF26A,W38Aを用いた場合は、C55カロテノイドおよびC60カロテノイドの生産がいずれも確認できなかった。 AC-FDSI78G,Y81A-idiまたはpAC-hexPSを、８種類のCrtM変異体（CrtM variants；pUC-CrtM変異体）と共発現させて、そのカロテノイド合成量を測定した結果を示す図である（実施例１２）。FDSI78G,Y81A-idiおよびCrtMF26A,F233SまたはCrtMF26A,W38A,F233Sを共発現させた細胞で、C55カロテノイドがより多く合成された。また、HexPSおよびCrtMW38A,F233SまたはCrtMF26A,W38A,F233Sを共発現させた細胞で、C60カロテノイドがより多く合成された。
　まずカロテノイドの生合成経路について説明する（図１参照）。カロテノイドは、自然界ではメバロン酸またはピルビン酸から生合成される。まず、メバロン酸経路または非メバロン酸経路（図１、MEP経路）によりイソペンテニル二リン酸（以下「IPP」とも称する）およびIPPが異性化した化合物であるジメチルアリル二リン酸（以下「DMAPP」とも称する）が合成される。次に、IPPと、DMAPPが縮合してゲラニル二リン酸（以下「C10PP」とも称する）が合成され、さらに２つのIPPが順次付加されることで、ファルネシル二リン酸（以下「C15PP」とも称する）やゲラニルゲラニル二リン酸（以下「C20PP」とも称する）が合成される。C15PPは、ファルネシル二リン酸合成酵素（ファルネシル二リン酸シンターゼ）により合成され、C20PPは、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素により合成される。
　炭素数40のカロテノイドを合成する経路では、フィトエン合成酵素（CrtB）により、二分子のC20PPが縮合されてフィトエンが合成され、これがカロテノイドの前駆物質（カロテノイド骨格化合物）となる。
　フィトエンが、順次不飽和されることにより、フィトフルエン、ζ－カロテン、ニューロスポレン、リコペン、テトラデヒドロリコペン等が合成される。リコペンの末端が環化や酸化されて修飾を受けることにより、α‐カロテン、β‐カロテン、γ‐カロテン、δ‐カロテン、ε‐カロテン 、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン等の種々のカロテノイドが合成される。なお、炭素と水素のみで構成されているカロテノイドはカロテン類、炭素と水素以外に酸素元素も含むものはキサントフィル類に分類される。
　本発明は、自然界に存在するカロテノイドの生合成経路を改変して炭素数50のカロテノイドを製造することを可能としたものであり、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養後の培養物から炭素数50のカロテノイドを得ることを手段とする、炭素数50のカロテノイドの製造方法を対象とするものである。なお、本明細書においては「炭素数50」を単に「C50」と表す場合もあり、炭素数35、40、45、55、60等においても同様とする。
　本明細書において「炭素数50のカロテノイド」は、変異型フィトエン不飽和化酵素により不飽和化される「炭素数50のカロテノイド骨格化合物」とは区別され、炭素数50のカロテノイド骨格化合物が不飽和化されて二重結合が１以上増加した化合物を指す。炭素数50のカロテノイドは、いかなる修飾を受けていてもよく、例えば末端にβ環やε環を有しているもの、ヒドロキシル基やケト基などの炭素と水素以外の元素を含む官能基を有するものも含まれる。また炭素数50のカロテノイドは骨格化合物に由来する炭素原子の数が50であればよく、例えば修飾によりメチル基やアセチル基などの炭素を含む官能基を付加された結果、総炭素数が50以上となったものも含まれる。
　「炭素数50のカロテノイド骨格化合物」は、炭素数50のカロテノイドの前駆物質であり変異型フィトエン不飽和化酵素によって不飽和化され得るものである。炭素数50のカロテノイド骨格化合物は具体的には、C50-カロテン(n=3)（16,16'－ジイソペンテニルフィトエン）、および、C50-カロテン(n=3)において共役二重結合が１～５個増加した化合物である。C50-カロテン(n=3)において二重結合が１～５個増加した化合物とは具体的には、二重結合が１個増加したC50-カロテン(n=5)、２個増加したC50-カロテン(n=7)、図１中のC50-ζ-カロテン(n=11)、C50-ニューロスポレン(n=13)等である。なお本明細書において化合物の慣用名の後ろなどに記載しているnは、共役二重結合の数を表す。
　本明細書においては、変異型フィトエン不飽和化酵素により不飽和化されているが、その後の修飾を受けていないものを、「炭素数50の不飽和化カロテノイド」と称する。炭素数50の不飽和化カロテノイドは直鎖状の化合物であり、骨格化合物に由来するもの以外の官能基を有さないものである。炭素数50の不飽和化カロテノイドは、炭素数50のカロテノイドに包含される。炭素数50の不飽和化カロテノイドは具体的には、C50-カロテン(n=3)において二重結合が１～６個増加した化合物であり、C50-カロテン(n=3)自体は含まない。なお、C50-カロテン(n=3)において二重結合が６個増加したものは、C50-リコペン(n=15)である。
　また本明細書において、炭素数50のカロテノイド、炭素数50のカロテノイド骨格化合物、炭素数50の不飽和化カロテノイドなどを全て含む概念として、「炭素数50のカロテノイド骨格を有する化合物」という用語を使用する場合もある。
　炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する反応を触媒する変異型フィトエン不飽和化酵素は、野生型フィトエン不飽和化酵素（CrtI）に変異が導入されたものである。フィトエン不飽和化酵素（CrtI）は、炭素数40のフィトエンを不飽和化する酵素であり、自然界においては、３個の共役二重結合を包含するフィトエンを不飽和化して順次二重結合を導入し、１１個の共役二重結合を包含したリコペンを合成する反応を触媒する。本発明における変異型フィトエン不飽和化酵素は、変異が導入されたことによって、C50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性が野生型フィトエン不飽和化酵素に比べて増強したものである。
　本発明における変異型フィトエン不飽和化酵素は、変異によりC50のカロテノイド骨格化合物を不飽和する活性が増強されているものであれば、植物、細菌等を含むいかなる生物由来のものであってもよい。変異型フィトエン不飽和化酵素は、好ましくは微生物由来であり、さらに好ましくはパントエア（Pantoea）属（旧名エルビニア（Erwinia）属）に属する細菌由来であり、より好ましくはパントエア・アナナチス（Pantoea ananatis；旧名エルビニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）、イネ内穎褐変病菌）由来である。パントエア・アナナチス由来の野生型フィトエン不飽和化酵素（CrtI）のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。
　本発明において、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子（crtI *）は変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするものである。変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子における変異は、本発明の目的を達成するものであればいかなるものであってもよい。好ましくは当該変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであり、より好ましくは、少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものである。さらに好ましくは、少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換をもたらすものである。ここで「配列番号１におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、変異の対象となるアミノ酸が配列番号１においてＮ末端から数えてＸ番目であることを特定したものであるが、配列番号１に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するフィトエン不飽和化酵素においては、Ｘ番目とはならず、異なる数値として表現されることを包含するものである。
　変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子としては、具体的には、パントエア・アナナチス由来のフィトエン不飽和化酵素遺伝子（配列表の配列番号２に示す塩基配列）に、所望のアミノ酸置換をもたらす変異を導入した塩基配列が例示される。例えば変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子としては、配列番号２の塩基配列において911番目のアデニン（A）がグアニン（G）に置換している配列番号３の塩基配列を持つ遺伝子が例示される。当該911番目の塩基の置換により、配列番号１のアミノ酸配列の304番目のアスパラギンのセリンへの置換がもたらされる。なお配列番号２には、G1131A、A1476Tのノンシノニマス変異が入っている。また、例えば変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子としては、配列番号２の塩基配列において910～912番目の塩基配列AACがCCT、CCC、CCA、CCG、より好ましくはCCTに置換している塩基配列を持つ遺伝子（配列表の配列番号２８に示す塩基配列）が例示される。かかる塩基の置換により、配列番号１のアミノ酸配列の304番目のアスパラギンのプロリンへの置換がもたらされる（配列表の配列番号２７に示すアミノ酸配列）。なお配列番号２８には、G1131A、A1476Tのノンシノニマス変異が入っている。
