BR122019004903B1

BR122019004903B1 - Célula hospedeira de saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, composição compreendendo a mesma e método para aumentar a produção de amorfa-4,11-dieno através da via do mevalonato na célula hospedeira

Info

Publication number: BR122019004903B1
Application number: BR122019004903-3A
Authority: BR
Inventors: Jay D. Keasling; Eric M. Paradise; James Kirby
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2004-07-27
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2021-11-03
Also published as: US20080171378A1; EP1778831B1; AU2005269556B2; CA2574593C; EP1778831A1; EP2298859A2; ES2386359T3; WO2006014837A1; MX2007000973A; US8828684B2; CN101001947A; CA2574593A1; AU2005269556A1; US10435717B2; ZA200700753B; US20180030481A1; JP2008507974A; US20150087042A1; BRPI0513837B1; EP2298859A3

Abstract

a presente invenção refere-se células hospedeiras geneticamente modificadas que produzem compostos isoprenóides ou precursores de isoprenóides. uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende níveis de atividade aumentados de um ou mais das enzimas da via do mevalonato, níveis de atividade aumentados de preniltrausferase e níveis diminuídos da atividade da esqualeno sintase. métodos são fornecidos para a produção de um composto isoprenóide ou de um precursor isoprenóide em uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada em questão. os métodos geralmente envolvem o cultivo de uma célula hospedeira geneticamente modificada sob condições que promovem a produção de altos níveis de um composto precursor isoprenóide ou isoprenóide.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Americano No. 60/592.009, requeridos em 27 de julho de 2004, cujo pedido é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção está no campo na produção dos com postos isoprenóides, e particularmente células hospedeiras que são geneticamente modificadas para produzir compostos isoprenóides.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Isoprenóides constituem um grupo extremamente grande e diverso de produtos naturais que têm uma origem biossintética comum, isto é, um precursor metabólico individual, difosfato de isopente- nila (IPP). Compostos isoprenóides também são referidos como "ter- penos" ou "terpenóides". Mais de 40.000 isoprenóides foram descritos. Por definição, isoprenóides são compostos das chamadas unidades de isopreno (C5). A quantidade de átomos de C presentes nos isoprenói- des é tipicamente divisível por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40), embora isoprenóides irregulares e politerpenos foram reportados. Membros importantes dos isoprenóides incluem os carotenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides e hemiterpenos. Carotenóides incluem, por exemplo, licopeno, β-caroteno e assim por diante, muitos dos quais funcionam como antioxidantes. Sesquiterpenóides incluem, por exemplo, artemisinina, um composto com atividade antimalárica. Di- terpenóides incluem, por exemplo, taxol, um agente quimioterapêutico contra o câncer.

[004] Isoprenóides incluem a família mais numerosa e estrutu ralmente diversa de produtos naturais. Nessa família, terpenóides isolados de plantas e outras fontes naturais são usados como compostos flavorizante e de fragrância naturais, assim como fármacos antimalári- cas e anticâncer. Uma maioria dos compostos terpenóides em uso hoje são produtos naturais ou seus derivados. Os organismos de origem (por exemplo árvores, invertebrados marinhos) de muitos desses produtos naturais não são nem acessíveis ao cultivo em larga escala necessário para produzir quantidades comercialmente viáveis nem à manipulação genética para a produção aumentada ou derivação desses compostos. Sendo assim, os produtos naturais devem ser produzidos semi-sinteticamente a partir de análogos ou sinteticamente usando sínteses químicas convencionais. Além disso, muitos produtos naturais têm estruturas complexas e, como resultado, são atualmente não- econômicas ou impossíveis de sintetizar. Tais produtos naturais devem ser ou extraídos de suas fontes naturais, tais como árvores, esponjas, corais e micróbios marinhos; ou produzidos sinteticamente ou semi-sinteticamente de precursores mais abundantes. A extração de um produto natural de uma fonte natural é limitada pela disponibilidade da fonte natural; e a produção sintética ou semi-sintética de produtos naturais pode sofrer de baixo rendimento e de alto custo. Tais problemas de produção e disponibilidade limitada da fonte natural podem restringir o desenvolvimento comercial e clínico de tais produtos.

[005] A biossíntese dos produtos naturais isoprenóides em célu las hospedeiras projetadas poderia remendar o potencial terapêutico e comercial não-cumprido dessas fontes naturais e produzir boas substâncias químicas e farmacêuticas menos caras e mais amplamente disponíveis. Um principal obstáculo para a biossíntese de terpenóides de alto nível é a produção de precursores terpênicos. Na Sacchar- myces cerevisiae, a via do mevalonato fornece a produção de difosfato de isopentenila (IPP), o qual pode ser isomerizado e polimerizado em isoprenóides e terpenos de valor comercial. Outros precursores valiosos também são produzidos, incluindo farnesil difosfato (FPP) e difos- fato de geranilgeranila (GPP). Entretanto, muito do fluxo reacional é direcionado para as últimas etapas indesejadas da via do esterol, resultando na produção de ergosterol.

[006] Existe uma necessidade na técnica por células hospedeiras produtoras de precursores de isoprenóides ou produtoras de isopre- nóides que proporcionem a produção em alto nível de comostos iso- prenóides, assim como os precursores do poliprenildifosfato de tais compostos. A presente invenção direciona essa necessidade e fornece vantagens relacionadas. Literatura

[007] Publicação de Patente US No. 2004/005678; Publicação de Patente US No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7): 796 - 802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67 - 71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182 (15): 4319 - 27; Publicação de Patente US No. 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63: 3341 - 3344; Jackson et al. (2003) Organ. Lett. 5: 1629 - 1632; Publicação de Patente US No. 2004/0072323; Publicação de Patente US No. 2004/0029239; Publicação de Patente US No. 2004/0110259; Publicação de Patente US No. 2004/0063182; Patente US No. 5.460.949; Publicação de Patente US No. 2004/0077039; Patente US No. 6.531.303; Patente US No. 6.689.593; Hamano et al. (2001) Bios- ci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627 - 1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (4): 931 - 934; T. Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487 - 1491; Brock et al. (2004) Eur. J. Biochem. 271: 3227 - 3241; Choi, et al. (1999) Appl. Environ. Microbio. 65: 4363 - 4368; Parke et al., (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974 - 2983; Subrahmanyam et al. (1998) J. Bact. 180: 4596 - 4602; Murli et al., (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500 - 509.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece células hospedeiras eucarióti- cas geneticamente modificadas que produzem precursores isoprenói- des ou compostos isoprenóides. Uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimas da via do mevalonato, níveis aumentados de atividade da preniltransferase e níveis diminuídos da atividade da esqualeno sintase. Métodos são fornecidos para a produção de um composto isoprenóide ou um precursor isoprenóide em uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada. Os métodos geralmente envolvem o cultivo de um objeto de célula hospedeira geneti-camente modificada que promovem a produção de altos níveis de um isoprenóide ou composto precursor isoprenóide.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] Figura 1 é uma representação esquemática da via do me- valonato na Saccharomyces cerevisiae. As estruturas dos intermediários e nomes genéticos que codificam as várias enzimas na via são apresentadas.

[0010] Figura 2 é uma representação esquemática de uma porção da via de biossíntese do esterol em um organismo que expressa a amor- fadieno sintase (ADS). As estruturas dos intermediários e os nomes dos genes que codificam as várias enzimas na via são apresentadas.

[0011] Figuras 3A e 3B descrevem a produção de amorfadieno pela S. cerevisiae por 96 horas de cultura expressando amorfadieno sintase (ADS) (♦); ADS e 3-hidróxi-3-metilglutarilcoenzima A redutase truncada (tHMGR) (•); ADS e upc2-1 (■); e ADS e ecm22-1 (▲). Os dados são apresentados como produção total (3A) e normalizados pa- ra a densidade celular (3B). Os dados são as médias ± desvios padrões (n = 3).

[0012] Figura 4 representa a produção de amorfadieno na cepa de S. cerevisiae EPY212 crescida em concentrações de metionina de 0, 0,1, 0,3, 0,5 e 1 depois de 64 e 87 horas de cultura. Os dados são as médias de duas amostras.

[0013] Figura 5 representa a produção de amorfadieno por S. ce- revisiae por várias cepas de levedura durante 144 horas de expressão de cultura. Os dados são as médias ± desvios padrões (n = 3).

[0014] Figura 6 representa uma seqüência molecular que codifica um HMGR truncado.

[0015] Figuras 7A e 7B representam uma seqüência de aminoáci- dos de um HMGR truncado.

DEFINIÇÕES

[0016] Os termos "isoprenóide", "composto isoprenóide", "terpe- no", "composto terpeno", "terpenóide" e "composto terpenóide" são aqui utilizados intercambiavelmente. Compostos isoprenóides são compostos de várias quantidades das chamadas unidades isoprênicas (C5). A quantidade de átomos C presentes nos isoprenóides é tipicamente igualmente divisível por cinco (por exemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40). Isoprenóides irregulares e politerpenos foram reportados, e estão também incluídos na definição de "isoprenóide". Compostos isoprenóides incluem, mas não estão limitados, a monoterpe- nos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos e diterpenos.

[0017] Conforme aqui utilizado, o termo "prenildifosfato" é usado intercambiavelmente com "pirofosfato de prenila", e inclui difosfatos de monoprenila com um grupo prenila único (por exemplo, IPP e DMAPP) assim como poliprenildifosfatos que incluem 2 ou mais grupos prenila. Difosfatos de monoprenila incluem pirofosfato de isopentenila (IPP) e seu isômero pirofosfato de dimetilalila (DMAPP),

[0018] Conforme aqui utilizado, o termo "terpeno sintase" se refere a uma enzima que modifica enzimaticamente o IPP, DMAPP ou um pirofosfato de poliprenila, de forma que um composto terpenóide é produzido. O termo "terpeno sintase" inclui enzimas que catalisam a conversão de um difosfato de prenila em um isoprenóide.

[0019] A palavra "pirofosfato" é usada intercambiavelmente aqui com "difosfato". Conseqüentemente, por exemplo, os termos "difosfato de prenila" e "pirofosfato de prenila" são intercambiáveis; os termos "pirofosfato de isopentenila" e "difosfato de isopentenila" são intercam- biáveis; os termos "difosfato de farnesila" e "pirofosfato de farnesila" são intercambiáveis; etc.

[0020] O termo "via do mevalonato" ou "viaMEV" é aqui utilizado para se referir à via biossintética que converte acetil-CoA em IPÁG. A via do mevalonato compreende enzimas que catalisam as seguintes etapas: (a) a condensação de duas moléculas de acetil-CoA em ace- toacetil-CoA; (b) a condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) a conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) a pirofosforilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) a conversão de mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; e (f) a conversão de mevalonato 5-pirofosfato em pirofosfato de isopenteni- la. A via do mevalonato está ilustrada esquematicamente na Figura 1.

[0021] Conforme aqui utilizado, o termo "transferase de prenila" é usado intercambiavelmente com os termos "difosfato de isoprenila sin- tase" e "sintase de poliprenila" (por exemplo, "GP sintase", "FPP sin- tase", "OPP sintase", etc.) para se referir a uma enzima que catalisa a 1'-4 condensação do difosfato de isopentenila consecutiva com substratos iniciadores alílicos, resultando na formação de difosfatos de prenila de vários comprimentos de cadeia.

[0022] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico", usados in- tercambiavelmente aqui, se referem a uma forma polimérica de nu- cleotídeos de qualquer comprimento, seja de ribonucleotídeos ou de desoxinucleotídeos. Sendo assim, esse termo inclui, mas não está limitado, a DNA ou RNA de fita única, dupla ou múltipla, DNA genômi- co, DNAc, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeo derivadas não-naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas naturais.

[0023] Conforme aqui utilizado, o termo "operon" e "unidade de transcrição individual" são usados intercambiavelmente para se referir a duas ou mais regiões codificadoras contíguas (seqüências de nucle- otídeos que codificam um produto genético tal como um RNA ou uma proteína) que são convenientemente reguladas por um ou mais elementos de controle (por exemplo, um promotor). Conforme aqui utilizado, o termo "produto de gene" se refere a um RNA codificado por um DNA (ou vice-versa) ou proteína que é codificada por um RNA ou DNA, onde um gene irá tipicamente compreender uma ou mais se- qüências de nucleotídeos que codificam uma proteína, e podem também incluir íntrons e outras seqüências de nucleotídeos não- codificantes,

[0024] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são aqui usados intercambiavelmente, e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, as quais podem incluir amino- ácidos codificados e não-codificados, quimicamente ou bioquimica- mente modificados ou aminoácidos derivados, e polipeptídeos com estruturas de peptídeo modificadas.

[0025] O termo "de ocorrência natural", conforme aqui utilizado, conforme aplicado a um ácido nucléico, uma célula ou um organismo, se refere a um ácido nucléico, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinu- cleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que podem ser isolados de uma fonte na natureza e a qual não tenha sido intencionalmente modificada por um ser humano no laboratório é de ocorrência natural.

