JP6673834B2 - メレオライド生合成遺伝子クラスターおよびその使用 - Google Patents

メレオライド生合成遺伝子クラスターおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP6673834B2
JP6673834B2 JP2016545321A JP2016545321A JP6673834B2 JP 6673834 B2 JP6673834 B2 JP 6673834B2 JP 2016545321 A JP2016545321 A JP 2016545321A JP 2016545321 A JP2016545321 A JP 2016545321A JP 6673834 B2 JP6673834 B2 JP 6673834B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protoyldene
cytochrome
hydroxylated
protoylidene
monooxygenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016545321A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017503504A (ja
Inventor
イェンネワイン，シュテファン
エンゲルス，ベネディクト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of JP2017503504A publication Critical patent/JP2017503504A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6673834B2 publication Critical patent/JP6673834B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
    • C12Y114/14001—Unspecific monooxygenase (1.14.14.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

本発明は、新たに同定された遺伝子クラスターに関し、具体的には、該遺伝子クラスターに含まれる新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、これらの製造および使用、ならびにこれらのバリアントおよびその使用に関する。本発明はさらに、新たに同定されたこれらのポリヌクレオチド／ポリペプチドを用いて、ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造する方法に関する。
標準的な抗生物質を用いた治療に対して耐性を示す病原性微生物の保菌率は常に増加し続けており、新規の作用機序を有する新たな抗菌薬の探索と開発に焦点を当てた研究が開始されている。従来、天然物は生物活性化合物の豊富な供給源であり、そのような天然物の中でもテルペノイド類が最も多くを占めている。しかし、テルペノイド群のうち認可されている抗菌薬は３種しか存在せず、これら３種すべてが真菌の天然物であるプレウロムチリンの半合成誘導体（チアムリン、バルネムリンおよびレタパムリン）である。
特に担子菌類は、複雑で多彩な構造を有する生物活性セスキテルペノイド類の豊富な供給源であり、ナラタケ属由来のプロトイルデン型セスキテルペノイドのアリールエステルのいくつかは、新たな抗菌薬を開発するためのリード化合物として有望視されている。ナラタケとして一般に知られているナラタケ属は、現在はタマバリタケ科に分類されており、世界で６００種以上が確認されている。ナラタケ属は、食用キノコとしてだけでなく、広葉樹、針葉樹、果樹、ブドウ樹などに被害を与える代表的な根の病原菌としても知られている。
ナラタケ属に属する種は、プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類を生成することが知られており、これらは二重結合の位置によってアルミリルオルセリナート類とメレオライド類の２種に分類される。現在、ナラタケ属由来のアルミリルオルセリナート構造およびメレオライド構造として５０種以上が知られており、真菌由来のものとして最も多様な天然物群の一つとなっている。
植物由来のテルペン類の生合成については、特にメントール、アルテミシニン、タキソールなどのいくつかのテルペン類においてこれまでに広く研究されてきたが、これら以外のテルペン類の大部分、特に真菌由来のテルペン類の合成についてはあまり知られていない。
プロトイルデン型アリールエステル類は、セスキテルペノイド類であるプロトイルデノール（アルコール）とオルセリン酸とからなる芳香族部分から構築される。メレオライド型セスキテルペノイド類およびアルミリルオルセリナート型セスキテルペノイド類の生合成はいずれも、広く使用可能なセスキテルペン前駆体であるファルネシル二リン酸を環化してプロトイルデンを生成することから開始できると考えられている。次いでプロトイルデン環系を複数回のヒドロキシル化反応に供し、得られたプロトイルデノール（アルコール）をオルセリン酸誘導体（ポリケチド）によりＣ５ヒドロキシル位置でエステル化する。
オルセリン酸やその誘導体は様々な微生物によって生合成され、プロトイルデン類は真正担子菌網に広く存在する。しかし、オルセリン酸やその誘導体とプロトイルデン類のカップリング反応はナラタケ属に特有であると考えられている。
上述のように、メレオライド類やアルミリルオルセリナート類は抗菌活性や細胞毒性を有していると見られるため、医薬分野において高い関心が寄せられており、制御可能な方法でこれらを特異的に生成させたり濃縮させたりすることが望まれている。
したがって、本発明は、単一種または複数種の標的生産を達成することが可能な改良された新規の手段を提供することを目的とする。
本発明によれば、単離されたポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ
ａ）添付の配列表に記載の配列番号５〜８、
ｂ）配列番号５〜８と相補的な核酸配列、ならびに
ｃ）ａ）およびｂ）で定義した核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列またはそれらの相補鎖
からなる群より選択される核酸配列を含む、または該配列からなるポリヌクレオチドを提供することによって上記の目的および他の目的を達成することができる。
具体的には、上記の目的および他の目的は、遺伝子クラスターであって、ワタゲナラタケ（Armillaria gallica）由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ１遺伝子、ワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ２遺伝子、ワタゲナラタケ由来Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ３遺伝子、ワタゲナラタケ由来プロトイルデンシンターゼ遺伝子、およびワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ４遺伝子をこの順で含む、またはこの順に並んだこれらの遺伝子からなる遺伝子クラスターによってさらに解決される。
上記目的は、ヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、上記ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの使用、ならびにヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための方法によってさらに達成される。
また、本発明は、ヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、上記遺伝子クラスターの使用、ならびにヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、上記遺伝子クラスターを用いた方法も提供する。
上記目的はこのようにして完全に達成される。
上述したポリヌクレオチドはいずれもモノオキシゲナーゼ活性を有するワタゲナラタケ（Armillaria gallica）由来のポリペプチドをコードするが、これらのポリヌクレオチドは、本発明者らの知る限り、今回初めて同定され、精製され、さらに酵素としての特性が評価された。これらの新たに同定されたポリヌクレオチドは、６−プロトイルデンをモノヒドロキシル化６−プロトイルデンまたはポリヒドロキシル化６−プロトイルデンに変換するヒドロキシル化反応を触媒する。この触媒反応は、ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の合成において重要な工程の１つである。したがって、本発明者らは、上記モノオキシゲナーゼ群をコードする遺伝子を同定したことから、ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の生成を改変することが可能な有益かつ有効なツールを見出し、それを作製することに成功した。上記遺伝子は、単独の遺伝子、またはプロトイルデンシンターゼをさらに含む遺伝子クラスターであり、異種発現または異種過剰発現させることによって遺伝子数を増やすことができる。この方法によって、プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の合成において、ヒドロキシル化プロトイルデンへの環化率およびヒドロキシル化プロトイルデンの生成を増加させることができ、その結果、プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の生成を増加させることができる。このようにして、高度に濃縮されたヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類を得てもよい。得られたヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類は、強力な抗菌薬や細胞毒性物質として使用することができ、様々な治療分野や医療分野において治療ツールとして使用してもよい。あるいは、さらに修飾を加えて上記ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類由来の他の抗菌性物質を製造することもできる。
