JP2008507974A - イソプレノイド化合物を生産するための遺伝的に修飾された宿主細胞および同宿主細胞の使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イソプレノイド化合物の生産、および特にイソプレノイド化合物を生産するように遺伝的に修飾された宿主細胞の分野に関する。
本出願は、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる、2004年7月27日に出願された米国仮特許出願第60/592,009号の恩典を主張する。
イソプレノイドは、共通の生合成起源、すなわち1つの代謝前駆体であるイソペンテニル二リン酸(IPP)を有する、極めて多種多様な一群の天然産物を含む。イソプレノイド化合物は、「テルペン」または「テルペノイド」とも呼ばれる。40,000を上回る種類のイソプレノイドの存在が明らかにされている。定義上、イソプレノイドは、いわゆるイソプレン(C5)単位から作られる。イソプレノイド中に存在するC原子の数は、不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されているが、典型的には5で割り切れる数(C5、C10、C15、C20、C25、C30、およびC40)である。イソプレノイドの重要な成員は、カロテノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、およびヘミテルペンを含む。カロテノイドは例えば、多くが抗酸化剤として機能するリコピン、β-カロテンなどを含む。セスキテルペノイドは例えば、抗マラリア活性を有する化合物であるアルテミニシンを含む。ジテルペノイドは例えば、癌の化学療法剤であるタキソールを含む。
米国特許公報第2004/005678号;米国特許公報第2003/0148479号;Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7): 796-802;Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71;Wilding et al. (2000) J. Bacteriol 182(15): 4319-27;米国特許公報第2004/0194162号;Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63: 3341-3344;Jackson et al. (2003) Organ. Lett. 5: 1629-1632;米国特許公報第2004/0072323号;米国特許公報第2004/0029239号;米国特許公報第2004/0110259号;米国特許公報第2004/0063182号;米国特許第5,460,949号;米国特許公報第2004/0077039号;米国特許第6,531,303号;米国特許第6,689,593号;Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627-1635;T. Kuzuyama (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934;T. Kazuhiko (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491;Brock et al. (2004) Eur J. Biochem. 271: 3227-3241;Choi, et al. (1999) Appl Environ. Microbio. 65 4363-4368;Parke et al., (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974-2983;Subrahmanyam et al. (1998) J. Bact. 180: 4596-4602;Murli et al. (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509。
本発明は、イソプレノイド前駆体またはイソプレノイド化合物を生産する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞を提供する。本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は、メバロン酸経路の1つまたは複数の酵素の活性レベルの上昇、プレニルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇、およびスクアレンシンターゼの活性レベルの低下を含む。本発明の遺伝的に修飾された真核宿主細胞におけるイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体の生産法を提供する。この方法は一般に、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞を、高レベルのイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産を促進する条件で培養する段階を含む。
「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」、および「テルペノイド化合物」という用語は、本明細書で互換的に使用される。イソプレノイド化合物は、さまざまな数の、いわゆるイソプレン(C5)単位から作られる。イソプレノイド中に存在するC原子の数は典型的には、5で割り切れる数(例えば、C5、C10、C15、C20、C25、C30、およびC40)である。不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されており、これらも「イソプレノイド」の定義に含まれる。イソプレノイド化合物は、モノテルペン、セスキテルペン、トリテルペン、ポリテルペン、およびジテルペンを含むがこれらに限定されない。
本発明は、イソプレノイド前駆体化合物またはイソプレノイド化合物を生産する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞を提供する。本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の活性レベルの上昇、プレニルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇、およびスクアレンシンターゼの活性レベルの低下を含む。本発明の遺伝的に修飾された真核宿主細胞における、イソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体の生産法を提供する。この方法は一般に、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞を、高レベルのイソプレノイド化合物もしくはイソプレノイド前駆体化合物の生産を促進する条件で培養する段階を含む。
