CN105849258B - 蜜环菌戊素生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可以用于产生羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的新近鉴定的基因。本发明相应地涉及核苷酸序列、已用该核苷酸序列转化的宿主微生物和采用经转化的微生物的方法。

Description

蜜环菌戊素生物合成基因簇及其应用

技术领域

本发明涉及新近鉴定的基因簇，特别是在所述基因簇内的新近鉴定的多核苷酸，以及由多核苷酸编码的多肽，以及其生产和用途，以及其变体及其用途。此外，本发明涉及通过使用新近鉴定的多核苷酸/多肽用于产生羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的方法。

背景技术

由于具有针对标准抗生素疗法的抗性的微生物病原体的流行率不断增加的事实，研究已开始集中于具有新型作用模式的新抗微生物药物的寻找和开发。天然产物是传统上生物活性化合物的丰富来源，尽管萜类是迄今为止最大的一类天然产物，但在萜类家族中仅存在三种获得批准的抗微生物药物，并且三种均为真菌天然产物截短侧耳素的半合成衍生物(硫姆林(tiamulin)、伐奈莫林(valnemulin)和瑞他莫林(retapamulin))。

担子菌纲是复杂、结构上分散和生物活性的倍半萜的特别丰富的来源，并且来自蜜环菌属(Armillaria)的某些原伊鲁烯型倍半萜芳基酯是用于开发新抗微生物药物的有希望的前导化合物。蜜环菌属通常也称为蜂蜜蕈，目前分类在膨瑚菌科(Physalacriaceae)内，并且全世界包含超过600个物种。蜜环菌属物种不仅视为食用菌，还视为攻击阔叶树和针叶树以及果树和葡萄藤的臭名昭著的根病原体。

蜜环菌属的成员因产生两类倍半萜原伊鲁烯型芳基酯而有名，所述芳基酯根据双链的位置分成苔色酸蜜环基酯(armillylorsellinates)和蜜环菌戊素(melleolides)。当今已知来自蜜环菌属物种的超过50种苔色酸蜜环基酯和蜜环菌戊素结构，这使得其成为已知来自真菌的天然产物的最广泛组之一。

虽然一些萜类特别是植物起源的一些萜类如薄荷醇、青蒿素或紫杉醇的生物合成已在过去得到广泛研究，但关于特别是通过真菌产生的萜类中的绝大多数的合成知之甚少。

原伊鲁烯型芳基酯由倍半萜原伊鲁醇(protoilludanol)和苔藓酸衍生的芳香族部分构建。所有蜜环菌戊素和苔色酸蜜环基酯型倍半萜的生物合成均被认为衍生自通用倍半萜前体法尼基二磷酸盐环化为原伊鲁烯。原伊鲁烯环系统随后经历几个羟基化反应，并且所得到的原伊鲁醇随后经历在C5-羟基位置处由聚酮苔藓酸衍生物的酯化。

虽然苔藓酸和衍生物通过众多微生物生物合成，并且原伊鲁烯是同担子菌亚纲中分布广泛的，但两者的联接看起来是蜜环菌属特有的。

因为，如上文已经提及的，由于其潜在的抗微生物和细胞毒性活性，蜜环菌戊素和苔色酸蜜环基酯在医学中是高度感兴趣的，所以期望使其以受控方式专门产生或富集。

因此，本发明的目的是提供新的和改良的工具，借助于所述工具可以实现同源或异源的靶向生产。

发明内容

根据本发明，这个目的及其他目的通过提供分离的或合成的或重组多核苷酸来实现，所述多核苷酸编码具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽，并且包含选自下述的核酸序列或由选自下述的核酸序列组成：a)所附序列表的SEQ ID NO.5至8；b)与SEQ ID NO.5至8互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中限定的核酸序列或其互补链杂交的核酸序列。

特别地，这个目的及其他目的通过包含下述基因或由下述基因组成的基因簇得到进一步解决：高卢蜜环菌(Armillaria gallica)细胞色素P450单加氧酶1、高卢蜜环菌细胞色素P450单加氧酶2、高卢蜜环菌P450单加氧酶3、高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶、高卢蜜环菌细胞色素P450单加氧酶4，其中所述基因以所述的次序排列。

上述目的通过以下方式进一步实现，使用用于生产羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的所述多核苷酸或由多核苷酸编码的多肽，以及用于生产羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的相应方法。

此外，本发明提供了上述的用于生产羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的基因簇，以及使用基因簇而用于生产原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的相应方法。

上述目的以此方式得以全部实现。

根据本发明人的知识，各自编码具有单加氧酶活性的高卢蜜环菌多肽的上述的多核苷酸已首次得到鉴定、纯化且酶促表征。这些新近鉴定的多核苷酸催化将6-原伊鲁烯转换成单一或多重羟基化6-原伊鲁烯的羟基化反应，所述反应代表羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯合成中的关键步骤。因此，通过已鉴定编码单加氧酶的基因，已发现且生成有价值和有效的工具，以影响羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的产生：基因可以是单一的或成簇的，还包含异源表达或过表达的原伊鲁烯合酶，以便生成所述基因的多重拷贝，从而在倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的合成中的羟基化原伊鲁烯的环化速率和生成得到升高，并且因此增加倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的产生。以这种方式，可以获得高度富集的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯，其可以用作有力的抗微生物和细胞毒性物质，并且可以用作所有不同的治疗和医学领域中的治疗工具，或其可以进一步修饰以产生衍生自所述羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的其他抗微生物物质。

