CN1469928A - 源于嗜热细菌的细胞色素p450单加氧酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到：源于嗜热细菌，尤其源于栖热菌属细菌的新型细胞色素P450单加氧酶、编码其的核苷酸序列、所述单加氧酶的重组制备以及这些酶在有机化合物的微生物氧化中的应用。

Description

源于嗜热细菌的细胞色素P450单加氧酶
本发明涉及到：源于嗜热细菌，尤其源于栖热菌属(Thermus)的新型细胞色素P450单加氧酶及编码其的核苷酸序列，这些单加氧酶的重组制备，以及这些酶在有机化合物的微生物氧化中的应用。
细胞色素P450单加氧酶有催化具工业价值的氧化反应的能力，故对其的深入研究已有时日。例如，已经从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中分离得到细胞色素P450单加氧酶BM-3，对其进行了表征，并且该酶现在已能通过重组路线获得(参见，如DE-A-199 35115)。
这种细胞色素P450单加氧酶通常催化长链饱和酸、其相应的酰胺以及醇类化合物的近末端羟基化反应，或者不饱和长链脂肪酸或中等链长度的饱和脂肪酸的环氧化反应。饱和脂肪酸的最佳链长度为14至16个碳原子。
P450 BM-3中血红素结构域的结构已经通过X-射线结构分析进行了测定。底物结合位点为一个长管状孔穴结构，此孔穴起于分子表面抵于血红素分子，其边界实际上仅由疏水性氨基酸残基界定。血红素结构域表面的带电荷残基只有Arg47和Try51。据认为后者通过形成氢键而参与和底物上羧基基团的结合。而且，已经通过靶向引入点突变成功地拓宽了此酶的底物谱。因此，现在此酶可以用于更长和更短链长的羧酸、烷烃、烯烃、环烷烃、环烯烃以及许多芳族化合物的氧化(参见，DE-A-199 35 115，19955 605，100 11 723和100 14 085)。
为了进一步提高此类酶在工业上的实用性，因此期望寻找新型的能更好地适应工业生产条件的细胞色素P450单加氧酶，比如，具有增加的热稳定性的酶。因此，本发明的目的是提供能更好地适应工业生产条件的细胞色素P450单加氧酶。
上述目的是通过提供一种细胞色素P450单加氧酶来实现的，此酶含有的氨基酸序列中包括来自SEQ ID NO：2的第Pro328至Glu345位氨基酸残基的子序列，并优选还包括来自SEQ ID NO：2的第Val216至Ala227位氨基酸残基的子序列。
本发明的优选细胞色素P450单加氧酶具有还包含至少一个其它的子序列的氨基酸序列，此子序列选自：SEQ ID NO：2第Met1至Phe327位和Gly346至Ala389位氨基酸残基所预确定的序列区域中含至少10个连续氨基酸的子序列。
一个特别优选的细胞色素P450单加氧酶具有和SEQ ID NO：2基本相符的氨基酸序列。
本发明的细胞色素P450单加氧酶尤其可以从嗜热细菌，优选栖热菌属(Thermus)细菌，例如，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，HB27株(保藏在DSM，保藏号为DSM7039)中分离。本发明中的“嗜热”细菌符合H.G.Schlegel，Allgemeine Mikrobiologie[普通微生物学]，ThiemeVerlag Stuttgart，第5版，173页针对嗜热细菌和极端嗜热细菌的温度耐受标准(即，最适生长温度大于40℃)。
优选地，本发明的单加氧酶的特征在于热稳定性增加。这表现为与巨大芽孢杆菌P450 BM-3相比，在升高的温度下(比如，30至60℃范围内，pH7.5，25mM Tris/HCl)活性丧失更少。
依据一个优选实施方案，本发明提供来源于嗜热细菌嗜热栖热菌的细胞色素P450单加氧酶。此蛋白具有约44 kDa分子量(据SDS凝胶电泳测定)，可溶，在还原状态、氧化状态及羰基加合物形式(和其他P450酶的类似)时具有吸收光谱。下面的同一性是把源于嗜热栖热菌的本发明酶和其他已知的P450酶进行序列比对得到的：P450 BM3，同一性32％；CYP119，同一性29％；P450eryF，同一性31％。本发明的酶具有极优异的热稳定性，这可以从其解链温度约为85℃得以证明，此值比P450cam的解链温度高出30℃。
本发明的主题还有和编码本发明的细胞色素P450单加氧酶的核酸序列杂交的寡核苷酸。
具体地，本发明的主题还涉及这样的寡核苷酸，其含有的一段核酸序列与SEQ ID NO：1中至少有30至45个连续核苷酸残基的核苷酸序列区域基本互补。
本发明另一主题涉及多核苷酸，其可与上面所定义的寡核苷酸杂交并编码细胞色素P450单加氧酶，尤其是来源于其他微生物(如栖热菌属的其它微生物)的细胞色素P450单加氧酶。
本发明的主题特别还涉及：编码如上所定义的细胞色素P450单加氧酶的多核苷酸及与其互补的多核苷酸。
优选的多核苷酸是这样的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO：1基本一致的核酸序列，或具有与其互补或源于其的核酸序列。
本发明的另一主题涉及到用于重组制备本发明单加氧酶的表达盒，其包含至少一个调控核酸序列，其中该序列与至少一个上述多核苷酸可操作地连接。
本发明其它主题涉及到：携带有至少一个上面所定义的多核苷酸，或者至少一个上面所定义的表达盒的重组载体；包含至少一个此种载体的微生物；制备本发明的细胞色素P450单加氧酶的方法，在此方法中，培养可生产细胞色素P450单加氧酶的微生物，然后从培养物里分离此单加氧酶。
本发明的酶及可由这些酶衍生的突变体可以在多种有重要工业价值的有机化合物的生化氧化反应中用作生物催化剂。同样，本发明的重组微生物也可用于执行此氧化反应。
因此，本发明的另一主题涉及到有机化合物的微生物氧化方法，其中，此化合物和至少一个本发明的细胞色素P450单加氧酶反应。
此方法优选按如下所示的方式进行：
a1)在含有外源(外在添加的)有机化合物、或者作为中间体形成的有机化合物的培养介质中，优选在氧及，如果合适的话，电子供体存在的条件下培养上面所定义的重组微生物，其中所述化合物是单加氧酶的底物；或者