本発明は、細胞が、イソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産の昂進を提供する1つもしくは複数の遺伝的修飾を含む、遺伝的に修飾された真核宿主細胞を提供する。本発明に従って遺伝的に修飾されていない対照宿主細胞と比較して、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は以下の特徴を示す:メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の活性レベルの上昇;プレニルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇;およびスクアレンシンターゼの活性レベルの低下。
メバロン酸経路は、以下の段階を触媒する酵素を含む:(a)典型的にはアセトアセチルCoAチオラーゼの作用による、アセチルCoAの2つの分子をアセトアセチルCoAに縮合させる段階;(b)典型的にはHMGシンターゼ(HMGS)の作用による、アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG-CoAを生成させる段階;(c)典型的にはHMGRの作用による、HMG-CoAをメバロン酸に変換する段階;(d)典型的にはメバロン酸キナーゼ(MK)の作用による、メバロン酸をメバロン酸5-リン酸にリン酸化する段階;(e)典型的にはホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)の作用による、メバロン酸5-リン酸をメバロン酸5-ピロリン酸に変換する段階;および(f)典型的にはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ(MPD)の作用による、メバロン酸5-ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する段階。
いくつかの態様では、本発明の遺伝的に修飾された真核宿主細胞は、ゲラニル二リン酸シンターゼ(GPPS)および/またはファルネシル二リン酸シンターゼ(FPPS)の活性レベルが高くなるように遺伝的に修飾される。
酵素スクアレンシンターゼは、ファルネシル二リン酸をスクアレンに変換する反応を触媒する。この段階は、ファルネシル二リン酸からエルゴステロールに至る経路における最初の段階である。したがって、この酵素の作用を制限することでFPPは、例えばテルペンシンターゼまたはGGPPシンターゼ、および続くテルペンシンターゼを利用することで、テルペノイド生産経路に向かって切り替えられる。
本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は、当業者に周知の標準的な方法で作製される。いくつかの態様では、メバロン酸経路のバリアント酵素をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸、および/またはメバロン酸経路の酵素(群)の転写を制御するバリアント転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を宿主細胞に導入し、および内因性の遺伝子の全体または一部を、例えば相同組換えによって置換する。いくつかの態様では、異種核酸を親宿主細胞に導入し、および異種核酸が、メバロン酸経路の酵素、プレニルトランスフェラーゼ、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の転写を制御する転写因子、またはスクアレンシンターゼをコードする内因性の核酸と組換えを起こすことで親宿主細胞が遺伝学的に修飾される。いくつかの態様では、異種核酸は、内因性のプレニルトランスフェラーゼの転写を制御する内因性のプロモーターと比較して高いプロモーター強度のプロモーターを含み、および組換え事象は、内因性のプロモーターと異種プロモーターの置換を生じる。他の態様では、異種核酸は、内因性のHMGRと比較して高い酵素活性を示す短縮型HMGRをコードするヌクレオチド配列を含み、および組換え事象は、内因性のHMGRのコード配列と異種HMGRのコード配列の置換を生じる。いくつかの態様では、異種核酸は、操作可能に連結されたスクアレンシンターゼのコード配列の調節型の転写を提供するプロモーターを含み、および組換え事象は、内因性のスクアレンシンターゼのプロモーターと異種プロモーターの置換を生じる。
いくつかの態様では、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は、上記の修飾に加えて1つまたは複数の遺伝的修飾を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は、プレニルトランスフェラーゼ(例えばFPPおよびGPP以外のプレニルトランスフェラーゼ);テルペンシンターゼなどの1つもしくは複数の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、1つもしくは複数の核酸によって、さらに遺伝的に修飾される。
いくつかの態様では、遺伝子産物(例えばプレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼなど)をコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、特定の宿主細胞のコドンの好みを反映するように修飾される。例えば、ヌクレオチド配列は、いくつかの態様では、酵母のコドン優先性に合わせて修飾される。これについては例えば、Bennetzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031を参照されたい。
アセチルCoAは、MEV経路において、アセトアセチルCoAチオラーゼとHMGSの両方に使用される反応物なので、一部の宿主細胞では、アセチルCoAの細胞内プールの拡大は、イソプレノイドおよびイソプレノイド前駆体の増加に至る可能性がある。細胞内のアセチルCoAのレベルを高めると考えられる修飾は、細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼの総活性を低下させると考えられる修飾、細胞内の酢酸キナーゼの総活性を低下させると考えられる修飾、細胞内のアルコールデヒドロゲナーゼの総活性を低下させると考えられる修飾、2-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの総活性を低下させると考えられるような、トリカルボン酸サイクルに干渉すると考えられる修飾、もしくは(F1F0)H+-ATPシンターゼの総活性を低下させると考えられるような、酸化的リン酸化を妨げると考えられる修飾、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