本発明によれば、「ポリヌクレオチド」は、通常、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは非修飾ＲＮＡもしくは非修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくは修飾ＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域からなるＤＮＡ混合物、一本鎖領域、二本鎖領域および三本鎖領域からなるＤＮＡ混合物、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域からなるＲＮＡ混合物、ならびに一本鎖領域、より典型的には、二本鎖領域または三本鎖領域であってもよく一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書において「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も包含する。各領域におけるＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖は、同じ分子に由来するものであってもよく、異なる分子に由来するものであってもよい。上記領域は、１以上の上記分子全体を含んでいてもよいが、より典型的には、これらの分子のうちのいくつかの一領域のみを含むものである。多くの場合、三重らせん領域に由来する分子のうちの１つはオリゴヌクレオチドである。本明細書において「ポリヌクレオチド」には、１つ以上の修飾塩基を含む上述のようなＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。したがって、本明細書において定義したように、「ポリヌクレオチド」は、安定性の向上などを目的として修飾された骨格を有するＤＮＡやＲＮＡを含む。さらに、本明細書において「ポリヌクレオチド」は、通常とは異なる塩基や修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含み、２つの例を挙げるとすれば、イノシンなどの通常とは異なる塩基やトリチル化塩基などの修飾塩基を含んでいてもよい。当業者であれば、様々な有用な目的に利用できる非常に多様な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができることを容易に理解するであろう。本明細書において「ポリヌクレオチド」は、化学的修飾、酵素的修飾または代謝的修飾を受けたポリヌクレオチド、ならびに単純な細胞や複雑な細胞などの細胞およびウイルスに特徴的なＤＮＡやＲＮＡの様々な化学形態も包含する。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い短いポリヌクレオチドも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質と呼ばれる長い鎖を指す。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、天然のプロセス、たとえばプロセシングや他の翻訳後修飾などによって修飾されたものだけでなく、化学修飾技術によって修飾されたものも含む。このような修飾は、基礎的な教科書や、研究論文、詳細な研究書などに詳しく説明されており、当業者にとって公知である。また、任意のポリペプチド内のいくつかの部位に同じ種類の修飾が同じ程度または異なる程度で存在していてもよいことは容易に理解される。さらに、任意のポリペプチドは、様々な種類の修飾を含んでいてもよい。修飾は、ポリペプチドのどの部位に存在していてもよく、たとえばペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端などに存在していてもよい。修飾としては、たとえば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム部分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質または脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノ化、硫酸化、ｔＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、たとえば、アルギニル化やユビキチン化などが挙げられる。ポリペプチドは分岐ポリペプチドであってもよいし、分岐を含んでいても含んでいなくてもよい環状ポリペプチドであってもよい。環状ポリペプチド、分岐ポリペプチドおよび分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって得られたものであってもよいし、全合成によって作製されたものであってもよい。
「単離された」は、天然の状態から「人の手によって」改変されたことを指し、すなわち、天然に存在するものが天然の状態から改変されているか、もしくはその本来の環境から取り出されたものであり、あるいはその両方を意味する。たとえば、本明細書において、生体内に天然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態での共存材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。同様に、本明細書において「合成」配列は、天然の供給源から直接単離されたものではなく、合成によって生成された任意の配列を意味する。「組換え」とは、ある生物種に由来する遺伝子を別の生物種の宿主細胞に移植またはスプライシングすることによって調製された遺伝子改変ＤＮＡを意味する。こうしたＤＮＡは、宿主の遺伝的組成の一部となり、複製される。
本明細書において「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発明のポリペプチドをコードする配列、具体的には、配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列を有するワタゲナラタケ（Armillaria gallica）由来モノオキシゲナーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、コード配列および／または非コード配列も含みうる別の領域とともに上記ポリペプチドをコードする単一の連続領域または複数の非連続領域（たとえば、組み込まれたファージまたは挿入配列または編集によって分断されたもの）を含むポリヌクレオチドも包含する。
本明細書において「バリアント」は、基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと本質的に同じ特性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。通常、ポリヌクレオチドのバリアントは、基準となるポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列が変化していても、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と比較してバリアントのアミノ酸配列が変化することもあれば、変化しないこともある。後述するように、ヌクレオチドの変化によって、基準配列によりコードされたポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断が起こったポリペプチドが得られうる。通常、ポリペプチドのバリアントは、基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。通常、アミノ酸配列の違いは限定的であるため、基準ポリペプチドの配列とバリアントの配列は全体的に非常によく似ており、多くの領域において同じ配列を有する。バリアントと基準ポリペプチドは、１以上の置換、付加および／または欠失によってアミノ酸配列が異なっている場合があり、これらの１以上の置換、付加および／または欠失はどのように組み合わさっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであってもよいし、遺伝子コードによってコードされたものでなくてもよい。ポリヌクレオチドやポリペプチドのバリアントは、アレルバリアントのような天然に存在するものであってもよく、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発、直接合成法、または当業者に公知の他の組換え法によって作製してもよい。
「オーソロガスな」ポリペプチド（オーソログ）も本発明の範囲に含まれ、かつ／または上記バリアントポリペプチドの定義に包含される。「オーソロガスな」ポリペプチドとは、異なる生物種が共通の祖先遺伝子から種分化によって分かれた遺伝子を有しており、このような遺伝子によってコードされるペプチドを指す。通常、オーソログは進化の過程において機能が変化していない。
本明細書において「宿主細胞」または「宿主微生物」は、外因性ポリヌクレオチド配列で形質転換または形質導入された細胞、微生物または微生物細胞を指し、あるいは外因性ポリヌクレオチド配列による形質転換または形質導入が可能である細胞、微生物または微生物細胞と定義される。形質転換または形質導入された細胞、微生物または微生物細胞は、導入されたポリヌクレオチドを異種発現することができる。
一般的に理解されるように、本明細書において「プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル」は、アルミリルオルセリナートまたはメレオライドを指す。これらは、その名称が示すように、これらは酸素化プロトイルデン型セスキテルペノイドおよびオルセリン酸から構築される。
本発明の一実施形態によれば、単離された上記ポリヌクレオチドは、添付の配列表に記載の配列番号５〜９のうちの１つからなり、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか（配列番号５〜８）、あるいは４種のモノオキシゲナーゼおよびプロトイルデンシンターゼを含む遺伝子クラスターをコードする。配列番号５〜８は、ワタゲナラタケから新たに同定されたメレオライド合成遺伝子クラスターに含まれる４種のワタゲナラタケ由来モノオキシゲナーゼの配列を示し、この遺伝子クラスターはさらにプロトイルデンシンターゼ遺伝子を含む。配列番号９はこの遺伝子クラスターの配列を示す。
添付の配列表に開示した配列番号５〜８は、ワタゲナラタケから同定されその特性が評価された４種のモノオキシゲナーゼ１〜４それぞれに対応するｃＤＮＡ配列である。これらのバリアント、すなわち、少なくとも９０％の配列同一性を有し、他のナラタケ属にも存在しうるバリアントも本発明に適しており、これらのバリアントも本発明の一部であると解される。これは、新たに同定された上記モノオキシゲナーゼを使用した有益なツールが提供されたことによって、上記のようなバリアントを使用したとしても、類似のモノオキシゲナーゼ、すなわち配列比較およびそれに続く酵素的試験によって配列番号５〜８とわずかな違いしかないと同定されるモノオキシゲナーゼを得ることができるからである。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを１種またはそれ以上含むベクター、本発明のベクターによって遺伝子改変された宿主微生物および／または宿主細胞、ならびに遺伝子組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。