[0026] O termo "ácido nucléico heterólogo", conforme aqui utiliza do, se refere a um ácido nucléico em que pelo menos um dos seguintes é verdade: (a) o ácido nucléico é externo ("exógeno") a (isto é, não- naturalmente encontrado em) um dado microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira; (b) o ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada em (por exemplo, é "endógena a") um dado microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira (por exemplo, o ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleo- tídeo endógena ao microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira); entretanto, no contexto de um ácido nucléico heterólogo, a mesma se- qüência de nucleotídeo conforme encontrada endogenamente é produzida em uma quantidade não-natural na célula (por exemplo, maior do que a esperada ou maior do que a naturalmente encontrada), ou um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que difere na seqüência da seqüência de nucleotídeo endógena mas codifica a mesma proteína (com a mesma ou substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos) conforme encontrado endogenosamente é produzida em uma quantidade não-natural (por exemplo, maior do que a esperada ou maior do que a naturalmente encontrada) na célula; (c) o ácido nucléico compreende duas ou mais seqüências de nucleotí- deos que não são encontradas na mesma relação a cada outra na natureza, por exemplo, o ácido nucléico é recombinante. Um exemplo de um ácido nucléico heterólogo é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um HMGR operavelmente ligado a um elemento de controle transcricional (por exemplo, um promotor) ao qual um HMGR endógeno (de ocorrência natural) não está normalmente operavelmente ligado. Outro exemplo de um ácido nucléico heterólogo e um plasmídeo de alto número de cópias compreendendo uma seqüência de nucleotí- deos que codifica um HMGR. Outro exemplo de um ácido nucléico he- terólogo é um ácido nucléico que codifica um HMGR, onde uma célula hospedeira que não produz normalmente o HMGR é geneticamente modificada com o ácido nucléico que codifica o HMGR; devido aos ácidos nucléicos que codificam o HMGR não serem naturalmente encontrados na célula hospedeira, o ácido nucléico é heterólogo à célula hospedeira geneticamente modificada.

[0027] "Recombinante", conforme aqui utilizado, significa que um ácido nucléico particular (DNA ou RNA) é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação resultando em um constructo com uma seqüência codificante ou não-codificante estrutural distinguível dos ácidos nucléicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Geralmente, seqüências de DNA que codificam a seqüência codificante estrutural podem ser montados de fragmentos de DNAc e ligantes de oligonucleotídeos curtos, ou de uma série de oligonucleotídeos sintéticos, para fornecer um ácido nucléico sintético e o qual seja capaz de ser expresso de uma unidade transcricional re- combinante contida em uma célula ou em um sistema de transcrição e tradução livre de célula. Tais seqüências podem ser fornecidas na forma de uma armação de leitura aberta não-interrompida por seqüên- cias não-traduzidas internas, ou íntrons, os quais estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. DNA genômico compreendendo as seqüências relevantes pode também ser usado na formação de um gene recombinante ou unidade transcricional. Seqüências de DNA não-traduzido podem estar presentes 5' ou 3' da armação de leitura aberta, onde tais seqüências não interferem com a manipulação ou expressão das regiões codificadoras, e podem de fato agir para modular a produção de um produto desejado por vários mecanismos (ver "seqüências regulatórias de DNA", abaixo).

[0028] Sendo assim, por exemplo, o termo polinucleotídeo ou áci- do nucléico "recombinante" se refere a um o qual não é de ocorrência natural, por exemplo, é feito pela combinação artificial de dois diferentes segmentos separados de seqüência através da intervenção humana. A combinação artificial é geralmente conseguida ou por formas de síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética. Tal é geralmente feito para substituir um códon com um códon redundante que codifica o mesmo ou um aminoácido conservativo, enquanto tipicamente introduzindo ou removendo uma seqüência de sítio de reconhecimento. Alternativamente, ele é efetuado para juntar segmento de ácido nucléico de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. Essa combinação artificial é geralmente realizada ou por formas de síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética.

[0029] Por "constructo" se entende um ácido nucléico recombinan- te, geralmente DNA recombinante, o qual foi gerado para o propósito de expressão de uma(s) seqüência(s) de nucleotídeos específica(s) ou é para ser usado na construção de outras seqüências de nucleotídeos recombinantes.

[0030] Conforme aqui utilizado, o termo "ácido nucléico exógeno" se refere a um ácido nucléico que não é normalmente ou naturalmente encontrado na e/ou produzido por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Conforme aqui utilizado, o termo "ácido nucléico endógeno" se refere a um ácido nucléico que é normalmente encontrado por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Um "ácido nucléico endógeno" também é referido como um "ácido nucléico natural" ou um ácido nucléico que é "natural" a uma dada bactéria, organismo ou célula. Por exemplo, um DNAc geado de um mRNA isolado de uma planta e codificando uma terpeno sintase representa um ácido nucléico exógeno para a S. cerevisiae. Na S. cerevisiae, se- qüências de nucleotídeos que codificam a HMGS, MK e PMK no cromossomo poderiam ser ácidos nucléicos "endógenos".

[0031] Os termos "seqüências regulatórias de DNA", "elementos de controle" e "elementos regulatórios" usados aqui intercambiavelmente, se referem a seqüências de controle transcricional e traducional, tais como promotores, intensificadores, sinais de polioadenilação, termina- dores, sinais de degradação de proteína e semelhantes, que fornecem para e/ou regulam a expressão de uma seqüência codificante e/ou a produção de um polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira.

[0032] O termo "transformação" é usado intercambiavelmente aqui com "modificação genética" e se refere a uma alteração genética permanente ou transiente induzida em uma célula seguido da introdução de um novo ácido nucléico (isto é, DNA exógeno à célula). Alteração genética ("modificação" pode ser efetuada ou pela incorporação de um novo DNA no genoma da célula hospedeira, ou pela manutenção transiente ou estável do novo DNA como um elemento epissomal. Onde a célula é uma célula eucariótica, uma alteração genética permanente é geralmente conseguida pela introdução do DNA no genoma da célula. Em células procarióticas, alterações permanentes podem ser introduzidas no cromossomo ou através de elementos extracromossomiais tais como plasmídeos e vetores de expressão, os quais podem conter um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar na sua manutenção na célula hospedeira recombinante.

[0033] "Operavelmente ligado" se refere a uma justaposição em que os componentes descritos dessa forma estão em uma relação que permite a eles funcionar na sua forma pretendida. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma seqüência codificadora se o promotor afetar sua transcrição ou expressão. Conforme aqui utilizado, os termos "promotor heterólogo" e "regiões de controle heterólogo" se referem a promotores e outras regiões de controle que não são normalmente associadas com um ácido nucléico particular na natureza. Por exemplo, uma "região de controle transcricional heteróloga a uma região codificadora" é uma região de controle transcricional que não está normalmente associada com a região codificadora na natureza.

[0034] Uma "célula hospedeira", conforme aqui utilizado, denota uma célula eucariótica ou uma célula de um organismo multicelular in vivo ou in vitro (por exemplo, uma linhagem celular) cultivada como uma entidade unicelular, cujas células eucarióticas podem ser ou tem sido usadas como receptoras por um ácido nucléico (por exemplo, um vetor de expressão que compreenda uma seqüência de nucleotídeo que codifique um ou mais produtos como os produtos genéticos da via do mevalonato) e incluem a progenia da célula original, a qual foi geneticamente modificada pelo ácido nucléico. É entendido que a progenia de uma única célula pode não necessariamente ser completamente idêntica na morfologia ou no complemento de DNA total ou genômi- co que o ancestral original, devido à mutação natural, acidental ou de-liberada. Uma "célula hospedeira recombinante" (também referida como "célula hospedeira geneticamente modificada") é uma célula hospedeira na qual foi introduzido um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica em questão é uma célula hospedeira geneticamente modificada em virtude da introdução em uma célula hospedeira eucariótica adequada de um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é externo à célula hospedeira eucariótica, ou um ácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célula hospedeira eucariótica.

[0035] Conforme aqui utilizado, o termo "isolado" pretende descre ver um polinucleotídeo, um polipeptídeo ou uma célula que esteja em um ambiente diferente daquele no qual o polinucleotídeo, o polipeptí- deo ou a célula ocorra naturalmente. Uma célula hospedeira geneticamente modificada isolada pode estar presente em uma população misturada de células hospedeiras geneticamente modificadas.

[0036] Cassetes de expressão podem ser preparados compreen dendo uma iniciação de transcrição ou regiões de controle transcricio- nal (por exemplo, um promotor), a região codificadora para a proteína de interesse, e uma região de terminação transcricional. Regiões de controle transcricionais incluem aquelas que proporcionam a superex- pressão da proteína de interesse na célula hospedeira geneticamente modificada; aquelas que proporcionam a expressão induzível, de forma que quando um agente indutor é adicionado ao meio de cultura, a transcrição da região codificadora da proteína de interesse é induzida ou aumentada até um nível mais alto antes da indução.

[0037] Um ácido nucléico é "hibridizável" a outro ácido nucléico, tal como um cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma forma de fita única do ácido nucléico pode anelar com o outro ácido nucléico sob as condições apropriadas de temperatura e força de solução iônica. As condições de hibridização e de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas no Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o capítulo 11 e a tabela 11.1 ali; e Sambrook, J. e Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e de força iônica determinam a "estringência" da hibridização. As condições de estringência podem ser ajustadas para efetuar a varredura para fragmentos moderadamente similares, tais como seqüências homólogas de organismos distantemente relacionados, até fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. Condições de hibridização e lavagens pós-hibridização são úteis para obter as condições de estrin- gência determinadas desejadas da hibridização. Um grupo de lavagens pós-hibridização ilustrativas é uma série de lavagens começando com 6 x SSC (onde SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato 15 mM), 0,5% de SDS a temperatura ambiente por 15 minutos, em seguida repetido com 2 x SSC, SDS 0,5% a 45 °C por 30 minutos e, em seguida, repetido duas vezes com 0,2 x SSC, SDS 0,5% a 50 °C por 30 minutos. Outras condições de estringência são obtidas pelo uso de temperaturas mais elevadas nas quais as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto para a temperatura das duas lavagens de 30 minutos finais em 0,2 x SSC, SDS 0,5%, a qual é aumentada até 60 °C. Outro grupo de condições altamente estringentes usa duas lavagens finais em 0,1 x SSCm SDS 0,1% a 65 °C. Outro exemplo de condições de hibridização estringentes é a hibridização a 50 °C ou superior e SSC x 0,1 (cloreto de sódio 15 mM / citrato de sódio 1,5 mM). Outro exemplo de condições de hibridização estringentes é a incubação de um dia para o outro a 42 °C em uma solução; 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, dextrana sulfato 10% e 20 μg/mL de DNA de esperma de salmão cortado desnaturado, seguido pela lava-gem dos filtros em 0,1 x SSC em cerca de 65 °C. Condições de hibridi- zação estringentes e condições de lavagem pós-hibridização são condições de hibridização e condições de lavagem pós-hibridização que são, pelo menos, tão estringentes quanto às condições representativas acima.

[0038] A hibridização requer que os dois ácidos nucléicos conte nham seqüências complementares, embora dependendo da estringên- cia da hibridização, maus emparelhamentos entre as bases é possível. A estringência apropriada para hibridizar ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, va riáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre as duas seqüências de nucleotídeos, maior o valor da temperatura de fusão (Tm) para híbridos de ácidos nucléicos com aquelas seqüências. A estabilidade relativa (correspondendo a uma Tm mais elevada) de hibridizações de ácido nucléico decresce na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais de 100 nucleotídeos de comprimento, equações para calcular a Tm foram derivadas (ver Sambrook et al., acima, 9.50 - 9.51). Para hibridizações com ácidos nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotí- deos, a posição de maus emparelhamentos fica mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (ver Sambrook et al., acima, 11.7 - 11.8). Tipicamente, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotí- deos. Comprimentos mínimos ilustrativos para um ácido nucléico hibri- dizável são: pelo menos 15 nucleotídeos; pelo menos 20 nucleotídeos; e pelo menos 30 nucleotídeos. Além disso, o artesão versado irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem pode ser ajustada conforme necessário de acordo com os fatores tais como comprimento da sonda.

[0039] O termo "substituição de aminoácido conservativa" se refe re à intercambialidade nas proteínas de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais de hidroxi- lalifáticas consiste em serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida consiste em asparagina e gluta- mina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre con- siste em cisteína e metionina. Exemplos de grupos de substituição de aminoácidos conservativos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

[0040] "Ácidos nucléicos sintéticos" podem ser montados a partir de blocos de construção de oligonucleotídeos que são quimicamente sintetizados usando procedimentos conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Esses blocos de construção são ligados e anelados para formar segmentos de genes os quais são, a seguir, enzimatica- mente montados para construir o gene inteiro. "Quimicamente sintetizado", conforme relacionado com uma seqüência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. Síntese química manual de DNA pode ser conseguida usando procedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automatizada pode ser efetuada usando um de uma variedade de máquinas comercialmente disponíveis. A seqüência de nucleotídeos dos ácidos nucléicos pode ser modificada para a expressão ótima baseando-se na otimização da se- qüência de nucleotídeos para refletir a propensão do códon da célula hospedeira. Os artesãos versados entendem a probabilidade de expressão com sucesso se o códon de uso é propenso para esses có- dons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira onde a informação de seqüência está disponível. Um poli- peptídeo ou polinucleotídeo tem um certo porcentual de "identidade de seqüência" em relação a outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhada, aquela porcentagem de bases ou amino- ácidos é a mesma, e na mesma posição relativa, quando em comparação com as duas seqüências. Similaridade de seqüência pode ser determinada de uma variedade de diferentes maneiras. Para determinar a identidade da seqüência, seqüências podem ser alinhadas usando os métodos e programas de computador, incluindo o BLAST, dis- ponível na rede mundial de computadores em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Ver, por exemplo, Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403 - 10. Outro algoritmo de alinhamento é o FASTA, disponível no pacote Genetics Computing Group (GCG), da Madison, Wisconsin, EUA, uma subsidiária completamente pertencente do Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para o alinhamento estão descritas em Methods in Enzymology, vol 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão da Harcourt Brace & Co., São Diego, Califórnia, EUA. De interesse particular são os programas de alinhamento que permitem intervalos na seqüência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite intervalos nos alinhamentos de seqüência. Ver Meth. Mol. Biol. 70: 173 - 187 (1997). Também, o programa GAP usando o método de alinha-mento Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar seqüên- cias. Ver J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970).