a2)将含底物的反应介质和本发明的细胞色素P450单加氧酶，优选在有氧和电子供体存在的条件下孵育；和
b)从介质中分离产生的氧化产物或它的随后产物。
所述外源底物或者以中间体形式形成的底物可选自：
a)任选被取代的N-，O-或者S-杂环单核、双核或者多核芳族化合物；
b)任选被取代的单核或者多核芳族化合物；
c)直链或者支链烷烃和烯烃；
d)任选被取代的环烷烃和环烯烃；和
e)脂肪族的、优选末端饱和的羧酸。
在本发明方法的第一个优选变体中，在至少约20℃培养温度，约6至9的pH，及有氧存在的条件下通过培养本发明微生物进行氧化反应。
在本发明方法的第二个优选变体中，至少一种选自上面定义的a)至e)组的化合物被作为外源底物加入介质中，在至少约20℃温度、约6至9的pH及有氧存在的条件下通过对含底物的介质的酶促转化进行氧化，其中含底物的介质还另外含有基于底物计算约10至100倍摩尔过量的还原当量(reduction equivalents)(电子供体)。
上述方法优选在生物反应器中进行。因此本发明的主题还包括此种生物反应器，在该生物反应器中含有至少一种本发明的单加氧酶或者至少一种重组微生物，而且，如果合适的话，两者都可以以固定化形式存在。
最后，本发明涉及到本发明细胞色素P450单加氧酶、载体或微生物在上面提到的各类有机化合物的微生物氧化中的用途。
现参考附图更详细地举例说明本发明。在这些附图里：
图1表示的是巨大芽孢杆菌P450 BM3的血红素结构域和嗜热栖热菌P450。血红素结合位点用双下划线指示(P450 BM3中的Cys400是和辅基中的铁原子配位的半胱氨酸残基)。与脂肪酸ω-末端接触的区域以单下划线指示。两者的匹配程度用不同的符号表示(“*”＝相同残基；“：”和“.”＝相似残基)。
图2表示用于确定P450 BM3和栖热菌P450(P450 Thermus)的热稳定性的对比实验的结果。热稳定性是通过在400至500nm波长范围内对血红素基团含量进行光谱测定得到的。
本发明还包括本文具体公开的新P450单加氧酶的“功能等价物”。
基于本发明的目的，本文具体公开的单加氧酶的“功能等价物”或者类似物是指这样的酶，其虽与上述酶不同，但是在上面指定的a)至e)氧化反应之至少一个的范围内仍有所需的底物特异性，而且/或者，和P450BM3相比，在比如约30至60℃温度及，如果合适的话，更高的温度下，在25mM Tris/HCl中处理30分钟后表现增加的热稳定性。
在本发明中“功能等价物”可理解为尤其指这样的突变体，其在至少一个上面所提到的序列位置处展示出与具体提到的氨基酸不同的氨基酸，但是仍催化上述一种氧化反应。因此“功能等价物”还包括可通过一个或多个，比如1至30或者1至20或者1至10个氨基酸添加、替代、缺失和/或倒位获得的突变体，上述修饰可发生在任何序列位置，只要它们能导致具有本发明性质谱的突变体即可。功能等价物还尤其存在于突变体和未修饰的酶在反应模式上性质相同，即同样的反应底物有不同的转化速率的情况下。
本发明还包括这样的“功能等价物”，其氨基酸序列和SEQ ID NO：2在至少一个位置处不同，优选此序列上的修饰仅致使单加氧酶活性发生十分轻微的改变，即改变不超过约±90％，尤其50％或者不超过30％。可用参照底物如β-芷香酮在标准化条件下(如：0.1至0.5M底物，pH6至8，尤其是7；T＝60至70℃，尤其是65℃)测定此改变。
本发明中的“功能等价物”还包括本文具体公开的蛋白的同源物(homolog)。按照Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci(usa)85(8)，1988，2444-2448)的算法计算，它们与本文具体公开的其中一个序列有至少60％同源性，优选至少75％同源性，尤其是至少85％同源性，如90％，95％或99％的同源性。
本发明的蛋白或者多肽的同源物可用诱变方式产生，如蛋白的点突变或者截短。
本发明的蛋白的同源物可通过筛选突变体，如截短型突变体的组合文库来甄别。可以通过在核酸水平上进行组合诱变，例如，通过对合成的寡核苷酸混合物进行酶促连接，产生蛋白变异体的多样化文库。有许多方法可用于从简并寡核苷酸序列制备潜在同源物文库。简并基因序列可用DNA合成仪进行化学合成，然后把合成的基因连接到合适的表达载体中。使用一套简并基因可以在一个混合物中提供如下所有序列，这些序列编码了期望的一套潜在蛋白序列。本领域技术人员了解简并寡核苷酸的合成方法(例如参见Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)NucleicAcids Res.11：447)。
“功能等价物”当然也包括从其他微生物例(如，非这里具体提到的那些其他细菌)中得到的P450单加氧酶，以及天然产生的变体。比如，可以用序列比对鉴定到同源序列区，然后可以依据本发明的具体目的判定等价酶。
本发明中可被氧化的a)组底物是可被氧化或者羟基化的、任选被取代的杂环单核、双核或者多核芳族化合物，尤其是N-，O-，或S-杂环单核、双核或多核芳族化合物。例如，它们包括2个或者3个四至七元环，尤其是六元环或五元环的稠环，稠环上至少一个环、优选全部的环都有芳香族的性质，而且，稠环上至少一个芳族环有1至3个，优选1个N-，O-或者S-杂原子和环相连。如果合适的话，整个环结构可再含有一个或者两个相同或者不同的杂原子。而且，此芳族化合物可在环碳原子上或在杂原子上连接一至五个取代基。适宜的取代基的例子有C1至C4烷基，如甲基，乙基，正或异丙基或正，异或叔丁基；或C2至C4-链烯基如乙烯基，1-丙烯基，2-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基或3-丁烯基；羟基和卤素，如F，Cl和Br。如果合适的话，上面提到的烷基和链烯基取代基中还可以有酮基或醛基基团；比如丙-2-酮-3-基，丁-2-酮4-基，3-丁烯-2-酮-4-基。非限定性的合适杂环底物的例子具体有双核杂环，如吲哚，N-甲基吲哚及其在碳原子上被1至3个取代基取代的类似物，如5-氯代吲哚或5-溴代吲哚；喹啉和喹啉衍生物如8-甲基喹啉，6-甲基喹啉和喹哪啶；以及苯并噻吩及其在碳原子上被1至3个取代基取代的类似物。其他可以提到的还有三核杂芳族化合物，如吖啶及其在碳原子上被1至3个取代基取代的类似物。