無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡから上記ポリペプチドを製造することもできる。
したがって、本発明はさらに、ベクターであって、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸配列を含み、該核酸配列が、該ベクターによって形質転換または形質導入される宿主細胞／宿主微生物によって認識される制御配列に作動可能に連結されているベクターに関する。本発明の一態様によれば、上記ベクターは発現ベクターであり、別の一態様によれば、上記ベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、リポソームまたはウイルスの形態で存在することができる。
組換え体の作製を目的として、発現系もしくはその一部または本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、宿主細胞を遺伝子改変することができる。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、様々な標準的実験マニュアルに記載の方法、たとえばDavis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)、およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載の方法によって行うことができる。
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、たとえば、ベクターに導入することによって、宿主微生物の細胞内へと安定に形質転換／形質導入することができる。ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは誘導プロモーターの制御下にあるため、この遺伝子／ポリヌクレオチドの発現を特異的に標的化することができ、また、所望に応じて、このような方法で１種以上の該遺伝子を過剰発現させてもよい。
本発明のポリペプチドを製造するため様々な発現系を使用することができる。発現系において使用されるベクターとしては、染色体ベクター、エピソーマルベクターおよびウイルス由来ベクターなどが挙げられ、たとえば、細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオファージ由来ベクター、トランスポゾン由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、挿入因子由来ベクター、酵母染色体因子由来ベクター、ウイルス由来ベクター、およびそれらの組み合わせに由来するベクター、たとえば、プラスミドやバクテリオファージの遺伝因子に由来するベクター（コスミドやファージミドなど）が挙げられる。発現系構築物は、発現の制御および誘導を行う制御配列を含んでいてもよい。通常、宿主内におけるポリヌクレオチドの維持、産生もしくは発現に適した系もしくはベクター、および／または宿主内におけるポリペプチドの発現に適した系もしくはベクターを上記発現に使用してもよい。前掲のSambrookらの文献に記載されているような公知かつ慣例の様々な技術を用いて、発現系に適切なＤＮＡ配列を挿入してもよい。
上記に鑑みて、本発明はさらに、
単離されたペプチドであって、
ａ）配列番号１〜４のいずれか１つに示すアミノ酸配列；
ｂ）ストリンジェントな条件下において配列番号５〜８のいずれかに示す核酸分子の逆鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列のアレルバリアントのアミノ酸配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下において配列番号５〜８のいずれかに示す核酸分子の逆鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列；および
ｄ）少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、モノオキシゲナーゼ活性を発揮する、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列の断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドで形質転換／形質導入した宿主細胞／宿主微生物、および上記で定義したベクターを含む宿主細胞／宿主微生物に関し、特に、酵母を含む真菌、および細菌からなる群より選択される微生物または宿主細胞に関する。
上記宿主微生物は、新たに同定された上記ポリヌクレオチドを異種発現し、すなわち本発明において同定されたモノオキシゲナーゼのうちの少なくとも１つを異種発現する。上記宿主微生物は、プロトイルデンシンターゼとともに上記モノオキシゲナーゼを異種発現することが好ましい。あるいは、上記宿主微生物は後述する遺伝子クラスターを異種発現することが好ましい。
本発明の別の一態様によれば、宿主微生物のコドン使用頻度に合わせて改変されたモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する宿主微生物を使用する。
本発明の別の一実施形態によれば、上記宿主細胞は、サッカロミセス属、特にサッカロミセス・セレビシエ；アスペルギルス属、特にアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）；または真正担子菌綱、特にナラタケ属（Armillaria）に属する真正担子菌、特にワタゲナラタケ（Armillaria gallica）、ナラタケ（Armillaria mellea）、オニナラタケ（Armillaria ostoyae）、および他のナラタケ属である。
本発明のさらに別の一態様は、
メレオライド類の製造方法であって、
ａ）ヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルの生成が可能な適切な栄養条件において、上記で定義した微生物を培養する工程；および
ｂ）上記宿主微生物またはその増殖培地からヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを単離する工程
を含む方法に関する。
本発明の一態様によれば、上記ヒドロキシル化プロトイルデンは、８−α−ヒドロキシ−６−プロトイルデン、８−α，１３−ヒドロキシ−６−プロトイルデンから選択される。上記プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルは、メレオライドＩ、アルミラリジン、メレオライドＡ、メレオライドＦ、メレオライドＢ、メレオライドＫ、アルミリルエベルニテート（armillyl evernitate）、アルミラリン、アルナミオール、メレオライドＪ、アルミルラリビン、１０−α−ヒドロキシ−メレオライド、アルミリルオルセリナート、メレオライドＥ、１−Ｏ−トリフルオロアセチル−メレオライドＥ、メレオライドＨ、５’−Ｏ−メチル−メレドナール、メレドナール、アルナミアール、メレオライドＣ、メレオライドＤ、メレドナールＡ、メレドナールＣ、メレドノール、デヒドロアルミリルオルセリナート、アルミラン、およびアルミラリジンから選択される。
さらに別の一態様によれば、上記工程を含む上記方法は、
ａ）（ａ）添付の配列表に記載の配列番号５〜８、（ｂ）配列番号５〜８に相補的な核酸配列、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義した核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列またはそれらの相補鎖から選択される核酸配列を含むように形質転換または形質導入された宿主微生物を適切な栄養条件で培養する工程；
ｂ）上記核酸配列を過剰発現させる工程；
ｃ）上記工程によって、宿主微生物細胞におけるヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルの生成を増加させる工程；ならびに
ｄ）生成されたヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを宿主微生物またはその増殖培地から単離する工程
からなる。
本発明の一実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルの製造方法であって、
ａ）少なくとも一方が外因性物質である（ｉ）プロトイルデンシンターゼと（ii）少なくとも１種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとを少なくとも異種発現するように形質転換された宿主微生物を提供する工程；および
ｂ）プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の生成が可能な適切な栄養条件において、工程ａ）で提供された宿主微生物を培養することによって、ヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造する工程
を含む方法に関する。
したがって、本発明の上記方法において用いられる宿主微生物は、少なくとも２種の遺伝子、すなわち、プロトイルデンシンターゼと少なくとも１種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとを含み、このシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、本発明において同定されたワタゲナラタケ由来のＣＹＰ−Ａｒｍ１〜４であることが好ましい。
したがって、上記方法は、
ｃ）上記宿主微生物またはその増殖培地からヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを単離する工程をさらに含む。
さらに、好ましい一実施形態では、本発明の上記方法において、上記プロトイルデンシンターゼおよび／または上記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、ナラタケ属のうちの１種に由来するプロトイルデンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであり、特にワタゲナラタケに由来するプロトイルデンシンターゼおよび／またはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであり、さらに好ましくは、本発明において同定されたＣＹＰ−Ａｒｍ１モノオキシゲナーゼ、ＣＹＰ−Ａｒｍ２モノオキシゲナーゼ、ＣＹＰ−Ａｒｍ３モノオキシゲナーゼもしくはＣＹＰ−Ａｒｍ４モノオキシゲナーゼ、またはＣＹＰ−Ａｒｍ１〜４モノオキシゲナーゼである。
したがって、本発明の改良された上記方法において、上記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、