　変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子は、変異型遺伝子のライブラリを作製し、ライブラリから、目的の機能を持つ酵素をコードする遺伝子をスクリーニングし、塩基配列を決定することができる。スクリーニングは例えば実施例に記載の方法により行うことができる。塩基配列が一旦決定されれば、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子は、化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたPCR、部位特異的突然変異誘発法等によって得ることができる。
　本発明は、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換される細胞を培地で培養する工程を含むが、当該細胞はもともと他のカロテノイド生合成遺伝子を有するものであってもよいし、他のカロテノイド生合成遺伝子を形質転換されたものであってもよい。他のカロテノイド生合成遺伝子は、C50カロテノイド骨格化合物を不飽和化する反応の上流または下流の反応に関連するものである。上流の反応は、C50カロテノイド骨格化合物を供給する経路に該当し、下流の反応は、C50不飽和化カロテノイドをさらに修飾する経路に該当する。
　C50のカロテノイド骨格化合物を供給する経路について説明する。IPP、DMAPP、C10PP、C15PP、C20PPは、多くの細胞、特に全ての微生物において、もともと合成が可能である。本発明における細胞は、C15PPおよび／またはC20PPからのゲラニルファルネシル二リン酸（以下「C25PP」とも称する）の合成、さらにC25PP二分子を縮合させることによるC50カロテノイド骨格化合物の合成を行うことができることが好ましい。さらに好ましくは本発明における細胞は、C15PPおよび／またはC20PPからC25PPを合成する酵素をコードする遺伝子、C25PPを二分子縮合させることによりC50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１以上により、形質転換されたものである。
　C15PPおよび／またはC20PPからC25PPを合成する酵素をコードする遺伝子は、目的とする機能を有する遺伝子であればいかなるものであってもよい。かかる遺伝子として例えば、ゲオバチルス（Geobacillus）属の中度好熱性細菌であるゲオバチラス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophillus）由来のファルネシル二リン酸合成酵素（FDS）の変異型遺伝子が例示される（Ohnuma, S. et al., J Biol Chem 271,30748-30754 (1996)、特願2010-258989）。当該変異型遺伝子として、81番目のチロシンがアラニンに置換（Y81A）し、かつ157番目のバリンがアラニンに置換（V157A）しているFDSの二重変異体（FDSY81A, V157A）をコードする遺伝子が挙げられる（fds Y81A,   V157A ：配列表の配列番号４）。
　C25PPを二分子縮合させることによりC50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子は、目的とする機能を有する遺伝子であればいかなるものであってもよい。かかる遺伝子として例えば、C15PPを二分子縮合させてC30カロテノイド骨格化合物を合成する、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のジアポフィトエン合成酵素（CrtM）の変異型遺伝子が例示される。当該変異型遺伝子として26番目のフェニルアラニンと38番目のトリプトファンがアラニンに置換（F26A、W38A）し、かつ233番目のフェニルアラニンがセリンに置換（F233S）しているCrtMの三重変異体（CrtMF26A,W38A,F233S）をコードする遺伝子が挙げられる（crtM F26A,W38A,F233S ：配列表の配列番号５）。CrtMF26A,W38A,F233Sは、きわめて効率的にC50カロテノイド骨格化合物を合成することがわかってきている。
　本発明の細胞に、C15PPおよび／またはC20PPからC25PPを合成する酵素をコードする遺伝子と、C25PP二分子からC50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子の両方を形質転換させた場合は、C50カロテノイド骨格化合物を高効率で生産することができ、好ましい。さらに、これらの遺伝子に加えて、IPPをDMAPPに異性化する酵素（例えば、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Idi））をコードする遺伝子（idi）により、本発明の細胞を形質転換してもよい。IPPをDMAPPに異性化する酵素をコードする遺伝子を細胞に形質転換することにより、C50カロテノイド骨格化合物の生産量と特異性をさらに向上させることができる。
　C50不飽和化カロテノイドをさらに修飾する経路について説明する。C50不飽和化カロテノイドは、自然界におけるリコペンやテトラデヒドロリコペンに相当すると考えられ、リコペンの修飾に関連する種々の酵素によりC50不飽和化カロテノイドを修飾し得ると予測される。本発明における細胞は、C50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子、および／またはC50の不飽和化カロテノイドを酸素添加して酸化する酵素をコードする遺伝子を含んでいてもよい。さらに本発明における細胞が、C50の不飽和化カロテノイドの末端を環化（特にβ環化）する酵素をコードする遺伝子を有する場合、当該細胞は、環状部分（特にβ環）をヒドロキシル化する酵素をコードする遺伝子、および／または環状部分（特にβ環）をケト化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていてもよい。なお、β環はβ-イオノン環と同義である。
　C50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子は、目的とする機能を有する遺伝子であればいかなるものであってもよい。かかる遺伝子として例えば、パントエア・アナナチス由来のリコペンからβ－カロテンを合成するリコペン環化酵素（CrtY）をコードする遺伝子（crtY）が例示される（Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990)）。
　末端がβ環化されたカロテノイドにおいて、β環をヒドロキシル化する酵素をコードする遺伝子、および／またはβ環をケト化する酵素をコードする遺伝子は、目的とする機能を有する遺伝子であればいかなるものであってもよい。かかる遺伝子として例えば、海洋細菌パラコッカス（Paracoccus）属N81106株（旧名アグロバクテリウム・アウランティアクム（Agrobacterium aurantiacum））由来、または、海洋細菌ブレバンディモナス（Brevundimonas）属SD-212株由来の、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ（CrtZ）遺伝子（crtZ）、β-イオノン環-4-ケトラーゼ（β-イオノン環-4-オキシゲナーゼ）（CrtW）遺伝子（crtW）（Misawa N. et al., J Bacteriol 177, 6575-6584 (1995); Nishida, Y. et al., Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296 (2005)）が例示される。パラコッカス属N81106株由来のcrtZ、crtW、前述のcrtYの結合した塩基配列を、配列番号６に示す。β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼは、β環の3位炭素をヒドロキシル化する反応を触媒するものであり、β-イオノン環-4-ケトラーゼは、β環の4位炭素に酸素添加してカルボニル基（ケト基）を形成する反応を触媒するものである。
　C50の不飽和化カロテノイドを酸化する酵素をコードする遺伝子は、目的とする機能を有する遺伝子であればいかなるものであってもよい。かかる遺伝子として例えば、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphearoides）由来のスフェロイデンモノオキシゲナーゼ（CrtA）遺伝子（crtA）が例示される（配列番号７）。スフェロイデンモノオキシゲナーゼは、スフェロイデンに酸素原子を挿入してスフェロイデノンへと変換させる酸化反応を触媒する酵素である。
　本発明の細胞は、製造するカロテノイドの種類に応じて、上記以外のC50不飽和化カロテノイド修飾経路に関連する種々の酵素をコードする遺伝子により形質転換されてもよい。例えば、ブレバンディモナス属SD-212株由来のβ－イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ（CrtG）遺伝子（国際公開WO2005/049643号公報においては「CrtV」と表記されている）（Nishida, Y. et al, Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296, 2005）により、当該細胞を形質転換することにより、有機合成が困難とされるβ環の2位および2'位をヒドロキシル化したC50カロテノイドの生産なども可能になる。また、パントエア・アナナチス由来のゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（crtX）遺伝子（Misawa N, J Bacteriol 172, 6704-6712, 1990）により、当該細胞を形質転換することにより、β環の3位および3'位の水酸基がグリコシド化されたしたC50カロテノイドの生産なども可能になる。
