JP5987176B2 - 炭素数50のカロテノイドの製造方法 - Google Patents
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Description
1.炭素数50のカロテノイドの製造方法であって、
変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするよう変異が導入されたものであり、
変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養後の培養物から炭素数50のカロテノイドを得ることを手段とする炭素数50のカロテノイドの製造方法。
2.変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、配列番号1に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか1以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、前項1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
3.変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、該変異は、少なくとも、配列番号1における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、前項1または2に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
4.変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたものであり、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、パントエア・アナナチス(Pantoea ananatis)由来のフィトエン不飽和化酵素遺伝子に変異を導入したことを特徴とする、前項1〜3のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
5.前記細胞が、大腸菌または酵母である、前項1〜4のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
6.変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞がさらに、ゲラニルファルネシル二リン酸を二分子縮合することにより炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項1〜5のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
7.前項1〜6のいずれか1に記載の細胞がさらに、ファルネシル二リン酸および/またはゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルファルネシル二リン酸を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項1〜6のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
8.前項1〜7のいずれか1に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項1〜7のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
9.前項8に記載の環化がβ環化であり、前項8に記載の細胞がさらに、末端にβ環を有する炭素数50のカロテノイドにおいて、β環をヒドロキシル化する酵素および/またはβ環をケト化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項8に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
10.前項1〜7のいずれか1に記載の細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドを酸化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、前項1〜7のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
11.炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入されたことを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
12.炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が、配列番号1に記載のアミノ酸配列において304番目のアスパラギン、339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか1以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、前項11に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
13.前項11または12に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子の変異が少なくとも、配列番号1における304番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
14.前項11〜13のいずれか1に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子によりコードされていることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素。
15.前項11〜13のいずれか1に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して炭素数50のカロテノイドを製造し得る細胞。
(1)C50カロテノイド原料であるC25PPの供給
大腸菌(E. coli)内で効率よくC25PPを合成するために、変異型遺伝子のfds Y81A, V157A を用いた。fds Y81A, V157A は、ゲオバチラス・ステアロサーモフィルス由来のファルネシル二リン酸合成酵素(FDS)の変異体である。変異Y81AはOhnuma, S. et al., J Biol Chem 271,30748-30754 (1996)に由来している。また本発明者らは、特願2010-258989に記載のテルペン合成酵素遺伝子のスクリーニング方法を用いて、変異型遺伝子fdsY81Aにさらに変異を導入することにより、基質に対するサイズ特異性をさらにシフトさせた変異型酵素をコードするfds Y81A,V157A を作製した。