ａ）添付の配列表に記載の配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列；
ｂ）ストリンジェントな条件下において配列番号５〜８のいずれかに示す核酸分子の逆鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列のアレルバリアントのアミノ酸配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下において配列番号５〜８のいずれかに示す核酸分子の逆鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列；および
ｄ）少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの機能を発揮する、配列番号２に示すアミノ酸配列の機能的断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明の改良された上記方法では、工程ａ）において、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ、好ましくはチュウゴクイチイ（Taxus chinensis）由来のＮＡＤＰＨ：シトクロムレダクターゼを発現するようにさらに形質転換された微生物が提供される。
この酵素を導入することによって、酵母における異種由来シトクロムＰ４５０酵素の還元を増強することができる。
本発明の改良された上記宿主微生物および／または改良された上記方法によれば、工程ａ）において提供される宿主微生物は、２−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼを発現するようにさらに形質転換されている。
この酵素を導入することによって、メバロン酸経路の流量を増やすことができ、その結果、ファルネシル二リン酸を増加させ、プロトイルデンの生合成を増強することができる。
上記プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルは、メレオライド類およびアルミリルオルセリナート類から選択されることが好ましく、具体的には、モノヒドロキシル化プロトイルデン、特に８−ヒドロキシ−６−プロトイルデン；およびジヒドロキシル化プロトイルデン、特に８，１３−ヒドロキシ−６−プロトイルデンから選択されることが好ましい。
したがって、本発明はさらに、本発明の方法によって得られるヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルに関する。
本発明はさらに、ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、本発明において同定されたポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターの使用に関する。
本発明はさらに、ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、（ｉ）プロトイルデンシンターゼと（ii）少なくとも１種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとを少なくとも含む遺伝子クラスターの使用に関する。
本発明の使用および方法の好ましい一実施形態において、添付の配列表に記載の配列番号９に示すヌクレオチド配列を有する遺伝子クラスターを使用する。
上記で開示した方法ならびにプロトイルデンシンターゼおよびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの標的発現により、宿主微生物中または該宿主微生物が含まれる培地中において、ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類を生成および蓄積させることができる。当業者であれば、ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の生成を向上させたり、そのような向上を補助するのに必要となる可能性がある任意および／または必須の前駆物質や他の物質、栄養素または代謝産物を宿主微生物細胞または宿主微生物細胞培養に添加してもよいことを容易に理解するであろう。
したがって、本発明はさらに、上記で定義した方法によって得られるヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類に関する。このようにして製造されたヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類は、医薬品、たとえば細菌性感染症または細菌性疾患を治療するための医薬品として効率的に使用することができる。
上記に鑑みて、本発明はさらに、ヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類を製造するための、上記で定義したポリヌクレオチド、ベクターまたはポリペプチドの使用に関する。
本発明に従ったヒドロキシル化プロトイルデン類またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の製造は、プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを異種的または同種的に過剰発現させることによって実施することができる。この発現に使用される系および方法、それらに適した宿主細胞は、本発明の教示を理解することによって当業者に明らかになるであろう。
本発明のさらなる利点は、実施形態の記載および添付の図面からさらに明らかになるであろう。
上記の特徴および後述する特徴は、記載された組み合わせだけでなく、本発明の範囲を逸脱することなく他の組み合わせやそれら単独でも使用できることは言うまでもない。
本発明のいくつかの実施形態を図面に示し、以下の説明においてより詳しく説明する。
メレオライドＩの合成のスキームを示す。このスキームはファルネシル二リン酸から６−プロトイルデンへの環化で始まり、次いでシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる酸化を行うことによってテルペン部分を生合成する。最終工程では、アシルトランスフェラーゼによるポリケチド生合成により得られたオルセリン酸をテルペン部分に付加する。 メレオライド遺伝子クラスターのテルペン生合成部分のスキームを示す。この遺伝子クラスターは、プロトイルデンシンターゼ、４種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび２種の機能未知タンパク質を含む（図２Ａ）。図２Ｂ〜図２Ｅは、同定した４種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの配列を示す。 シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ−Ａｒｍ１〜４を発現する種々のサッカロミセス・セレビシエのクローンから調製したミクロソームタンパク質試料とネガティブコントロールのウェスタンブロットの結果を示す。 ６−プロトイルデンを添加したin vivoフィーディングにより得られた溶媒抽出物の非放射性分析およびＧＣ／ＭＳ分析の結果を示す。ＣＹＰ−Ａｒｍ３を発現するクローンのin vivoフィーディングからの抽出物（Ｂ）は、保持時間１０．６分においてネガティブコントロール（Ａ）とは別のピークを示した。 出芽パン酵母であるサッカロミセス・セレビシエを用いた、推定上ヒドロキシ−プロトイルデンの製造スキームを示す。 ＮＭＲ分光法によって８−ヒドロキシ−プロトイルデンであると解明された、発酵によって得られたヒドロキシ−プロトイルデンの構造を示したスキームを示す。
図１は、ナラタケ属によって生成されるプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類のうちのいくつかの代表例を示す。プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類は、二重結合の位置によってアルミリルオルセリナート類とメレオライド類の２種類に分類される（図１）。
材料と方法
酵母株と培養条件
ワタゲナラタケ（Armillaria gallica）FU02472株を過去の報告に従って培養した（Engels et al., “Cloning and Characterization of an Armillaria gallica cDNA encoding protoilludene synthase, which catalyzes the first committed step in the synthesis of antimicrobial melleolides, J. Biol. Chem. 286:6871-6878 (2011)）。酵母株サッカロミセス・セレビシエCEN.PK2-1C（MATa, ura3-52, trp1-289, Leu2-3_112, his3 Δ1, MAL2-8c, SUC2）は、EUROSCARF（EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis）およびフランクフルト大学（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）より入手し、ＳＣ最少寒天培地で維持した（Engels, et al., "Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol production", Metab. Eng. 10, 201-206 (2008)）。バッチ培養においては、緩衝ＹＰ培地（２％ｗ／ｖトリプトン、１％ｗ／ｖ酵母エキスおよび５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）に２％ｗ／ｖグルコースを添加して使用し、Gal1プロモーター駆動性発現を誘導するためのフェッドバッチ発酵においては、緩衝ＹＰ培地に２％ｗ／ｖガラクトースを添加して使用した。Ｓ．セレビシエの形質転換は、過去の報告に従って酢酸リチウム法を実施し選択を行うことによって達成した（Engelsら、2008）。
ゲノムＤＮＡの単離およびライブラリの構築
ワタゲナラタケのゲノムＤＮＡは、セチルトリメチルアンモニウムブロミド法（MurrayおよびThompson、1980）を用いて単離した。製造者のガイドラインに従って、Lambda DASH II/BamHIベクターキットおよびGigapack III Gold packaging extract（Stratagene、ハイデルベルグ、ドイツ）を組み合わせて使用してワタゲナラタケのゲノムライブラリを構築した。Clontech社（サン＝ジェルマン＝アン＝レー、フランス）のGenomeWalker（登録商標）Universal Kitを製造者のプロトコルに従って使用して、ワタゲナラタケのゲノムウォーキングライブラリを構築した。