[0041] Antes da presente invenção ser adicionalmente descrita, é para ser entendido que essa invenção não está limitada a modalidades particulares descritas, como tal pode, é claro, variar. É também para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever somente modalidades particulares, e não é pretendida para ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.

[0042] Onde é fornecida uma variedade de faixas, é entendido que cada valor interveninete, até o décimo da unidade do limite inferior, a não ser que o contexto claramente dite uma outra forma, entre o limite superior e inferior daquela faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente naquela faixa estabelecida, é englobado na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores, e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído n fai- xa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo qualquer um ou ambos daqueles limites inclusos também são incluídas na invenção.

[0043] A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo normalmente versado na técnica para o qual essa invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos preferidos e materiais são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas seção aqui incorporadas por referência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais juntamente com as quais as publicações são citadas.

[0044] Deve ser notado que conforme aqui utilizado e nas reivindi cações em anexo, as formas singulares "um", "e" e "o" incluem múltiplos referentes, a não ser que o contexto claramente dite algo diferente. Sendo assim, por exemplo, referência a "uma célula hospedeira geneticamente modificada" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras geneticamente modificadas e referência a "composto isopre- nóide" inclui referência a um ou mais compostos isoprenóides e seus equivalentes conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e assim por diante. É ainda notado que as reivindicações podem ser esboçadas pra excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esse estabelecimento pretende servir como base de antecedente para uso de tal terminologia como "unicamente", "somente" e semelhantes juntamente com a recitação dos elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".

[0045] As publicações aqui discutidas são fornecidas somente pa ra a sua descoberta antes da data de requerimento do presente pedido. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão que a pre sente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação verdadeiras, o que pode necessitar ser independentemente confirmado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] A presente invenção fornece células hospedeiras eucarióti- cas geneticamente modificadas que produzem precursores de isopre- nóides ou compostos isoprenóides. Uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão compreende níveis de atividade aumentado de uma ou mais enzimas da via do mevalonato, níveis aumentados de atividade da prenil transferase e níveis diminuídos de atividade da esqualeno sintase. Métodos são fornecidos para a produção de um composto isoprenóide ou um precursor isoprenóide em uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada em questão. Os métodos geralmente envolvem o cultivo de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão sob condições que promovem a produção de altos níveis de um composto precursor isoprenóide ou iso- prenóide.

[0047] As vias do mevalonato e do esterol da S. cerevisiae são representadas esquematicamente na Figura 1 e na Figura 2 (notar que a amorfadieno sintase (ADS) na Figura 2 não é normalmente expressa em S. cerevisiae geneticamente não-modificada). Essa via é típica de uma ampla variedade de células eucarióticas. FPP é convertido a es- qualeno pela esqualeno sintase (ERG9). Esqualeno é convertido em ergosterol nos etapas subseqüentes. Em células não-modificadas, muito do fluxo metabólico direciona o FPP em direção à síntese de esterol. Em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão, o fluxo metabólico é redirecionado para uma maior produção dos precursores isoprenóides IPP e FPÁG. CÉLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

[0048] A presente invenção fornece células hospedeiras geneti camente modificadas, cujas células compreendem uma ou mais modificações genéticas que proporcionam uma produção melhorada de compostos precursores isoprenóides ou isoprenóides. Comparado com uma célula hospedeira de controle não-geneticamente modificada de acordo com a presente invenção, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão exibe as seguintes características: níveis de atividade elevados de uma ou mais enzimas da via; níveis aumentados de atividade da prenil transferase; e níveis diminuídos da atividade da esqualeno sintase.

[0049] Níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimas da via do mevalonato, níveis aumentados da atividade da prenil transferase e níveis diminuídos da atividade da esqualeno sintase aumentam a produção de precursores de isoprenóides ou isoprenóides por uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão. Sendo assim, em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão exibe aumentos na produção de precursores de isoprenóides e de isoprenóides, onde a produção de precursores de isoprenóides e de isoprenóides é aumentado por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo me- nos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, em comparação com o nível de composto isoprenóide ou de precursor de isoprenóide produzido em uma célula hospedeira de controle que não é geneticamente modificada conforme aqui descrito. A produção de precursor de iso- prenóide ou de isoprenóide é prontamente determinada usando métodos bem conhecidos, por exemplo, cromatografia a gás - espectrome- tria de massa, cromatografia líquida - espectrometria de massa, cro- matografia iônica - espectrometria de massa, detecção amperométrica pulsátil, espectrometria uv-vis e semelhantes.

[0050] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada proporciona para a produção aumentada de precursor de isoprenóide ou de isoprenóide por célula, por exemplo, a quantidade de precursor de isoprenóide ou de isoprenóide produzido usando um método em questão é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, mais alta do que a quantidade de composto de precursor de isoprenóide ou de isoprenói- de produzida por uma célula hospedeira que não é geneticamente modificada pelos métodos em questão, em uma base por célula. A quantidade de células é medida pela medição de peso de célula seco ou pela medida da densidade ótica da cultura celular.

[0051] Em outras modalidades, uma célula hospedeira genetica mente modificada em questão proporciona para a produção aumentada de precursor de isoprenóide ou de isoprenóide por unidade de volume de cultura celular, por exemplo, a quantidade de composto de precursor de isoprenóide ou de isoprenóide produzida usando uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo me-nos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, mais alta do que o composto de precursor de isoprenói- de ou de isoprenóide produzida por uma célula hospedeira que não é geneticamente modificada pelos métodos em questão, em uma base de cultura celular por unidade de volume.

[0052] Em algumas modalidades, um hospedeiro eucariótico gene ticamente modificado em questão produz um composto precursor de isoprenóide ou de isoprenóide em uma quantidade variando de 1 μg de composto isoprenóide/mL até 100.000 μg de composto isoprenói- de/mL, por exemplo, de cerca de 1 μg/mL até cerca de 10.000 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 5.000 μg/mL de composto iso- prenóide, 1 μg/mL até 4.500 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 4.000 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 3.000 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 2.500 μg/mL de composto iso- prenóide, 1 μg/mL até 2.000 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 1.500 μg/mL de composto isoprenóide, 1 μg/mL até 1.000 μg/mL de composto isoprenóide, 5 μg/mL até 5.000 μg/mL de composto iso- prenóide, 10 μg/mL até 5.000 μg/mL de composto isoprenóide, 20 μg/mL até 5.000 μg/mL de composto isoprenóide, 30 μg/mL até 1.000 μg/mL de composto isoprenóide, 40 μg/mL até 500 μg/mL de composto isoprenóide, 50 μg/mL até 300 μg/mL de composto isoprenóide, 60 μg/mL até 100 μg/mL de composto isoprenóide, 70 μg/mL até 80 μg/mL de composto isoprenóide, de cerca de 1 μg/mL até cerca de 1.000 μg/mL, de cerca de 1.000 μg/mL até cerca de 1.000 μg/mL, de cerca de 2.000 μg/mL até cerca de 3.000 μg/mL, de cerca de 3.000 μg/mL até cerca de 4.000 μg/mL, de cerca de 4.000 μg/mL até cerca de 5.000 μg/mL, de cerca de 5.000 μg/mL até cerca de 7.500 μg/mL, de cerca de 7.500 μg/mL até cerca de 10.000 μg/mL, ou maior do que 10.000 μg/ml de composto isoprenóide, por exemplo, de cerca de 10 mg de composto isoprenóide/mL até cerca de 20 mg de composto iso- prenóide/mL, de cerca de 20 mg de composto isoprenóide/mL até cerca de 50 mg de composto isoprenóide/mL, de cerca de 50 mg de composto isoprenóide/mL até cerca de 100 mg de composto isoprenói- de/mL ou mais.

[0053] Os métodos em questão podem ser usados em uma varie dade de diferentes tipos de células hospedeiras eucarióticas. Células hospedeiras são, em muitas modalidades, organismos unicelulares, ou são crescidas em cultura como células individuais. Células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, mas não estão limitadas, a células de levedura, células de inseto, células vegetais, células de fungos e células de algas. Células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, mas não estão limitadas, a Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pi- chia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranefaciens, Pichia ountiae, Pichia thermotolerans, Pichia salcitaria, Pichia guercuum, Pi- chia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccha- romyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyceslactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii e semelhantes. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucaroiótica diferente de uma célula vegetal. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada em questão é uma célula de levedura. Em uma modalidade particular, a célula de levedura é a Saccharomyces cerevisiae.

[0054] Em uma modalidade exemplar, a via metabólica da Saccha- romyces cerevisiae é projetada para produzir sesquiterpenos do difos- fato de farnesila. Um tal sesquiterpeno, amorfadieno, é um precursor do fármaco artemisinino antimalárico. Amorfadieno, ciclizado da difos- fato de farnesila, pode ser usado como um ensaio para níveis de precursores de isoprenóides.

[0055] Em uma modalidade exemplar, níveis de atividade de HMGR, uma prenil transferase, Ecm22p e Upc2p são aumentados e níveis de atividade de esqualeno sintase são diminuídos. 3-hidróxi-3- metilglutarilcoenzima A redutase (HMGR) e uma prenil transferase, por exemplo, difosfato de farnesila sintase (FPPS), catalisa reações de obstáculos em uma via de síntese de amorfadieno. Aumentando a atividade do HMGR e uma prenil transferase, por exemplo, FPPS, contorna esses obstáculos. Dois fatores de transcrição, Ecm22p e Upc2p, são importantes na regulação da síntese do esterol. Cada um desses dois fatores é modificado em um único aminoácido próximo do seu C- terminal, cuja mutação aumenta a atividade de cada fator. A esqualeno sintase catalisa a reação do difosfato de farnesila para esqualeno na via se síntese de esterol indesejada. Sendo assim, para maximizar as reuniões de precursores e prevenir o fluxo inadequado de esteróis, a transcrição de ERG9 foi limitada. Nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimas da via do me- valonato

[0056] A via do mevalonato compreende enzimas que catalisam as seguintes etapas: (a) a condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA, tipicamente pela ação da acetoacetil-CoA tiolase; (b) a condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA, tipicamente pela ação da HMG sintase (HMGS); (c) a conversão de HMG-CoA em mevalonato, tipicamente pela ação da HMGR; (d) a pirofosforilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato, tipicamente pela ação da mevalonato quinase (MK); (e) a conversão de mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato, tipicamente pela ação da fosfomevalonato quinase (PMK); e (f) a conversão de mevalo- nato 5-pirofosfato em pirofosfato de isopentenila, tipicamente pela ação da mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD).

[0057] Uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modifi cada compreende uma ou mais modificações resultantes em uma ou mais das seguintes: nível aumentado de atividade de HMGS; nível aumentado de atividade da HMGR; nível aumentado da atividade da MK; nível aumentado da atividade da PMK; e nível aumentado da atividade da MPD.

[0058] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada em questão é geneticamente modificada de forma que o nível de atividade de uma ou mais enzimas da via do mevalona- to é aumentado. O nível de atividade de uma ou mais enzimas da via do mevalonato em uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão pode ser aumentado de uma variedade de formas, incluindo, mas sem se limitar, a 1) aumentar a força promotora do promotor ao qual a região codificadora da enzima da via do mevalonato é operativamente ligada; 2) aumentando a quantidade de cópias do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima da via do mevalonato; 3) aumentando a estabilidade de um mRNA da enzima da via do mevalonato (onde um "mRNA da enzima da via do mevalonato" é um mRNA compreendendo uma seqüência de nucleotí- deo que codifica uma enzima da via do mevalonato); 4) modificando a seqüência do sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da enzima da via do mevalonato de forma que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato seja aumentado; 5) a modificação da se- qüência entre o sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da enzima da via do mevalonato e um códon de início da enzima da via do meva- lonato que codifica a seqüência de forma que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato seja aumentado; 6) modificando a região intercistrônica inteira 5' do códon de início da região codificadora da enzima da via do mevalonato de forma que a tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato seja aumentada; 7) modificação do uso do códon da enzima da via do mevalonato de forma que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato seja aumentado; 8) exprimindo os códons raros de TRNAs usados na enzima da via do mevalonato de forma que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato seja aumentado; 9) aumentando a estabilidade enzimática da enzima da via do mevalonato; 10) aumentando a atividade específica (unidades de atividade por unidade de proteína) da enzima da via do mevalonato; 11) expressando uma forma modificada de uma enzima da via do mevalonato de forma que a enzima modificada exiba solubilidade aumentada na célula hospedeira; ou 12) expressando uma forma modificada de uma enzima da via do mevalo- nato de forma que a enzima modificada não tenha um domínio através do qual ocorra a regulação. As modificações precedentes podem ser feitas individualmente ou em combinação; por exemplo, duas ou mais das modificações precedentes podem ser feitas para proporcionar um nível aumentado de atividade da enzima da via do mevalonato.