根据本发明，术语“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，其为单链和双链区或者单链、双链和三链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，以及其为单链和双链区的混合物的RNA，包含其可为单链或更通常的双链或三链区的DNA和RNA的杂交分子，或单链和双链区的混合物。另外，本文使用的“多核苷酸”是指，包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。此类区域中的链可以来自相同分子或不同分子。区域可以包括分子中的一种或多种的全部，但更通常仅涉及分子中的一些的仅一个区域。三螺旋区的分子之一通常是寡核苷酸。本文使用的术语“多核苷酸”还包括如上所述的DNA或RNA，其含有一个或多个经修饰的碱基。因此，具有出于稳定性或其他原因修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，这是该术语在本文中所意旨的。此外，包含罕见碱基例如肌苷或经修饰的碱基例如三苯甲基化碱基(仅举两个例子)的DNA或RNA是多核苷酸，这是该术语在本文中所意旨的。应了解已对DNA和RNA作出广泛多样的修饰，其发挥本领域技术人员已知的许多有用的目的。本文使用的术语“多核苷酸”涵盖此类化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及化学形式的病毒和细胞包括例如简单细胞和复杂细胞特有的DNA和RNA。此外，“多核苷酸”还涵盖通常被称为寡核苷酸的短多核苷酸。

“多肽”指包含通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”指通常被称为肽、寡肽和寡聚物的短链，以及一般被称为蛋白质的更长链两者。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程例如加工及其他翻译后修饰进行修饰的那些，以及通过化学修饰技术进行修饰的那些。此类修饰在基础课本和更详细的专题论文以及大量的研究文献中描述，并且它们是本领域技术人员众所周知的。应了解相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点处。此外，给定多肽可以含有许多类型的修饰。修饰可以在多肽中的任何地方出现，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白质，例如精氨酰化和泛素化。多肽可以是分支或环状的，含或不含分支。环状、分支和分支环状多肽可以起因于翻译后天然过程，并且同样可以通过完全合成的方法进行制备。

“分离的”意指由其天然状态“通过人工”改变，即如果它存在于自然界中，则它已改变或从其原始环境中取出，或两者。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，这是该术语在本文中所意旨的。类似地，本文使用的术语“合成”序列意指已合成生成且并非从天然来源中直接分离的任何序列。“重组”意指通过将来自一个物种的基因移植或剪接到不同物种的宿主生物体的细胞内制备的遗传改造的DNA。此类DNA变成宿主的基因构成的部分并且被复制。

本文使用的术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖包括编码本发明多肽的序列的多核苷酸，所述多肽特别是高卢蜜环菌的单加氧酶，其具有如SEQ ID No.1至4中所示的氨基酸序列。该术语还涵盖包括编码多肽的单个连续区或不连续区(例如由整合的噬菌体或插入序列或编辑间断)，连同还含有编码和/或非编码序列的另外区域的多核苷酸。

本文使用的术语“变体”是分别不同于参考多核苷酸或多肽，但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列不同于另一种参考多核苷酸。变体的核苷酸序列中的变化可以改变或不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可以导致如下所述的由参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变体的氨基酸序列不同于另一种参考多肽。一般地，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体非常类似，并且在许多区域中相同。变体和参考多肽是在氨基酸序列中存在差异，差异方式可以是一或多个取代、添加、缺失、或任意组合。取代或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的例如等位基因变体，或它可以是已知并非天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术、直接合成和本领域技术人员已知的其他重组方法进行制备。

在本发明和/或变体多肽定义内还包括“直向同源”多肽(直向同源物)，其是由不同物种中的基因编码的肽，所述基因通过物种形成由共同祖先基因进化而来。通常，直向同源物在进化过程中保留相同功能。

此外，术语“宿主细胞”或“宿主微生物”目前定义为细胞或微生物或微生物细胞，其已转化或转染，或能够通过外源多核苷酸序列转化或转染，因此异源表达所引入的多核苷酸。

目前，通常的理解是，“倍半萜原伊鲁烯型芳基酯”应理解为代表苔色酸蜜环基酯或蜜环菌戊素。就其本身而言，它们由氧合倍半萜原伊鲁烯和苔藓酸构建。

根据本发明的一个实施方案，分离的多核苷酸由所附序列表的SEQ ID No.5至9之一组成，并且编码具有单加氧酶活性的多肽(SEQ ID No.5至8)，或代表包含4种单加氧酶和原伊鲁烯合酶的基因簇。SEQ ID No.5至8代表新近鉴定的高卢蜜环菌的蜜环菌戊素合成基因簇中含有的四种不同的高卢蜜环菌单加氧酶的序列，所述簇还包含原伊鲁烯合酶基因。SEQ ID No.9显示了簇的序列。

如所附序列表中公开的SEQ ID No.5至8分别是如由高卢蜜环菌鉴定和表征的单加氧酶1至4的四种cDNA序列。应理解其变体也是合适的且是本发明的部分，所述变体具有至少90％的序列同一性，并且可能甚至在其他蜜环菌属物种中发现，因为提供了新近鉴定的单加氧酶的有价值的工具，从而可以通过序列比较和后续酶促测试鉴定类似单加氧酶，即略微不同于SEQ ID No.5至8的单加氧酶。