ライブラリスクリーニング、ゲノムウォーキングおよび配列解析
ファージプラークを荷電ナイロン膜（ＧＥヘルスケア）に転写し、３２Ｐ標識核酸プローブを用いてスクリーニングした。０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを添加したRoti（登録商標）Hybrid Quick（Carl Roth、カールスルーエ、ドイツ）を用いて、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った。DecaLabel（登録商標）DNA Labelling Kit（Fermentas（ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）；２０１０年よりThermo Fisher Scientific）を用いて、プローブの標識を行った。膜を６５℃で１５時間ハイブリダイズした後、希釈したRoti Hybrid Quickハイブリダイゼーションバッファーで４回洗浄した（Roti Hybrid Quick：H2Oを１：２で混合したもので３０分間、１：５で混合したもので３０分間、次いで１：１０で混合したもので１０分間を２回）。膜を−８０℃で４日間Ｘ線フィルムに暴露した。プライマーウォーキングを実施して、単離した陽性コスミドの配列解析を行った。ゲノムウォーキングＰＣＲ増幅により得られた断片を、Zero Blunt（登録商標）クローニングキット（インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ）を使用してサブクローニングし、ＤＮＡ配列解析を行った。
酵母におけるシトクロムＰ４５０の異種発現およびin vivoフィーディングによる機能試験
Gatewayクローニング法によって、ガラクトースで誘導可能な酵母発現ベクターpYES-DEST52（インビトロジェン）に４種のワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼをクローニングした。ハプロイド酵母株CEN.PK2-1Cを用いて、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを異種発現させた。
酵母における異種由来シトクロムＰ４５０酵素の還元を増強するため、チュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Jennewein, et al., “Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductase with cytochrome P450 oxygenases involved in Taxol biosynthesis” Biotechnol. Bioeng. 89:588-598 (2005)）をpCM183酵母発現ベクターにクローニングし、異種共発現させた。酵母ミクロソーム画分を調製するため、ガラクトースで誘導した組換え酵母バイオマス約５ｇ（湿重量）を使用してスフェロプラストを調製した。ガラスビーズを用いてスフェロプラストを破壊した後、得られた粗抽出物を遠心分離により清澄化し、１０５，０００×ｇで超遠心分離を３時間行うことによって上清から小胞体（ＥＲ）膜を回収した。in vivoフィーディングによる機能試験を行うため、クローニングした上記ワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをチュウゴクイチイ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとともに異種共発現させた。このガラクトース誘導株に非標識６−プロトイルデンまたはトリチウム標識［３Ｈ］−６−プロトイルデンを添加した。一晩インキュベートした後、誘導した酵母細胞培養に１ｍＬの食塩水を加え、５ｍＬのｎ−ペンタンで培養物を３回抽出した。有機溶媒画分をプールし、濃縮して、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＧＣ／ＭＳ分析を行った。
ヒドロキシル−プロトイルデンを全合成するための組換えＳ．セレビシエの発酵
ＮＭＲ解析による構造解明に十分な量のヒドロキシル−プロトイルデンを全生合成するため、ワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ−Ａｒｍ３とチュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼとを共発現するCEN.PK2-1C酵母株を作製した。次いで、PGKプロモーターとcyc1転写ターミネーターとを含むpRS315ベクターに酵母由来末端切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ１（Dimster-Denk, et al., “Feedback regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in Saccharomyces cerervisiae”, Mol. Biol. Cell 5:655-665 (1994)）をクローニングし、このベクターを用いて上記共発現酵母株を形質転換した。ワタゲナラタケ由来プロトイルデンシンターゼは、Gal1プロモーターとcyc1転写ターミネーター（いずれもpYES-DEST52ベクターに由来）とを含む（CEN.PK2-1C酵母株のヒスチジン栄養要求性を補うための）pRS423ベクターにクローニングした。
ＮＭＲ分光測定
ＮＭＲスペクトルはいずれも、ｚグラジエントを備えた５ｍｍのBBOプローブを用いてBruker DRX 500MHz NMR分光計で記録した。ヒドロキシ−プロトイルデン試料を重水素化ジクロロメタンに溶解して最終濃度を約５０ｍＭとし、５．３２ｐｐｍおよび５４．００ｐｐｍにおける溶媒のシグナルを基準として補正した。13C-NMRスペクトルは、パルス幅を３０°とし、遅延時間を２秒として１０００回スキャンすることによって得た。13C-DEPT-135は４００回スキャンして得た。二次元スペクトルはいずれもBruker標準パルスプログラムを用いて取得した。DQF-COSYスペクトルおよびgs-NOESYスペクトルは、それぞれ５１２回のインクリメントによって測定し、DQF-COSYスペクトルでは１回のインクリメントにつき２回スキャンし、gs-NOESYスペクトルでは１回のインクリメントにつき４回スキャンした。NOESYスペクトルでは混合時間を６００ｍｓとした。異核相関は、それぞれ５１２回のインクリメントによって取得したgs-HSQCスペクトルおよびgs-HMBCスペクトルによって測定した。gs-HSQCスペクトルでは１回のインクリメントにつき４回スキャンし、gs-HMBCスペクトルでは１回のインクリメントにつき８回スキャンした。これらのスペクトルはいずれも１４０Ｈｚにおける１Ｊカップリングおよび８ＨｚにおけるｎＪカップリングに対して最適化した。データは、TopSpin 1.3ソフトウェア（Bruker Biospin）およびMestReNova 8.0ソフトウェア（MestreLab Research）を用いて処理した。
結果
ファージライブラリスクリーニングとゲノムウォーキングを用いた生合成遺伝子クラスターの単離
プロトイルデン型セスキテルペノイド遺伝子クラスターを単離するため、ワタゲナラタケ由来ゲノムＤＮＡファージライブラリを構築し、ワタゲナラタケ由来プロトイルデンシンターゼをプローブとしてスクリーニングを行った。２回目のスクリーニングで得られた陽性プラークのうち２つをコスミドＤＮＡの単離に使用した。得られたコスミドＤＮＡを制限消化したところ、同一の断片パターンが見られたことから、これらのコスミドは同じものであることが判明した。一方のコスミドインサート（コスミド５．１）について、プライマーウォーキングによる配列解析を行った結果、２２．９０２ｋｂの断片であることが分かった。
得られた配列データの解析の結果、以前に単離されたプロトイルデンシンターゼのゲノム配列、およびシトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼと高い相同性を有する３つの配列が同定された。この３つの配列のうちの１つは部分配列であると見られた。これらのプロトイルデンシンターゼとシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに加えて、機能が知られていない２つの配列（機能未知タンパク質（hypothetical protein）とした）と、ＧＭＣ酸化還元酵素と高い相同性を有する１つの配列とが約２３ｋｂの上記断片中に同定された。
最大で８位すべてを酸化した複数のプロトイルデン型アリールエステルを用いて、プロトイルデンシンターゼと密接に関連する３種の類似したシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを同定したところ、ワタゲナラタケの生合成経路においてクラスタリングしている可能性が初めて示された。
次に、以下のようにしてゲノムウォーキングライブラリを構築した。制限消化したワタゲナラタケ由来ゲノムＤＮＡにＤＮＡアダプター断片をライゲートし、次いで、得られた複数のＰＣＲ断片の配列解析を行うことによって、コスミド配列インサート内に複数存在するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの断片間のギャップを埋めてその全長を取得した。次に、新たに同定されたこの配列の一部を用いて、上記ゲノムファージライブラリの別の１．７×１０４プラーク形成単位のスクリーニングを行った。スクリーニングの結果、２回目のスクリーニングでも陽性を示した１つのクローンが得られた。このコスミドインサートの配列解析を行った結果、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ、転写活性化因子および逆転写酵素それぞれと相同性を有する３つの推定遺伝子と、別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ−Ａｒｍ１と呼ぶ）とをさらに含む１６．２７ｋｂのワタゲナラタケ遺伝子断片であることが分かった。３’末端から上記５．１コスミド断片までのプライマーウォーキングを試みたが、テルペノイド生合成またはポリケチド生合成において機能を有すると考えられるさらなる遺伝子は認められなかった。図２は、放射性プローブ（プロトイルデンシンターゼ）を用いたゲノムＤＮＡライブラリスクリーニングによって得られた上記メレオライド遺伝子クラスターのテルペン生合成部分のスキームを示す。この遺伝子クラスターは、プロトイルデンシンターゼ（「Ｐｒｏ１」）、４種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（「ＣＹＰ−Ａｒｍ１」、「ＣＹＰ−Ａｒｍ２」、「ＣＹＰ−Ａｒｍ３」および「ＣＹＰ−Ａｒｍ４」と呼ぶ）、ならびに２種の機能未知タンパク質を含む。