　本発明における、C50カロテノイドを製造し得る細胞は、適当な発現ベクターを選択し、公知の外来遺伝子の導入・発現法により製造することができる（例えば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001）。形質転換により細胞に導入する遺伝子を、PCR法など常法により調製し、その遺伝子を宿主に適する発現ベクターに常法により組み込み、目的のベクターを選択し、そのベクターにより宿主細胞を常法により形質転換することにより得られる。二種類以上の遺伝子により細胞を形質転換する場合には、それら複数の遺伝子を同一の発現ベクターに組み込んで形質転換してもよいし、異なる発現ベクターに組み込んで共形質転換してもよい。
　宿主となる細胞は、制限されないが、培養時間の短縮やクローニングの容易さを考え、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物が好ましい。特に大腸菌、酵母が好ましく、好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blue（以下単に「大腸菌XL1-Blue」と表す。）のようなクローニング株、HB101やBL21などの発現株に加え、テルペン前駆体の合成量が豊富な遺伝子ノックアウト株、たとえばJW1750 ΔgdhA (glutamate dehydrogenase欠損)、JW0110 ΔaceE(pyruvate dehydrogenase欠損)（Baba,T. et al.; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)）等が挙げられ、好適な酵母としては、標準的な発芽酵母、INVSc1(invitrogen)、YPH499(stratagene)等が挙げられる。
　遺伝子を組み込む発現ベクターは、特に制限はなく、一般に用いられているベクターでよい。例えば、宿主が大腸菌であるときは、pUC18、pACYC184などに由来するものが挙げられ、宿主が枯草菌であるときはpUB110、pE194、pC194、pHY300PLK DNAなどが、宿主が酵母であるときは、pRS303、YEp213、TOp2609等が挙げられる。
　目的の遺伝子が宿主の細胞に導入されたか否かの確認は常法により行うことができ、例えば、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　本発明のC50カロテノイドの製造方法は、上述のようにして得られた形質転換体である細胞を、培地で培養する工程を含む。培地は、C50カロテノイド骨格化合物の供給源となり得る物質を含むものであればよく、細胞の培養に一般的に用いられるような成分が含まれる培地でよい。C50カロテノイド骨格化合物が、IPPおよびDMAPPの代謝により合成される細胞においては、IPPおよびDMAPPの供給源となり得る炭素源が、培地に含まれていればよい。かかる炭素源としては、グルコース等の種々の糖類が例示される。
　培養時の温度は特に限定されないが、18～30℃とするのが好ましく、20～30℃とするのがさらに好ましい。
　培養時間も特に限定されないが、形質転換により導入した遺伝子の発現から12～72時間培養することが好ましく、24～48時間培養することがさらに好ましい。
　培養後の培養物からのC50カロテノイドの回収は、微生物等の細胞から、カロテノイド等の生産物を得るのに常用される方法に従って行うことができる。培養物から細胞のみを分離して、細胞からカロテノイドを得てもよい。
　なお本発明は、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子、当該変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子によりコードされる変異型フィトエン不飽和化酵素、および変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換されている、C50カロテノイド骨格化合物を不飽和化してC50のカロテノイドを製造し得る細胞も対象とするものである。
　また、本発明は、不飽和化C55カロテノイドや不飽和化C60カロテノイドなどの高効率な合成にも利用することができる。例えば、ファルネシル二リン酸合成酵素（FDS）の78番目のイソロイシンがグリシンに置換（I78G）し、かつ81番目のチロシンがアラニンに置換（Y81A）しているFDSの二重変異体（FDSI78G,Y81A）（Ohnuma S et al., JBiol Chem 273, 26705-26713,1998）を用いて、本発明を利用することにより、C50カロテノイドに加えて不飽和化C55カロテノイドを高効率に製造することができる。また、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）由来のC30PP合成酵素（HexPS）（Shimizu N et al, J Bacteriol 180,1578-1581, 1998）を用いて、本発明を利用することにより、。これらFDSI78G,Y81AまたはHexPSをCrtM変異体と共発現させることにより、不飽和化C60カロテノイドを高効率に製造することができる。
　以下、本発明を実施例に示して具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）C50カロテノイド骨格化合物の合成
（１）C50カロテノイド原料であるC25PPの供給
　大腸菌（E. coli）内で効率よくC25PPを合成するために、変異型遺伝子のfds Y81A,   V157A を用いた。fds Y81A,   V157A は、ゲオバチラス・ステアロサーモフィルス由来のファルネシル二リン酸合成酵素（FDS）の変異体である。変異Y81AはOhnuma, S. et al., J Biol Chem 271,30748-30754 (1996)に由来している。また本発明者らは、特願2010-258989に記載のテルペン合成酵素遺伝子のスクリーニング方法を用いて、変異型遺伝子fdsY81Aにさらに変異を導入することにより、基質に対するサイズ特異性をさらにシフトさせた変異型酵素をコードするfds Y81A,V157A を作製した。
（２）C50カロテノイド骨格化合物の合成
　C25PPの二分子縮合によるC50カロテノイド骨格化合物（16,16'－ジイソペンテニルフィトエン）の合成には、変異型遺伝子のcrtM F26A,W38A,233S を用いた。スタフィロコッカス・アウレウス由来のジアポフィトエン合成酵素（CrtM）は本来、C15PPを二分子縮合させC30骨格のカロテノイドを合成する酵素である。本発明者らは、基質に対するサイズ選択性の向上した酵素を作製するために、crtM遺伝子に変異を導入した（Umeno et al.,J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)、Umeno et al.,Nucleic Acids Res 31, e91 (2003)）。F26A、W38Aの変異をもつCrtMの二重変異体にC25PPを与えると、わずかにC50カロテノイド骨格化合物を合成することがわかった（非特許文献７）。
　さらに、F26A、W38Aに加えてF233S変異を導入したCrtMの三重変異体が、二分子のC25PPからC50カロテノイド骨格化合物を極めて効率的に合成すること、C30PPを与えるとわずかながらC60カロテノイド骨格化合物を合成することを見出した（古林真衣子，生悦住茉友，斎藤恭一，梅野太輔．非天然カロテノイト合成経路の活性進化，日本農芸化学会関東支部2010年度大会，2010年10月9日：梅野太輔，古林真衣子，生悦住茉友，方波見彰仁，李伶，梶原順．非天然生合成経路を創り，そして育てる，「細胞を創る」研究会3.0，東京大学生産技術研究所，2010年11月12日：Furubayashi M, Saito K, Umeno D, In-laboratory genetic drift of carotenoid synthase and its evolution of size specificity. The international chemical congress of Pacific basin societies, Hawaii, USA, 2010年12月17日：古林真衣子，生悦住茉友，斎藤恭一，梅野太輔．酵素変異体のコンビナトリアル発現による非天然カロテノイドの選択的合成，2011年度農芸化学会大会，2011年3月）。C25PPを供給するfds Y81A,   V157A と、crtM F26A,W38A,F233S を大腸菌XL1-Blueに共発現させることにより、C50カロテノイド骨格化合物であるC50-カロテン(n=3)を効率よく（約61％）で生産することがわかった。
（３）なお、fds Y81A,   V157A とcrtM F26A,W38A,F233S による大腸菌XL1-Blueの形質転換は、常法によりプラスミドpAC-crtMF26A,W38A,F233S（図２（ｇ）：配列番号８）およびpUC-fdsY81A,V157A（図２（ｆ）：配列番号９）を作製して行った。