C25PPの二分子縮合によるC50カロテノイド骨格化合物(16,16'−ジイソペンテニルフィトエン)の合成には、変異型遺伝子のcrtM F26A,W38A,233S を用いた。スタフィロコッカス・アウレウス由来のジアポフィトエン合成酵素(CrtM)は本来、C15PPを二分子縮合させC30骨格のカロテノイドを合成する酵素である。本発明者らは、基質に対するサイズ選択性の向上した酵素を作製するために、crtM遺伝子に変異を導入した(Umeno et al.,J Bacteriol 184, 6690-6699 (2002)、Umeno et al.,Nucleic Acids Res 31, e91 (2003))。F26A、W38Aの変異をもつCrtMの二重変異体にC25PPを与えると、わずかにC50カロテノイド骨格化合物を合成することがわかった(非特許文献7)。
fds Y81A, V157A と、crtM F26A,W38A,F233S に加えて、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(Idi)をコードする遺伝子(大腸菌ゲノム由来)を大腸菌XL1-Blueにて発現させ、大腸菌を培養した。fds Y81A, V157A とcrtM F26A,W38A,F233S による大腸菌XL1-Blueの形質転換は、常法によりプラスミドpAC-crtMF26A,W38A,F233S-idi(図2(h):配列番号10)およびpUC-fdsY81A,V157A(図2(f):配列番号9)を作製して行った。pAC-crtMF26A,W38A,F233S-idiはpAC-crtMF26A,W38A,F233SのClaIサイト上流にlacPO-idiを挿入することによって作製した。pUC-fdsY81A,V157Aは参考例1と同様にして作製した。形質転換した大腸菌の培養、製造されたカロテノイドについての解析は参考例1と同様にして行った。
本発明者らは、CrtI(配列番号2(G1131A、A1476Tのノンシノニマス変異の入ったもの)の塩基配列を有する遺伝子がコードするフィトエン不飽和化酵素)によってC50カロテノイド骨格化合物をもつカロテノイドが不飽和化することを見出した(非特許文献9)。しかしその生産量は極めて少なく、C50カロテノイド骨格化合物のうち25%が不飽和化されるに留まっていることがわかった(非特許文献8)。
一方、本発明者らは、lacプロモータ(lacP)などを用いた野生型CrtIの定常発現が細胞増殖を著しく阻害すること、また細胞の色素形成を著しく不安定化することを見出した。しかしながらC50カロテノイド骨格化合物の合成/蓄積までの経路を持つ細胞(例えば、参考例1や実施例1にて得られた細胞)では、明らかな細胞毒性は認められなかった。
フィトエン不飽和化酵素(CrtI)の進化工学に基づき、より効率よくC50カロテノイド骨格化合物を不飽和化する変異型crtIの取得を目指した。図4(a)に本実施例の操作の概略を示し、図4(b)にスクリーニングの原理を示す。
実施例2にて得られたコロニーのうち、野生型CrtIに比べて色素形成が増強されていたCrtI-m1, m2, m4, m6, m8について、C50カロテノイド骨格化合物の不飽和化能を確認した。
リコペンからβ−カロテノイドを合成するリコペンシクラーゼをコードするcrtY遺伝子を用いて、不飽和化C50カロテノイドであるC50-リコペン(n=15)の環化を行った。
crtY遺伝子の形質転換には、プラスミドpUC-pBAD-crtI/CrtI-m2-crtYを用いた。当該プラスミドは、pUC-pBAD-crtI/CrtI-m2のApaIサイトの後ろにSpeIサイトを挿入し、ApaI/SpeIサイトにcrtY遺伝子を挿入することにより作製した。crtY遺伝子は、パントエア・アナナチス由来のリコペン環化酵素をコードする遺伝子である(Misawa N. et al., J Bacteriol 172, 6704-6712 (1990))。なおプラスミド中のCrtI-m2の表記は、CrtI-m2に由来する変異型遺伝子crtIN304Sを挿入していることを意味する。pUC-pBAD-CrtI-m2-crtYの塩基配列を配列番号13に示す。
実施例4にて確認した環状C50カロテノイドを合成する経路をさらに拡張することにより、オキソカロテノイドを合成した。
ロドバクター・スフェロイデス由来のCrtAのアミノ酸配列をもとに、大腸菌用にコドンを最適化してcrtAを全合成した(配列番号7、DNA2.0社に委託)。合成した遺伝子を用いて、プラスミドpUC-pBAD-crtI-crtAおよびpUC-pBAD-CrtI-m2-crtAを作製した(図2(e):配列番号15)。
実施例5と同様の手法により、作製したプラスミドを大腸菌に形質転換し、大腸菌を培養し、コロニーの色を観察し、アセトン抽出液のスペクトルを解析した。
実施例3および4において実現したC50-リコペンやC50-β-カロテンの生合成経路は、未だC50骨格(C50-カロテン(n=3))が残存しているという点で効率に改良の余地を認めた。そこで、よりC50骨格を不飽和化するようなCrtIの変異体の取得を目指した。実施例2で得られたCrtI変異体のうち、CrtI-m2がもっともC50骨格の不飽和化効率が高かった。そこで、CrtI-m2のもつアミノ酸置換N304Sに着目し、304番目のアミノ酸の部位特異的総置換を行い、より不飽和化効率の高い変異体を探索した。
実施例5においては、C50-β-カロテンに加えてパラコッカス属N81106株由来のCrtWおよびCrtZを用いてC50-アスタキサンチンの生産を目指した。極性のピークはみられたが、C50-β-カロテンの多くはCrtWまたはCrtZによって修飾されずに残存した。そこでより効率の良いCrtWおよびCrtZを用いてC50-アスタキサンチン、およびその中間体のC50-ゼアキサンチンおよびC50-カンタキサンチンを合成することを目指した。
pAC-crtMF26A,W38A,F233S-fdsY81A,V157AおよびpUC-pBAD-CrtIN304P-CrtY-CrtWBD-CrtZBDを用いて実施例8に記載の方法で大腸菌にC50-アスタキサンチンを合成させ、そのHPLCピーク面積から合成量を求めた。
ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtG遺伝子(Nishida,Y. et al, Appl Environ Microbiol 71, 4286-4296, 2005)およびパントエア・アナナチス由来のcrtX遺伝子をさらに発現させることにより、合成されるカロテノイド構造のさらなる多様化を検討した。crtX遺伝子はゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
FDSにI78GおよびY81Aの変異が入った変異体(FDSI78G,Y81A)は、C25PPおよびC25PPに更にC5ユニットが足されたプレニル二リン酸(C30PPやC35PPなど)を合成する(Ohnuma S et al., JBiol Chem 273, 26705-26713,1998)。また、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)由来のC30PP合成酵素(HexPS)はC30PPを合成する(Shimizu N et al, J Bacteriol 180,1578-1581, 1998)。これらFDSI78G,Y81AまたはHexPSをCrtM変異体と共発現させることにより、C50骨格よりも大きいカロテノイド骨格の生合成を目指した。
Claims (13)
- 炭素数50のカロテノイドの製造方法であって、
変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞を培地で培養し、培養後の培養物から炭素数50のカロテノイドを得ることを手段とし、
該変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列で表されるフィトエン不飽和化酵素において変異が存する変異型フィトエン不飽和化酵素であって炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするよう変異が導入されたものであり、
ここで該変異は、少なくとも、配列番号1に記載のアミノ酸配列における304番目のアスパラギンのプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする炭素数50のカロテノイドの製造方法。 - 前記変異が、少なくとも、配列番号1に記載のアミノ酸配列における304番目のアスパラギンのプロリンまたはセリンへの置換をもたらす変異に加えて、配列番号1に記載のアミノ酸配列において339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか1以上のアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、請求項1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子が、パントエア・アナナチス(Pantoea ananatis)由来のフィトエン不飽和化酵素遺伝子に変異を導入したことを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記細胞が、大腸菌または酵母である、請求項1〜3のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換された細胞がさらに、ゲラニルファルネシル二リン酸を二分子縮合することにより炭素数50のカロテノイド骨格化合物を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記細胞がさらに、ファルネシル二リン酸および/またはゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルファルネシル二リン酸を合成する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドの末端を環化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記環化がβ環化であり、前記細胞がさらに、末端にβ環を有する炭素数50のカロテノイドにおいて、β環をヒドロキシル化する酵素および/またはβ環をケト化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項7に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 前記細胞がさらに、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して得られた炭素数50の不飽和化カロテノイドを酸化する酵素をコードする遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1に記載の炭素数50のカロテノイドの製造方法。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列で表されるフィトエン不飽和化酵素において変異が存する変異型フィトエン不飽和化酵素であって炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化する活性の増強した変異型フィトエン不飽和化酵素をコードするような変異が導入された変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子であり、ここで該変異は、少なくとも、配列番号1に記載のアミノ酸配列における304番目のアスパラギンのプロリンまたはセリンへの置換をもたらすものであることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
- 前記変異が、少なくとも、配列番号1に記載のアミノ酸配列における304番目のアスパラギンのプロリンまたはセリンへの置換をもたらす変異に加えて、配列番号1に記載のアミノ酸配列において339番目のフェニルアラニン、338番目のイソロイシン、395番目のアスパラギン酸、228番目のイソロイシンから選択されるいずれか1以上のアミノ酸の置換をもたらすものであることを特徴とする、請求項10に記載の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子。
- 請求項10または請求項11の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子によりコードされていることを特徴とする、変異型フィトエン不飽和化酵素。
- 請求項10または請求項11の変異型フィトエン不飽和化酵素遺伝子により形質転換されていることを特徴とする、炭素数50のカロテノイド骨格化合物を不飽和化して炭素数50のカロテノイドを製造し得る細胞。
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