同定されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのワタゲナラタケ由来ｃＤＮＡライブラリからの増幅
上記クローン化ゲノムＤＮＡの配列解析を行ったところ、上記でゲノムウォーキングを行った４種のゲノムシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ配列は、イントロン／エキソンが高度に断片化していることが分かった。２１５８ｂｐにわたるシトクロムＰ４５０ ＣＹＰ−Ａｒｍ１のゲノム配列は、１０個のイントロンを含み、３８ｂｐ〜５３７ｂｐの長さのエキソンを有する。ＣＹＰ−Ａｒｍ２のゲノム配列とＣＹＰ−Ａｒｍ３のゲノム配列は非常に類似しており、いずれも１１個のイントロンを含み、配列全体の同一性は７３．８％である。ＣＹＰ−Ａｒｍ４を解析した結果、５０９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された。この推定ＯＲＦは１４個のイントロンによって分断されており、４〜１９０ｂｐの長さのエキソンを生じる。さらに、単離した各シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをアミノ酸配列レベルで解析したところ、ＣＹＰ−Ａｒｍ１、ＣＹＰ−Ａｒｍ２およびＣＹＰ−Ａｒｍ３は、ＣＹＰ−Ａｒｍ４に対してそれぞれ３２．５％、３４．０％および３４．０％のアミノ酸配列類似性を示した。
上記で予測した配列に基づいて、これらに対応するｃＤＮＡをワタゲナラタケ由来ｃＤＮＡライブラリからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。いくつかのサブクローン化ＰＣＲ断片の配列解析を行ったところ、ｃＤＮＡクローンの大部分に依然としてイントロンが含まれていることが明らかとなった。しかしながら、４種すべてのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにおいて適切なｃＤＮＡクローンが得られた。この得られたｃＤＮＡクローンをサッカロミセス・セレビシエにサブクローニングし、異種発現させた。適切な異種発現および酵母小胞体への局在化についての解析を容易にするため、４種すべてのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのＣ末端にヒスチジンタグを付加した。
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの異種発現と機能試験
異種発現させるため、単離したワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを含む４種の発現構築物を用いてCEN.PK2-1C酵母株を形質転換した。Ｌ−ガラクトースによって異種発現を誘導した後、組換え酵母細胞を回収し、酵母のミクロソームタンパク質を調製することによって、異種発現されたＰ４５０が適切に局在化しているかどうかを調べた。ヘキサヒスチジン特異的一次抗体を用いた免疫ブロット分析の結果、異種発現されたタンパク質（推定分子量：５７〜６０ｋＤａ）がミクロソーム画分に適切に局在化していることが示された（図３参照）。
クローン化したシトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼの機能試験を行うため、チュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼを組換え酵母内で共発現させた。クローン化したワタゲナラタケ由来シトクロムＰ４５０に対する最初の機能試験では、in vivoフィーディング法を行った。in vivoフィーディング実験では、まず、誘導した酵母培養物５ｍＬに１５，０００ｃｐｍの３Ｈ標識６−プロトイルデンを加え、一晩インキュベートした。次いで、酵母培養物それぞれから有機抽出物を得て、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオ−ＴＬＣ）で分析した。ラジオ−ＴＬＣ分析の結果、チュウゴクイチイ由来シトクロムＰ４５０レダクターゼとともにＣＹＰ−Ａｒｍ３を発現しているCEN.PK2-1株では、添加した３Ｈ標識６−プロトイルデンがさらに極性の高い推定ヒドロキシル化生成物にほぼ完全に変換されることが分かった。ＣＹＰ−Ａｒｍ２を用いた場合でも、添加した３Ｈ標識６−プロトイルデンよりも極性の高い生成物が認められたが、変換の程度ははるかに低かった。興味深いことに、添加した６−プロトイルデンをｎ−ペンタンを用いて酵母細胞培養から再抽出することは困難であることが分かったが、ヒドロキシル化誘導体の抽出に対しては顕著な改善が見られた。
ＧＣ／ＭＳを用いたさらなる分析のため、ファルネシル二リン酸および組換えプロトイルデンシンターゼを用いた生体触媒作用に基づく合成反応から得られた「非放射性標識（cold）」６−プロトイルデンを上記組換え酵母株に添加した。誘導とin vivoフィーディングを行った組換え酵母培養を上記と同様にしてｎ−ペンタンで抽出し、有機抽出物をＧＣ／ＭＳで分析した。ＧＣクロマトグラムにおいて、（チュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼのみを発現する）ネガティブコントロールと比較すると、ＣＹＰ−Ａｒｍ３は別のピークを示している（図４）。この得られた質量スペクトルは、ヒドロキシプロトイルデン生成物に対応する質量を示した。
組換えＳ．セレビシエによるヒドロキシプロトイルデンの全生合成
次に、ヒドロキシプロトイルデンと推定される生成物の構造をＮＭＲ分析によって調査した。化合物の適切な構造解明には数ミリグラム程度の純粋な生成物が必要であるため、十分な量の生成物を得る必要があった。このため、均質な化合物を精製して分析を行うことを目的として、サッカロミセス・セレビシエ株の遺伝子を改変してヒドロキシプロトイルデンと推定されるものを全生合成した。
チュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ−Ａｒｍ３、酵母由来の末端切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧＲ）およびワタゲナラタケ由来プロトイルデンシンターゼを含むエピソーマル発現ベクターでＳ．セレビシエCEN.PK2-1C株を形質転換し、この酵母株を全発酵に使用した。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの還元を増強し、それによってこの酵素の触媒活性を高めるため、チュウゴクイチイ由来ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼを異種的に共発現させた。末端切断された脱制御型の酵母由来ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸経路の流量を増やすことによってファルネシル二リン酸を増加させ、それによってプロトイルデン生合成を増強する目的で導入した（図６参照）。
以下の表１に、ヒドロキシプロトイルデンの製造に使用した組換えＳ．セレビシエ株において形質転換に使用したプラスミドおよび異種発現させた遺伝子をまとめる。
代謝を遺伝子改変した株を用いてヒドロキシプロトイルデンと推定される生成物を全合成するための発酵は、２．８Ｌのスケールで行った。ＣＹＰ−Ａｒｍ３生成物の精製には、バイオマスから分離した培養上清を用いた。
ヒドロキシプロトイルデンの精製と構造解明
得られた培養上清にシリカＣ１８ＲＰ粉末を加え、４℃でインキュベートすることにより抽出を行った。シリカＣ１８ＲＰ粉末をろ過により回収し、凍結乾燥した。ソックスレー装置を用い、ｎ−ペンタンを有機溶媒として抽出を行った。得られた抽出物を減圧濃縮した。次いで、粗抽出物をシリカゲル６０（クロロプロピル官能基化シリカゲル）上でのクロマトグラフィー（逆相セミ分取ＨＰＬＣ）によって精製した。３つの精製工程を経た後、ＮＭＲ分析用の純生成物約４０ｍｇを得ることができた。
構造を決定するため、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲによる直接分析を行った。以下の表２に、二次元ＮＭＲスペクトルの分析結果として、完全な１Ｈ−ＮＭＲシフトおよび１３Ｃ−ＮＭＲシフトならびにそれらの帰属を示す。
分析の結果、単離された化合物は８−ヒドロキシ−６−プロトイルデンであることが示され、すなわち、ＣＹＰ−Ａｒｍ３は８−α−ヒドロキシラーゼとして作用したことが示された。さらに、分析結果から上記生成物の分子構造が明らかになったとともに、今回初めて、担子菌由来のセスキテルペンアルコールに対するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの触媒作用を詳細に評価することができた。
次に、ＣＹＰ−Ａｒｍ２をさらに発現させることで、ジヒドロキシル化プロトイルデン構造が得られるかどうかを評価した。
上記評価を行うため、使用するプラスミドセットを第５の外因性遺伝子の発現に適合させる必要があった。以下の表３は、ジヒドロキシル化プロトイルデンの製造に使用した組換えＳ．セレビシエ株において形質転換に使用したプラスミドおよび異種発現させた遺伝子を示す。
ジヒドロキシル化プロトイルデンを得るための発酵は３Ｌのスケールで行い、上記のモノヒドロキシル化８−α−６−プロトイルデンを製造するための発酵と同様にした。生成物を精製するため、バイオマスより分離した培養上清をクロロホルムで抽出した。上記の８−α−６−プロトイルデンの単離と同様にして、濃縮した抽出物をＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
ジヒドロキシル化プロトイルデンの精製と構造解明
得られた培養上清をクロロホルム−ｄ１で抽出し、空気乾燥し、重水素化溶媒に溶解し、ＧＣ／ＭＳで分析した。
さらなる構造決定のため、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲによる直接分析を行った。以下の表４は、二次元ＮＭＲスペクトル分析の結果として、完全な１Ｈ−ＮＭＲシフトおよび１３Ｃ−ＮＭＲシフトならびにそれらの帰属を示す。
スペクトル分析の結果、単離された化合物は８−α−１３−ヒドロキシ−６−プロトイルデンであることが示された。したがって、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ−Ａｒｍ２は１３−ヒドロキシラーゼとして作用することが分かった。
上述した異種遺伝子を導入した生合成によって、今回初めて、Ｓ．セレビシエにおいてジヒドロキシル化セスキテルペンアルコールを製造することができ、このジヒドロキシル化セスキテルペンアルコールの構造を解明することができた。
本明細書においてワタゲナラタケ由来の遺伝子クラスターが同定されたように、担子菌類における他のセスキテルペン合成経路の同定も可能である。