　pAC-crtMF26A,W38A,F233SはpACmodベクター（Claudia Schmidt-Dannert et al., Nat. Biotechnol., 18: 750-753(2000)）のBamHIサイトにlacプロモータ／オペレータ(lacPO)-crtM F26A,W38A,F233S を挿入することによって作製した。
　pUC-fdsY81A,V157AはpUC18Nmベクター（Umeno D. et al, J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)）のlacPO下流にfds Y81A,V157A 遺伝子を挿入することによって作製した。
　形質転換した大腸菌は、非特許文献７に記載の手法により、培養を行った。
　製造されたカロテノイドについての解析も、非特許文献７に記載の方法によりHPLCを用いて行った。
（実施例１）C50カロテノイド骨格化合物の合成の改良
　fds Y81A,   V157A と、crtM F26A,W38A,F233S に加えて、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Idi）をコードする遺伝子（大腸菌ゲノム由来）を大腸菌XL1-Blueにて発現させ、大腸菌を培養した。fds Y81A,   V157A とcrtM F26A,W38A,F233S による大腸菌XL1-Blueの形質転換は、常法によりプラスミドpAC-crtMF26A,W38A,F233S-idi（図２（ｈ）：配列番号１０）およびpUC-fdsY81A,V157A（図２（ｆ）：配列番号９）を作製して行った。pAC-crtMF26A,W38A,F233S-idiはpAC-crtMF26A,W38A,F233SのClaIサイト上流にlacPO-idiを挿入することによって作製した。pUC-fdsY81A,V157Aは参考例１と同様にして作製した。形質転換した大腸菌の培養、製造されたカロテノイドについての解析は参考例１と同様にして行った。
　結果を図３に示す。Idiを導入した場合は、Idiを導入していない場合に比べて、C50カロテノイド骨格化合物であるC50-カロテン(n=3)の生産量が増加した。またIdiを導入していない場合は、C40カロテノイド骨格化合物であるフィトエンが多量に合成されていたが、Idiを導入した場合は、フィトエンの生産量が減少し、C50-カロテン(n=3)の生産の特異性が向上した。Idiを導入した場合は、C50-カロテン(n=3)の合成効率が向上することがわかった（約90%）
（参考例２）野生型CrtIによるC50カロテノイド骨格化合物の不飽和化
　本発明者らは、CrtI（配列番号２（G1131A、A1476Tのノンシノニマス変異の入ったもの）の塩基配列を有する遺伝子がコードするフィトエン不飽和化酵素）によってC50カロテノイド骨格化合物をもつカロテノイドが不飽和化することを見出した（非特許文献９）。しかしその生産量は極めて少なく、C50カロテノイド骨格化合物のうち25%が不飽和化されるに留まっていることがわかった（非特許文献８）。
　一方、本発明者らは、lacプロモータ（lacP）などを用いた野生型CrtIの定常発現が細胞増殖を著しく阻害すること、また細胞の色素形成を著しく不安定化することを見出した。しかしながらC50カロテノイド骨格化合物の合成／蓄積までの経路を持つ細胞（例えば、参考例１や実施例１にて得られた細胞）では、明らかな細胞毒性は認められなかった。
　本発明者らは、leakyな発現（誘導しなくても起こる低レベル発現）を低く抑えることのできるaraBADプロモータの下流に、crtIを連結して、大腸菌XL1-Blueにおいて発現させることを試みた。crtIの上流のカロテノイド生合成遺伝子群はlacPで定常的に発現させ、菌密度／菌数が十分量に達した後に、crtIの発現を誘導して、C50カロテノイド骨格化合物を不飽和化して色素形成させることを試みた。
　用いたプラスミドは、pUC-pBAD-crtI（図２（ｂ）のcrtI variant部分にcrtIが導入されたもの）である。pUC18Nmベクター（Umeno D. et al, J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)）のlacプロモータ／オペレータ（lacPO）を取り除き、pBADHisAベクター（invitrogen）由来のaraC遺伝子／araBADプロモータ配列を挿入した。プロモータ下流のXhoI-ApaIサイトにcrtIを挿入した。crtIは、パントエア・アナナチス由来の野生型フィトエン不飽和化酵素をコードする遺伝子である（Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990)）。
　pUC-pBAD-crtIにより形質転換した大腸菌では、細胞毒性の問題は解消された。しかしながら、C50カロテノイド骨格化合物の不飽和化は、ほとんど確認できないほど極めて効率の低いものであった。
（実施例２）C50カロテノイド骨格化合物を不飽和化する変異型crtIの取得
　フィトエン不飽和化酵素（CrtI）の進化工学に基づき、より効率よくC50カロテノイド骨格化合物を不飽和化する変異型crtIの取得を目指した。図４（ａ）に本実施例の操作の概略を示し、図４（ｂ）にスクリーニングの原理を示す。
　まず、野生型crtIを含むプラスミドpUC-pBAD-crtI（図４（ｂ）中「pUC-I」と示す）をテンプレートとして、MnCl2を用いたエラープローンPCR法（Cadwellら：PCR Methods Appl 2, 28-33 (1992)）によりcrtIにランダム変異を導入した。得られたPCR産物を制限酵素のXhoI、ApaIで消化し、pUC-pBADベクターのaraBADプロモータ下流のXhoI、ApaIの制限酵素部位にライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌XL10-Gold（Stragatene）に形質転換し、その一部をLB（Luria Bertani）固体培地に散布した。残りの形質転換体である大腸菌を、10 mL LB液体培地に加え、37℃で一晩培養後、2 mLからプラスミドを抽出し、これを「変異型crtIプラスミドライブラリ」とした。また、固体培地に形成したコロニー数から、形質転換された細胞数（ライブラリサイズ）を算出したところ、105 cfu/transformationであった。
　こうして得たプラスミドライブラリによりプラスミドpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157A（図４（ｂ）中「pAC-C50」と示す：配列番号１１）を持つ大腸菌XL1-Blueを形質転換し、ニトロセルロースフィルタを載せたLB固体培地（50μg/mL carbenicillin, 30μg/mL chloramphenicolを含む）に散布した。37℃で24時間、コロニーが形成するまで培養した後、室温でさらに48時間静置した。
　コントロールとして、野生型crtIを含むpUC-pBAD-crtIにより大腸菌XL1-Blueを形質転換した。この場合、コロニーは肌色を示した。変異型crtIプラスミドライブラリを形質転換して得た約2000のコロニー群の中に、ひときわ強い赤紫色を呈する8個のコロニーを目視により検出した。それぞれのコロニーをCrtI-m1, m2, …, m8と名付けた。図４（ｂ）に示すように、C50不飽和化カロテノイドであるC50-リコペン(n=15)は赤紫色を呈する色素であり、かかる化合物が効率よく合成された結果、コロニーが赤紫色を呈したものと考えられた。
　各コロニーの菌株を、LB液体培地で37℃、12時間培養してプラスミドを抽出し、プラスミドに含まれる変異型crtIの塩基配列をダイデオキシ法によって解析した。解析した結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　CrtI-m2とCrtI-m8は同じ、304番目のアスパラギン（N）がセリン（S）に置換している変異（N304S）を有していることがわかった。また、CrtI-m1とCrtI-m4は、339番目のフェニルアラニン（F）がセリン（S）またはロイシン（L）へ置換している変異（F339S、F339L）を有しており、CrtI-m6とCrtI-m7は338番目のイソロイシン（I）がバリン（V）に置換している変異（I338V）を有していた。これらの変異により、変異型CrtIのC50カロテノイド骨格化合物の不飽和化能が高められたものと考えられた。
（実施例３）変異型CrtIによる不飽和化C50カロテノイドの合成
　実施例２にて得られたコロニーのうち、野生型CrtIに比べて色素形成が増強されていたCrtI-m1, m2, m4, m6, m8について、C50カロテノイド骨格化合物の不飽和化能を確認した。
　プラスミドpUC-pBAD-CrtI-m1, m2, m4, m6, m8のそれぞれにより、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aを持つ大腸菌XL1-Blueを形質転換し、ニトロセルロース（NC）膜をのせたLB寒天培地に散布して37℃で24時間培養した。プラスミドpUC-pBAD-CrtI-m1, m2, m4, m6, m8は、図２（ｃ）pUC-pBAD-crtI*-crtYのcrtI *の部分に各種変異型遺伝子mut1、mut2、mut4、mut6、mut8が挿入されたものであり、mut2の挿入されたプラスミドの塩基配列を配列番号１２に示す。
　コロニーが形成した後、コロニーの乗った状態でNC膜を、0.2 % アラビノース（arabinose）を含むLB寒天培地上に乗せ換えて、室温で培養した。コロニーを2 mL LB培地（50μg/mL carbenicillin, 30μg/mL chloramphenicolを含む）に植菌して、37℃で一晩培養した。培養液300μLを30 mL TB培地（50μg/mL carbenicillin, 30μg/mL chloramphenicolを含む）に植菌し、30℃、200 rpmで震盪培養を行った。24時間、震盪培養した後、培養液に20 % アラビノースを最終濃度 0.2 %となるように添加し、さらに48時間、震盪培養（30℃）を行った。