本发明中可被氧化的b)组底物是任选被取代的单核或多核，尤其是单核或双核芳族化合物，如苯和萘。如果合适的话，此芳族化合物可被单取代或多取代，例如在环碳原子上连结1至5取代基。适宜的取代基的例子有C1-至C4-烷基如甲基，乙基，正或异丙基，或正，异或叔丁基，或C2-至C4-链烯基如乙烯基，1-丙烯基，2-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基或3-丁烯基，羟基和卤素如F，Cl和Br。如果合适的话，上面提到的烷基和链烯基取代基中还可以有酮基或醛基基团；比如丙-2-酮-3-基，丁-2-酮-4-基，3-丁烯-2-酮-4-基。如果合适的话，芳族环可以和4至7元非芳族环稠和。如果合适的话，非芳族环可以有一个或两个C-C双键、被上面提到的取代基进行了单取代或多取代，而且，如果合适的话，其上还连接一个或两个环杂原子。极其有用的芳香族化合物的例子有单核芳香族化合物如异丙基苯，以及双核底物如茚和萘及其在碳原子上被1至3个取代基取代的类似物。
本发明中可被氧化的c)组底物是直链或支链的含4至15，优选6至12个碳原子的烷烃和烯烃。可以提到的例子有正戊烷，正己烷，正庚烷，正辛烷，正壬烷，正癸烷，正十一烷，正十二烷，及这些化合物的有一个或多个支链的类似物，如具有1至3个甲基侧基团的类似物；或上述烷烃的单不饱和或多不饱和的(优选单不饱和的)类似物。
本发明中可被氧化的d)组底物是任选被取代的环烷烃和环烯烃。实例有环戊烷，环戊烯，环己烷，环己烯，环庚烷，环庚烯。在本发明上下文中，此环结构可被单取代或多取代，且可以连接上例如1至5个如上面针对a)组和b)组化合物所定义的取代基。一个非限定性的例子是芷香酮，如α-，β-和γ-芷香酮及相应的甲基芷香酮和异甲基芷香酮。
本发明中可被氧化的e)组底物是直链或支链的、饱和的或单不饱和或多不饱和的C8-C30-羧酸，尤其是单羧酸，或者其羧酸衍生物，如酯和酰胺。可以提到的例子有可在末端和近末端(ω-1-，ω-2-，或ω-3位置)被羟基化的饱和单羧酸。
本发明的主题还有编码上述单加氧酶及其功能等价物的核酸序列(单链和双链DNA以及RNA序列)。本发明的其它核酸序列来源于SEQ IDNO：1但因添加，替代，插入或者缺失一个或多个核苷酸而与之不同，而且该序列仍能编码具有期望的性质谱的单加氧酶。
本发明还包括，与本文具体提到的序列相比，包含所谓沉默突变的核酸序列，或者因具体的来源生物或宿主生物的密码子使用而不同的核酸序列。这些序列的天然变体，例如的剪接变体也包括在本发明中。本发明的主题还有可以通过核苷酸保守替代得到的序列(即所讨论的氨基酸被一个有同样电荷，大小，极性和/或溶解性的氨基酸代替)。
本发明还包括可和上述编码序列杂交或者和之互补的核酸序列。这些多核苷酸可通过筛选基因组文库或者cDNA文库得到，如果合适的话，可用合适的引物通过PCR从中将其扩增出来，然后用比如合适的探针进行分离。另一个可能的方案是用本发明的多核苷酸或载体对适宜微生物进行转化，扩增微生物，这样多核苷酸也得到扩增，随后对其进行分离。另外，本发明的多核苷酸还可以化学合成。
有能力和多核苷酸杂交这一性质应理解为一段多核苷酸或者寡核苷酸有能力在严紧的条件下和实质上互补的序列结合，此时，在此条件下不互补的配偶体(partner)之间不会发生非特异性结合。此处，序列应有70-100％，优选90-100％的互补性。互补序列相互之间能够特异性结合这一性质被运用于比如Northern或Southern印迹技术中，或者运用于PCR或RT-PCR中以进行引物结合。为此目的，通常使用的寡核苷酸的最小长度为30个碱基对。对严紧条件含义的理解，以Northern印迹技术为例，是指为了洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸，在50-70℃，优选60-65℃温度下，用洗涤溶液例如含0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)进行洗脱。如上所述，在本方法中仅有高度互补的核酸才能保持相互结合。
本发明的主题还有包含编码本发明突变体的核酸序列的表达构建体，其中核酸序列处于调控核酸序列的遗传控制之下；以及包含至少一个这样的表达构建体的载体。本发明的构建体优选在所涉编码序列5’上游包含启动子及在3’下游包含终止子序列，而且，如果合适的话，还含有常用的调控元件，这些序列均和编码序列可操作地连接。“可操作地连接”应理解为指启动子、编码序列、终止子，如果合适的话，及其它调控元件按一定方式顺序排列，以致编码序列表达时每个调控元件都能如期发挥其功能。可操作连接的序列的例子有引导序列，翻译及其它的增强子，多腺苷酸化信号等等。其他的调控元件包括选择性标记，扩增信号，复制起点等等。
在实际的结构基因前，除了人工调控序列外仍可以有天然的调控序列。如果合适的话，可用遗传修饰关闭此天然的调控作用，以增加或者降低基因的表达。但是，基因构建体也可以有更简单的结构，就是说在结构基因前不插入其他调控信号，并保留天然启动子及启动子的调控作用。或者，使天然调控序列突变，以致不再发挥调控作用，从而使基因表达增加或降低。在基因构建体中可以有一个或多个拷贝的核酸序列。
有用的启动子的实例有：cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，1-PR或1-PL启动子(所有这些都可有利地用于革兰氏阴性菌中)；以及革兰氏阳性细菌启动子amy和spo2，酵母启动子ADC1，MFa，AC，P-60，CYC1，GAPDH或植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，not或者遍在蛋白或菜豆蛋白启动子。尤其优选使用诱导型启动子，如光诱导型，特别是温度诱导型启动子，如PrP1启动子。