Claims (10)

  1. ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルの製造方法であって、
    ａ）添付の配列表に記載の配列番号９に示すヌクレオチド配列を有する遺伝子クラスターを異種発現するように形質転換された宿主微生物を提供する工程、および
    ｂ）プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステル類の生成が可能な適切な栄養条件において、工程ａ）で提供された宿主微生物を培養することによって、ヒドロキシル化プロトイルデンまたはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造する工程
    を含む方法。
  2. ｃ）前記宿主微生物またはその増殖培地から前記ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／または前記プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 工程ａ）において提供される前記宿主微生物が、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼを発現するようにさらに形質転換されている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼが、チュウゴクイチイ由来のＮＡＤＰＨ：シトクロムレダクターゼである、請求項３に記載の方法。
  5. 工程ａ）において提供される前記宿主微生物が、２−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼを発現するようにさらに形質転換されている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記プロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルが、メレオライド類およびアルミリルオルセリナート類から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ヒドロキシル化プロトイルデンが、モノヒドロキシル化プロトイルデンおよびジヒドロキシル化プロトイルデンからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. ヒドロキシル化プロトイルデンおよび／またはプロトイルデン型セスキテルペノイドアリールエステルを製造するための、（ｉ）プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドと（ii）少なくとも１種のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドとを少なくとも含む遺伝子クラスターの使用であって、
    前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドが、
    ａ）添付の配列表に記載の配列番号６または７に示す核酸配列、
    ｂ）配列番号２または３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに
    ｃ）ａ）で定義した核酸配列の逆鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
    からなる群より選択される配列を含む、または該配列からなる
    使用。
  9. 添付の配列表に記載の配列番号９に示すヌクレオチド配列を有する遺伝子クラスターを用いる、請求項８に記載の使用。
  10. ヒドロキシル化プロトイルデンが、８−ヒドロキシ−６−プロトイルデンおよび８，１３−ヒドロキシ−６−プロトイルデンから選択される、請求項７に記載の方法。
JP2016545321A 2014-01-08 2014-01-08 メレオライド生合成遺伝子クラスターおよびその使用 Active JP6673834B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2014/050246 WO2015104051A1 (en) 2014-01-08 2014-01-08 Melleolide-biosynthesis gene cluster and its application