　培養液のOD600を測定して、細胞を遠心して集菌した。集菌して得たペレットを生理食塩水で洗浄し、10 mL アセトンで脂溶性画分を抽出した。抽出液から300μLを分取し、Spectra Max 384（Molecular Device社）を用いて吸光スペクトルを測定した。
　結果を図５に示す。図５（ａ）は各アセトン抽出液の実際の色を示す写真である。mut2、mut8、mut1、mut4、mut6を発現する大腸菌では、野生型crtI（WT）を発現する大腸菌に比べて、アセトン抽出液の500～600 nm付近の吸光度が増加していた（図５（ｂ））。特にN304Sのある変異型CrtIを有するCrtI-m2およびCrtI-m8では、強い色・吸光度を示していた。これらの変異型CrtIを発現させた場合では、最も右側のピーク（肩）が約540 nmにあるが、これは６ステップ不飽和化された産物（１５個の共役二重結合）が多量に含まれていることを示す。最もC50不飽和化カロテノイドの合成量の多かったのは、CrtI-m2またはCrtI-m8を導入した場合であった。
　次にCrtI-m2の場合に合成されたカロテノイドについてHPLC解析を行った。アセトン抽出液に1 mLヘキサンおよび35 mL 10 % NaClを加えてヘキサン相にカロテノイド画分を抽出した。ヘキサン抽出液の75%を回収し、これにMgSO4を少量加えて水分を除いた。ヘキサン溶媒を窒素により除去し、最終的に100μLヘキサン中にカロテノイド画分を濃縮してカロテノイド抽出液を得た。得られたカロテノイド抽出液のうち、25μL（全量の75% x 25% = 19%、7.3mL培地相当）を、HPLC-photodiodearrayシステムにインジェクションした。HPLCではTakaichi, S. Photosynth Res, 65,93-99 (2000)の条件に従って分析した（カラム：Waters Spherisorb(R) 5.0μm ODS2 4.6 mm x 250 mm Column、溶出液：Acetonitrile/Tetrahydrofuran/Metanol (58:7:35)　2 mL/min、検出器：Photodiode array (190～800 nm)）。またHPLCによって分取したものについての質量分析は、M-2500型日立二重収束質量分析計（日立製作所）を用いて、フィールド・デソープション・モードで行った(Takaichi(1993) Org. Mass Spectrom. 28:785-788))。 
　その結果、CrtI-m2ではC50カロテノイド骨格化合物を６ステップ不飽和化した化合物（C50-リコペン：C50-lycopene）を多く合成していることがわかった（図６（ｂ）ピーク3）。一方野生型CrtIにより形質転換した場合では、ほとんど不飽和化した化合物を合成してないことがわかった（図６（ａ））。
　図６（ｂ）のピーク2とピーク3についての解析結果を以下に示す。C50-カロテン(n=3)：図６（ｂ）のピーク2に該当する試料をHPLCにより分取し、質量分析を行った。HPLC溶出時間は、不飽和化された同サイズのカロテノイドより非常に遅かったため、C50カロテノイド骨格を有する化合物であると考えられた。吸収スペクトルは、n=3のフィトエンと同様であった。質量分析により得られた質量数は680であり、推定構造（図１の化合物番号２）と合致した。
　C50-リコペン(n=15)：図６（ｂ）のピーク3に該当する試料をHPLCにより分取し、質量分析を行った。HPLC溶出時間は比較的早いものであった。吸収スペクトルはn=15の3,4,3',4'-テトラデヒドロリコペンの文献値（Karrer and Rutschmann (1945) Helv. Chim. Acta 28:793-795）に近く、吸収スペクトルは非環型カロテノイドの特徴を持つものであった。質量分析により得られた質量数は668であり、推定構造（図１の化合物番号３）と合致した。
（実施例４）不飽和化C50カロテノイドの環化
　リコペンからβ－カロテノイドを合成するリコペンシクラーゼをコードするcrtY遺伝子を用いて、不飽和化C50カロテノイドであるC50-リコペン(n=15)の環化を行った。
　crtY遺伝子の形質転換には、プラスミドpUC-pBAD-crtI/CrtI-m2-crtYを用いた。当該プラスミドは、pUC-pBAD-crtI/CrtI-m2のApaIサイトの後ろにSpeIサイトを挿入し、ApaI/SpeIサイトにcrtY遺伝子を挿入することにより作製した。crtY遺伝子は、パントエア・アナナチス由来のリコペン環化酵素をコードする遺伝子である（Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990)）。なおプラスミド中のCrtI-m2の表記は、CrtI-m2に由来する変異型遺伝子crtIN304Sを挿入していることを意味する。pUC-pBAD-CrtI-m2-crtYの塩基配列を配列番号１３に示す。
　pUC-CrtI-m2-CrtYにより、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aを持つ大腸菌XL1-Blueに形質転換した。コントロールとして、crtI-m2の代わりに野生型crtIと共に、crtYを形質転換した。大腸菌をニトロセルロース（NC）膜をのせたLB寒天培地に散布して37℃で24時間培養した。コロニーが形成した後、コロニーの乗った状態でNC膜を0.2 %アラビノースを含むLB寒天培地に乗せ換え、室温で培養してコロニー色を観察した。
　形質転換した大腸菌を0～48時間培養した写真を図７に示す。CrtI-m2由来の変異型crtIの下流にcrtYがあるプラスミドを形質転換した大腸菌（図７中の「CrtI2Y」）では、非常に濃い赤色を示した。
　また実施例３と同様の手法によりアセトン抽出液についてHPLC解析と質量分析を行った。
　HPLC解析によって、502nmに吸収極大ピークを持つカロテノイドが検出された（図６（ｄ）ピーク7）。CrtIが野生型の場合では、このピークは痕跡量確認されるに留まった（図６（ｃ）ピーク5）。こうして得られたC50カロテノイドの推定構造と合成経路を図１に示す。なお、図１の各化合物の番号は、図６のクロマトグラムにおける番号と対応している。
　C50-β-カロテン：図６のピーク7に該当する試料をHPLCにより分取し、質量分析を行った。HPLC溶出時間はC50-リコペンより遅かった。C40のカロテノイドにおいても同様の挙動を示すことが知られている。吸収スペクトルは化学合成したもの（Khachik and Beecher (1985) J. Chromatogr. 346:237-246）とほぼ一致した（図９（ｃ））。吸収スペクトルは二環型カロテノイドの特徴を持つものと同様であった。質量分析により得られた質量数は668であり、推定構造（図１の化合物番号７）と一致した。
（実施例５）環状C50カロテノイド経路のさらなる修飾による拡張
　実施例４にて確認した環状C50カロテノイドを合成する経路をさらに拡張することにより、オキソカロテノイドを合成した。
　crtW、crtZ、crtYを含むプラスミドpUC-pBAD-crtI-crtWZY（図２（ｄ）：配列番号１４）を用いた。当該プラスミドは、パラコッカス属N81106株のcrtW、crtZ、crtY（配列番号６）をプラスミドpAK32（Misawa N. et al.,J　Bacteriol 177, 6575-6584 (1995)）からPCRにより増幅した。得られたcrtW、crtZ、crtYを用いて、pUC-pBAD-crtI-crtWZYとpUC-pBAD-CrtI-m2-crtWZYを作製した。実施例４の手法と同様にして、作製したプラスミドをpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aとともに大腸菌（XL1-Blue）に導入し、大腸菌を培養して、コロニー色を観察した。
　その結果、pUC-pBAD-CrtI-m2-crtWZYを導入した系では、コロニーは鮮やかな赤色を呈した（図８（ｃ）右から２列目：CrtI*のCrtWZY）。
　実施例４と同様にアセトン抽出液のスペクトルを測定したところ、pUC-pBAD-CrtI-m2-crtWZYにより形質転換した場合は、508nmに強いピークを示した（図８（ａ）CrtI*-CrtWZY）。一方、野生型CrtIを用いた場合では、わずかな色素しか蓄積しなかった（図７（ａ）CrtI-CrtWZY）。実施例４と同様にHPLC解析したところ、502nmに吸収極大ピークをもつ新規な極性の高いカロテノイドがメジャーピークとして得られた（図６（ｆ）ピーク9）。こうして得られたカロテノイドの推定構造と経路を図１に示す。なお、図１の各化合物の番号は、図５のクロマトグラムにおける番号と対応している。
（実施例６）不飽和化C50カロテノイドの酸化
　ロドバクター・スフェロイデス由来のCrtAのアミノ酸配列をもとに、大腸菌用にコドンを最適化してcrtAを全合成した（配列番号７、DNA2.0社に委託）。合成した遺伝子を用いて、プラスミドpUC-pBAD-crtI-crtAおよびpUC-pBAD-CrtI-m2-crtAを作製した（図２（ｅ）：配列番号１５）。
　実施例５と同様の手法により、作製したプラスミドを大腸菌に形質転換し、大腸菌を培養し、コロニーの色を観察し、アセトン抽出液のスペクトルを解析した。
　その結果、pUC-pBAD-CrtI-m2-crtAを形質転換した場合は、コロニーは鮮やかな色を呈しており（図８（ｃ）右から１列目：CrtI*のCrtA）、またアセトン抽出液も、オキソカロテノイド特有に見られる、ブロードな吸収スペクトルを与えた（図８（ｂ）CrtI*-CrtA）。野生型のCrtIと共にCrtAを発現させた場合は、ごくわずかな色しか示さなかった。実施例５と同様にHPLC解析したところ、極性の高い新規なカロテノイドがメジャーピークとして現れた（図６（ｈ）ピーク11）。