プレニルトランスフェラーゼは、さまざまな鎖長のプレニル二リン酸の生成につながる、IPPの連続的な縮合を触媒する広範囲の酵素を含む。適切なプレニルトランスフェラーゼは、IPPとアリルプライマー基質の縮合を触媒して、約5イソプレン単位〜約6000イソプレン単位もしくはこれ以上、例えば約5イソプレン単位〜約10イソプレン単位、約10イソプレン単位〜約15イソプレン単位、約15イソプレン単位〜約20イソプレン単位、約20イソプレン単位〜約25イソプレン単位、約25イソプレン単位〜約30イソプレン単位、約30イソプレン単位〜約40イソプレン単位、約40イソプレン単位〜約50イソプレン単位、約50イソプレン単位〜約100イソプレン単位、約100イソプレン単位〜約250イソプレン単位、約250イソプレン単位〜約500イソプレン単位、約500イソプレン単位〜約1000イソプレン単位、約1000イソプレン単位〜約2000イソプレン単位、約2000イソプレン単位〜約3000イソプレン単位、約3000イソプレン単位〜約4000イソプレン単位、約4000イソプレン単位〜約5000イソプレン単位、または約5000イソプレン単位〜約6000イソプレン単位もしくはこれ以上のイソプレノイド化合物を生成する酵素を含む。
テルペンシンターゼは、化学および生物学で既知の、非常に複雑な反応の1つを介してイソプレノイド化合物の生産を触媒する。一般にテルペンシンターゼは、分子量が約40〜100 kDの中程度のサイズの酵素である。テルペンシンターゼは、十分な反応特異性およびキラリティの保存を併せもつ、低速〜中速のターンオーバー速度を有する酵素として分類可能である。ターンオーバーは、酵素と基質の結合、基質のコンフォメーションの確立、基質から生成物への変換、および生成物の放出を含む。反応は、水性溶媒中でインビトロで実施可能であり、典型的にはマグネシウムイオンを補因子として要求し、および疎水性が高いことの多い、結果として得られる生成物は、有機溶媒中に分配することで回収できる。米国特許第6,890,752号。
遺伝的に修飾された宿主細胞を作製するために、1つもしくは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、1つもしくは複数の核酸を、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポソームによるトランスフェクション、酢酸リチウムの存在下における熱ショックなどの手法を含むがこれらに限定されない確立された手法で、宿主細胞に安定に、または一過的に導入する。安定な形質転換に関しては、核酸は一般に、例えばネオマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性などの周知の複数の選択マーカーのいくつかの選択マーカーをさらに含む。
本発明はさらに、本発明の遺伝的に修飾された真核宿主細胞を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の遺伝的に修飾された真核宿主細胞を含み、およびいくつかの態様では、部分的には、遺伝的に修飾された真核宿主細胞の意図された用途を元に選択される1つまたは複数の別の成分を含む場合がある。適切な成分は、塩類;緩衝剤;安定剤;プロテアーゼ阻害剤;細胞膜および/または細胞壁を保存するような化合物、例えばグリセロール、ジメチルスルフォキシドなど;細胞に適した栄養培地;ほかの成分を含むがこれらに限定されない。
本発明は、イソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産法を提供する。この方法は一般に、本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞を適切な培地で培養する段階を含む。
以下の実施例は、本発明の製造法および使用法の完全な開示および記述を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが、本発明者らの発明とみなす範囲を制限することを意図したものではなく、以下に示す実験が、実施された全てまたは唯一の実験であることを示すことを意図したものでもない。使用された数値(例えば、量、温度など)に関しては正確を期すように努力したが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮されなければならない。特に示された部分を除き、割合(part)は重量の割合、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、および圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。標準的な省略形を使用することができる。例えば、bp、塩基対(複数を含む);kb、キロ塩基対(複数を含む);pl、ピコリットル(複数を含む);sもしくはsec、秒(複数を含む);min、分(複数を含む);hもしくはhr、時間(複数を含む);aa、アミノ酸(複数を含む);kb、キロ塩基対(複数を含む);bp、塩基対(複数を含む);nt、ヌクレオチド(複数を含む);i.m.、筋肉内(に);Lp.、腹腔内(に);s.c、皮下(に);など。
材料および方法
試薬
ドデカンおよびカリオフィレンはSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入した。5-フルオロオロト酸酸(5-FOA)はZymo Research (Orange, CA)から購入した。Synthetic Defined培地調製用のComplete Supplement Mixture (CSM)はQbiogene (Irvine, CA)から購入した。他の全ての培地成分はSigma-AldrichまたはBecton, Dickinson (Franklin Lakes, NJ)から購入した。
本研究で使用する発現プラスミドの構築時の細菌の形質転換および、プラスミドの増幅には、大腸菌株DH10BおよびDH5αを使用した。これらの株は、100 mg/Lのアンピシリンを添加したルリア-ベルターニ培地で37℃で培養した。ただしpδ-UBベースのプラスミドの増幅時には、株を50 mg/Lのアンピシリン存在下で培養した。