本发明还涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传改造的宿主微生物和/或宿主细胞，以及通过重组技术产生本发明的多肽。

使用衍生自本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可用于产生此类多肽。

因此在另外的方面，本发明还涉及含有如上定义的核酸序列的载体，编码具有单加氧酶活性的多肽，可操作地连接至由用载体转化或转染的宿主细胞/微生物识别的控制序列的核酸序列。根据本发明的一个方面，载体是表达载体，并且根据另一个方面，载体可以以质粒、粘粒、噬菌体、脂质体或病毒的形式存在。

对于重组生产，宿主细胞可以遗传改造，以掺入表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。多核苷酸引入宿主细胞内可以通过许多标准实验室手册中描述的方法来实现，例如Davis等人Basic Methods in Molecular Biology,(1986)和Sambrook等人MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)。

因此，根据本发明的多核苷酸可以例如包含在载体中，所述载体待稳定转化/转染到宿主微生物细胞内。在载体中，本发明的多核苷酸处于诱导型启动子的控制下，使得基因/多核苷酸的表达可以特异性靶向，并且需要时，一种或多种基因可以以这种方式过表达。

广泛多样的表达系统可以用于产生本发明的多肽。此类载体尤其包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和细菌噬菌体遗传元件的那些，例如粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以含有调节以及引起表达的控制区。一般地，适合于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体可以用于在这方面的表达。适当的DNA序列可以通过各种众所周知和常规技术中的任一种插入表达系统内，例如Sambrook等人中所示的那些，参见上文。

根据上文，本发明还涉及由选自下述的氨基酸序列组成的分离的肽：

a)SEQ ID No：1至4之一中所示的氨基酸序列；

b)SEQ ID No.1至4中所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下分别与SEQ ID No.5至8中所示的核酸分子的相反链杂交；

c)SEQ ID No.1至4中所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中所述直向同源物由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID No.5至8中所示的核酸分子的相反链杂交；和

d)SEQ ID No.1至4中所示的氨基酸序列的片段，其中所述片段包含至少10个连续的氨基酸且展示单加氧酶活性。

此外，本发明涉及已用根据本发明的多核苷酸转化/转染的宿主细胞/微生物，或含有如上定义的载体且特别是选自包括酵母的真菌和细菌的微生物或宿主细胞。

应理解宿主微生物异源表达新近鉴定的多核苷酸，即本文鉴定的单加氧酶中的至少一种，优选与原伊鲁烯合酶组合，或异源表达如下文进一步阐述的基因簇。

根据本发明的另一个方面，使用宿主微生物，其中编码具有单加氧酶活性的多肽的核酸适合各个宿主微生物的密码子使用。

根据本发明的另一个实施方案，宿主细胞是酵母属物种(Saccharomyces spp.)，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、曲霉菌属物种(Aspergillus spp.)特别是构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、同担子菌纲，特别是蜜环菌属的同担子菌纲，特别是高卢蜜环菌、蜜环菌(Armillaria mellea)、奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)以及蜜环菌属物种的其他成员。

本发明的另外一个方面涉及用于产生蜜环菌戊素的方法，其包括下述步骤：

a)在允许生产羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的合适营养条件下，生长如上文定义的微生物；和

b)从宿主微生物或其生长培养基中分离所述羟基化原伊鲁烯或所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

根据本发明的一个方面，羟基化原伊鲁烯选自8-α-羟基-6-原伊鲁烯；8-α,13-羟基-6-原伊鲁烯；并且倍半萜原伊鲁烯型芳基酯选自蜜环菌戊素I、亮菌甲素(armillaridine)、蜜环菌戊素A、蜜环菌戊素F、蜜环菌戊素B、蜜环菌戊素K、扁枝衣酸蜜环基酯(armillyl evernitate)、蜜环菌甲素、蜜环菌醇(arnamiol)、蜜环菌戊素J、蜜环菌寅素、10-α-羟基-蜜环菌戊素、苔色酸蜜环基酯(armillyl orsellinate)、蜜环菌戊素E、1-O-三氟乙酰基-蜜环菌戊素E、蜜环菌戊素H、5'-O-甲基-美莱道耐尔(melledonal的音译)、美莱道耐尔、阿内米尔(arnamial的音译)、蜜环菌戊素C、蜜环菌戊素D、美莱道耐尔A、美莱道耐尔C、美莱道耐路(melledonol的音译)、脱水苔色酸蜜环基酯(dehydroarmillyloresllinate)、阿内米兰(armillane的音译)、蜜环菌乙素。

根据另外一个方面，该方法包括由下述步骤组成的上述步骤：

a)在合适的营养条件下生长宿主微生物，所述宿主微生物经转化或转染以包含选自下述的核酸序列：a)来自所附序列方案的SEQ-ID-No.5至8，b)与SEQ ID No.5至8互补的核酸序列，和c)在严格条件下与a)和b)中限定的核酸序列或者其互补链杂交的核酸序列；

b)过表达核酸序列；

c)因此，增强微生物细胞中的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯生产，和

d)从微生物或其生长培养基中分离所述羟基化原伊鲁烯或所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

根据本发明的一个实施方案，本发明还涉及用于产生羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供宿主微生物，其已转化以至少异源表达下述全部：i)原伊鲁烯合酶，和ii)至少一种细胞色素P450单加氧酶，其中(i)或(ii)中的至少一种对所述宿主微生物是外来的，

b)在允许生产倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的合适营养条件下，生长步骤a)中提供的宿主微生物；因此产生羟基化原伊鲁烯，以及视情况而定的倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