原则上，所有天然启动子及其调控序列都可使用。而且，还可以有利地使用合成的启动子。
上面提到的调控序列旨在使核酸序列和蛋白质可以定向表达。这可能意味着依宿主的不同，比如只在诱导以后基因才能表达或者过量表达，或基因能立即表达和/或过量表达。
调控序列或调控因子可以优选对表达有积极作用，由此可以对其进行增加或者减少。这样，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子可在转录水平上方便地强化调控元件。另外，也可以通过比如提高mRNA的稳定性增强转录。
可将合适的启动子和合适的单加氧酶核苷酸序列，及终止子或多腺苷酸化信号融合在一起制成表达盒。常规的重组和克隆技术可以用于此目的，其描述在例如：T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等.，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Assoc.andWiley Interscience(1987)。
对于在适宜宿主生物中的表达来说，可有利地将重组核酸结构或基因构建体插入宿主特异性的载体中，这样可以使基因在宿主中的表达达到最佳。本领域技术人员熟知这些载体，并可在如“Cloning Vectors”中找到(Pouwels P.H.等，Ed.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。除了质粒，载体应理解为还指本领域技术人员熟知其他所有载体，如噬菌体，病毒如SV40，CMV，杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，噬粒，粘粒，线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制。
利用本发明的载体可制备重组微生物，例如可以用至少一个本发明载体转化及可以用于生产突变体的重组微生物。上述的本发明重组构建体可方便地导入适宜的宿主系统中并得到表达。为此，优选使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法，如共沉淀，原生质体融合，电穿孔，逆转录病毒转染等等，以使所说的核酸在所涉及的表达系统中表达。对适宜表达系统的论述可参见例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等，Ed.，Wiley Interscience，纽约1997。
原则上，适宜的宿主生物可以是所有可能表达本发明核酸、这些核酸的等位基因变异体、它们的功能等价物或衍生物的生物。宿主生物应理解为指，例如，细菌，真菌，酵母，植物或动物细胞。优选生物是细菌，如埃希氏杆菌属(Escherichia)的细菌，像大肠杆菌(Escherichia coli)，链霉菌(Streptomyces)，芽孢杆菌(Bacillus)或假单胞菌(Pseudomonas)；真核微生物，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曲霉菌(Aspergillus)，来自动物或植物的高等真核细胞，如sf9或CHO细胞。
已成功转化的生物能通过载体或者表达盒中含有的标记基因进行筛选。此种标记基因的实例有抗生素抗性基因和催化颜色反应(此颜色反应可使已转化的细胞着色)的酶的基因。然后后者可通过自动细胞分拣挑出。被载体成功转化并携带有抗生素(如G418或潮霉素)抗性相关基因的微生物可用含抗生素的合适液态或固态培养基进行选择。细胞表面展示的标记蛋白可用于亲和层析筛选。
宿主生物和与其匹配的载体和/或其它有利的调控序列进行组合从而构成表达系统，载体的例子有质粒，病毒或噬菌体，如带有RNA聚合酶/启动子系统的质粒，λ噬菌体或者μ噬菌体或其他温和噬菌体或转座子。例如，术语“表达系统”可指哺乳动物细胞如CHO细胞与适用于哺乳动物细胞的载体如pcDNA3neo载体的组合。
如果需要的话，也可在转基因生物如转基因动物，尤其像小鼠或羊这样的转基因动物或者转基因植物中表达基因产物。
本发明的主题还有重组制备本发明的单加氧酶的方法，其中培养可产生单加氧酶的微生物，然后(如果合适的话)诱导表达单加氧酶，再从培养物中分离单加氧酶。这样，如果希望，还可以进行单加氧酶的工业规模生产。
重组微生物可以按已知方法培养和发酵。如细菌可在20至40℃温度范围，6至9的pH条件下在TB或LB培养基中扩增。具体的合适培养条件参见如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)。
除非单加氧酶分泌到培养基中，否则都要进行细胞破碎，然后用已知的蛋白分离方法从裂解物中获得酶。细胞破碎方法可选自高频超声，高压如弗氏压碎器，渗压裂解，利用变性剂、裂解酶或有机溶剂进行作用，匀浆，或者所列方法中多个方法的组合。
单加氧酶可用已知的层析方法(如分子筛层析(凝胶过滤)像Q-Sepharose层析，离子交换层析，疏水层析)结合其他常规方法(像超滤，结晶，盐析，透析和天然胶电泳)进行纯化。合适的方法参见如，Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsprocessen[生物化学方法]，Verlag Walter deGruyter，柏林，纽约；或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，纽约，海德尔堡，柏林。
为了进行重组蛋白的分离，尤其有利的是，使用这样的载体系统或寡核苷酸，其中cDNA经特殊核苷酸序列进行了延长，这样编码的修饰多肽或融合蛋白可使提纯简化。这种合适修饰的实例是具有锚定功能的所谓“标签”，例如：称作八组氨酸锚的修饰，或可被抗体作为抗原识别的表位(参见如Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港(N.Y.)出版社)。这些锚可用于蛋白和固体支持物之间的连接，固体支持物的例子有聚合物基质，它可用于如装填层析柱，或可以将其用于微滴定板或者任何其他支持物上。