（実施例７）C50カロテノイド骨格化合物を不飽和化する能力の高い変異型crtIの取得
　実施例３および４において実現したC50-リコペンやC50-β-カロテンの生合成経路は、未だC50骨格（C50-カロテン(n=3)）が残存しているという点で効率に改良の余地を認めた。そこで、よりC50骨格を不飽和化するようなCrtIの変異体の取得を目指した。実施例２で得られたCrtI変異体のうち、CrtI-m2がもっともC50骨格の不飽和化効率が高かった。そこで、CrtI-m2のもつアミノ酸置換N304Sに着目し、304番目のアミノ酸の部位特異的総置換を行い、より不飽和化効率の高い変異体を探索した。
　まず、野生型CrtIを含むプラスミドpUC-pBAD-crtIをテンプレートとして、304番目のアミノ酸をランダム化（NNKコドン）したプライマーを用いてPCRおよびそれにつづくクローニングによりライブラリを作成した。得られたプラスミドライブラリを実施例２に記載した方法と同じ方法によりスクリーニングを行った。CrtI野生型よりも赤い色を示すコロニーを探索し、CrtI変異体のプラスミドを単離した。これらのCrtI変異体を再度スクリーニングし直したところ、グリシン（G）、セリン（S）、アスパラギン（N）、プロリン（P）、アラニン（A）に置換されたものが特に赤いコロニーを与え、とりわけP置換体（コドン：CCT）が最も赤いコロニーを与えた。P置換体を有するCrtIのアミノ酸配列を配列表の配列番号２７に示し、また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２８に示す。
　次いで、CrtI-m2およびCrtIN304PによるC50-リコペンの合成量をHPLCによって解析した。pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aと共に、pUC-pBAD-crtI-m2またはpUC-pBAD-crtIN304Pを大腸菌XL1-Blueに形質転換し、コロニーが形成した後、コロニーの乗った状態でNC膜を、0.2 % アラビノース（arabinose）を含むLB寒天培地上に乗せ換えて、室温で培養した。コロニーを2 mL LB培地（50μg/mL carbenicillin, 30μg/mL chrolamphenicolを含む）に植菌して、37℃で一晩培養した。培養液300μLを30 mL TB培地（50μg/mL carbenicillin, 30μg/mL chrolamphenicolを含む）に植菌し、30℃、200 rpmで震盪培養を行った。36時間、震盪培養した後、培養液に20 % アラビノースを最終濃度 0.2 %となるように添加し、さらに36時間、震盪培養（30℃）を行った。実施例３に示す方法でHPLC解析を行った。
　その結果を図１０に示す。CrtIN304Pを用いた場合、細胞に蓄積するC50-リコペン合成量は殆ど増加しなかったが、C50-カロテン(n=3)の生産量が、CrtIm2に比べて明快に減少している。これはC50-リコペンの生合成量（C50カロテンの不飽和化効率）は高いが、C50-リコペンの細胞内での安定性が低く、その多くが分解されているのだと考えられる。
　次に、CrtIN304Pを用いてよりC50-βカロテンが増加するかどうかを調べた。まずpUC-pBAD-crtIN304P-crtYプラスミドを作成した。このプラスミドおよびpUC-pBAD-crtI-m2-crtYを、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aと共に大腸菌XL1-Blueに形質転換し、上記項目と同様に培養・抽出・HPLC分析をおこなった。
　その結果、CrtIN304Pを用いた場合は、CrtI-m2を用いた場合に比べ、C50-カロテン(n=3)が減少してC50-リコペンが増加した（図１０）。
（実施例８）ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtW, CrtZの使用の検討
　実施例５においては、C50-β-カロテンに加えてパラコッカス属N81106株由来のCrtWおよびCrtZを用いてC50-アスタキサンチンの生産を目指した。極性のピークはみられたが、C50-β-カロテンの多くはCrtWまたはCrtZによって修飾されずに残存した。そこでより効率の良いCrtWおよびCrtZを用いてC50-アスタキサンチン、およびその中間体のC50-ゼアキサンチンおよびC50-カンタキサンチンを合成することを目指した。
　既報（Choi S.et al., Mar Biotechnol 7, 515-522 (2005), Choi S. et al., Appl Microbiol Biotechnol 72, 1238-1246 (2006)）より、ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtWおよびCrtZはそれぞれ効率の良いβカロテンケトラーゼおよびβカロテンヒドロキシラーゼであることがわかっている。天然型（C40型）のアスタキサンチンを合成するに際して、この酵素が現在入手可能な最良の選択である。そこで、これらの遺伝子をDNA2.0社に委託して大腸菌にコドン最適化したものを全合成した。これらの遺伝子を用いて、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDを作成した。また、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtWBDおよびpUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZBDも作成した。pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtWBD、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZBD、およびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDのプラスミドマップをそれぞれ図１１の（ｉ）、（ｊ）、および（ｋ）に示し、塩基配列をそれぞれ配列番号１６、１７、および１８に示す。
　これらのプラスミドをpAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157Aとともに大腸菌（XL1-Blue）に導入し、実施例３に示すような方法で培養および抽出を行った。得られたカロテノイド抽出液をHPLC-photodiodearrayシステムにインジェクションした。カラムはμBondapak column (100 × 8 mm, RCM-type, Waters)を用い、メタノールを溶出液として1 mL/minの流速で分析した。
　その結果、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtZBDでは特異的にC50-ゼアキサンチンを合成し（図１２中、パネルａ）、pUC-pBAD-CrtI-m2-CrtY-CrtWBDを用いた場合は特異的にC50-カンタキサンチンを合成した（図１２中、パネルｂ）。また、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDを用いた場合は特異的にC50-アスタキサンチンを合成した（図１２中、パネルｃ）。
（実施例９）idiの共発現によるC50-アスタキサンチンの増量
　pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157AおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDを用いて実施例８に記載の方法で大腸菌にC50-アスタキサンチンを合成させ、そのHPLCピーク面積から合成量を求めた。
　その結果、288μg/gDCWのC50-アスタキサンチンを合成した（図１３）。
　ここにidiを共発現させるため、pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157A-idiを作成し、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDと共に大腸菌（XL1-Blue）に形質転換させ、同様の方法でカロテノイド合成量を求めた。pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157A-idiのプラスミドマップは図１１の（ｌ）に示し、塩基配列を配列番号１９に示す。
　その結果、884μg/gDCWのC50-アスタキサンチンを合成した（図１３）。
（実施例１０）実施例４で得られたC50-β-カロテンのピーク（図６中のピーク７）中の化合物、および実施例８で同定されたC50-ゼアキサンチン、C50-カンタキサンチン、C50-アスタキサンチンのピーク（図１２のピーク１、２、および３）中の化合物の同定を行った。
　C50-β-カロテンのピーク（図６中のピーク７）中の化合物の極大吸収波長は、メタノール中で467(肩)、501、 534nmであり、C50-リコペンよりも低波長側にピークシフトしていたことから、環構造をもつカロテノイドである（Takaichi, S. & Shimada, K. Methods Enzymol. 213, 374-385 (1992)）。また、逆相HPLCにおける溶出時間が延びたことからも、環化は明らかである。モレキュラーマスは668であり、C50-β-カロテンに計算される値と同一であった。