在根据本发明的方法中采用的宿主微生物因此包含至少两种基因，即原伊鲁烯合酶和至少一种细胞色素P450单加氧酶，优选如本发明中鉴定的高卢蜜环菌的CYP-Arm 1至4。

相应地，该方法可以进一步包括步骤c)：

c)从宿主微生物或其生长培养基中分离所述羟基化原伊鲁烯和/或所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

此外，在根据本发明的方法中，在一个优选实施方案中，原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶分别是来自下述之一的原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶：蜜环菌属物种，特别是高卢蜜环菌，并且进一步优选如本文鉴定的CYP-Arm 1、2、3或4或者CYP-Arm 1至4单加氧酶。

因此，在本发明的方法的改善中，细胞色素P450单加氧酶具有选自下述的氨基酸序列：

a)所附序列表的SEQ ID No.1至4的任一中所示的氨基酸序列；

b)SEQ ID No.1至4的任一中所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，其中所述等位基因变体由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID No.5至8中所示的核酸分子的相反链杂交；

c)SEQ ID No.1至4的任一中所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中所述直向同源物由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID No.5至8中所示的核酸分子的相反链杂交；和

d)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的功能片段，其中所述片段包含至少10个连续的氨基酸，实现细胞色素P450单加氧酶的功能。

另外，在本发明的方法的改善中，在步骤a)中提供了微生物，其进一步转化以表达NADPH-细胞色素P450还原酶，优选来自红豆杉(Taxus chinensis)的NADPH:细胞色素还原酶。

引入该酶以便改善异源细胞色素P450酶在酵母中的还原。

根据依照本发明的宿主微生物和/或方法的改善，步骤a)中提供的宿主微生物进一步转化，以表达2-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)还原酶。

引入该酶以便增加通过甲羟戊酸途径的通量，以提供另外的法尼基二磷酸盐以加强原伊鲁烯生物合成。

应理解优选倍半萜原伊鲁烯型芳基酯选自蜜环菌戊素和苔色酸蜜环基酯，特别是单羟基化原伊鲁烯，特别是8-羟基-6-原伊鲁烯、二羟基化原伊鲁烯，特别是8,13羟基-6-原伊鲁烯。

相应地，本发明还涉及由根据本发明的方法获得的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

进一步地，本发明还涉及如本文鉴定的多核苷酸、或如本文描述的载体用于生产羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的用途。

此外，本发明还涉及包含至少(i)原伊鲁烯合酶和(ii)至少一种细胞色素P450单加氧酶的基因簇用于生产羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的用途。

在根据本发明的用途和方法的一个优选实施方案中，使用具有所附序列表的SEQID No.9中所示的核苷酸序列的基因簇。

使用所公开的方法以及原伊鲁烯合酶和细胞色素P450单加氧酶的靶向表达，能够在宿主微生物或在其中包含宿主微生物的培养基中产生且累积羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。应理解本领域技术人员的技术和知识还包括，用另外和/或必要前体或其他物质、营养素或代谢产物(其可能是完成或帮助增强的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯生产必需的)补充宿主微生物细胞或宿主微生物细胞培养物。

相应地，本发明还涉及通过如上定义的方法获得的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。因此生成的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯可以有效地用作药剂，例如用于治疗任何细菌造成的感染或疾病。

考虑到上文，本发明还涉及如上定义的多核苷酸、载体或多肽分别用于产生羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的用途。

应理解根据本发明的羟基化原伊鲁烯或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的生产可以借助于编码原伊鲁烯合酶的多核苷酸的异源或同源过表达来执行。在阅读本发明的教导后，系统和方法以及各个合适宿主细胞对于本领域技术人员将是显而易见的。

进一步的优点遵循实施方案和附图的描述。

不言而喻的是，在不背离本发明的范围的前提下，上述特点和下文有待说明的特点不仅可以以分别指定的组合使用，还可以以其他组合或单独使用。

附图说明

本发明的几个实施方案在附图中举例说明，并且在下述说明书中更详细地说明。在附图中：

图1显示了涉及萜烯生物合成部分的蜜环菌戊素(melleolide I)合成的方案，以法尼基二磷酸盐环化为6-原伊鲁烯开始，随后为经由细胞色素P450单加氧酶的氧化；最后步骤是通过酰基转移酶的得自聚酮生物合成的苔藓酸的附着。

图2显示了蜜环菌戊素基因簇的萜烯生物合成部分的方案；该簇含有原伊鲁烯合酶、四种细胞色素P450单加氧酶和两种假定蛋白质(图2A)；图2B至2E展示了四种鉴定的细胞色素P450单加氧酶的序列；

图3显示了来自表达酿酒酵母克隆的细胞色素P450单加氧酶CYP-Arm 1至4和阴性对照的微粒体蛋白质制备的不同样品的蛋白质印迹(Western Blot)；

图4显示了对得自用6-原伊鲁烯体内供给的溶剂提取物的非放射性测定法和GC/MS分析：与阴性对照(A)相比较，表达CYP-Arm3(B)的克隆的体内供给的提取物在10.6分钟的保留时间时显示另外的峰。