[0059] A enzima HMG-CoA redutase (HMGR) catalisa uma reação irreversível que reduz a 3-hidróxi-3-metilglutarilcoenzima A (HGM- CoA) a mevalonato. Essa etapa é a etapa comprometida na via de bi- ossíntese do esterol. Sendo assim, HMGR é um ponto principal de regulação em organismos que utilizam naturalmente a via do mevalonato para produzir isoprenóides.

[0060] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada em questão é geneticamente modificada de forma que o nível de atividade de HMGR é aumentado. O nível de atividade da HMGR na célula hospedeira geneticamente modificada pode ser aumentado de uma variedade de formas, incluindo, mas sem se limitar, a 1) aumentar a força promotora do promotor ao qual a região codificadora da HMGR é operativamente ligada; 2) aumentando a quantidade de cópias do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nu- cleotídeos que codifica a HMGR; 3) aumentando a estabilidade de um mRNA da HMGR (onde um "mRNA da HMGR" é um mRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma HMGR); 4) modificando a seqüência do sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da HMGR de forma que o nível de tradução do mRNA da HMGR seja aumentado; 5) a modificação da seqüência entre o sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da HMGR e um códon de início da HMGR que codifica a seqüência de forma que o nível de tradução do mRNA da HMGR seja aumentado; 6) modificando a região intercistrô- nica inteira 5' do códon de início da região codificadora da HMGR de forma que a tradução do mRNA da HMGR seja aumentada; 7) modificação do uso do códon da HMGR de forma que o nível de tradução do mRNA da HMGR seja aumentado; 8) exprimindo os códons raros de TRNAs usados na HMGR de forma que o nível de tradução do mRNA da HMGR seja aumentado; 9) aumentando a estabilidade enzimática da HMGR; 10) aumentando a atividade específica (unidades de atividade por unidade de proteína) da HMGR; ou 11) truncando a HMGR para remover um elemento regulatório negativo. As modificações precedentes podem ser feitas individualmente ou em combinação; por exemplo, duas ou mais das modificações precedentes podem ser feitas para proporcionar um nível aumentado de atividade de HMGR.

[0061] Em muitas modalidades, o nível de HMGR é aumentado pela modificação genética de uma célula hospedeira eucariótica de forma que ela produza uma forma truncada de HMGR (tHMGR), cuja forma truncada tenha atividade enzimática em relação ao tipo selvagem da HMGR. tHMGR não tem um domínio de extensão e é, dessa forma, solúvel e não tem a inibição por retroalimentação da HMGR. HMGRt retém sua região C-terminal catalítica, e dessa forma retém a atividade do HMGR. Em algumas modalidades, o HMGR truncado tem a seqüência de aminoácidos representada nas Figuras 7A e 7B (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o HMGR truncado é codificado por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos representada na figura 6 (SEQ ID NO: 1).

[0062] Em algumas modalidades o nível de atividade de uma ou mais das HGMS, MK e PMK é aumentado. Na S. cerevisiae, os genes que codificam a HMGS (ERG13), MK (ERG12) e PMK (ERG8) compreendem um elemento regulatório de esterol que se liga aos fatores de transcrição Ecm22p e Upc2p, onde, na ligação do Ecm22p e Upc2p, a transcrição é ativada. Em algumas modalidades, o nível de atividade de uma ou mais dos HMGS, MK e PMK é aumentado pelo aumento da atividade da Ecm22p e Upc2p. Vik et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 19: 6395 - 405.

[0063] Normalmente, a S. cerevisiae não absorve esteróis do am biente sob condições aeróbicas. Lewis et al. ((1998) Yeast 4:93 - 106) isolou um mutante de levedura, upc2-1 (controle de consumo), o qual resultou em um consumo de esterol aeróbico. O alelo de upc2-1 compreende uma transição de guanina para adenina na estrutura de leitura aberta designada YDR213W no cromossomo IV. Crowley et al. (1998) J. Bacteriol. 16: 4177 - 4183. A seqüência de ácidos nucléicos da Upc2 do tipo selvagem é conhecida e pode ser obtida através do No. De acesso Genbank Z68194. Esse alelo do tipo selvagem é notado como coordenado 889746 - 892487 no cromossomo da S. cerevisiae. Conforme anteriormente encontrado por Lewis et al., sob condições naturais o nível de consumo de esterol foi de 10- a 20- vezes maior do que o isogênico do tipo selvagem. O mutante resultou em uma produção de ergosterol aumentada.

[0064] A única alteração de aminoácido próxima do C terminal dos fatores de transição de Upc2p e do Ecm22p mostraram que aumentam a sua atividade. Em muitas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada tal como uma Upc2p compreende uma substituição de glicina para ácido aspártico no aminoácido 888; e Ecm22p compreende uma substituição de glicina para ácido aspártico no ami- noácido 790. Nível aumentado de atividade da preniltransferase.

[0065] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada em questão é geneticamente modificada de forma que o nível de atividade da difosfato de geranila sintase (GPPS) e/ou difosfato de farnesila sintase (FPPS) é aumentado.

[0066] A enzima difosfato de farnesila sintase (FPPS) catalisa uma reação que converte o difosfato de geranila (GPP) em difosfato de far- nesila (FPP). Essa etapa também foi mostrado ser limitante do grau de velocidade na via do mevalonato. Conseqüentemente, FPPS é um ponto de regulação em organismos que naturalmente utilizam a via do mevalonato para produzir isoprenóides. Como tal, e para facilidade de descrição adicional, níveis de modulação de atividade de uma prenil transferase é discutido em termos de modulação do nível de atividade de uma FPPS.

[0067] Em algumas modalidades, o nível de atividade da FPPS é aumentado. O nível de atividade da FPPS em uma célula hospedeira geneticamente modificada pode ser aumentado de diversas formas, incluindo, mas sem se limitar, a 1) aumentar a força promotora do promotor ao qual a região codificadora da FPPS é operativamente ligada; 2) aumentando a quantidade de cópias do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica a FPPS; 3) aumentando a estabilidade de um mRNA da FPPS (onde um "mRNA da FPPS" é um mRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma FPPS); 4) modificando a seqüência do sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da FPPS de forma que o nível de tradução do mRNA da FPPS seja aumentado; 5) a modificação da se- qüência entre o sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da FPPS e um códon de início da FPPS que codifica a seqüência de forma que o nível de tradução do mRNA da FPPS seja aumentado; 6) modificando a região intercistrônica inteira 5' do códon de início da região codificadora da FPPS de forma que a tradução do mRNA da FPPS seja aumentada; 7) modificação do uso do códon da FPPS de forma que o nível de tradução do mRNA da FPPS seja aumentado; 8) exprimindo os códons raros de TRNAs usados na FPPS de forma que o nível de tradução do mRNA da FPPS seja aumentado; 9) aumentando a estabilidade enzimática da FPPS; 10) aumentando a atividade específica (unidades de atividade por unidade de proteína) da FPPS. As modifi- cações precedentes podem ser feitas individualmente ou em combinação; duas ou mais das modificações precedentes podem ser feitas para fornecer um nível aumentado de atividade de FPPS. Nível diminuído da atividade da esqualeno sintase.

[0068] A enzima esqualeno sintase catalisa uma reação que con verte difosfato de farnesila em esqualeno. Essa etapa é a primeira etapa na via levando o farnesildifosfato ao ergosterol. Sendo assim, pela limitação da ação dessa enzima, FPP é desviado para as vias de produção de terpenóides, por exemplo, terpeno sintases ou GGPP sin- tase e as subseqüentes terpeno sintases.

[0069] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada em questão é geneticamente modificada de forma que o nível de atividade da esqualeno sintase seja diminuído. O nível de atividade da esqualeno sintase na célula hospedeira geneticamente modificada pode ser reduzido em uma variedade de formas, incluindo, mas não limitadas, a 1) reduzir a força promotora do promotor ao qual a região codificadora da esqualeno sintase é operativamente ligada; 2) reduzindo a estabilidade de um mRNA da esqualeno sintase (onde um "mRNA da esqualeno sintase" é um mRNA compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo que codifica uma esqualeno sintase); 3) modificando a seqüência do sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da esqualeno sintase de forma que o nível de tradução do mRNA da es- qualeno sintase seja diminuído; 4) a modificação da seqüência entre o sítio de ligação do ribossomo de um mRNA da esqualeno sintase e um códon de início da esqualeno sintase que codifica a seqüência de forma que o nível de tradução do mRNA da esqualeno sintase seja reduzido; 5) modificando a região intercistrônica inteira 5' do códon de início da região codificadora da esqualeno sintase de forma que a tradução do mRNA da esqualeno sintase seja reduzida; 6) modificação do uso do códon da esqualeno sintase de forma que o nível de tradução do mRNA da esqualeno sintase seja reduzido; 7) reduzindo a estabilidade enzimática da esqualeno sintase; 8) reduzindo a atividade específica (unidades de atividade por unidade de proteína) da esqualeno sintase; ou 9) usando um promotor quimicamente reprimível e reprimindo um promotor quimicamente reprimível pela adição de uma substância química a um meio de crescimento. As modificações precedentes podem ser feitas individualmente ou em combinação; por exemplo, duas ou mais das modificações precedentes podem ser feitas para proporcionar um nível reduzido de atividade da esqualeno sintase.

[0070] Em uma modalidade exemplar, a atividade da esqualeno sintase na S. cerevisiae foi reduzida ou eliminada. Mutantes de levedura ERG9 que são incapazes de converter mevalonato em esqualeno foram produzidos. Ver, por exemplo, Karst et al., (1977) Molec. Gen. Genet. 154: 269 - 277; Patente US No. 5.589.372; e Publicação de Patente US No. 2004/0110257. Modificações genéticas incluem a redução da atividade da esqualeno sintase pelo bloqueio ou redução da produção de esqualeno sintase, redução da atividade da esqualeno sintase ou pela inibição da atividade da esqualeno sintase. O bloqueio ou redução da produção da esqualeno sintase pode incluir a colocação do gene da esqualeno sintase sob o controle de um promotor que requer a presença de um composto indutor no meio de crescimento. Pelo estabelecimento das condições de forma que o indutor fique esgotado do meio, a expressão da esqualeno sintase pode se desligada. Alguns promotores são desligados pela presença de um composto repressor. Por exemplo, os promotores dos genes de levedura CTR3 ou CTR1 podem ser reprimidos pela adição de cobre. O bloqueio ou redução da atividade da esqualeno sintase pode incluir a tecnologia de excisão semelhante àquela descrita na Patente US No. 4.743.546, incorporada aqui por referência. Nessa tentativa, o gene ERG9 é clona- do entre as seqüências genéticas específicas que permitem a excisão controlada específica do gene ERG9 do genoma. A excisão pode ser efetuada por, por exemplo, uma mudança na temperatura de cultivo da cultura, como na Patente US No. 4.743.546, ou por algum outro sinal físico ou nutricional. Tal modificação genética inclui qualquer tipo de modificação e, especificamente, inclui modificações feitas pela tecnologia recombinante e por mutagênese clássica. Inibidores da esquale- no sintase são conhecidos (ver Patente US No. 4.871.721 e a referências citadas na Patente US No.5.475.029) e podem ser adicionados a culturas celulares.

[0071] Em algumas modalidades, o códon de uso de uma seqüên- cia codificadora da esqualeno sintase é modificada de forma que o nível de tradução do mRNA ERG9 é diminuído. A redução do nível de tradução do mRNA da ERG9 pela modificação do códon de uso é conseguida pela modificação da seqüência para incluir códons que são raros ou não comumente usados pela célula hospedeira. Tabelas de códons de uso para muitos organismos são disponíveis que resumem a porcentagem de tempo que um organismo específico usa um códon específico para codificar um aminoácido. Certos códons são usados mais comu- mente que outros, códons "raros". O uso de códons "raros" em uma se- qüência geralmente reduz sua taxa de tradução. Sendo assim, por exemplo, a seqüência codificadora é modificada pela introdução de um ou mais códons raros, os quais afetam a taxa de tradução, mas não a seqüência de aminoácidos da enzima traduzida. Por exemplo, existem 6 códons que codificam a arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG. Na E. coli os códons CGT e CGC são usados de maneira mais comum (codificando aproximadamente 40% das argininas em cada E. Coli) do que o códon AGG (codificando aproximadamente 2% das argininas na E. Coli). A modificação de um códon CGT na seqüência de um gene para um códon AGG poderia não alterar a seqüência da enzima, mas poderia provavelmente diminuir a taxa de tradução do gene. Gerando uma célula hospedeira geneticamente modificada

[0072] Uma célula hospedeira geneticamente modificada em ques tão é gerada usando métodos padronizados bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Em algumas modalidades, um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma variante da enzima da via do mevalonato e/ou um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma seqüência de nucleo- tídeo que codifica um fator de transcrição variante que controla a transcrição de enzima(s) da via do mevalonato é introduzido em uma célula hospedeira e substitui toda ou parte de um gene endógeno, por exemplo, através de recombinação homóloga. Em algumas modalidades, um ácido nucléico heterólogo é introduzido em uma célula hospedeira de origem, e o ácido nucléico heterólogo recombina com um ácido nucléico endógeno e codificando uma enzima da via do mevalona- to, uma preniltransferase, um fator de transcrição que controla a transcrição de uma ou mais enzimas da via do mevalonato, ou uma esqua- leno sintase, modificando dessa forma geneticamente a célula hospedeira de origem. Em algumas modalidades, o ácido nucléico heterólo- go compreende um promotor que tem força promotora aumentada em comparação com o promotor endógeno que controla a transcrição da preniltransferase endógena, e o evento de recombinação resulta na substituição do promotor endógeno com o promotor heterólogo. Em outras modalidades, o ácido nucléico heterólogo compreende uma se- qüência de nucleotídeos que codifica um HMGR truncado que exibe atividade enzimática aumentada em comparação com o HMGR endógeno, e o evento de recombinação resulta na substituição da seqüên- cia codificadora do HMGR endógeno com a seqüência codificadora do HMGR heterólogo. Em algumas modalidades, o ácido nucléico heteró- logo compreende um promotor que fornece para a transcrição regulada de uma seqüência codificadora da esqualeno sintase operativa- mente ligada e o evento de recombinação resulta na substituição do promotor da esqualeno sintase endógeno com o promotor heterólogo. Outras modificações genéticas

[0073] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneti camente modificada compreende uma ou mais modificações genéticas além daquelas discutidas acima. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é ainda geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam uma ou mais de uma preniltransferase (por exemplo, uma preniltransferase diferente de FPP e GPP); uma terpeno sintase; e semelhantes. Códons de uso

[0074] Em algumas modalidades, a seqüência de nucleotídeos que codifica um produto de gene (por exemplo, uma preniltransferase, uma terpeno sintase, etc.) é modificada de forma que a seqüência de nucleotídeos reflete a preferência do códon para a célula hospedeira particular. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeos será, em algumas modalidades, modificada pela preferência de códon de levedura. Ver, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J. Biol. Chem. 257 (6): 3026-3031.