GAL1プロモーターによるADS発現用にプラスミドpRS425ADSを作製するために、ADSをpADS (Martin et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): p.796-802)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマー対ADS-SpeI-F/ADS-HindIII-Rを使用して増幅した(表1)。これらのプライマーを使用して、ヌクレオチド配列5'-AAAACA-3'をADSの開始コドンのすぐ上流にクローニングした。このコンセンサス配列は、ADSおよび本研究で使用される他のガラクトース誘導型遺伝子の効率的な翻訳のために使用した(Looman et al. (1993) Nucleic Acids Research. 21(18): 4268-71;Yun et al. (1996) Molecular Microbiol. 19(6): 1225-39)。増幅産物をSpeIおよびHindIII切断し、SpeIおよびHindIIIで切断したpRS425GAL1 (Mumberg et al. (1995) Gene 156(1): 119-122)にクローニングした。
S288Cに由来する、S.セレビシエ株BY4742 (Carrie Baker Brachmann et al. (1998) Yeast 14(2): 115-132)を全てのS.セレビシエ株の親株として使用した。全てのS.セレビシエ株の形質転換は、標準的な酢酸リチウム法で実施した(Gietz et al. (2002) Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B., Academic Press Inc: San Diego. 87-96)。最高のアモルファジエン生産形質転換体を選択するために、各形質転換に由来する3〜10個のコロニーをスクリーニングした。株BY4742のプラスミドpRS425ADSによる形質転換およびSD-LEUプレート上における選択によって、株EPY201を構築した。株EPY203、EPY204、EPY205、およびEPY206を、株EPY201をそれぞれプラスミドpRS-HMGR、pRS-UPC2、pRS-ECM22、およびpRS-ERG20で形質転換して構築した。形質転換体をSD-LEU-URAプレート上で選択した。プラスミドpδ-HMGRをXhoIで切断後に、同DNAで株EPY201を形質転換してEPY207を構築した。URA3マーカー欠損体を選択するために、株EPY207を培養し、1 g/Lの5-FOAを含むSD-LEUプレートにプレーティングした。結果として得られたウラシル栄養要求性変異株を次に、XhoIで切断したpδ-UPC2プラスミドDNAで形質転換し、SD-LEU-URAプレート上で選択することでEPY209を構築した。プラスミドpRS-ERG9をHindIIIで切断し、EPY209のERG9座位におけるPMET3-ERG9融合体の組込みに使用し、EPY212を構築した。この株はSD-LEU-URA-HIS-METプレートで選択した。URA3マーカーの欠失体を選択するために、EPY212を培養し、5-FOAを含むSD-LEU-HIS-METプレートにプレーティングした。結果として得られたウラシル栄養要求体を次に、XhoIで切断したpδ-ERG20プラスミドDNAで形質転換し、SD-LEU-URA-HIS-METプレート上で選択することでEPY214を構築した。
アモルファジエン生産の測定の時間経過実験では、5 mLのSD (2%ガラクトース)培地(上記の適切なアミノ酸を欠く)を含む培養用チューブに対象株を播種した。これらの播種物(innocula)を、600 nmにおける光学密度(OD600)が約1となるまで30℃で成長させた。50 mLのSD培地を含む250 mL容量のバッフル付フラスコに、OD600が0.05の種培養物を播種した。図4は、メチオニンを記載のレベルで含むSD-URA-LEU-HIS中で成長させた株を示す。図5に示した株用の培地は、メチオニンを最終濃度が1 mMとなるように添加したSD-URAを含む。他の全ての生産実験では、適切であればSD-URAまたはSD-URA-LEUを使用した。
さまざまな株によるアモルファジエン生産を、文献(Martin et al. (2001) Biotechnology and Bioengineering, 75(5): 497-503)に記載された手順によるGC-MSで、分子イオン(204 m/z)および189 m/zイオンの2種類のイオンのみをスキャンして測定した。カリオフィレン標準曲線、および総イオン量に対するイオン189 m/zおよび204 m/zの相対量を用いて、アモルファジエン濃度をカリオフィレン同等物に変換した。
アモルファジエンの生産を最大化するために、S.セレビシエゲノムへのコンストラクトの連続的な組込みを利用する段階的なアプローチを採用した。
コレステロールの生合成の医学的重要性、およびS.セレビシエの解析の実験的容易さから、S.セレビシエは過去数十年間、メバロン酸経路の調節の研究のための理想的な生物となっている(Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267(1): 473-477;Dimster-Denk et al. (1999) J. Lipids Res., 40(5): 850-860)。
アモルファジエンを増やす別のアプローチでは、ステロール生合成の調節に重要な役割を果すことが確認済みのS.セレビシエの2種類の転写因子を使用した。S.セレビシエ変異体upc2-1は当初、有酸素条件でステロールを取り込むという独特な能力によって同定された(Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2): 93-106)。後の解析の結果、このような変異体では、ステロール合成能力が昂進していることが判明した(Lewis et al. (1988) Yeast, 4(2): 93-106)。こうした特徴に関与する変異は、UPC2遺伝子中の1残基のグアニン→アデニン移行であり;この点変異は、カルボキシ末端近傍のアミノ酸888位におけるグリシンからアスパラギン酸への残基変化を生じる(Crowley et al. (1998) J. Bacteriol., 180(16): 4177-83)。同遺伝子のホモログであるECM22は後に、アミノ酸配列の同一性が45%であることがわかった(Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3): 830-834)。UPC2とECM22間では、upc2-1の点変異の座位において36残基のアミノ酸が完全に保存されている(Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3): 830-834)。upc2-1点変異が野生型のECM22対立遺伝子に導入されて、upc2-1変異体に類似の用語型を有する株が得られている(Shianna et al. (2001) J. Bacteriol., 183(3): 830-834)。