同时这些锚还可用于蛋白的识别。其他可以用于蛋白识别的还有常规标记物，比如荧光染料标记物，酶标记物或者放射性标记物，其中所述酶标记物与底物反应后产生可检测的反应产物，这些标记物可单独使用或可以和锚联合使用以使蛋白衍生化。
本发明还涉及到用于以上类型的有机化合物的微生物氧化的方法。
如果用重组微生物进行转化，优选首先在有氧存在下在复合培养基如TB或LB中，于约20℃或更高培养温度、约6至9的pH下培养此微生物，直到生长达到充分的细胞密度。为了更好地控制氧化反应，优选使用诱导型启动子。诱导单加氧酶产生后，在有氧条件下继续培养12小时至3天。
相反，如果用纯化的酶或浓缩酶进行本发明的转化，则将本发明的酶溶解于含外源性底物(约0.01至10mM或0.05至5mM)的介质中，且在如下条件下进行转化：约10℃或更高温度及约6至9的pH(比如用100至200mM磷酸缓冲液或Tris缓冲液调节)，优选存在氧，同时存在还原剂，且含底物的介质中还含有基于待氧化的底物约10至100倍摩尔过量的还原当量。优选的还原剂为NADPH。
本发明的底物氧化方法中，反应介质中含有的或者被添加进去的氧被酶促还原断裂。所需的还原当量由加入的还原剂(电子供体)提供。
然后从介质中分离形成的氧化产物，并用常规方法，如抽提或层析法纯化氧化产物。
下面非限定性的实施例对本发明的特定实施方案进行描述。
一般实验数据：
a)常规克隆方法
本发明中的克隆步骤如，限制性切割，琼脂糖凝胶电泳，DNA片段纯化，核酸向硝酸纤维素膜或者尼龙膜上转移，DNA片段连接，大肠杆菌细胞的转化，细菌培养，噬菌体扩增和重组DNA的序列分析均按Sambrook等(1989)(上述引文)操作。
b)聚合酶链反应(PCR)
PCR用下面标准反应混合物，通过标准方案进行：
8μl dNTP混合物(200μM)，10μl无MgCl2的Taq聚合酶缓冲液(10×)，8μl MgCl2(25μM)，每种引物1μl(0.1μM)，1μl待扩增的DNA，2.5U Taq聚合酶(MBI Fermentas，Vilnius，Lith uania)，去矿质水补足到100μl。
c)大肠杆菌培养
重组大肠杆菌菌株DH5α在37℃下LB-Amp培养基(蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，酵母提取物5.0g，氨苄青霉素100g/ml，加水补足到1000ml)中培养。培养结束，用接种环从琼脂板上每例取1个菌落转移到5mlLB-Amp中。220rpm频率振荡培养约18小时后，将4ml培养物接种于2升烧瓶中的400ml培养基中。OD578达到0.8至1.0后，通过42℃热激诱导3至4小时来诱导大肠杆菌中P450的表达。
d)细胞裂解
将湿重达15g生物量的大肠杆菌DH5α细胞沉淀在冰上解冻，悬溶于25ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.5，1mM EDTA)或Tris/HCl缓冲液(50mM，pH7.5，1mM EDTA)中。在冰上冷却的大肠杆菌细胞悬液用超声波裂解3分钟(Branson Sonifier W250，(Dietzenbach，德国)，输出功率80W，操作间隔20％)。蛋白纯化前，将细胞悬液在32,500g下离心20分钟，用0.22mm Sterivex-GP滤膜(millipore)过滤得到粗提取产物。
实施例1：
嗜热栖热菌HB27来源的P450及其组氨酸-标签衍生物的克隆和表达
1.嗜热栖热菌HB27来源的P450的克隆
将P450编码序列(平末端)克隆进pTZ19R质粒(MBI Fermentas)的HincII酶切位点中。用PCR从得到的TTHB66质粒扩增P450的编码序列。用于此目的的引物如下：
a)含NdeI酶切位点(斜体部分)(作为P450起始密码子的部分)的30聚体(mer)有义寡核苷酸：
 5′-CGAAGCT AAGCGCCTTTCCCTGAG(SEQ ID NO：7).
b)含有EcoRI酶切位点(斜体部分)(作为TGA终止密码子的部位)的30-mer反义寡核苷酸：
  5′-GC
Figure A0181746800182
ACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG(SEQ ID NO：8).
将产物片断克隆进pCYTEXP1载体(带有λ噬菌体的温度诱导型PRPL启动子系统的质粒(Belev T.N.，等Plasmid(1991)26：147))的NdeI酶切位点中，并转化到大肠杆菌DH-5α中(Clontech，Heidelberg)。
将含有目的质粒的大肠杆菌DH-5α在有氨卞青霉素存在的条件下接种到LB培养基中，培养物在37℃孵育过夜。部分样品接种于新鲜LB培养基(含氨卞青霉素)中，所得培养物在37℃生长至OD＝0.9。将温度升高到42℃，经过24小时实现诱导。表达过程中P450含量的变化通过测量CO示差光谱确定。
    表达时间[h]     ΔA450-490     P450浓度[μM]
    4     0.092     0.056
    8     0.176     0.106
    24     0.106     0.064
2.带有N末端组氨酸标签的嗜热栖热菌HB27来源的P450的克隆：
用下面的引物从质粒TTHB66对P450编码序列进行PCR扩增：
(a)含NdeI酶切位点(斜体部分)(作为P450起始密码子的部份)和编码标签的密码子(下划线部分)的50-mer有义寡核苷酸：
 5′-CGAAGCT CATCACCATCATCATCACAAGCGCCTTTC(SEQ ID NO：9)；
(b)含有EcoRI酶切位点(斜体部分)(作为TGA终止密码子的部份)的30-mer反义寡核苷酸：
 5′-GC ACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG(SEQ ID NO：8).