[0075] Conforme notado acima, em algumas modalidades, o có- don de uso de uma seqüência que codifica uma esqualeno sintase é modificada de forma que o nível de tradução do mRNA ERG9 é reduzido. A redução do nível de tradução da mRNA ERG9 pela modificação do códon de uso é conseguida pela modificação da seqüência para incluir códons que são raros ou não comumente usados pela célula hospedeira. Tabelas de códons de uso para muitos organismos são disponíveis que resumem a porcentagem de tempo que um organismo específico usa um códon específico para codificar um aminoácido. Certos códons são usados mais comumente que outros, códons "ra- ros". O uso de códons "raros" em uma seqüência geralmente reduz sua taxa de tradução. Sendo assim, por exemplo, a seqüência codificadora é modificada pela introdução de um ou mais códons raros, os quais afetam a taxa de tradução, mas não a seqüência de aminoáci- dos da enzima traduzida. Por exemplo, existem 6 códons que codificam a arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG. Na E. coli os códons CGT e CGC são usados muito mais freqüentemente (codificando aproximadamente 40% das argininas em cada E. Coli) do que o códon AGG (codificando aproximadamente 2% das argininas na E. Coli). A modificação de um códon CGT na seqüência de um gene para um códon AGG poderia não alterar a seqüência da enzima, mas poderia provavelmente diminuir a taxa de tradução do gene. Fornecimento de acetil-CoA aumentado

[0076] Uma vez que a acetil-CoA é um reagente usado tanto pela acetoacetil-CoA tiolase e pela HMGS na via de MEV, em algumas células hospedeiras, aumentos na reunião intracelular da acetil-CoA poderiam levar a aumentos nos precursores de isoprenóide e de isopre- nóides. Modificações que poderiam aumentar os níveis de acetil-CoA intracelular incluem, mas não estão limitados, a modificações que poderiam diminuir a atividade total da lactato desidrogenase na célula, modificações que poderiam reduzir a atividade total de acetato quinase na célula, modificações que poderiam diminuir a atividade total da álcool desidrogenase na célula, modificações que poderiam interromper o ciclo do ácido tricarboxílico, tais como aquelas que poderiam reduzir a atividade total da 2-cetoglutarato desidrogenase, ou modificações que poderiam interromper a fosforilação oxidativa, tais como aquelas que poderiam reduzir atividade total da (F1F0)H+-ATP sintase, ou su-as combinações. Feniltransferases

[0077] Feniltransferases constituem um grupo amplo de enzimas que catalisam a condensação consecutiva de IPP, resultando na formação de prenildifosfatos de vários comprimentos de cadeia. Prenil- transferases adequadas incluem enzimas que catalisam a condensação do IPP com substratos iniciadores alílicos para formar compostos isoprenóides com de cerca de 5 unidades isoprênicas até cerca de 6000 unidades isoprênicas ou mais, por exemplo, de cerca de 5 unidades isoprênicas até cerca de 10 unidades isoprênicas, de cerca de 10 unidades isoprênicas até cerca de 15 unidades isoprênicas, de cerca de 15 unidades isoprênicas até cerca de 20 unidades isoprênicas, de cerca de 20 unidades isoprênicas até cerca de 25 unidades isoprê- nicas, de cerca de 25 unidades isoprênicas até cerca de 30 unidades isoprênicas, de cerca de 30 unidades isoprênicas até cerca de 40 unidades isoprênicas, de cerca de 40 unidades isoprênicas até cerca de 50 unidades isoprênicas, de cerca de 50 unidades isoprênicas até cerca de 100 unidades isoprênicas, de cerca de 100 unidades isoprênicas até cerca de 250 unidades isoprênicas, de cerca de 250 unidades iso- prênicas até cerca de 500 unidades isoprênicas, de cerca de 500 uni-dades isoprênicas até cerca de 1000 unidades isoprênicas, de cerca de 1000 unidades isoprênicas até cerca de 2000 unidades isoprênicas, de cerca de 2000 unidades isoprênicas até cerca de 3000 unidades isoprênicas, de cerca de 3000 unidades isoprênicas até cerca de 4000 unidades isoprênicas, de cerca de 4000 unidades isoprênicas até cerca de 5000 unidades isoprênicas ou de cerca de 5000 unidades iso- prênicas até cerca de 6000 unidades isoprênicas ou mais.

[0078] Preniltransferases adequadas incluem, mas não estão limi tadas, a difosfato de E-isoprenila sintase, incluindo, mas sem se limitar, a difosfato de geranilgeranila (GGPP) sintase, difosfato de hexa- prenila (HexPP) sintase, difosfato de heptaprenila (HepPP) sintase, difosfato de octaprenila (OPP) sintase, difosfato de solanesila (SPP) sintase, difosfato de decaprenila (DPP) sintase, chiclessintase e gota- perca sintase; e uma difosfato de Z-isoprenila sintase, incluindo, mas sem se limitar, a difosfato de nonaprenila (NPP) sintase, difosfato de undecaprenila (UPP) sintase, difosfato de deidrodoliquila sintase, di- fosfato de eicosaprenila sintase, sintase de borracha natural e outras difosfato de Z-isoprenila sintases.

[0079] As seqüências de nucleotídeos de numerosas preniltransfe- rases de uma variedade de espécies são conhecidas, e podem ser usadas ou modificadas para uso na geração de uma célula hospedeira euca- riótica geneticamente modificada em questão. Seqüências de nucleotí- deos que codificam preniltransferases são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, mRNA da farnesilpirofosfato sintetase humana (N° de Acesso Genbank J05262; Homo sapiens); gene (FPP) da difosfato de farnesila sintetase (No. De Acesso Genbank J05091; Saccharomyces cerevisiae); gene da difosfato de isopentenila:difosfato de dimetilalila isomerase (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang e Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529: 33 - 48; Patente US No. 6.645.747; pirofos- fato de farnesila sintetase 2 da Arabidopsis thaliana (FPS2) / FPP sinte- tase 2 / mRNA da difosfato de farnesila sintase 2 (At4g17190) (No. De Acesso Genbank NM_202836); mRNA (ggpps) da difosfato de geranilge- ranila sintase de Ginkgo biloba (No. De Acesso Genbank AY371321); pirofosfato de geranilgeranila sintase (GGPS1) da Arabidopsis thaliana / GGPP sintetase / mRNA da fernesiltranstransferase (At4g36810) (No. De Acesso Genbank NM_119845); gene da Synechococcus elongatus para a farnesila, geranilgeranila, geranilfarnesila, hexaprenila, heptaprenila, difosfato de heptaprenila sintase (SelF-HepPS) (No. De Acesso Genbank AB016095); etc.

[0080] Em muitas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma preniltransferase. Por exemplo, em muitas modalidades, uma célula hospedeira é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo seqüência de nucleotídeos que codificam uma prenil- transferase selecionada de uma GGPP sintase, uma GFPP sintase, uma HexPP sintase, uma HepPP sintase, uma OPP sintase, uma SPP sintase, uma DPP sintase, uma NPP sintase e uma UPP sintase. Terpeno sintases

[0081] Terpeno sintases catalisam a produção de compostos iso- prenóides através de uma das reações mais complexas conhecidas na química ou na biologia. Em geral, terpeno sintases são enzimas de tamanho moderado com pesos moleculares de cerca de 40 a 100 KD. Como uma enzima, terpeno sintases podem ser classificadas como tendo de taxas de renovação de baixa a moderada acopladas com a especificidade e preservação da quiralidade da reação escolhida. A renovação compreende a ligação do substrato à enzima, o estabelecimento da conformação do substrato, a conversão do substrato no produto e a liberação do produto. As reações podem ser efetuadas in vitro em solventes aquosos, tipicamente necessitam de íons magnésio como cofatores, e os produtos resultantes, os quais são geralmente altamente hidrofóbicos, podem ser recuperados pelo particionamento em um solvente orgânico. A Patente US No. 6.890.752.

[0082] Nessas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é ainda geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma terpeno sintase. Em algumas modalidades, um ácido nucléico com cuja célula hospedeira é geneticamente modificada compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma terpeno sintase que difere na seqüência de aminoácido por um ou mais aminoácidos de uma terpeno sintase de ocorrência natural ou outra terpeno sintase de origem, por exemplo, uma variante da terpeno sintase. Uma "terpeno sintase de origem" é uma terpeno sintase que serve como ponto de referência para comparação. Variantes de terpeno sintases incluem ter- peno sintases de consenso e terpeno sintases híbridas. Em algumas modalidades, o ácido nucléico sintético compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma terpeno sintase de consenso. Em outras modalidades, o ácido nucléico sintético compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma terpeno sintase híbrida.

[0083] Um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucle- otídeos que codifica uma terpeno sintase conhecida pode ser usada. Terpeno sintases adequadas incluem, mas não estão limitadas, a amor- fa-4,11-dieno sintase (ADS), betacariofileno sintase, germacreno A sin- tase, 8-epicedrol sintase, velenceno sintase, (+)-delta cadineno sintase, germacreno C sintase, (E)-beta-farneseno sintase, Casbeno sintase, ve- tispiradieno sintase, 5-epi-aristoloqueno sintase, Aristoloqueno sintase, betacariofileno, alfaumuleno, (E,E)-alfafarneseno sintase, (-)-betapineno sintase, gamaterpineno sintase, limoneno ciclase, linalol sintase, 1,8- cineol sintase, (+)-sabineno sintase, E-alfa-bisaboleno sintase, difosfato de (+)-bornila sintase, levopimaradieno sintase, Abietadieno sintase, iso- pimaradieno sintase, (E)-gamabisaboleno sintase, taxadieno sintase, pi- rofosfato de copalila sintase, caureno sintase, longifoleno sintase, ga- maumuleno sintase, deltaselineno sintase, betafelandreno sintase, limo- neno sintase, mirceno sintase, terpinoleno sintase, (-)-canfeno sintase, (+)-3-careno sintase, difosfato de sin-copalila sintase, alfaterpineol sin- tase, sin-pimara-7,15-dieno sintase, ent-sandaaracopimaradieno sintase, stemer-13-eno sintase, E-beta-ocimeno, S-linalol sintase, geraniol sin- tase, gamaterpineno sintase, linalol sintase, E-beta-ocimeno sintase, epi- cedrol sintase, alfa-zingibereno sintase, guaiadieno sintase, cascariladie- no sintase, cis-muroladieno sintase, afidicolan-16b-ol sintase, elizabeta- trieno sintase, sandalol sintase, patchoulol sintase, zinanol sintase, cedrol sintase, scareol sintase, copalol sintase, manool sintase e semelhantes.

[0084] Seqüências de ácidos nucléicos que codificam terpeno sin- tases são conhecidas na técnica, e qualquer seqüência de nucleotí- deos que codifique uma terpeno sintase pode ser usada para modificar geneticamente uma célula hospedeira. Por exemplo, as seguintes se- qüências de nucleotídeos que codificam uma terpeno sintase, seguidas por seus números de acesso Genbank e os organismos nos quais elas foram identificadas são conhecidos e podem ser usados: mRNA de (-) germacreno D sintase (AY438099, Populus balsamifera subsp. Trichocarpa x Populus deltoids); mRNA de E,E-alfa-farneseno sintase (AY640154; Cucumis sativus); mRNA de 1,8-cineol sintase (AY691947; Arabidopsis thaliana); mRNA de terpeno sintase 5 (TPS5) (AY518314; Zea mays); RNA m de terpeno sintase 4 (TPS4) (AY518312; Zea mays); mRNA de mirceno/omiceno sintase (TPS10) (At2g24210) (NM_127982; Arabidopsis thaliana); mRNA de geraniol sintase (GES) (AY362553; Ocimum basilicum); mRNA da pineno sin- tase (AY237645; Picea sitchensis); mirceno sintase 1e20 mRNA (AY195609; Antirrhinum majus); mRNA da (E)-β-ocimeno sintase (0e23) (AY195607; Antirrhinum majus) mRNA da E-β-ocimeno sintase (AY151086; Antirrhinum majus); mRNA da terpeno sintase (AF497492); Arabidopsis thaliana); mRNA da (-)-camfeno sintase (AG6.5) (U87910; Abies grandis); gene da (-)-4S-limoneno sintase (por exemplo, seqüência genômica) (AF326518; Abies grandis); gene da delta-selineno sintase (AF326513); Abies grandis); mRNA da amorfa- 4,11-dieno sintase (AJ251751; Artemisia annua); mRNA da E-α- bisaboleno sintase (AF006195; Abies grandis); mRNA da gama- umuleno sintase (U92267; Abies grandis); mRNA da δ-selineno sintase (U92266; Abies grandis); mRNA da pineno sintase (AG3.18) (U87909; Abies grandis); mRNA da mirceno sintase (AG2.2) (U87908; Abies grandis); etc.