图5显示了出芽面包酵母酿酒酵母用于生产假定的羟基-原伊鲁烯的方案；

图6显示了展示得自发酵的羟基-原伊鲁烯的结构的方案，所述羟基-原伊鲁烯通过NMR光谱学阐明为8-羟基-原伊鲁烯。

具体实施方式

图1显示了通过蜜环菌属的成员产生的倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的一些代表的示意图。两类倍半萜原伊鲁烯型芳基酯根据双键的位置分成苔色酸蜜环基酯和蜜环菌戊素(图1)。

材料与方法

菌株和生长条件：高卢蜜环菌菌株FU02472如先前描述(Engels等人"Cloning andCharacterization of an Armillaria gallica cDNA encoding protoilludenesynthase，which catalyzes the first committed step in the synthesis ofantimicrobial melleolides，J.Biol.Chem.286:6871-6878(2011))进行培养。酵母菌株酿酒酵母CEN.PK2-1C(MATa，ura3-52，trp1-289，Leu2-3_112，his3Δ1，MAL2-8^c，SUC2)得自EUROSCARF(EUROpean Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional analysis)Universitat Frankfurt(Frankfurt am Main，德国)，并且维持在SC基本培养基琼脂(Engels等人"Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as afirst step towards TAxol production"，Metab.Eng.10，201-206(2008))上。缓冲的YP培养基(2％w/v胰蛋白胨、1％w/v酵母提取物和50mM MES，pH5.5)与2％w/v葡萄糖一起用于分批培养中，并且与2％w/v半乳糖一起用于分批补料发酵中，用于诱导Gal1启动子驱动的表达。酿酒酵母的转化通过使用乙酸锂方法伴随先前描述的选择(Engels等人2008)来完成。

基因组DNA分离和文库构建：高卢蜜环菌基因组DNA使用十六烷基三甲基溴化铵方法(Murray和Thompson，1980)进行分离。对于基因组文库构建，根据制造商的指导(Stratagene，Heidelberg，德国)，使用与Gigapack III Gold(商品名)包装提取物组合的Lambda DASH M/BamHI载体试剂盒。对于高卢蜜环菌基因组步移文库的构建，根据制造商的方案使用Clontech(Saint-Germain-en-Laye，法国)GenomeWalker^TMUniversal Kit(商品名)。

文库筛选、基因组步移和测序：将噬菌体噬斑转移至荷电尼龙膜(GEHealthcare)，并且使用³²P标记的核酸探针进行筛选。对于预杂交和杂交，

HybridQuick(Carl Roth，Karlsruhe，德国)补充有0,1mg/ml鲑精DNA。对于探针的标记，使用DecaLabel^TMDNA Labelling Kit(Fermentats，St.Leon-Rot，德国；自从2010年后ThermoFisher Scientific)。膜在65℃下杂交15小时，并且随后用稀释的

Hybrid Quick杂交缓冲液(

Hybrid Quick:H20 1:2共30分钟，1:5共30分钟，并且1:10共两次每次10分钟)洗涤四次。膜随后在-80℃下暴露于X射线胶片4天。分离的阳性粘粒随后通过引物步移进行测序。由基因组步移PCR扩增所获得的片段进行亚克隆，用于Zero

Cloning Kit(Invitrogen，Karlsruhe，德国)中的DNA测序。

细胞色素P450在酵母中的异源表达和经由体内供给的功能测试：所有四种高卢蜜环菌细胞色素P450依赖性单加氧酶经由gateway克隆(一种克隆方式)而克隆到半乳糖诱导型酵母表达载体pYES-DEST52(Invitrogen)内。对于细胞色素P450单加氧酶的异源表达，使用单倍体酵母菌株CEN.PK2-1C。

为了改善异源细胞色素P450酶在酵母中的还原，将红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶(Jennewein等人"Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductasewith cytochrome P450oxygenases involved in Taxol biosynthesis"Biotechnol.Bioeng.89:588-598(2005))克隆到pCM183酵母表达载体内，用于异源共表达。对于酵母微粒体部分制备，大约5g(湿重)半乳糖诱导的重组酵母生物量用于球芽制备。在使用玻璃珠破坏球芽后，所得到的粗提取物通过离心澄清，并且经由105.000g超速离心三小时从上清液中收集ER膜。对于经由体内供给的功能测试，所克隆的高卢蜜环菌细胞色素P450单加氧酶与红豆杉细胞色素P450单加氧酶异源共表达。对半乳糖诱导的菌株使用冷的6-原伊鲁烯或氚标记的[³H]-6-原伊鲁烯。在过夜温育后，向诱导的酵母细胞培养物加入1ml盐水，并且培养物用5ml正戊烷提取三次。将有机溶剂馏分合并且浓缩用于放射薄层色谱法(TLC)或GC/MS分析。