将产物片断克隆进p-CYTEXP1载体的NdeI和EcoRI酶切位点中，在大肠杆菌DH-5α中表达。
将含有目的质粒的大肠杆菌DH-5α，在有氨卞青霉素存在的条件下接种到LB培养基中，培养物在37℃孵育过夜。部分样品接种于新鲜LB培养基(含氨卞青霉素)中，所得培养物在37℃生长至OD＝0.9。将温度升高到42℃，经过24小时实现诱导。表达过程中P450含量的变化通过测量CO示差光谱确定。
    表达时间[h]     ΔA450-490     P450浓度[μM]
    4     ND     ND
    8     0.097     0.073
    24     0.111     0.073
3.  带有C末端组氨酸标签的嗜热栖热菌HB27来源的P450的克隆：
用下面引物从TTHB66质粒对P450编码序列进行PCR扩增：
(a)含NdeI酶切位点(斜体部分)(作为P450起始密码子的部份)的30-mer有义寡核苷酸：5′-CGAAGCT
Figure A0181746800192
AAGCGCCTTTCCCTGAG(SEQ ID NO：7)
(b)含有EcoRI酶切位点(斜体部分)(作为TGA终止密码子的部份)和编码标签的密码子(下划线部分)的47-mer反义寡核苷酸：
5′-CG
Figure A0181746800193
AGTGATGATGATGGTGATGCGCCCGCACCTCCTC(SEQ ID NO：10).
将产物片断克隆进p-CYTEXP1载体的NdeI和EcoRI酶切位点中，在大肠杆菌DH-5α中表达。
将含有目的质粒的大肠杆菌DH-5α在有氨卞青霉素存在的条件下接种到LB培养基中，培养物在37℃孵育过夜。部分样品接种于新鲜LB培养基(含氨卞青霉素)中，所获培养物在37℃生长至OD＝0.9。将温度升高到42℃，经24小时实现诱导。表达过程中P450含量的变化通过测量CO示差光谱确定。
    表达时间[h]     ΔA450-490     P450浓度[μM]
    4     ND     ND
    8     0.1     0.075
    24     ND     ND
实施例2：
与P450 BM3比较确定嗜热栖热菌P450的热稳定性
将这两种酶均在不同的温度下，于pH7.5的Tris/HCl缓冲溶液中孵育30分钟。然后冷却反应混合物，并用分光光度法测量P450浓度。结果汇编在下表中并以图示方式显示在图2中。
  温度(℃)   30   40   50   60
  P450浓度[％]   P450 Thermus   100   89   29   22
  P450 BM3   92   63   0   0
正如实验结果显示的那样，本发明的酶在所有温度下孵育30分钟后，都有明显更高的热稳定性。
实施例3：
生物转化实验
迄今为止尚未能明确地找到本发明嗜热栖热菌细胞色素P450的内源性氧化还原配偶体。但是，在例如β-芷香酮和/或α-芷香酮的羟基化反应中发现有酶活性。以β-芷香酮为底物，观测到转化成主产物，而α-芷香酮则转化成产物混合物。与合成的标准物的对比显示，β-芷香酮的主要转化产物是4-羟基-β-芷香酮。
从琼脂平板培养物接种，进行嗜热栖热菌的预培养[5ml Tt培养基(2g酵母提取物，2g胰化蛋白胨，1g NaCl溶解在500ml去离子水中)]，65℃振摇下(150rpm)孵育24小时。然后将预培养物接种于100ml Tt培养基中，65℃振摇条件下孵育。
24小时后在每例培养物中加入β-芷香酮(107μl/ml培养物)。继续培养78小时。离心除去细胞，用乙醚抽提上清。用GC和TLC分析抽提物。在同样条件下制备并分析了无底物的对照培养物。序列表<110>巴斯福股份公司(BAsF Aktiengesellschaft)<120>源于嗜热细菌的细胞色素p450单加氧酶<130>M/41524<140><141><160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1170<212>DNA<213>嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)<220><221>CDS<222>(1)..(1170)<400>1atg aag cgc ctt tcc ctg agg gag gcc tgg ccc tac ctg aaa gac ctc    48Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1               5                  10                  15cag caa gat ccc ctc gcc gtc ctg ctg gcg tgg ggc cgg gcc cac ccc    96Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro
         20                  25                  30cgg ctc ttc ctt ccc ctg ccc cgc ttc ccc ctg gcc ctg atc ttt gac    144Arg Leu Phe Leu Pro Leu pro Arg Phe Pro Leu Ala Leu Ile Phe Asp
     35                  40                  45ccc gag ggg gtg gag ggg gcg ctc ctc gcc gag ggg acc acc aag gcc    192Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Gly Thr Thr Lys Ala
 50                  55                  60acc ttc cag tac cgg gcc ctc tcc cgc ctc acg ggg agg ggc ctc ctc    240Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu Thr Gly Arg Gly Leu Leu65                  70                  75                  80acc gac tgg ggg gaa agc tgg aag gag gcg cgc aag gcc ctc aaa gac    288Thr Asp Trp Gly Glu Ser Trp Lys Glu Ala Arg Lys Ala Leu Lys Asp
             85                  90                  95ccc ttc ctg ccg aag aac gtc cgc ggc tac cgg gag gcc atg gag gag    336Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr Arg Glu Ala Met Glu Glu
        100                 105                 110gag gcc cgg gcc ttc ttc ggg gag tgg cgg ggg gag gag cgg gac ctg    384Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg Gly Glu Glu Arg Asp Leu
    115                 120                 125gac cac gag atg ctc gcc ctc tcc ctg cgc ctc ctc ggg cgg gcc ctc    432Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg Leu Leu Gly Arg Ala Leu
130                 135                 140ttc ggg aag ccc ctc tcc cca agc ctc gcg gag cac gcc ctt aag gcc    480Phe Gly Lys Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ala Glu His Ala Leu Lys Ala145                 150                 155                 160ctg gac cgg atc atg gcc cag acc agg agc ccc ctg gcc ctc ctg gac    528Leu Asp Arg Ile Met Ala Gln Thr Arg Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asp
            165                 170                 175ctg gcc gcc gaa gcc cgc ttc cgg aag gac cgg ggg gcc ctc tac cgc    576Leu Ala Ala Glu Ala Arg Phe Arg Lys Asp Arg Gly Ala Leu Tyr Arg