tHMGRおよびupc2-1の過剰発現はそれぞれ、細胞培養物中におけるアモルファジエンの最終収率を高めた。これらの遺伝子がともに存在するときの過剰発現に由来する相乗効果の可能性を検討するために、発現カセットを、S.セレビシエゲノム中に段階的に組込んだ。組込み型プラスミドの構築にはプラスミドpδ-UB (Lee et al. (1997) Biotechnol Prog., 13(4): 368-373)を使用した。このプラスミドは、URA3マーカーのリサイクルを可能とする再利用可能なURA3 Blasterカセットを含む。加えて、同プラスミドは、約425個がゲノム全体に分散する、(Ty-トランスポゾン部位の長い末端反復配列(LTR)中に存在する)δ-配列に組込まれる(Dujon (1996) Trends in Genetics, 12(7): 263-270)。
アモルファジエン生産に見られる上昇は、FPPの前駆体プールの拡大を示唆していた。FPPは、ステロール、ドリコール、およびポリプレノール、ならびにプレニル化タンパク質を含むいくつかのS.セレビシエ化合物の合成の中心的存在である。メバロン酸経路のフラックスの昂進は、より高いアモルファジエン生産をもたらすが、他の数種類の酵素も、FPPのプールの拡大をめぐって、最も重要なのはERG9にコードされたスクアレンシンターゼと競合していた。スクアレン合成は、FPPからエルゴステロールに至る過程の分岐点である。HMGRの触媒ドメインを発現し、かつERG9欠失を含む株ではFPPが蓄積することが認められている(Song (2003) Analytical Biochemistry, 317(2): 180-185)。FPPを、ステロール生産から引き離して、アモルファジエンの生産に向かわせるためには、スクアレンシンターゼ活性の低下が有用であると考えられる。しかしながら、ERG9の欠失は、ステロールの外因的供給が無い場合には致死的に作用する。
ERG20にコードされるFPPシンターゼ(FPPS)を、セスキテルペン収量がさらに高まることを期待して、過剰発現の次の標的とした。FPPS活性の6倍の増加は、それぞれドリコールおよびエルゴステロールの80%および32%の増加と相関していた(Szkopinska et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications, 267(1): 473-477)。HMGRおよびupc2-1を過剰発現させる研究と同様に、最初にERG20を高コピー数プラスミド上のGAL1プロモーターの下流にクローニングしてpRS-ERG20を得た。このプラスミド上におけるpRS425ADSとERG20の同時発現は実際に、アモルファジエンの絶対的な生産性を60%低下させた。FPPS活性の増加が、エルゴステロールなどの他のFPP由来の生成物の量のみを高めることはあり得る。別の可能性は、FPPSの過剰発現が、HMGR分解の主要シグナルであるFPPの細胞内濃度を高めたということである(Gardner et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(44): 31671-31678)。脱調節型の還元酵素の過剰発現なしには、FPP濃度の上昇は、メバロン酸経路のフラックスを制限し、かつアモルファジエン生産を低下させるように作用すると考えられる。
Claims (30)
- 以下を提供する遺伝的修飾を含む、メバロン酸経路を介してイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物を生産する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞であって、遺伝的修飾が、遺伝的修飾を含まない対照細胞におけるイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物のレベルより少なくとも約50%高いレベルでイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産を提供する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞:
a)メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の活性レベルの上昇、
b)プレニルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇、および
c)スクアレンシンターゼの活性レベルの低下。 - プレニルトランスフェラーゼがファルネシルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
- プレニルトランスフェラーゼがゲラニルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
- プレニルトランスフェラーゼがゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
- 遺伝的に修飾された真核宿主細胞が酵母細胞である、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
- 遺伝的に修飾された真核宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項5記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 短縮型のヒドロキシメチルグルタリル補酵素A還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 野生型Ecm22pと比較して上昇した転写活性化活性を有し、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の転写レベルが高められるバリアントEcm22p転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼの転写レベルが高められる、請求項8記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 