[0085] Seqüências de aminoácidos das seguintes terpeno sintases são encontradas sob os números de acesso Genbank em parênteses, juntamente com o organismo no qual cada um foi identificado, seguido de cada terpeno sintase: (-)-germacreno D sintase (AAR99061; Populus balsamifera subsp. Trichocarpa x Populus deltoids); D-cadineno sintase (P93665; Gossypium hirsutum); 5-epi-aristoloqueno sintase (Q40577; Nicotiana tabacum); E,E-alfa-farneseno sintase (AAU05951; Cucumis sativus); 1,8-cineol sintase (AAU01970; Arabidopsis thaliana); (R)-limoneno sintase 1 (Q8L5K3; Citrus limon); difosfato de sin-copalil sintase (AAS98158; Oryza sativa); uma taxadieno sintase (Q9FT37; Taxus chinensis; Q93YA3; Taxus bacca/; Q41594; Taxus brevifolia); uma D-cadineno sintase (Q43714; Gossypium arboretum); terpeno sin- tase 5 (AAS88575; Zea mays); terpeno sintase 4 (AAS88573; Zea mays); terpenóide sintase (AAS79352; Vitis vinifera); geraniol sintase (AAR11765; Ocimum basilicum); mirceno sintase 1e20 (AAO41727; Antirrhinum majus); 5-epi-aristoloqueno sintase 37 (AAP05762; Nicoti- ana attenuata); (+)-3-careno sintase (AAO73863; Picea abies); (-)- canfeno sintase (AAB70707; Abies grandis); abietadieno sintase (AAK83563; Abies grandis); amorfa-4,11-dieno sintase (CAB94691; Artemisia annua); tricodieno sintase (AAC49957; Myrothecium rori- dum); gama-umuleno sintase (AAC05728; Abies grandis); δ-selineno sintase (AAC05727; Abies grandis); etc. Ácidos nucléicos, vetores, promotores.

[0086] Para gerar uma célula hospedeira geneticamente modifica da, um ou mais ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nu- cleotídeos codificando um ou mais produtos de gene é introduzido es- tavelmente ou transientemente em uma célula hospedeira, usando técnicas estabelecidas, incluindo, mas sem se limitar, a eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrana, transfecção mediada por lipossoma, choque de calor na presença de acetato de lítio e semelhantes. Para a transformação estável, um ácido nucléico irá geralmente incluir ainda um marcador selecioná- vel, por exemplo, qualquer um de vários marcadores selecionáveis bem conhecidos tais como o de resistência a neomicina, resistência à ampicilina, resistência à tetraciclina, resistência ao cloranfenicol, resistência à canamicina e semelhantes.

[0087] Em muitas modalidades, o ácido nucléico com o qual a célu la hospedeira é geneticamente modificada é um vetor de expressão que inclui um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotí- deos que codificam, um produto de gene, por exemplo, uma enzima da via do mevalonato, um fator de transcrição, uma preniltransferase, uma terpeno sintase, etc. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados, aos vetores de baculovírus, vetores bacteriófagos, plasmídeos, fagemidas, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, vetores virais (por exemplo, vetores virais baseados no vírus da vacina, poliovírus, adenovírus, vírus adenoassociado, SV40, vírus de herpes simplex e semelhantes), cromossomos artificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros específicos de interesse (tais como leveduras). Sendo assim, por exemplo, um ácido nucléico que codifica um(uns) produto(s) de gene é incluído em qualquer um de uma variedade de vetores de expressão para expressar o(s) produto(s) de gene(s). Tais vetores incluem seqüências de DNA sintéticas, cromossomais e não-cromossomais.

[0088] Vários vetores de expressão adequados são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, e muitos são comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado até logo que ele seja compatível com a célula hospedeira.

[0089] A seqüência de nucleotídeos no vetor de expressão é ope rativamente ligada a uma(s) seqüência(s) de vetor(es) de expressão (promotor) para direcionar a síntese do produto genético codificado. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de uma variedade de elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de expressão, terminadores de transcrição, etc. podem ser usados no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153: 516 - 544).

[0090] Exemplos não-limitantes de promotores eucarióticos ade quados (promotores que são funcionais em células eucarióticas) incluem o antigo imediato CMV, HSV timidina quinase, SV40 cedo e tardio, LTRs de retrovírus e metalotioneína-I de camundongo. A seleção do vetor e do promotor apropriado está bem dentro do nível do normal versado na técnica. O vetor de expressão pode também conter um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação da tradução e um termi- nador de transcrição. O vetor de expressão também pode incluir se- qüências apropriadas para amplificar a expressão.

[0091] Além disso, os vetores de expressão, em muitas modalida des, conterão um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer um traço fenotípico para a seleção das células hospedeiras transformadas tais como a diidrofolato redutase ou a resistência à ne- omicina para cultura de células eucarióticas.

[0092] Geralmente, vetores de expressão recombinantes irão in cluir origens de replicação e marcadores selecionáveis permitindo a transformação da célula hospedeira, por exemplo, o gene TRP1 da S. cerevisiae, etc.; e um promotor derivado de um gene altamente expresso para direcionar a transcrição da seqüência do gene que codifica o produto. Tais promotores podem ser derivados a partir de ope- rons que codificam enzimas glicolíticas tais como a 3-fosfoglicerato quinase (PGK), fator α, fosfatase ácida ou proteínas de choque de calor, dentre outros.

[0093] Em muitas modalidades, uma célula hospedeira genetica mente modificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico que inclui uma seqüência de nucleotídeo que codifica um produto de gene, onde a seqüência de nucleotídeo que codifica o produto de gene é operativamente ligada a um promotor induzível. Promotores induzí- veis são bem conhecidos na técnica. Promotores induzíveis adequados incluem, mas não estão limitados a, o pL do bacteriófago X; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor de isopropil-beta- D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)-induzível, por exemplo, um promotor lacZ; um promotor tetraciclina-induzível; um promotor induzível por arabinose, por exemplo, PBAD (ver, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 4121 - 4130); um promotor induzível por xilo- se, por exemplo, Pxyl (vide, por exemplo, Kim et al. (1996) Gene 181: 71 - 76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor indu- zível por metanol, um promotor induzível por etanol; um promotor in- duzível por rafinose; um promotor induzível por calor, por exemplo, um promotor PL lambda induzível por calor, um promotor controlado por um repressor sensível a calor (por exemplo, vetores de expressão baseados em lamba reprimidos por CI857; ver, por exemplo, Hoffman et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177 (2): 327 - 34); e semelhantes.

[0094] Em muitas modalidades, uma célula hospedeira genetica mente modificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico que inclui uma seqüência de nucleotídeo que codifica um produto de gene, onde a seqüência de nucleotídeo que codifica o produto de gene é operativamente ligada a um promotor constitutivo. Em leveduras, uma variedade de vetores contendo promotores constitutivos ou indu- zíveis pode ser usada. Para uma revisão vide, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Associ. & Wiley Interscience, Cap. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press. N. Y., Vol. 153, pág. 516 - 544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C., Cap. 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y., Vol. 152, pág. 673 - 684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II. Um promotor de levedura constitutivo tal como ADH ou LEU2 ou um promotor induzível tal como GAL pode ser usado (Cloning in Yeast, Cap. 3, R. Rothstein in: DNA cloning Vol. 11, A Pratical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D. C.). Alternativamente, vetores podem ser usados os quais promovam a integração de seqüências de DNA estranhas no cromossomo de levedura. Composições compreendendo uma célula hospedeira eucariótica ge-neticamente modificada em questão

[0095] A presente invenção fornece ainda composições compre endendo uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada em questão. Uma composição em questão compreende uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada em questão, e irá, em algumas modalidades, compreender um ou mais componentes adicionais, cujos componentes são selecionados baseando-se em parte no uso pretendido da célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada. Componentes adequados incluem, mas não estão limitados, a sais; tampões; estabilizantes; agentes inibidores da protease; compostos conservantes da parede celular e/ou da membrana celular, por exemplo, glicerol, dimetilsulfóxido, etc.; meio nutricional apropriado para a célula; e semelhantes. MÉTODOS PARA PRODUZIR COMPOSTOS ISOPRENÓIDES

[0096] A presente invenção proporciona métodos de produzir um composto precursor de isoprenóide ou isoprenóide. Os métodos ge- ralmente envolvem o cultivo de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão em um meio adequado.

[0097] Compostos precursores de isoprenóides que podem ser produzidos usando um método em questão incluem um composto di- fosfato de isoprenila. Compostos isoprenóides que podem ser produzidos usando o método da invenção incluem, mas não estão limitados, a monoterpenos, incluindo mas sem se limitar ao limoneno, citranelol, geraniol, mentol, álcool perílico, linalool, tujona; sesquiterpenos, incluindo mas sem se limitar a periplanona B, gingcolida B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, notcatona, epicedrol, epia- ristoloqueno, farnesol, gossipol, sanonina, periplanona e forscolina; diterpenos, incluindo mas sem se limitar a casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina e pseudopterosina; e triterpenos, incluindo mas sem se limitar a arbrusideE, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados, a carotenóides tais como o licopeno, α- e β-caroteno, α- e β - criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina e luteína. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados, a triterpenos, compostos esteróides e compostos que são compostos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como terpenoalcalóides misturados, e coenzima Q-10.

[0098] Em algumas modalidades, o método em questão compre ende ainda o isolamento do composto isoprenóide da célula e/ou do meio de cultura.

[0099] Em geral, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é cultivada em um meio adequado (por exemplo, caldo Lu- ria-Bertoni, opcionalmente suplementado com um ou mais agentes adicionais, tais como um indutor (por exemplo, onde uma ou mais seqüên- cias de nucleotídeos que codificam um produto de gene está sob o controle de um promotor induzível), etc.). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão é cultivada em um meio adequado; e o meio de cultura é revestido com um solvente orgânico, por exemplo, dodecano, formando uma camada orgânica. O composto isoprenóide produzido pela célula hospedeira geneticamente modificada é particionado na camada orgânica, da qual ele pode ser purificado. Em algumas modalidades, onde uma ou mais seqüências de nucleotídeos que codificam um produto de gene está operavelmente ligada a um promotor induzível, um indutor é adicionado ao meio de cultura; e, depois de um tempo adequado, o composto isoprenóide é isolado da camada orgânica revestida no meio de cultura.

[00100] Em algumas modalidades, o composto isoprenóide será separado dos outros produtos, os quais podem estar presentes na camada orgânica. A separação do composto isoprenóide de outros produtos que podem estar presentes na camada orgânica é prontamente conseguido usando, por exemplo, técnicas cromatográficas padronizadas.

[00101] Em algumas modalidades, o composto isoprenóide é puro, por exemplo, pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50% puro, pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro ou mais de 98% puro, onde "puro" no contexto de um composto isopre- nóide, refere-se a um composto isoprenóide que é livre de outros compostos isoprenóides, contaminantes, etc. EXEMPLOS

[00102] Os seguintes exemplos são publicados de forma a fornecer aos normalmente versados na técnica com uma completa descoberta e descrição de como fazer e usar a presente invenção, e não são pretendidos para limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção nem são eles pretendidos para representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos efetuados. Es- forços foram feitos pra assegurar exatidão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais devem ser considerados. A não ser que seja de outra maneira indicado, partes são partes por peso, peso molecular é o peso molecular de média de peso, temperatura é em graus Celsius e pressão é na ou próxima da atmosférica. Abreviações padronizadas podem ser usadas, por exemplo, pb, par(es) de base; kb, quilobase(s); pL. picolitro(s); s ou seg, segundo(s); min, minuto(s); h ou hr, hora(s); aa, aminoácido(s); Kb, quilobase(s); pb, par(es) de base; nt, nucleotí- deo(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea(mente); e assim por diante. Exemplo 1: Produção de altos níveis de um composto isoprenóide em uma célula de levedura geneticamente modificada. MATERIAIS E MÉTODOS

[00103] Produtos químicos. Dodecano e cariofileno foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Ácido 5-fluorórtico (5-FOA) foi comprado da Zymo Research (Orange, CA). Misturas de Suplementos Completas para formulação de meio definido sintético foram adquiridos da Qbio- gene (Irvine, CA). Todos os outros componentes do meio foram adquiridos ou da Sigma-Aldrich ou da Becton, Dickinson (Franklin Lakes, NJ).

[00104] Cepas e meio: Cepas de Escherichia coli DH10B e DH5a foram usadas para a transformação bacteriana e amplificação de plasmídeo na construção dos plasmídeos de expressão usados nesse estudo. As cepas foram cultivadas a 37 °C em meio Luria-Bertani com 100 mg litro-1 de ampicilina com a exceção dos plasmídeos baseados em pδ-UB os quais foram cultivados com 50 mg litro-1 de ampicilina.