        180                 185                 190gag gcg gaa gcc ctc atc gtc cac ccg ccc ctc tcc cac ctt ccc cga    624Glu Ala Glu Ala Leu Ile Val His Pro Pro Leu Ser His Leu Pro Arg
    195                 200                 205gag cgc gcc ctg agc gag gcc gtg acc ctc ctg gtg gcg ggc cac gag    672Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu Leu Val Ala Gly His Glu
210                 215                 220acg gtg gcg agc gcc ctc acc tgg tcc ttt ctc ctc ctc tcc cac cgc    720Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg225                 230                 235                 240ccg gac tgg cag aag cgg gtg gcc gag agc gag gag gcg gcc ctc gcc    768Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala
            245                 250                 255gcc ttc cag gag gcc ctg agg ctc tac ccc ccc gcc tgg atc ctc acc    816Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Trp Ile Leu Thr
        260                 265                 270cgg agg ctg gaa agg ccc ctc ctc ctg gga gag gac cgg ctc ccc ccg    864Arg Arg Leu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Gly Glu Asp Arg Leu Pro Pro
    275                 280                 285ggc acc acc ctg gtc ctc tcc ccc tac gtg acc cag agg ctc cac ttc    912Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser Pro Tyr Val Thr Gln Arg Leu His phe
290                 295                 300ccc gat ggg gag gcc ttc cgg ccc gag cgc ttc ctg gag gaa agg ggg    960Pro Asp Gly Glu Ala phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Arg Gly305                 310                 315                 320acc cct tcg ggg cgc tac ttc ccc ttt ggc ctg ggg cag agg ctc tgc    1008Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly Leu Gly Gln Arg Leu Cys
            325                 330                 335ctg ggg cgg gac ttc gcc ctc ctc gag ggc ccc atc gtc ctc agg gcc    1056Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly Pro Ile Val Leu Arg Ala
        340                 345                 350ttc ttc cgc cgc ttc cgc cta gac ccc ctc ccc ttc ccc cgg gtc ctc    1104Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu Pro Phe Pro Arg Val Leu
    355                 360                 365gcc cag gtc acc ctg agg ccc gaa ggc ggg ctt ccc gcg cgg cct agg    1152Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg
370                 375                 380gag gag gtg cgg gcg tga                                            1170Glu Glu Val Arg Ala385                 390<210>2<211>389<212>PRT<213>嗜热栖热菌<400>2Met Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Asp Leu1               5                  10                  15Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Arg Ala His Pro
         20                  25                  30Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro Leu Ala Leu Ile Phe Asp
     35                  40                  45Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala Glu Gly Thr Thr Lys Ala
 50                  55                  60Thr Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Ser Arg Leu Thr Gly Arg Gly Leu Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Trp Gly Glu Ser Trp Lys Glu Ala Arg Lys Ala Leu Lys Asp
             85                  90                  95Pro Phe Leu Pro Lys Asn Val Arg Gly Tyr Arg Glu Ala Met Glu Glu
        100                 105                 110Glu Ala Arg Ala Phe Phe Gly Glu Trp Arg Gly Glu Glu Arg Asp Leu
    115                 120                 125Asp His Glu Met Leu Ala Leu Ser Leu Arg Leu Leu Gly Arg Ala Leu
130                 135                 140Phe Gly Lys Pro Leu Ser Pro Ser Leu Ala Glu His Ala Leu Lys Ala145                 150                 155                 160Leu Asp Arg Ile Met Ala Gln Thr Arg Ser Pro Leu Ala Leu Leu Asp
            165                 170                 175Leu Ala Ala Glu Ala Arg Phe Arg Lys Asp Arg Gly Ala Leu Tyr Arg
        180                 185                 190Glu Ala Glu Ala Leu Ile Val His Pro Pro Leu Ser His Leu Pro Arg
    195                 200                 205Glu Arg Ala Leu Ser Glu Ala Val Thr Leu Leu Val Ala Gly His Glu