　50-アスタキサンチンのピーク（図１２のピーク３）中の化合物では、メタノール中で512nmに極大吸収波長をもつ広い吸収スペクトルが得られた。728のモレキュラーマスはC50-アスタキサンチンの構造式から予想される値と一致した。さらに、既報（S. Takaichiら、Org. Mass Spdectroscopy, 28, 785-788 (1993) ）に従い、化学誘導化による部分構造の決定を試みた。この化合物は、NaBH4による還元により、吸収スペクトルはC50-β-カロテンと等しくなり、モレキュラーマスは732へと増加した。このことから、4, 4'位に２つのカルボニル基が存在することが明らかとなった。NABH4処理前の化合物を、ジアセチルおよびジトリメチルシリル誘導体を作成したところ、そのモレキュラーマスはそれぞれ812および872となった。これはそれぞれ、アセチル基２つおよびトリメチルシリル基２つ分の分子量増加に相当する。こうして、２つの水酸基を持つことが明らかになった。一方、NABH4処理後の化合物を同じくジアセチルおよびジトリメチルシリル誘導体を作成したところ、そのモレキュラーマスはそれぞれ900および1020となった。つまり、４つのヒドロキシル基があることが確認できた。さらに、この化合物を精製してNMR解析を行ったところ、明快にC50-アスタキサンチンであると同定された（図１４）。
　C50-ゼアキサンチンのピーク（図１２のピーク１）中の化合物は、モレキュラーマスが700であり、そのHPLC溶出プロファイルおよび吸収スペクトルは図１２のパネル（ａ）に示す通りであり、その溶出ピークの極性側へのシフトなどを勘案して、C50-ゼアキサンチンであると断定した。
　C50-カンタキサンチンのピーク（図１２のピーク２）中の化合物は、モレキュラーマスが696であり、そのHPLC溶出プロファイルおよび吸収スペクトルは図１２のパネル（ｂ）に示す通りであり、その溶出ピークの極性側へのシフトなどを勘案して、C50-カンタキサンチンであると断定した。
（実施例１１）CrtGおよびCrtXの追加発現による多様な構造のカロテノイドの製造
　ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtG遺伝子（Nishida,Y. et al, Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296, 2005）およびパントエア・アナナチス由来のcrtX遺伝子をさらに発現させることにより、合成されるカロテノイド構造のさらなる多様化を検討した。crtX遺伝子はゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
　まず、ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtG遺伝子を用いて、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBDおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtWBD-CrtZBDを作成した。pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBDおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtWBD-CrtZBDのプラスミドマップをそれぞれ図１５の（ｍ）および（ｎ）に示し、塩基配列をそれぞれ配列番号２０および２１に示す。
　pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBDとpAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aとを大腸菌に共発現させて培養すると、ゼアキサンチンの2位および2'位が水酸化された、C50-カロキサンチン（Caloxanthin）およびC50-ノストキサンチン（Nostoxanthin）が合成できる（図１６）。
　pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtWBD-CrtZBDとpAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aとを大腸菌に共発現させて培養すると、アスタキサンチンの2位および2'位が水酸化されたC50-2-ヒドロキシアスタキサンチン（Hydroxyastaxanthin）およびC50-2,3,2’,3’-テトラヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4'-ジオンが合成できる（図１６）。
　また、カンタキサンチンの2位および2'位が水酸化されたC50-2-ヒドロキシカンタキサンチン（Hydroxycanthaxanthin）およびC50-2,2'-ジヒドロキシカンタキサンチン（Dihidroxycanthaxanthin）の合成もできる（図１６）。
　次に、パントエア・アナナチス由来のcrtX遺伝子を用いて、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBDおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtWBD-CrtZBDを作成した。pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBDおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtWBD-CrtZBDのプラスミドマップをそれぞれ図１５の（ｏ）および（ｐ）に示し、塩基配列をそれぞれ配列番号２２および２３に示す。
　pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBDとpAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aとを大腸菌に共発現させて培養すると、ゼアキサンチンの3位および3'位の水酸基がグリコシド化されたC50-ゼアキサンチン-β-D-グルコシドおよびC50-ゼアキサンチン-β-D-ジグルコシドが合成できる（図１７）。
　pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtWBD-CrtZBDとpAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aとを大腸菌に共発現させて培養すると、アスタキサンチンの3位および3'位の水酸基がグリコシド化されたC50-アスタキサンチン-β-D-グルコシドおよびC50-アスタキサンチン-β-D-ジグルコシドが合成できる（図１７）。
　実際に、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBD、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBD、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtWBD-CrtZBD、またはpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtWBD-CrtZBDのいずれかを、pAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aと共に大腸菌（XL1-Blue）に共発現させ、LB固体培地に散布してコロニーを形成させたところ、赤紫色のコロニーを形成した（図１８）。
　コロニーを2 mL LB液体培地に植菌して16時間培養したのち、これを30mL TB液体培地に1/100量植菌した。30℃にて200rpmで回転させながら36時間培養後、最終濃度0.2% (v/v)となるようにL-アラビノースを加え、さらに36時間培養した。培養液から2mLを集菌回収し、生理食塩水で洗浄後、1 mLアセトンを加えてカロテノイド画分を抽出した。細胞ペレットおよびアセトン抽出液を図１８に示す。また、それぞれの抽出液の吸収スペクトルを図１９に示す。
　次に、pUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtX-CrtZBDまたはpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtG-CrtZBDおよびpAC-CrtMF26A,W38A,F233S-FDSY81A,V157Aを大腸菌（XL1-Blue）に形質転換した。この細胞コロニーを2 mL LB液体培地に植菌して16時間培養したのち、これを30 mL TB液体培地に1/100量植菌した。30℃にて200 rpmで回転しながら36時間培養後、最終濃度0.2% (v/v)となるようにL-アラビノースを加え、さらに36時間培養した。培養液を遠心集菌し、生理食塩水で洗浄した。細胞ペレットにアセトン10 mLを加えカロテノイド画分を抽出した。アセトン抽出液に1 mLクロロホルムおよび35 mL 10 % NaClを加えてクロロホルム相にカロテノイド画分を抽出した。クロロホルム抽出液をすべて回収し、これにMgSO4を加えて水分を除いた。クロロホルム溶媒を窒素により除去し、最終的にメタノール/THF(1:1, v/v)100 μLにカロテノイド画分を濃縮してカロテノイド抽出液を得た。得られたカロテノイド抽出液のうち、10 μL（全量の10%、3 mL培地相当）を、HPLC-photodiodearrayシステムにインジェクションした。HPLCではNishida, Y. et al, Appl Environ Microbiol, 71, 4286-4296 (2005)の条件に従って分析した（カラム：TSK gel ODS-80Ts column (4.6-mm inner diameter by 150 mm; Tosoh Co.)、溶出液：溶出液A （Methanol/Water, 95:5）を5分，溶出液Aから溶出液B（Methanol/Tetrahydrofuran,7:3）を5分，溶出液Bを15分，1 mL/min、検出器：Photodiode array (190～800 nm)）。