用于羟基-原伊鲁烯的总体合成的重组酵母细胞的发酵：对于用于经由NMR分析的结构阐明的足够量的羟基-原伊鲁烯的总体生物合成，共表达高卢蜜环菌细胞色素P450单加氧酶CYP-Arm3与红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶的CEN.PK2-1 C酵母菌株用克隆有截短形式的酵母HMG-CoA还原酶1(Dimster-Denk等人"Feedback regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in Saccharomyces cerervisiae"，Mol.Biol.Cell 5:655-665(1994))的pRS315载体进行转化，所述pRS315载体含有PGK启动子和cyc1转录终止子。将高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶克隆到pRS423载体(补充酵母CEN.PK2-1C组氨酸营养缺陷型)内，所述pRS423载体含有Gal1启动子和cyc1转录终止子(两者均得自pYES-DEST52载体)。

NMR光谱学：所有NMR谱均记录在Bruker DRX 500MHz NMR光谱仪上，使用具有z梯度的5mm BBO探针。羟基-原伊鲁烯样品溶解于氘化二氯甲烷中至约50mM的最终浓度，并且分别相对于在5.32ppm和54.00ppm处的溶剂信号校准。¹³C-NMR谱通过用30°脉冲和2秒延迟的1000次扫描获得。¹³C-DEPT-135通过400次扫描获得。所有二维谱均使用BRUKER标准脉冲方案获得。DQF-COSY和gs-NOESY谱用512次增量进行测量，分别具有两次或四次扫描/增量。600ms的混合时间用于NOESY谱。异核关联通过gs-HSQC和gs-HMBC谱进行测量，所述谱用512次增量获得，分别具有四次或八次扫描/增量。两个谱分别就140Hz和8Hz的¹J和ⁿJ偶联进行优化。数据使用TopSpin 1.3(Bruker Biospin)和MestReNova 8.0(MestreLab Research)软件进行加工。

结果

使用噬菌体文库筛选和基因组步移分离生物合成基因

对于原伊鲁烯型倍半萜基因簇的分离，构建高卢蜜环菌基因组DNA噬菌体文库；使用高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶作为探针执行筛选。来自第二轮筛选所获得的阳性噬斑中的两个用于粘粒DNA分离。所获得的粘粒DNA的限制性消化显示相同的片段模式，其得出两种粘粒相同的结论。粘粒之一(粘粒5.1)的插入片段随后通过引物步移进行测序，其揭示22,902kb片段。

所获得的序列数据的分析鉴定先前分离的原伊鲁烯合酶基因组序列，以及与细胞色素P450依赖性单加氧酶具有高同源性的三个序列，其中之一看起来是部分序列。除原伊鲁烯合酶和细胞色素P450单加氧酶之外，在～23kb片段中鉴定功能未知的两个序列(标记为假定蛋白质)和与GMC氧化还原酶具有高同源性的一个序列。

随着原伊鲁烯型芳基酯在最高达八个位置处被氧合，与原伊鲁烯合酶紧密相关的三种类似的细胞色素P450单加氧酶的鉴定已提供了高卢蜜环菌中的生物合成途径的潜在成簇的首个指示。

接下来，通过将DNA衔接片段连接至限制性消化的高卢蜜环菌基因组DNA来构建基因组步移文库，并且通过测序所获得的PCR片段，可以完成序列粘粒插入片段所遇到的部分细胞色素P450单加氧酶。新近鉴定的序列的部分随后用于筛选基因组噬菌体文库的另外的1.7x10⁴噬斑形成单位。筛选导致一个克隆，其还在后续第二轮筛选中证明是阳性的。粘粒插入片段的测序揭示16.27kb的高卢蜜环菌基因组片段，其含有另外的细胞色素P450单加氧酶(命名为CYP-Arm1)加上与DNA修复核酸内切酶具有同源性的三种假定基因、转录激活子和逆转录酶。3'至5.1粘粒片段的引物步移尝试未揭示在萜烯或聚酮生物合成中具有潜在功能的更多基因。图2显示了用放射性探针(原伊鲁烯合酶)筛选基因组DNA文库获得的蜜环菌戊素基因簇的萜烯生物合成部分的方案；该簇含有原伊鲁烯合酶("Pro 1")，称为"CYP-Arm1"、"CYP-Arm2"、"CYP-Arm3"和"CYP-Arm4"的四种细胞色素P450单加氧酶，以及两种假定蛋白质。

由高卢cDNA文库扩增所鉴定的细胞色素P450单加氧酶

所克隆的基因组DNA的测序揭示了所遇到的四种基因组细胞色素P450单加氧酶序列的高度内含子/外显子断裂。扩展超过2158bp的细胞色素P450 CYP-Arm1的基因组序列含有10个内含子，其中外显子大小范围为38bp-537bp。CYP-Arm2和CYP-Arm3的基因组序列显示高相似性，两者均含有11个内含子且具有73.8％的总体序列同一性。CYP-Arm4的分析鉴定编码509个氨基酸的蛋白质的开放读码框，所推导的ORF由14个内含子间断，获得长度4-190bp的外显子。分离的细胞色素P450单加氧酶在氨基酸序列水平上的进一步分析分别展示CYP-Arm1、CYP-Arm2和CYP-Arm 3与CYP-Arm 4相比较32.5％、34.0％和34.0％的氨基酸序列相似性。

基于这些预测序列，相应的cDNA通过聚合酶链式反应由高卢蜜环菌cDNA文库进行扩增。几个亚克隆的PCR片段的测序揭示仍含有内含子的cDNA克隆的显著部分。然而，对于所有四种细胞色素P450单加氧酶，获得正确的cDNA克隆且亚克隆用于在酿酒酵母中的异源表达。为了促进对正确的异源表达和定位至酵母内质网的分析，所有四种细胞色素P450单加氧酶均在C末端处进行组氨酸标记。