210                 215                 220Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg225                 230                 235                 240Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala
            245                 250                 255Ala Phe Gln Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Trp Ile Leu Thr
        260                 265                 270Arg Arg Leu Glu Arg pro Leu Leu Leu Gly Glu Asp Arg Leu Pro Pro
    275                 280                 285Gly Thr Thr Leu Val Leu Ser pro Tyr Val Thr Gln Arg Leu His phe
290                 295                 300Pro Asp Gly Glu Ala Phe Arg pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Arg Gly305                 310                 315                 320Thr Pro Ser Gly Arg Tyr Phe Pro Phe Gly Leu Gly Gln Arg Leu Cys
            325                 330                 335Leu Gly Arg Asp Phe Ala Leu Leu Glu Gly Pro Ile Val Leu Arg Ala
        340                 345                 350Phe Phe Arg Arg Phe Arg Leu Asp Pro Leu Pro Phe Pro Arg Val Leu
    355                 360                 365Ala Gln Val Thr Leu Arg Pro Glu Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg
370                 375                 380Glu Glu Val Arg Ala385<210>3<211>1188<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(4)..(21)<223>His标签<220><223>人工序列的描述：N端带有his标签<220><221>CDS<222>(1)..(1188)<400>3atg cat cac cat cat cat cac aag cgc ctt tcc ctg agg gag gcc tgg    48Met His His His His His His Lys Arg Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp1               5                  10                  15ccc tac ctg aaa gac ctc cag caa gat ccc ctc gcc gtc ctg ctg gcg    96Pro Tyr Leu Lys Asp Leu Gln Gln Asp Pro Leu Ala Val Leu Leu Ala
         20                  25                  30tgg ggc cgg gcc cac ccc cgg ctc ttc ctt ccc ctg ccc cgc ttc ccc    144Trp Gly Arg Ala His Pro Arg Leu Phe Leu Pro Leu Pro Arg Phe Pro
     35                  40                  45ctg gcc ctg atc ttt gac ccc gag ggg gtg gag ggg gcg ctc ctc gcc    192Leu Ala Leu Ile Phe Asp Pro Glu Gly Val Glu Gly Ala Leu Leu Ala
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210                 215                 220Thr Val Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Phe Leu Leu Leu Ser His Arg225                 230                 235                 240Pro Asp Trp Gln Lys Arg Val Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Leu Ala
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Claims (22)

1.一种细胞色素P450单加氧酶，其具有的氨基酸序列中包含来自SEQID NO：2的第Pro328至Glu345位氨基酸残基的部分序列。
2.权利要求1的细胞色素P450单加氧酶，其具有的氨基酸序列中还包含来自SEQ ID NO：2的第Va1216至Ala227位氨基酸残基的部分序列。
3.如前面任何一项权利要求所述的细胞色素P450单加氧酶，其展示的氨基酸序列中还包含至少一个其它的部分序列，该部分序列选自：SEQ IDNO：2的第Met1至Phe327位和第Gly346至Ala389位氨基酸残基所定义的序列区域中具有至少10个连续氨基酸的部分序列。
4.如前面任何一项权利要求所述的细胞色素P450单加氧酶，其展示出基本上与SEQ ID NO：2相符的氨基酸序列。
5.如前面任何一项权利要求所述的细胞色素P450单加氧酶，其来源于栖热菌属细菌。
6.权利要求5的细胞色素P450单加氧酶，其来源于细菌嗜热栖热菌。
7.寡核苷酸，其能与编码前述任何一项权利要求的细胞色素P450单加氧酶的核酸序列杂交。
8.权利要求7的寡核苷酸，其含有与SEQ ID NO：1中包含至少45个连续核苷酸残基的核苷酸序列区域基本上互补的核酸序列。
9.多核苷酸，其能与权利要求7或权利要求8的寡核苷酸杂交并编码细胞色素P450单加氧酶。
10.编码权利要求1至6之任何一项的细胞色素P450单加氧酶的多核苷酸，及与其互补的多核苷酸。
11.权利要求10的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的核酸序列，或具有该核酸序列的互补核酸序列。
12.表达盒，其包含至少一个调控核酸序列，其中，此调控核酸序列与权利要求9至11之任何一项的多核苷酸可操作地连接。
13.重组载体，其含有权利要求9至11之任何一项的多核苷酸或者权利要求12的表达盒。
14.包含至少一个权利要求13的重组载体的微生物。
15.制备权利要求1至6之任何一项的细胞色素P450单加氧酶的方法，其中，培养可产生细胞色素P450单加氧酶的微生物，并从培养物中分离此单加氧酶。
16.用于微生物氧化有机化合物的方法，其中，使用至少一种权利要求1至6之任何一项的细胞色素P450单加氧酶进行化合物的转化。
17.权利要求16的方法，其中，
a1)在存在外源有机化合物或者作为中间体形成的有机化合物时，于培养介质中培养权利要求14的重组微生物，其中所述化合物是单加氧酶的底物；或
a2)把含底物的反应介质与权利要求1至6之任何一项的细胞色素P450单加氧酶一起温育；和
b)从介质中分离形成的氧化产物或者其随后产物。
18.权利要求17的方法，其中，所述外源底物或作为中间体形成的底物选自：
a)任选被取代的N-，O-或者S-杂环单-，双-或者多核芳族化合物；
b)任选被取代的单-或者多核芳族化合物；
c)直链或者支链烷烃和烯烃；
d)任选被取代的环烷烃和环烯烃；和
e)脂肪族(末端饱和的)羧酸。
19.权利要求17或18的方法，其中，通过在至少约20℃的培养温度及pH约6至9的条件下，在有氧存在时培养所述微生物进行氧化。
20.权利要求17或18的方法，其中，将至少一种选自以上定义的a)至e)组的化合物作为外源底物加入介质中，通过在至少约20℃温度及pH约6至9的条件下，在有氧存在时对含底物的介质进行酶促转化，实现氧化反应，其中含底物的介质中还包含基于底物计算约10至100倍摩尔过量的还原当量。
21.生物反应器，其包含以固定化形式存在的权利要求1至6之任何一项的酶或权利要求14的重组微生物。
22.权利要求1至6之任何一项的细胞色素P450单加氧酶、权利要求13的载体或权利要求14的微生物在微生物氧化中的用途，其中所述微生物氧化为对：
a)任选被取代的N-，O-或者S-杂环单-，双-或者多核芳族化合物；
b)任选被取代的单-或者多核芳族化合物；
c)直链或者支链烷烃和烯烃；
d)任选被取代的环烷烃和环烯烃；和/或
e)脂肪族羧酸，进行的微生物氧化。
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