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017503504A JP2017503504A (ja) 2017-02-02
JP6673834B2 true JP6673834B2 (ja) 2020-03-25

Family

ID=49956165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016545321A Active JP6673834B2 (ja) 2014-01-08 2014-01-08 メレオライド生合成遺伝子クラスターおよびその使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10011821B2 (ja)
EP (1) EP3092307B1 (ja)
JP (1) JP6673834B2 (ja)
CN (1) CN105849258B (ja)
ES (1) ES2747844T3 (ja)
WO (1) WO2015104051A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114940980B (zh) * 2022-06-02 2023-11-21 暨南大学 一类倍半萜聚酮合成基因及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10051175A1 (de) * 2000-10-16 2002-05-02 Basf Ag Cytochrom P450 Monoxygenasen aus thermophilen Bakterien
WO2005030806A2 (en) 2003-09-24 2005-04-07 Montana State University Norovirus monoclonal antibodies and peptides
BRPI0616883A2 (pt) * 2005-10-07 2011-07-05 Univ California ácidos nucléicos que codificam enzima modificada de citocromo p450 e métodos de uso dos mesmos
JP5526381B2 (ja) * 2009-09-07 2014-06-18 学校法人近畿大学 セスキテルペン変換酵素遺伝子及びそれを利用した酸化セスキテルペンの製造方法
CN102812129B (zh) * 2009-11-10 2015-08-26 麻省理工学院 用于从类异戊二烯途径生产化学和医药产品的微生物工程
EP2415865B1 (en) * 2010-08-02 2013-05-01 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Protoilludene synthase

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015104051A1 (en) 2015-07-16
US20160319251A1 (en) 2016-11-03
US10011821B2 (en) 2018-07-03
ES2747844T3 (es) 2020-03-11
CN105849258A (zh) 2016-08-10
JP2017503504A (ja) 2017-02-02
EP3092307A1 (en) 2016-11-16
CN105849258B (zh) 2020-05-26
EP3092307B1 (en) 2019-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Enhancement of ganoderic acid accumulation by overexpression of an N-terminally truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene in the basidiomycete Ganoderma lucidum
Wang et al. Genome mining for fungal polyketide-diterpenoid hybrids: discovery of key terpene cyclases and multifunctional P450s for structural diversification
Guo et al. Tafuketide, a phylogeny-guided discovery of a new polyketide from Talaromyces funiculosus Salicorn 58
CN110691850B (zh) 生产折叶苔醇和/或补身醇的方法
Kasahara et al. Pinus taeda phenylpropenal double-bond reductase: purification, cDNA cloning, heterologous expression in Escherichia coli, and subcellular localization in P. taeda
O'Connor Strategies for engineering plant natural products: the iridoid-derived monoterpene indole alkaloids of Catharanthus roseus
Arthaud et al. Studies on the secondary metabolites of a Pseudoalteromonas sp. isolated from sediments collected at the northeastern coast of Brazil
Valente et al. Production of 5-hydroxy-7-methoxy-4-methylphthalide in a culture of Penicillium crustosum
JP6673834B2 (ja) メレオライド生合成遺伝子クラスターおよびその使用
CN110616205B (zh) 一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶
Kumar et al. Cultural, morphological and molecular characterization of vinca alkaloids producing endophytic fungus Fusarium solani isolated from Catharanthus roseus
US9005939B2 (en) Protoilludene synthase
JP6018915B2 (ja) ２８位がヒドロキシメチル基またはカルボキシル基である五環系トリテルペン化合物の製造方法
JP2011172526A (ja) 酵母宿主
CN109790553B (zh) 芝麻素酚或芝麻素酚糖苷的生产方法
EP1885848B1 (en) Microbial conversion of sugar acids and means useful therein
Nguyen et al. Optimization, purification and characterization of α-glucosidase inhibitors from Streptomyces costaricanus EBL. HB6 isolated in Vietnam
CN108504640A (zh) 甾体化合物侧链修饰基因及其应用
CN114350524B (zh) Mycoleptodiscin型吲哚倍半萜化合物、其生物合成方法及其用途
WO2009084439A1 (ja) リグナン水酸化酵素
Jumpathong et al. Chemical investigation of novel ascomycetes using PCR based screening approaches
Weber et al. Histochemical and ultrastructural characterization of fungal mitochondria
Aitken Antifungal Natural Products from Endophytes of Fruit-Bearing Plants
Hufendiek Enzyme-inhibitory secondary metabolites and their exudation in the marine-derived fungus Epicoccum nigrum link
Abdel-Hameed Polyketide biosynthesis in lichen fungi Cladonia uncialis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20160711

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20161128

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20170912

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170926

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20171221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180226

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180731

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181130

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20181211

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20190215

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191213

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200305

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6673834

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250