细胞色素P450单加氧酶的异源表达和功能检查。

对于异源表达，含有分离的高卢蜜环菌细胞色素P450单加氧酶的四种构建的表达构建体转化到酵母CEN.PK2-1 C内。在用L-半乳糖诱导异源表达后，收获重组酵母细胞，并且经由酵母微粒体蛋白质制备检查异源表达的P450的正确定位。使用六组氨酸特异性一抗的免疫印迹分析显示异源表达的蛋白质(具有57-60kDa的预期分子量)正确定位至微粒体部分(参见图3)。

对于克隆的细胞色素P450依赖性单加氧酶的功能测试，红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶在重组酵母中共表达。对于克隆的高卢蜜环菌细胞色素P450的初始功能检查，采用体内供给方法。对于体内供给实验，向诱导的5ml酵母培养物中加入15.000cpm ³H标记的6-原伊鲁烯，并且将培养物温育过夜。各个酵母培养物的有机提取物随后经由放射薄层色谱法(放射-TLC)进行分析。对表达CYP-Arm3连同红豆杉细胞色素P450还原酶的CEN.PK2-1C的放射-TLC分析显示，供给的氚标记的6-原伊鲁烯几乎全部转化成更极性的推定羟基化产物。同样对于CYP-Arm2，观察到更极性的产物，但其发生的转化程度少得多。有趣的是，使用正戊烷从酵母细胞培养物中再提取供应的6-原伊鲁烯被证明是困难的，然而，看起来对于羟基化衍生物显著改善。

对于使用GC/MS的进一步分析，重组酵母菌株供给衍生自基于生物催化的合成反应的“冷”6-原伊鲁烯，所述合成反应使用法尼基二磷酸盐和重组原伊鲁烯合酶。所诱导的和体内供给的重组酵母培养物随后类似地用正戊烷提取，并且经由GC/MS分析有机提取物。CYP-Arm3的GC色谱图与阴性对照(仅表达红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶)比较显示另外的峰(图4)。所获得的质谱显示对应于羟基原伊鲁烯产物的质量。

通过重组酿酒酵母的羟基原伊鲁烯的总体生物合成。

接下来，经由NMR分析阐明潜在羟基原伊鲁烯产物的结构。因为对于化合物的恰当结构阐明，需要几毫克的纯产物，所以必需获得足够材料。为此，并且为了将化合物纯化至同质性和分析，对酿酒酵母菌株进行改造，以能够总体生物合成所推定的羟基原伊鲁烯。

对于总体发酵，采用由附加型表达载体转化的酿酒酵母CEN.PK2-1 C菌株，所述附加型表达载体含有红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶、细胞色素P450单加氧酶CYP-Arm3、截短形式的酵母HMG-CoA还原酶(tHMGR)和高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶。异源共表达红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶，以便增加还原并因此而增加细胞色素P450单加氧酶的催化活性。引入截短的失调形式的酵母HMG-CoA还原酶，以增加通过甲羟戊酸途径的通量，以提供另外的法尼基二磷酸盐以加强原伊鲁烯生物合成(参见图6)。

下表1显示了在用于生产羟基原伊鲁烯的重组酿酒酵母菌株中转化的质粒和异源表达的基因的概括：

表1

使用代谢改造菌株用于总体合成假定的羟基原伊鲁烯产物的发酵在2.8L规模上进行。对于CYP-Arm3产物的纯化，采用从生物量中分离得到的培养上清液。

羟基原伊鲁烯的纯化和结构阐明

所获得的培养上清液通过添加二氧化硅C18 RP粉末和在4℃下温育进行提取。二氧化硅C18 RP材料通过过滤进行回收且通过冻干进行干燥。提取使用索氏萃取仪器执行，使用正戊烷作为有机溶剂。所得到的提取物在真空下进行浓缩。粗提取物随后通过在硅胶60、氯-丙基官能化的硅胶上的色谱法和反相半制备-HPLC进行纯化。在三个纯化步骤后，可以获得大约40mg用于NMR分析的纯产物。

对于结构测定，执行直接¹H和¹³C NMR分析。下表2显示了完全¹H和¹³C-NMR位移及其作为二维NMR谱分析结果的分配：

表2

分析显示，分离的化合物是8-羟基-6-原伊鲁烯，这就是CYP-Arm 3已显示作为8-α-羟化酶起作用的原因。进一步地，结果首次显示，来自担子菌纲的细胞色素P450单加氧酶介导的向倍半萜醇的催化的功能表征，并且阐明了产物分子结构。

在下一步中阐明了，CYP-Arm2的另外表达是否可以导致双羟基化原伊鲁烯结构。

为此，将要使用的质粒必须适合表达第五种外来基因。下表3显示了，在用于生产双羟基化原伊鲁烯的重组酿酒酵母菌株中转化的质粒和异源表达的基因：

表3

对于双羟基化原伊鲁烯的发酵，发酵在3L规模上进行-类似于上文描述的用于产生单羟基化的8-α-6-原伊鲁烯的发酵。对于产物的纯化，对从生物量中分离的培养上清液实施氯仿提取。浓缩的提取物经由GC/MS和LC/MS/MS进行分析-类似于8-α-6-原伊鲁烯的分离过程。