[00105] A cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 (Baker Brachmann et al. (1998) Yeast 14 (2): 115 - 132), um derivado da S288C, foi usada como a cepa de origem para todas as cepas de levedura. Essa cepa cresceu em meio YPD rico. Burke et al., Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor laboratory course manual, 2000, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cepas de levedura projetadas cresceram em meio definido sintético (SD) Burke et al. (2000) acima) com leucina, uracil, histidina e/ou metionina desligados onde apropriado. Para a indução dos genes expressos do promotor GAL1, cepas de S. Cerevisiae cresceram em 2% de galactose como a única fonte de carbono.

[00106] Construção de plasmídeo. Para criar o plasmídeo pRS425ADS para a expressão de ADS com o promotor GAL1, ADS foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir de pADS (Martin et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): p. 796-802) usando o par de iniciadores ADS-SpeI-F/ADS-HindIII-R (Tabela 1). Usando esses iniciadores, a seqüência de nucleotídeo 5'-AAAACA-3' foi clona- da imediatamente à montante do códon de início da ADS. Essa se- qüência de consenso foi usada para a tradução eficiente (Looman et al. (1993) Nucleic Acids Research. 21 (18): 4268 - 71; Yun et al. (1996) Molecular Microbiol. 19 (6):1225 - 39) de ADS e os outros genes indu- zíveis por galactose usados nesse estudo. O produto amplificado foi clivado com SpeI e HinIII e clonado em SpeI e HinIII digerido pRS425GAL1 (Mumberg et al. (1995) Gene 156(1): 119 - 122). Tabela 1

[00107] Sítios de restrição são sublinhados e o negrito indica um códon de início ou parada.

[00108] Para a expressão do tHMGR, o plasmídeo pRS-HMGR foi construído. Primeiro os sítios de restrição SacII foram intoduzidos no pRS426GAL1 (Mumberg et al. (1995) Gene 156(1):119 - 122) no terminal 5' do promotor GAL1 e 3' do terminador CYC1. O promotor-sítio múltiplo de clonagem-cassete de terminação da pRS426GAL1 foi amplificado por PCR usando o par de iniciador pRS42X-PvuIISacII- F/pRS42X-PvuIISacII-R (Tabela 1). O produto amplificado foi clonado diretamente no PvuII digerido pRS426GAL1 para o vetor de construção pRS426-SacII. O domínio catalítico do HMG1 foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pRH127-3 (Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63(9): 3341-44) como o par de iniciador HMGR-BamHI- F/HMGR-SaII-R. O produto amplificado foi clivado cm BamHI e SalI e clonado no BamHI e XhoI digerido pRS426-SacII.

[00109] O alelo upc2-1 da UPC2 foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pBD33 usando o par de iniciadores YPC2-BamHI-F/UPC2- SaII-R. O produto amplificado foi clivado com BamHI e SalI e clonado em BamHI e XhoI digerido pRS426-SacII para criar o plasmídeo Prs- upc2. Da mesma forma o gene ECM22 contendo a mutação semelhante a upc2-1 (glicina para aspartato no resíduo 790)foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pBD36 usando o par de iniciadores ECM22-BamHI-F/UPC2-SaII-R. O produto amplificado foi clivado com BamHI e SalI e clonado no BamHI e XhoI digerido pRS426-SacII para criar o plasmídeo pRS-ECM22.

[00110] Um plasmídeo foi construído para a integração do cassete de expressão tHMGR do pRS-HMGR no genoma de levedura utilizando o plasmídeo pδ-UB (Lee et al. (1997) Biotechnol Prog. 13 (4): 368 - 373). pRS-HMGR foi clivado com SacII e o fragmento do cassete de expressão foi extraído com gel e clonado no SacII digerido pδ-UB. Para a integração do upc2-1, pδ-UPC2 foi criado de uma maneira idêntica pela digestão do pRS-UPC2 com SacII e movendo o fragmento apropriado pra pδ-UB.

[00111] Para substituir o promotor ERG9 com o promotor MET3, o plasmídeo pRS-ERG9 foi construído. O plasmídeo pRH973 (Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(44): 31671 - 31678) continha um segmento 5' truncado de ERG9 colocado atrás do promotor MET3. pRH973 foi clivado com ApaI e ClaI e clonado no ApaI e ClaI digerido pRS403 (Sikorski et al. (1989) Genetics, 122 (1): 19 - 27).

[00112] Par a expressão do ERG20, o plasmídeo pRS-ERG20 foi construído. O plasmídeo pRS-SacII foi primeiramente digerido com SalI e XhoI o qual criou terminais coesivos compatíveis. O plasmídeo foi, a seguir, alto-ligado, eliminando os sítios SalI e o XhoI para criar o plasmídeo pRS-SacII-DX. ERG20 foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico da BY4742 usando o par de iniciadores ERG20-SpeI- F/ERG20-SmaI-R. O produto amplificado foi clivado com SpeI e SmaI e clonado no SpeI e no SmaI digerido pRS-SacII-DX. Para a integração do cassete de expressão ERG20, pRS-ERG20 foi clivado com Sa- cII e o fragmento do cassete de expressão foi extraído com gel e clo- nado em SacII digerido pδ-UB.

[00113] Uma descrição dos plasmídeos usados nesse estudo é fornecida na Tabela 2. Tabela 2

[00114] Uma lista de cepas de leveduras usadas nesse estudo, e os genótipos relevantes das cepas é fornecida na Tabela 3. Tabela 3

[00115] Transformação de levedura e construção de cepa. A cepa de S. cerevisiae BY4742 (Carrie Baker Brachmann et al (1988) "Yeast" 14(2): 115 - 132), um derivado da S288C foi usado como a cepa de origem para todas as cepas de S. cerevisiae. A transformação de todas as cepas de S. Cerevisiae foi efetuada pelo método de acetato de lítio padrão (Gietz et al. (2002) Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B., Academic Press Inc: São Diego. 87 - 96). De três a dez colônias de cada transformação foram varridas para a seleção do transformante produtor de amorfadieno maior. A cepa EPY201 foi construída pela transformação da cepa BY4742 com o plasmídeo pRS425ADS e a seleção nas placas de SD-LEU. As cepas EPY203, EPY204, EPY205 e EPY206 foram construídas pela transformação da cepa EPY201 com os plasmídeos pRS-HMGR, pRS-UPC2, pRS- ECM22 e pRS-ERG20, respectivamente. Transformantes foram selecionados nas placas SD-LEU-URA. O plasmídeo pδ-HMGR foi digerido com XhoI antes da transformação do DNA na cepa EPY201 para a construção do EPY207. A cepa EPY207 foi cultivada e plaqueada em placas SD-LEU incluindo a seleção de 1g/L de 5-FOA da perda do marcador URA3. O auxotrófico de uracil resultante foi, a seguir, transformado com o plasmídeo de DNA XhoI digerido pδ-UPC2 para a construção do EPY209, o qual foi selecionado em placas SD-LEU- URA. O plasmídeo pRS-ERG9 foi clivado com HindII para a integração da fusão PMET3-ERG9 no local ERG9 da EPY209 para a construção do EPY212. Essa cepa foi selecionada para em placas SD-LEU-URA- HIS-MET. EPY212 foi cultivado e plaqueado em placas SD-LEU-HIS- MET contendo 5-FOA para a seleção da perda do marcador URA3. O auxotrófico de uracil resultante foi, a seguir, transformado com DNA de plasmídeo pδ-ERG20 para a construção do EPY214, o qual foi selecionado nas placas SD-LEU-URA-HIS-MET.

[00116] Cultivo de leveduras. Para o curso de tempo os experimen- tos para a medida da produção de amorfadieno, tubos de cultura contendo 5 mL de meio SD (2% de galactose) (com omissões de aminoá- cidos apropriadas conforme acima descrito) foram inoculados com as cepas de interesse. Esses inóculos cresceram a 30 °C até uma densidade ótica a 600 nm (OD600) de aproximadamente 1,250 mL de frascos com chicana contendo 50 mL de meio SD foram inoculados até uma OD600 0,05 com essas culturas de semeadura. A Figura 4 representa o crescimento de cepas em SD-URA-LEU-HIS com metionina no nível indicado. Meio para as cepas apresentadas na Figura 5 continham SD- URA suplementado com metionina até uma concentração final de 1 mM. Todos os outros experimentos de produção usaram SD-URA ou SD-URA-LEU onde apropriado.

[00117] Todos os frascos também continham 5 mL de dodecano. Essa camada de dodecano foi amostrada e diluída em acetato de etila para a determinação da produção de amorfadieno por GC-MS.

[00118] Análise de GC-MS de amorfadieno. A produção de amorfa- dieno pelas várias cepas foi medida por GC-MS conforme anteriormente descrito (Martin et al. (2001) Biotechnology and Bioengineering, 75 (5): 497 - 503) pela varredura somente para dois íons, o íon molecular (204 m/z) e o íon 189 m/z. Concentrações de amorfadieno foram convertidas em equivalentes de cariofileno usando uma curva padrão de cariofileno e a abundância relativa dos íons 189 e 204 m/z para os seus íons totais. RESULTADOS

[00119] Para maximizar a produção de amorfadieno, uma tentativa etapa a etapa foi tomada com a integração sucessiva dos constructos no genoma da S. cerevisiae.

[00120] Produção de amorfadieno. Uma célula hospedeira plataforma, S. cerevisiae, foi projetada para uma produção de alto nível de isoprenóides. S. Cerevisiae direciona toda a sua produção de isopre- nóides através da difosfato de isopentenila (IPP) e a maioria desse, conseqüentemente, através da difosfato de farnesila (FPP). Os níveis de IPP e de FPP foram aumentados na cepa hospedeira. IPP e FPP são metabolisados para uma variedade de produtos naturais. Ao invés de medir os níveis de FPP, o nível de amorfadieno, um produto direto de FPP que não será metabolisado ou degradado durante o tempo do curso do crescimento, foi medido. Amorfadieno sintase (ADS) foi expresso em S. cerevisiae para a ciclização enzimática do FPP para o sesquiterpeno amorfadieno. Amorfadieno também é prontamente quantificado por GCMS.

[00121] ADS foi expresso no plasmídeo de 2 mícrons pRS425ADS sob o controle induzível do promotor GAL1. Culturas de S. Cerevisiae cresceram por seis dias em galactose para a expressão do ADS, e os níveis de amorfadieno foram medidos a cada 24 horas. S. cerevisiae modificada somente pela introdução de pRS425ADS alcançou uma produção máxima de amorfadieno de 4,6 μg de amorfadieno mL-1 depois de quatro dias (Figura 3A).

[00122] Experimentos de controle anteriores consistindo em meio adicionado com amorfadieno puro mostrou a rápida perda de sesqui- terpeno da fase líquida. Uma camada de dodecano equivalente a 10% do volume do meio foi adicionada a cada frasco de agitação para se- qüestrar o amorfadieno da cultura. A adição dessa camada orgânica assegura a medida precisa da quantidade total de amorfadieno produzida pela prevenção da perda para o ar. A volatilização do amorfadie- no é um problema particular durante períodos de tempo prolongados de vários dias como aqueles usados nesse estudo.

[00123] Superexpressão da HMG-CoA-redutase. A importância médica da biossíntese do colesterol e da facilidade experimental de análise na S. cerevisiae fez disso um organismo ideal para o estudo da regulação da via do mevalonato durante as décadas passadas (Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267 (1): 473 - 477; Dimster-Denk et al. (1999) J. Lipid Res., 40 (5): 850 - 860).

[00124] Esses estudos elucidaram um sistema complexo de regulação, com 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMGR) como o principal ponto de controle regulatório da via. Duas isozimas de HMGR, Hmg1p e Hmg2p, estão presentes em leveduras, com Hmg1p sendo a mais estável das duas (Hampton et al. (1996) Trends in Biochemical Sciences, 21 (4): 140 - 145). Hmg1p é uma proteína de ligação de membrana integral contendo uma região N-terminal responsável por ancorar a proteína à membrana ER (Liscum et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 (1): 522 - 530). Para a expressão de uma forma solúvel da enzima (Donald et al. (1997) Appl. Enciron. Microbiol. 63(9): 3341 - 44) removeu o N-terminal ligado à membrana da Hmg1p e expressou somente o domínio catalítico. Em nosso estudo, essa forma truncada de HMGR (tHMGR) em um plasmídeo de 2 mícrons foi expressa sob o controle do promotor GAL1. Quando expresso juntamente com ADS, S. cerevisiae alcançou uma produção máxima de 11,2 μg de amorfadi- eno mL-1 depois de quatro dias (Figura 3A).

[00125] Superexpressão de fatores de transcrição envolvidos com esterol. Em outra tentativa de aumentar o amorfadieno, dois fatores de transcrição de S. cerevisiae anteriormente identificados para a sua importância na regulação da biossíntese de esterol foram usados. Upc2-i de mutantes da S. Cerevisiae foram originalmente identificados por sua única capacidade de captação de esteróis sob condições aeróbicas (Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2): 93 - 106). Outra caracterização mostrou que esses mutantes tinham capacidade de síntese de esteróis melhorada (Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2): 93 - 106. A mutação responsável por essas características é uma única transição de guanina para adenina no gene UPC2; essa mutação pontual resulta em uma alteração de resíduo de glicina para aspartato no aminoácido 888 próximo do terminal carbó- xi (Crowley et al. (1998). J. Bacteriol., 180 (16): 4177 - 83). Um homólogo desse gene, EMC22, foi posteriormente identificado com 45% de identidade de seqüência de aminoácidos (Shianna et al. (2001) J. Bac- teriol., 183 (3): 830 - 834). 36 aminoácidos são completamente conservados entre UPC2 e ECM22 no local da mutação pontual upc2-1. (Shi- anna Et Al. (2001) J. Bacteriol., 183 (3): 830 - 834). A mutação pontual upc2-1 foi introduzida no alelo ECM22 de tipo selvagem resultando em uma cepa com um fenótipo similar àquele do mutante upc2-1 (Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183 (3): 830 - 834).