　その結果、C50-ゼアキサンチンにCrtXを共発現させたものでは、より溶出時間の短いところに新規なピークが１つ現れた（図２０のピーク５）。これはC50-ゼアキサンチンと同一の吸収スペクトルをもつこと、極性がC50-ゼアキサンチンより高いことから、C50-ゼアキサンチン-β-D-ジグルコシドであると考えられる。
　また、C50-ゼアキサンチンにCrtGを共発現させたものでは、新規ピークが２つ現れた（図２０のピーク２および３）。C50-ゼアキサンチンと同じ吸収スペクトルをもつこと、極性の高いものであること、などから、それらは、C50-カロキサンチン（図２０のピーク３）およびC50-ノストキサンチン（図２０のピーク２）だと考えられる。
（実施例１２）C55およびC60カロテノイドの生合成
 　FDSにI78GおよびY81Aの変異が入った変異体（FDSI78G,Y81A）は、C25PPおよびC25PPに更にC5ユニットが足されたプレニル二リン酸（C30PPやC35PPなど）を合成する（Ohnuma S et al., JBiol Chem 273, 26705-26713,1998）。また、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）由来のC30PP合成酵素（HexPS）はC30PPを合成する（Shimizu N et al, J Bacteriol 180,1578-1581, 1998）。これらFDSI78G,Y81AまたはHexPSをCrtM変異体と共発現させることにより、C50骨格よりも大きいカロテノイド骨格の生合成を目指した。
　まず、pAC-hexPS、pAC-FDSI78G,Y81A-idi、およびpUC-CrtMF26A,W38A,F233Sを作成した。pAC-hexPS、pAC-FDSI78G,Y81A-idi、およびpUC-CrtMF26A,W38A,F233Sのプラスミドマップをそれぞれ図２０の（ｑ）、（ｒ）、および（ｓ）に示し、塩基配列をそれぞれ配列番号２４、２５、および２６に示す。
　pAC-FDSI78G,Y81A-idiまたはpAC-hexPSを、それぞれpUC-CrtMF26A,W38AまたはpUC-CrtMF26A,W38A,F233Sと共に大腸菌（XL1-Blue）に形質転換した。細胞の培養および生産されたカロテノイドの解析は参考例１と同様にして行った。
　結果を図２１に示す。CrtMF26A,W38A,F233Sを用いた場合は、pAC-FDSI78G,Y81A-idiとを共発現させるとC45およびC50カロテノイドに加えてC55カロテノイドを生産した。また、hexPSを共発現させるとC60カロテノイドを特異的に合成した。一方で、CrtMF26A,W38Aを用いた場合は、C55カロテノイドおよびC60カロテノイドの生産がいずれも確認できなかった。よって、C55カロテノイドおよびC60カロテノイドの生産には、CrtMのF233S変異が必須である。
　つぎに、pAC-FDSI78G,Y81A-idiまたはpAC-hexPSを、８種類のCrtM変異体（pUC-CrtM変異体）と共発現させて、そのカロテノイド合成量を同様の方法で調べた。その結果を図２２に示す。C55骨格をより多く合成したのは、FDSI78G,Y81A-idiとCrtMF26A,F233SまたはCrtMF26A,W38A,F233Sとを共発現させた細胞であった。C60骨格を効率的に合成したのはHexPSとCrtMW38A,F233SまたはCrtMF26A,W38A,F233Sとを共発現させた細胞であった。
　以上説明したとおり、本発明の製造方法は、高効率で不飽和化C50カロテノイドを合成することができ、種々のC50カロテノイドを合成可能とする。C50カロテノイドは、自然界においてほとんど確認されておらず、合成された例も皆無といってよい。カロテノイドは、抗酸化作用等の生理活性を有することが知られているが、C50カロテノイドはこれまでにない新たな作用を発揮することや、従来のカロテノイドに比較して顕著に活性が増強していることが期待される。例えばC50カロテノイドは、高い抗酸化活性を持つ可能性、抗腫瘍活性等の生理活性物質の新規シーズとしての用途、機能性色素分子としての利用などが期待される。また、本発明の製造方法は、不飽和化C55カロテノイドや不飽和化C60カロテノイドなどの高効率な合成にも利用することができる。さらに本発明の製造方法は、イソプレノイド合成経路を強化した細胞（Klein-Marcuschamer Dら：Trends Biotechnol 25,417-424 (2007), Kirby Jら：Nat Prod Rep 25, 656-661 (2008)）等の従来技術と組み合わせることにより、合成可能なカロテノイドの種類を飛躍的に増大させるものと考えられる。

Claims (15)

  1. 炭素数50のカロテノイドの製造方法であって、
    変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするよう変異が導入されたものであり、
    変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養後の培養物から炭素数50のカロテノイドを得ることを手段とする炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  2. 変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、請求項１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  3. 変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  4. 変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、パントエア・アナナチス（Pantoea ananatis）由来のフィトエン不飽和化酵素遺伝子に変異を導入したことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  5. 前記細胞が、大腸菌または酵母である、請求項１～４のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  6. 変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞がさらに、ゲラニルファルネシル二リン酸を二分子縮合することにより炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  7. 請求項１～６のいずれか１に記載の細胞がさらに、ファルネシル二リン酸および／またはゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルファルネシル二リン酸を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  8. 請求項１～７のいずれか１に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  9. 請求項８に記載の環化がβ環化であり、請求項８に記載の細胞がさらに、末端にβ環を有する炭素数50のカロテノイドにおいて、β環をヒドロキシル化する酵素および／またはβ環をケト化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項８に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  10. 請求項１～７のいずれか１に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドを酸化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
  11. 炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたことを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
  12. 炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が、配列番号１に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、請求項１１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
  13. 請求項１１または１２に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子の変異が少なくとも、配列番号１における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
  14. 請求項１１～１３のいずれか１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子によりコードされていることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素。
  15. 請求項１１～１３のいずれか１に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して炭素数50のカロテノイドを製造し得る細胞。
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