双羟基化原伊鲁烯的纯化和结构阐明

所获得的培养上清液在氯仿-d1中提取且风干，溶解于氘化溶剂中，且经由GC/MS进行分析。

对于进一步的结构测定，执行直接¹H和¹³C NMR分析。下表4显示了完全¹H和¹³C-NMR位移及其作为二维NMR谱分析结果的分配：

表4

谱分析显示，分离的化合物是8-α-13-羟基-6-原伊鲁烯。因此，细胞色素P450单加氧酶CYP-Arm2已表征为作为13-羟化酶起作用。

使用所述异源引入的生物合成，首次在酿酒酵母中制备了双羟基化倍半萜醇且在结构上进行了表征。

本文所述的来自高卢蜜环菌的基因簇的鉴定，担子菌纲中的其他倍半萜生物合成途径的鉴定是可能的。

Claims (24)

1.宿主微生物，其被转化以包含和表达编码具有细胞色素P450单加氧酶活性之多肽的多核苷酸，所述多核苷酸由选自(i)、(ii)和(iii)的核酸序列组成：

(i)a)所附序列表的SEQ ID NO.5至8中的任一项；b)SEQ ID NO.5至8中任一项的互补序列；

(ii)载体，其含有编码具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽的(i)中所述的核酸序列，所述核酸序列可操作地与控制序列连接，所述载体所转化的宿主微生物识别所述控制序列；和

(iii)所附序列表的SEQ ID NO.9，

其中所述宿主微生物被进一步转化以表达2-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)还原酶，并且选自真菌和细菌。

2.根据权利要求1的宿主微生物，其中所述真菌包括酵母。

3.根据权利要求1的宿主微生物，其中(ii)中所述的载体是表达载体。

4.根据权利要求1的宿主微生物，其中使编码具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽的所述多核苷酸适合各个细胞的密码子使用。

5.根据权利要求1的宿主微生物，其中所述宿主微生物选自酵母属物种；大肠杆菌(Escherichia coli)；构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)；同担子菌纲。

6.根据权利要求5的宿主微生物，其中所述宿主微生物为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

7.根据权利要求5的宿主微生物，其中所述宿主微生物选自蜜环菌属。

8.根据权利要求5的宿主微生物，其中所述宿主微生物选自高卢蜜环菌(Armillariagallica)或蜜环菌(Armillariamellea)。

9.根据权利要求1的宿主微生物，其中所述宿主微生物被进一步转化，以包含原伊鲁烯(protoilludene)合酶。

10.根据权利要求9的宿主微生物，其中所述原伊鲁烯合酶为来自蜜环菌属物种的原伊鲁烯合酶。

11.根据权利要求10的宿主微生物，其中所述原伊鲁烯合酶为来自高卢蜜环菌的原伊鲁烯合酶。

12.根据权利要求1的宿主微生物，其中所述宿主微生物被进一步转化，以表达NADPH-细胞色素P450还原酶。

13.根据权利要求12的宿主微生物，其中所述NADPH-细胞色素P450还原酶为来自红豆杉(Taxuschinensis)的NADPH:细胞色素还原酶。

14.用于产生羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供选自真菌和细菌的宿主微生物，其已被转化以异源表达SEQ ID NO.9，或至少表达下述全部：i)原伊鲁烯合酶，和ii)至少一种细胞色素P450单加氧酶，其中(i)或(ii)中的至少一种对所述宿主微生物是外来的，并且其中所述细胞色素P450单加氧酶由所附序列表的SEQ ID NO:1至4的任一种的氨基酸序列组成；

其中所述宿主微生物被进一步转化以表达2-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)还原酶，

b)在允许生产倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的合适营养条件下，生长步骤a)中提供的宿主微生物；因此产生所述羟基化原伊鲁烯，以及视情况而定的所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

15.根据权利要求14的方法，其中所述真菌包括酵母。

16.根据权利要求14的方法，其进一步包括步骤c)：

c)从宿主微生物或其生长培养基中分离所述羟基化原伊鲁烯和/或所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯。

17.根据权利要求14的方法，其中所述原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶分别是来自蜜环菌属物种的原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶。

18.根据权利要求14的方法，其中所述原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶分别是来自高卢蜜环菌的原伊鲁烯合酶和/或细胞色素P450单加氧酶。

19.根据权利要求14的方法，其中在步骤a)中提供了微生物，其已被进一步转化以表达NADPH-细胞色素P450还原酶。

20.根据权利要求19的方法，其中所述NADPH-细胞色素P450还原酶是来自红豆杉的NADPH-细胞色素P450还原酶。

21.根据权利要求14的方法，其中所述倍半萜原伊鲁烯型芳基酯选自蜜环菌戊素和苔色酸蜜环基酯。

22.根据权利要求14的方法，其中所述羟基化原伊鲁烯选自单羟基化原伊鲁烯和二羟基化原伊鲁烯。

23.根据权利要求22的方法，其中所述单羟基化原伊鲁烯为8-羟基-6-原伊鲁烯；和/或所述二羟基化原伊鲁烯为8,13-羟基-6-原伊鲁烯。

24.权利要求1至13中任一项的宿主微生物用于生产羟基化原伊鲁烯和/或倍半萜原伊鲁烯型芳基酯的用途。

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