[00126] Vik e Rine identificaram ERG2 e ERG3 como alvos para a regulação de gene por Ecm22p e Upc2p. Um elemento regulatório de esterol de 7 pares de base foi identificado como o local de ligação necessário para esses fatores de transcrição. Esse elemento de seqüên- cia de 7 pares de base é encontrado nos promotores de muitos outros genes da via do esterol incluindo ERG8, ERG12 e ERG13 (Vik et al. (2001) Mol. Cell. Biol., 21 (19): 6395 - 6405.). Esses produtos enzimá- ticos para cada um desses três genes estão envolvidos na síntese de isoprenóides à montante do FPP (vide Figura 1).

[00127] Foi feita a hipótese que a coexpressão dos alelos mutantes para UPC22 e ECM22 com ADS poderia aumentar a produção de amorfadieno pelo aumento do fluxo metabólico através da via do me- valonato. Os alelos mutantes upc2-1 da UPC2 e ECM22 foram, cada um, expressos sob o controle do promotor GAL1 em um plasmídeo de 2 mícrons em uma cepa já abrigando o pRS425ADS. A produção de amorfadieno absoluta nas culturas aumentou somente minimamente para a expressão de UPC2 e ECM22, parte por causa da densidade celular diminuída. Entretanto, a produção normalizada para a densidade celular aumentou 76% e 53% para a expressão do UPC2 e ECM22, respectivamente (Figura 3B).

[00128] Esse aumento relativamente pequeno na produção de amorfadieno comparado com a superexpressão de tHMGR suporta o fato de que a atividade de HMGR é o maior obstáculo limitante da via do mevalonato. Mesmo expressão em alto nível do ERG8, ERG 12 e ERG13 é improvável de aumentar grandemente o fluxo através da via se o HMGR permanecer no nível de expressão basal. A densidade celular reduzida observada para a superexpressão do UPC2 e ECM22 é improvável devido ao fluxo aumentado através da via do mevalonato para o FPÁG. Isso é, ao contrário, provavelmente causado por uma alteração desfavorável na regulação transcricional para um ou outros múltiplos genes controlados pela UPC2 e ECM22.

[00129] Coexpressão de tHMGR e upc2-1. A superexpressão do tHMGR e do upc-2 cada um, aumentou o rendimento final do amorfa- dieno nas culturas celulares. Para testar a possibilidade de um efeito sinergístico da superexpressão desses genes juntos, os cassetes de expressão foram integrados seqüencialmente no genoma da S. cerevi- siae. O plasmídeo pδ-UB (Lee et al. (1997) Biotechnol Prog., 13 (4): 368 - 373) foi usado para a construção dos plasmídeos de integração. Esse plasmídeo contém um cassete Blaster URA3 permitindo a reciclagem do marcador URA3. Adicionalmente, ele integra na seqüência δ (encontrada nas repetições do longo terminal dos sítios de Ty- transposon) de cujos existiram aproximadamente 425 dispersos através do genoma (Dujon (1996) Trends in Genetics, 12 (7): 263 - 270).

[00130] tHMGR foi integrado no cromossomo de uma cepa abrigando pRS425ADS usando pδ-HMGR. O nível de produção de amor- fadieno de 13,8 μg de amorfadieno mL-1 foi comparável na cepa com a cepa EP203 a qual continha tHMGR em um plasmídeo de alta cópia (Figura 5). Depois de reciclar o marcador URA3 pelo plaqueamento no 5-FOA, upc2-1 foi integrado no cromossomo usando o plasmídeo pδ- UPC2. Os efeitos da superexpressão do tHMGR e upc2-1combinados para elevar a produção de amorfadieno até 16,2 μg de amorfadieno. mL-1 (Figura 5). Embora a expressão de upc2-1 juntamente com tHMGR elevou a produção de amorfadieno absoluta em 17%, esse aumento é somente comparável com aquele visto quando o upc2-1 é expresso somente com o ADS. Com a remoção do impedimento do HMGR, é esperado um impacto mais significativo da expressão da upc2-1. Aumentos potenciais na produção de amorfadieno devem ser prevenidos devido ao curso do FPP para outros metabólitos.

[00131] Infra-regulação da esqualeno sintase. Os aumentos observados na produção de amorfadieno sugeriram uma reunião de precursor de FPP aumentada. FPP é central à síntese de uma variedade de compostos de S. Cerevisiae incluindo esteróis, dolicóis e poliprenóis, e proteínas preniladas. Embora o fluxo aumentado através da via do mevalonato levou a uma produção aumentada de amorfadieno, uma variedade de outras enzimas também competiram para a reunião aumentada de FPP, mais importantemente a esqualeno sintase codificada pela ERG9. A síntese de esqualeno é o ponto de ramificação do FPP levando ao ergosterol. Em uma cepa expressando o domínio catalítico do HMGR e contendo uma anulação de ERG9, foi observado que o FPP acumulou (Song (2003) Analytical Biochemistry, 317 (2): 180 - 185). Com o objetivo de direcionar o FPP para fora da produção de esterol e para a produção de amorfadieno, a redução na atividade da esqualeno sintase poderia ser útil. Entretanto, uma anulação de ERG9 é letal sem a suplementação exógena de esteróis.

[00132] Empregando uma estratégia alternativa, ERG9 foi infra- regulado transcricionalmente pela substituição de seu promotor natural com um promotor reprimível de metionina, PMET3 (Cherest et al. (1985) Gene, 34 (2 - 3): 269 - 281). Gardner et al. Anteriormente utilizou tal constructo de fusão PMET3-ERG9 para o estudo dos sinais de degradação de HMGR (Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(44): 31671 - 31678; Gardner et al. (2001) J. Biol. Chem., 276 (12): 8681 - 8694). O plasmídeo pRS-ERG9 foi construído para utilizar a mesma estratégia que Gardner na substituição do promotor natural ERG9 com o promotor MET3. A utilidade da fusão PMET3-ERG9 é sublinhada pelo controle re- gulatório cerrado entre 0 e 100 μM das concentrações extracelulares de metionina (Mao et al. (2002) Current Microbiology, 45 (1): 37 - 40). Na presença das concentrações extracelulares de metionina, a expressão do promotor MET3 é muito baixa. Depois da integração do pRS-ERG9 no local ERG9, nós poderiam-se adaptar a expressão da esqualeno sin- tase baseando-se na suplementação de metionina ao meio.

[00133] pRS-ERG9 foi integrado na cepa EPY209, e a produção de amorfadieno foi medida com uma faixa de 0 a 1 mM de metionina no meio. Os pontos de tempo 64 e 87 horas depois da inoculação são apresentados (Figura 4). Os dados sugerem que uma expressão mínima de ERG9 (concentrações de metionina acima de 0,5 mM) maximizam a produção de amorfadieno. Conforme as culturas de S. cerevi- siae aumentam a densidade celular e metabolisam os nutrientes no meio, a concentração de metionina da mesma forma cai, explicando porque as culturas fornecidas com 0,1 mM de metionina no meio têm rendimentos mais baixos de amorfadieno. 1 mM de metionina foi selecionado para experimentos futuros para assegurar as altas concentrações extracelulares por todo os cursos de período prolongado.

[00134] A cepa EPY212 contendo uma cópia integrada de tHMGR e upc2-1, assim como um alelo de ERG9 reprimível por metionina cresceu em cultura e a produção de amorfadieno foi medida durante seis dias (Figura 5). A limitação do FPP incorporado no esqualeno teve um grande impacto na produção de amorfadieno, aumentando-a de quatro vezes até 61 μg de amorfadieno mL-1 na cepa EPY209 contendo o ale- lo do tipo selvagem ERG9. Embora limitado na sua capacidade de produzir ergosterol, EPY212 ainda cresceu até uma OD final de ~ 75% daquela de EPY209.

[00135] Superexpressão da FPP sintase. A FPP sintase (FPPS), codificada pela ERG20, foi alvejada como um próximo alvo para a superex- pressão na expectativa de ainda aumentar os rendimentos de sesquiter- peno. Um aumento de seis vezes na atividade de FPPS foi correlacionado com um aumento de 80% e de 32% no dolicol e no ergosterol, respectivamente (Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267 (1): 473 - 477). Similar aos estudos que supe- rexpressam o HMGR e o upc2-1, ERG20 foi primeiramente clonado atrás do promotor GAL1 em um plasmídeo de alta cópia para criar o pRS- ERG20. A coexpressão do ERG20 nesse plasmídeo com pRS425ADS de fato reduziu a produtividade absoluta do amorfadieno em 60%. É possível que um aumento na atividade de FPPS aumentou somente o conteúdo de outros produtos derivados de FPP tais como ergosterol. Outra possibilidade é que a superexpressão de FPPS aumentou a concentração intracelular de FPP - o principal sinal para a degradação de HMGR (Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (44): 31671 - 31678). Sem a superexpressão de uma forma desregulada da redutase, as concentrações aumentadas de FPP poderiam agir para limitar o fluxo através da via do mevalonato e diminuir a produção de amorfadieno.

[00136] pδ-ERG20 foi, a seguir, construído para a integração e ex pressão do ERG20 no nosso produtor de amorfadieno mais alto. O marcador URA3 foi reciclado, e pδ-ERG20 integrado no cromossomo para criar a cepa EPY212. Essa cepa superexpressando o FPPS, ainda aumentou a produção de amorfadieno até 73 μg de amorfadieno mL-1 (Figura 5). Inicialmente foi visto um decréscimo de 60% na produção de amorfadieno na cepa EPY206 superexpressando o ERG20 com ADS. Entretanto, agora em uma cepa expressando o tHMGR e o upc2-1 e com uma esqualeno sintase regulada, a produção de amor- fadieno aumentou em 20% com a superexpressão de ERG20.

[00137] Nas cepas EPY206 e EPY212 cada uma expressando o ERG20, um decréscimo na densidade celular foi observado. Esse decréscimo no crescimento celular pode ser explicado por uma toxicidade causada diretamente pelo ERG20p. Alternativamente, um efeito poderia aparecer de um acúmulo ou depleção de um intermediário de uma via devido ao fluxo modificado através da FPP sintase.

[00138] Enquanto a presente invenção foi descrita com referência às suas modalidades específicas, deve ser entendido pelos indivíduos versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem sair do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular, composição do assunto, processo, etapa ou etapas do processo, para o objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas as tais modificações pretendem estar dentro do escopo das reivindicações a isto associadas.

Claims

1. Célula hospedeira de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que produz um isopre- noide ou um composto precursor isoprenoide através da via do meva- lonato, a célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada compreendendo: (a) um ácido nucleico heterólogo, integrado no cromossomo da célula hospedeira, codificando uma 3-hidroxi-3-metilglutaril- coenzima-A truncada (HMG-CoA) redutase (HMGR), em que o ácido nucleico heterólogo que codifica a HMGR truncada compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou sequências nucleotídicas degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; (b) um ácido nucleico heterólogo, integrado no cromossomo da célula hospedeira, codificando uma farnesil difosfato (FPP) sintase; (c) um ácido nucleico heterólogo, integrado no cromossomo da célula hospedeira, em que o ácido nucleico heterólogo compreende um promotor repressível heterólogo, cujo promotor heterólogo substitui um promotor endógeno operacionalmente ligado a uma sequência nu- cleotídica endógena que codifica esqualeno sintetase, em que o promotor repressível heterólogo fornece um nível reduzido de esqualeno sintase comparado a uma célula hospedeira controle; e (d) um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica amorfa-4,11-dieno sintase, em que as modificações genéticas proporcionam a produção de amorpha-4,11-dieno em um nível que é pelo menos cerca de 50% superior ao nível de amorpha-4,11-dieno em uma célula controle que não compreende as modificações genéticas.

2. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a expressão da HMGR truncada está sob o controle de um promotor heterólogo que aumentou a força do promotor em comparação com o promotor endógeno que controla a transcrição da HMGR endógena.

3. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a expressão da HMGR truncada está sob o controle de um promotor GAL1.

4. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a expressão de FPP sintase está sob o controle de um promotor heterólogo que aumentou a força do promotor em comparação com o promotor endógeno que controla a transcrição de FPP sintase endógena.

5. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a expressão da FPP sintase está sob o controle de um promotor GAL1.

6. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o promotor repressí- vel é um promotor repressível com metionina.

7. Método para aumentar a produção de amorfa-4,11-dieno através da via do mevalonato em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada, como definida em qualquer umas das reivindicações 1 a 6, em um meio adequado e sob condições que promovem a produção de amorfa-4,11-dieno, em que amor- fa-4,11-dieno é produzido em um nível que é pelo menos 50% mais alto do que o nível de amorfa-4,11-dieno em uma célula controle não compreendendo as modificações genéticas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem a inclusão no meio de cultura de um agente indutor que ativa um promotor indutível.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula hospedeira geneticamente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dentre um sal, um tampão, um estabilizador, um agente inibidor de protease, um composto de preservação da membrana celular e um meio nutricional.