野生型Upc2pと比較して上昇した転写活性化活性を有し、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の転写レベルが高められるバリアントUpc2p転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼの転写レベルが高められる、請求項10記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してファルネシルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項12記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してゲラニルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項14記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項16記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、異種プロモーターが、スクアレンシンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してスクアレンシンターゼのレベルの低下を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸でさらに遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- テルペンシンターゼが、アモルファ-4,11-ジエンシンターゼ(ADS)、ベータ-カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンAシンターゼ、8-エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、(+)-デルタ-カジネンシンターゼ、ゲルマクレンCシンターゼ、(E)-ベータ-ファルネセンシンターゼ、カスベン(Casbene)シンターゼ、ベティスピラジエン(vetispiradiene)シンターゼ、5-エピ-アリストロチェンシンターゼ、アリストロチェンシンターゼ、ベータ-カリオフィレン、アルファ-フムレン、(E,E)-アルファ-ファルネセンシンターゼ、(-)-ベータ-ピネンシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、1,8-シネオールシンターゼ、(+)-サビネンシンターゼ、E-アルファ-ビサボレンシンターゼ、(+)-ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエン(levopimaradiene)シンターゼ、アビエタジエン(Abietadiene)シンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、(E)-ガンマ-ビサボレンシンターゼ、タクサジエン(taxadiene)シンターゼ、コパリル(copalyl)ピロリン酸シンターゼ、カウレン(kaurene)シンターゼ、ロンギフォレンシンターゼ、ガンマ-フムレンシンターゼ、デルタ-セリネンシンターゼ、ベータ-フェランドレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、(-)-カンフェンシンターゼ、(+)-3-カレンシンターゼ、syn-コパリル二リン酸シンターゼ、アルファ-テルピネオールシンターゼ、syn-ピマラ-7,15-ジエンシンターゼ、ent-サンダアラコピマラジエン(sandaaracopimaradiene)シンターゼ、ステマー(stemer)-13-エンシンターゼ、E-ベータ-オシメン、S-リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、E-ベータ-オシメンシンターゼ、エピ-セドロールシンターゼ、アルファ-ジンギベレンシンターゼ、ギアジエン(guaiadiene)シンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、シス-ムーロラジエン(muuroladiene)シンターゼ、アフィジコラン(aphidicolan)-16b-オールシンターゼ、エリザベスアトリエン(elizabethatriene)シンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ジンザノール(Zinzanol)シンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオール(scareol)シンターゼ、コパロール(copalol)シンターゼ、およびマノール(manool)シンターゼから選択される、請求項19記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- テルペンシンターゼがアモルファ-4,11-ジエンシンターゼである、請求項19記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
- 以下の段階を含む、宿主細胞のメバロン酸経路を介してイソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの生産を増強する方法:請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞を適切な培地で、およびイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物が、遺伝的修飾を含まない対照細胞におけるイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物のレベルより少なくとも約50%高いレベルで生産される、イソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産を増強する条件下で培養する段階。
- 条件が、誘導型プロモーターを活性化する誘導薬剤の培地への含有を含む、請求項22記載の方法。
- イソプレノイド化合物がモノテルペンである、請求項22記載の方法。
- イソプレノイドがポリテルペンである、請求項22記載の方法。
- イソプレノイドがジテルペンである、請求項22記載の方法。
- イソプレノイドがトリテルペンである、請求項22記載の方法。
- イソプレノイドがカロテノイドである、請求項22記載の方法。
- イソプレノイドがセスキテルペンである、請求項22記載の方法。
- セスキテルペンがアモルファジエンである、請求項29記載の方法。
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